مقدمه.

آفت‌ها مهم‌ترین چالش و عامل اصلی کاهش محصولات مختلف کشاورزی در دنیا محسوب می‌شوند. امروزه از آفت‌کش‌های شیمیایی مختلف نظیر انواع علف‌کش‌ها، حشره‌کش‌ها و قارچ‌کش‌ها به‌وفور استفاده می‌شود (1). از مهم‌ترین مشکلات استفاده از ترکیبات یادشده، مشکلات زیست‌محیطی و سمیت این ترکیبات و نیز مقاوم‌شدن عوامل بیماری‌زا نسبت به آنها هستند. جلوگیری از شیوع بیماری با شناسایی سریع و دقیق عوامل بیماری‌زا در مراحل ابتدایی بیماری و یا پیش از آن ازجمله راهکارهای مؤثر برای کاهش میزان استفاده از آفت‌کش‌ها و مشکلات ناشی از مصرف آنها و نیز کاهش میزان هدررفت محصول است. بر اساس این، روش‌های مختلفی پیشنهادشده که به‌کارگیری روش‌های شناسایی مبتنی بر اسیدهای نوکلئیک و به‌ویژه روش PCR بیشترین توجه و موفقیت را داشته است (2).

عوامل بیماری‌زای قارچی براساس توکسین‌هایی که تولید می‌کنند به دو دسته‌ عوامل بیماری‌زای اختصاصی برای میزبان و انواع غیراختصاصی دسته‌بندی می‌شوند (3). تا کنون، 20 توکسین اختصاصی میزبان در قارچ‌ها شناسایی شده‌اند که Alternaria alternata 7 نمونه از آنها را تولید می‌کند (4). جدول 1، طبقه‌بندی پاتوتایپ‌های گونه A. alternata را بر‌اساس توکسین‌های اختصاصی نشان می‌دهد؛ جدایه‌های مختلف A. alternata با تولید توکسین‌های متفاوت می‌توانند گیاهان مختلف را بیمار کنند و تقسیم‌بندی بر‌اساس الگوی تولید توکسین و بیماری‌زایی اختصاصی در گیاه تنها راه تشخیص این جدایه‌ها از یکدیگر است (5).‌

جدول 1‌- انواع پاتوتایپ‌های تولید‌کننده توکسین‌های اختصاصی میزبان در Alternaria alternata

تمام پاتوتایپ‌های A. alternataکه توکسین اختصاصی میزبان تولید می‌کنند آنامورف بوده و‌ از نظر ریخت‌شناسی بسیار به یکدیگر شبیه هستند (5). شناسایی‌نشدن از راه ریخت‌شناسی و ویژگی‌های میکروسکوپی ازجمله مشکلات شناسایی پاتوتایپ‌های مختلف A. alternata است و دلیل اصلی آن وجود تنها عامل تمایزی Aژن‌های تولید توکسین اختصاصی@ است؛ بر این اساس به‌طور رایج از روش سنجش فعالیت بیماری‌زایی و سنجش زیستی در گیاه میزبان برای شناسایی پاتوتایپ‌های مختلف A. alternataاستفاده می‌شود که روشی زمان‌بر و همراه باخطاست (5). امروزه ثابت شده توکسین‌های اختصاصی که این جدایه‌ها روی برگ و میوه گیاه تولید می‌کنند ازجمله عوامل ایجاد سرطان در انسان هستند.

بیماری لکه قهوه‌ای از بیماری‌های رایج مرکبات به‌ویژه نارنگی در سراسر دنیاست که پاتوتایپ بیماری‌زای نارنگی A. alternataآن را ایجاد می‌کند. این بیماری میزان محصول را کاهش می‌دهد و به‌ویژه در کشورهای آفریقای جنوبی، ترکیه، فلسطین اشغالی، ایران، اسپانیا، ایتالیا، یونان، برزیل، آرژانتین، پرو و کلمبیا بسیار گزارش شده است (5). ACT توکسین اختصاصی و عامل بیماری‌زای اصلی این پاتوتایپ است که روی درخت نارنگی و میوه آن تأثیر می‌گذارد (3). این توکسین از سه بخش اپوکسی دکاتری‌انوئیک اسید[1] (EDA)، آمینواسید والین و یک پلی‌کتاید با همکاری آنزیم‌های مختلف ساخته می‌شود (6). شکل 1، تصویر توکسین‌های اختصاصی میزبان ازجمله ACT توکسینی را نشان می‌دهد که پاتوتاتیپ‌های A. alternata تولید می‌کنند.

شکل 1- ساختار توکسین‌های اختصاصی میزبان که پاتوتایپ‌های A. alternata تولید می‌کنند

پژوهش‌های میاموتو[2] و همکاران در سال 2010 و آجیرو[3] و همکاران در سال 2010 نشان دادند ژن‌های actts2 و actts3 که به‌ترتیب کد‌کننده آنزیم‌های انویل‌ردکتاز[4] و پلی‌کتاید‌سنتاز[5] هستند فقط در پاتوتایپ تولید‌کننده توکسین اختصاصی ACT دیده می‌شوند (7 و 8).

براساس اطلاعات موجود، هدف پژوهش حاضر استفاده از ژن actts2 مولد توکسین ACT به‌عنوان نشانگر مولکولی برای تشخیص مولکولی مبتنی بر PCR قارچ بیماری‌زای‌ گیاهی A. alternata عامل بیماری لکه قهوه‌ای در مرکبات است.

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‌برداری: 20 نمونه آلوده برگ و میوه نارنگی از مؤسسه تحقیقات مرکبات کشور در شهر رامسر برای جداسازی جدایه‌های بیماری‌زا جمع‌آوری شد. از عمق 3 تا 15 سانتی‌متری سطح خاک درختان سالم و بیمار مؤسسه تحقیقات مرکبات کشور نیز 5 نمونه برای استخراج DNA از خاک جمع‌آوری شد. نمونه‌های جمع‌آوری‌شده پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.

کشت و جداسازی جدایه‌های بیماری‌زا: برای حذف‌کردن میکروفلور بومی، برگ‌های نکروزه و بیمار گیاه و بافت‌های آسیب‌دیده با محلول هیپوکلریدسدیم 5 درصد ضدعفونی سطحی شدند (9). سپس، نمونه‌ها در پلیت‌های حاوی محیط‌کشت [6]PDA و [7]PCA کشت و در دمای 20 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از 7 روز انکوباسیون جدایه، کلنی‌های حاصل خالص و در مجموعه میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران [8]UTMC ثبت و نگهداری شدند.

بررسی ریخت‌شناسی جدایه‌ها: شناسایی جدایه‌های جنس Alternariaبا بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایه‌های حاصل از طریق تهیه اسلاید‌ کالچر و رنگ‌آمیزی با لاکتوفنول کاتن بلو زیر میکروسکوپ و بر‌اساس کلید شناسایی (10) انجام شد.

سنجش زیستی بیماری‌زایی در گیاه: ابتدا، جدایه‌ها همراه با 4 نمونه قارچ‌ استاندارد غیربیماری‌زا در محیط PCA کشت شدند. نمونه‌های تشخیص داده شده جنس Alternaria 7 روز در دمای 18 درجه سانتی‌گراد و سایر نمونه‌های شاهد در دمای 28 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. سپس با اسپورکش، کنیدی‌های قارچ‌ها جمع‌آوری و با لام نئوبار شمارش شدند و غلظت 10⁵ اسپور در میلی‌لیتر در محلول بافر فسفات با اسیدیته 7 آماده شد. 1 میلی‌لیتر از محلول اسپوری آماده‌شده روی برگ‌های جوان و ضد‌عفونی‌شده نارنگی اسپری و برگ‌های تلقیح‌شده در محفظه‌های دارای رطوبت اشباع قرار داده شدند. برای نمونه شاهد منفی از قارچ‌های استاندارد و غیر از Alternaria به‌همراه محلول بافر فسفات به‌تنهایی استفاده شد. پلیت‌های آماده‌شده 3 روز در تاریکی نگهداری شدند و هر روز از نظر بروز علایم بیماری ارزیابی شدند. سنجش بیماری‌زایی روی برگ‌های نارنگی برای 20 جدایه بیماری‌زا و غیربیماری‌زا در دو آزمایش مستقل و در سه تکرار انجام شد.

.استخراج DNA از نمونه‌های جدا‌شده و خالص‌شده: جدایه‌های حاصل و نمونه‌های شاهد 48 ساعت در محیط PDB[9] و دمای 28 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند و سپس با سانتریفیوژ، میسیلیوم‌های قارچ از محیط‌کشت جدا شدند. زیست‌توده حاصل با سرم فیزیولوژی شسته شد و سلول‌ها با روش کوبیدن زیست‌توده منجمدشده با ازت مایع به‌شکل فیزیکی شکسته شدند. DNA قارچ از مخلوط سلولی حاصل به روش استخراج فنل و کلروفرم جداسازی شد (11).

استخراج DNA از خاک: برای بررسی وجودداشتن یا نداشتن قارچ مدنظر، 5 نمونه خاک‌ جداشده از مناطق مختلف جمع‌آوری و روش زیر برای استخراج DNA از خاک استفاده شد: 1/0 گرم خاک در هاون ریخته شد و 500 میکرولیتر محلول بافر Z (Na₂HPO₄، NaH₂PO₄ KCl، MgSO₄، β- مرکاپتواتانول) و 100 میلی‌لیتر ازت مایع به آن اضافه و در حالت انجماد کوبیده شد. مخلوط حاصل به داخل ویال منتقل و هم‌وزن نمونه اولیه خاک،گلوله‌های شیشه‌ای (سیگما، آمریکا) به آن اضافه شد؛ ویال 5 مرتبه و هر بار 2 دقیقه ورتکس شد. در مرحله بعد، به محلول واکنش 1 درصد [10]CTAB اضافه و 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس، 130 میکرولیتر محلول SDS 20 درصد به آن اضافه و 2 ساعت در دمای 65 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. محلول حاصل در 15000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و پروتئین و لیپیدهای سلولی با افزدون فنل و کلروفرم از سوپرناتانت استخراج و DNA باقیمانده با اتانول رسوب داده شد (12).

.طراحی پرایمر و انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: طراحی پرایمرهای اختصاصی براساس ابتدا و انتهای ژن actts2 و با نرم‌افزار پرایمر-بلاست[11] انجام و دمای اتصال پرایمرها 52 درجه سانتی‌گراد محاسبه شد. همچنین، برای تأیید و شناسایی مولکولی جدایه‌های مثبت و بیماری‌زا از PCR ژن 18S rRNA به‌کمک پرایمرهای عمومی این ژن استفاده شد. هر واکنش PCR، حاوی 200 نانوگرم DNA به همراه 20 پیکومول از هر پرایمر بود و واکنش PCR برای ژن ACT توکسین در دمای اتصال پرایمر 52 درجه سانتی‌گراد و برای ژن 18S rRNA در دمای 51 درجه سانتی‌گراد انجام شد. جدول2، پرایمرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر را نشان می‌دهد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای[12]: برای تأیید تکثیر اختصاصی ژن actts2، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای با پرایمرهای داخلی طراحی ‌شده و به‌کمک نرم‌افزار پرایمر-بلاست انجام و دمای اتصال پرایمرها 54 درجه سانتی‌گراد محاسبه شد؛ ترتیب پرایمرها در جدول 2 مشاهده می‌شود و طول قطعه‌ای که این دو تکثیر انجام می‌دهند، 663 نوکلئوتید در نظر گرفته شد.

جدول 2- پرایمرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر

توالی‌یابی محصول تکثیرشده: برای بررسی نتایج، محصول تکثیرشده PCR روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد و پس از رنگ‌آمیزی، عکس ژل تهیه شد. همچنین برای توالی‌یابی باند‌های مد‌نظر از ژل با کمک کیت استخراج از ژل (ژل آل-کره جنوبی[13]) استخراج انجام و به شرکت ماکروژن کره جنوبی[14] ارسال شد. نتایج تعیین ترادف در بانک ژنی و از طریق هم‌ردیفی توالی ارزیابی شدند.

نتایج.

کشت و جداسازی جدایه‌های قارچی بیماری‌زا: در مرحله جداسازی قارچ بیماری‌زا، 15 جدایه حاصل شد که پس از مشاهدات میکروسکوپی و بررسی ویژگی‌های کلنی و شناسایی مولکولی، 9 نمونه از آنها به‌عنوان A. alternata شناسایی شدند. شکل 2، ریخت‌شناسی کلنی در محیط PDA و تصویر میکروسکوپی یکی از جدایه‌ها را نشان می‌دهد. جدایه‌های حاصل در مجموعه میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران ثبت و نگهداری شدند. از سویه A. alternataاستاندارد و بیماری‌زا در سایر گیاهان استفاده شد و سویه‌های استاندارد قارچی غیر از Alternaria، نمونه‌های شاهد بودند.

سنجش زیستی بیماری‌زایی جدایه‌ها روی برگ گیاه: برای بررسی توانایی تولید توکسین و قابلیت جدایه‌ها برای ایجاد بیماری در گیاه، آزمایش فیتوپاتوژنسیتی روی برگ‌های تازه نارنگی با اسپور 20 قارچ مختلف لیست‌شده در جدول 3 انجام شد. شکل 3، نتیجه تست بیماری‌زایی تعدادی از جدایه‌ها را روی برگ‌های نارنگی نشان می‌دهد؛ پس از 5 روز، در برگ‌های شاهد که تنها با بافر اسپری شده‌ بودند و برگ‌های تلقیح‌شده با جدایه‌هایی غیر از A. alternata پاتوتایپ نارنگی تغییری مشاهده نشد ولی در برگ‌های تلقیح‌شده با اسپورهای جدایه‌های جداشده از نمونه‌های بیمار تغییر‌‌ رنگ و بافت برگ و ایجاد بیماری به‌وضوح دیده شد. نتایج سنجش بیماری‌زایی جدایه‌های آزمایش‌شده روی برگ‌های نارنگی در جدول 3 مشاهده می‌شود.

شکل 2- 1- برگ‌های بیمار گیاه نارنگی استفاده‌شده برای جداسازی Alternaria، 2. میسلیوم‌های رشدکرده قارچ A. alternata روی پلیت‌های PDA پس از 7 روز انکوباسیون، 3. کنیدی‌های A. alternata زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 400

شکل 3- نتایج حاصل از سنجش بیماری‌زایی روی برگ‌های نارنگی پس از 5 روز؛ 1. برگ اسپری‌شده با بافر به‌تنهایی، 2. برگ اسپری شده با A. alternata UTMC 5014 (پاتوتایپ گلابی)، 3. برگ اسپری‌شده با A.alternata UTMC 5016 (پاتوتایپ سیب)، 4. برگ اسپری‌شده با Aspergillus niger UTMC 5020، 5. برگ اسپری‌شده با  Fusarium oxysporum UTMC 5019، 6. برگ اسپری‌شده با A.alternata UTMC 5005 (پاتوتایپ نارنگی)، 7. برگ اسپری‌شده با A.alternata UTMC 5006 (پاتوتایپ نارنگی)، 8. برگ اسپری‌شده با A.alternata UTMC 5009 (پاتوتایپ نارنگی)، 9. برگ اسپری‌شده با A. alternata UTMC 5010 (پاتوتایپ نارنگی) و 10. برگ اسپری‌شده با A. alternata UTMC 5012 (پاتوتایپ نارنگی)

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و PCR آشیانه‌ای[15]با پرایمرهای اختصاصی ژن ACT توکسین: در شکل 4-1 نتایج واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصی طراحی‌شده برای ژن ACT توکسین در 14 نمونه مشاهده می‌شود. نتیجه PCR برای 8 جدایه بیماری‌زا و 2 نمونه خاک، حضور یک باند 1000 نوکلئوتیدی را نشان می‌دهد. نتیجه PCR ژن اختصاصی actts2 برای پاتوتایپ‌های سیب، گوجه، لیمو و گلابی A. alternata و همچنین سایر قارچ‌های شاهد غیر از A. alternataمنفی بود و هیچ تکثیری مشاهده نشد. تعیین توالی محصول PCR حاصل از ژن actts2 و انجام هم‌ردیفی آن در بانک ژنی نشان داد که محصول حاصل ژن مولد توکسین ACT بوده و توالی حاصل با شماره دسترسی KM198326 در بانک ژنی به ثبت رسید.

شکل 4- 1- تصویر ژل الکتروفورز محصول PCR ژن actts2 در تعدادی از جدایه‌های آزمایش‌شده، 2. تصویر محصول تکثیر‌شده PCR مربوط به ژن 18S rRAN، 3. تصویر ژل الکترفورز مربوط به  نستد PCR برای تعدادی از جدایه‌های آزمایش‌شده. اعداد نمایش داده شده کد ثبت‌شده جدایه‌ آزمایش‌شده هستند و نام کامل جدایه در جدول 3 آورده شده است. نمونه‌های خاک نیز با S₁ تا S₅ نشانه‌گذاری شده‌اند

شکل 4-2-  نتیجه انجام PCR ژن 18S rRNA با پرایمرهایnu-SSU-0817 و nu-SSU-1536 را برای تعدادی از جدایه‌های آزمایش‌شده روی ژل 1 درصد آگارز نشان می‌دهد. تکثیر ژن 18S rRNA در این جدایه‌ها، شاهد مثبت واکنش PCR و کیفی بودن نمونه‌های DNA استخراج‌شده از جدایه‌های مختلف در نظر گرفته شد و درستی شناسایی جدایه‌ها با تعیین ترادف ژن تکثیرشده در نمونه‌های جداسازی‌شده و انطباق توالی با بانک ژنی تأیید شد.

شکل 4-3- نتایج حاصل از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای با پرایمرهای طراحی‌شده در قسمت داخلی ژن actts2 برای چهار جدایه مثبت A. alternata پاتوتایپ نارنگی را نشان می‌دهد. طبق انتظار واکنش انجام‌شده، قطعه‌ای به طول 663 نوکلئوتید تکثیر شد که بسیار اختصاصی‌بودن پرایمرهای طراحی‌شده را نشان می‌دهد.

بحث و نتیجه‏‏گیری.

جنس Alternaria دارای گونه‌های بیماری‌زا و غیربیماری‌زا است. 7 سویه از A. alternata که به سویه‌های Keissler شهرت دارند قابلیت تولید مایکوتوکسین‌های اختصاصی گیاه را دارند و نمی‌توان آنها را براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی تشخیص داد (8)؛ به همین دلیل، این سویه‌ها به‌نام پاتوتایپ‌های مختلف A. alternata شناخته می‌شوند. این پاتوتایپ‌ها میزبان‌های محدودی دارند و براساس توکسین‌های اختصاصی طبقه‌بندی می‌شوند که در آنها برای ایجاد بیماری ضروری هستند (3).

به‌طور کلی، پذیرش عمومی برای دسته‌بندی پاتوتایپ‌های تولیدکننده توکسین اختصاصی میزبان در A. alternataوجود ندارد (13 و 14) و دلیل این امر، طبقه‌بندی براساس ریخت‌شناسی کنیدی است که برای تشخیص پاتوتایپ‌ها ناتوان است (8).

جدول 3- فهرست جدایه‌های استفاده‌شده در آزمایش بیماری‌زایی روی برگ‌های نارنگی و نتیجه حاصل از انجام واکنش PCR روی ژن actts2 آنها