نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیستشناسی سلولی و مولکولی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
2 دانشیار بیوشیمی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
3 استادیار شیمی کاربردی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان. تبریز، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Lysine is an essential amino acid and has importance in food and pharmaceutical industry. Nowadays, there are different methods such as genetic and growth media optimization to enhance the lysine production. One of the useful methods in optimization of growth media is the response surface methodology.
Materials and methods: In this study, lysine was produced by wild type of Corynebacterium glutamicum ATCC15032 and the production increased by response surface methodology. After selection of M9 culture media as a basic culture media, the effect of different factors such as carbon (glucose), nitrogen (ammonium sulphate) sources and methionine, as an additive, were studied on the lysine production. Then, the culture media and the time of incubation were optimized by response surface methodologyforlysine production.
Results: The results showed that in M9 culture media, the amount of the produced lysine was 0.7 milligram per liter. In the optimized culture media (by response surface methodology) which has 14% glucose, 5% ammonium sulphate and 5mM methionine, lysine was produced up to 0.98 gram per liter after 2.5 days incubation. Pareto analysis indicated that methionine is the most effective factor in the lysine production. Finally, the results of granulation showed that the optimum condition for granulation of culture media (containing lysine) was achieved by adding starch, ammonium sulphate and sodium chloride in low pH and 100 °C.
Discussion and conclusion: According to the results, the proposed culture media by response surface methodology causes 1400 times increase in the lysine production compared with M9 culture media and methionine had an important role in the production of lysine, probably by inhibiting the other metabolic pathway which has common metabolic precursor with lysine production metabolic pathway.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
اسیدآمینه‌ها از پیش‌سازهای اصلی سازندۀ پروتئین‌ها هستند و کاربردهای فراوانی در تهیۀ غذای انسان و دام، لوازم آرایشی، سنتز مواد شیمیایی و تولید داروها دارند. یکی از مهم‌ترین و پراستفاده‌ترین اسیدآمینه‌ها در صنایع غذایی و داروی، لیزین است (1). سالانه بیش از یک میلیون تن اسیدآمینه مثل لیزین و متیونین به‌عنوان افزاودنی‌های مواد غذایی تولید می‌شود (2). از باکتری‌های شاخص در تولید لیزین، کورینهباکتریومگلوتامیکوم است. این باکتری گرم‌مثبت، غیربیماری‌زا، غیرمتحرک، هوازی و دارای رشد سریع است که توانایی تولید اسپور را ندارد و معمولاً کلنی زرد کم‌رنگ تولید می‌کند (3). از مزایای این باکتری نسبت به سایر میکروارگانسیم‌ها در تولید لیزین، می‌توان به این موارد اشاره کرد: استفاده از دو مسیر متابولیسمی سوکسینیلاز و دهیدروژناز (در سایر باکتری‌ها تنها ازطریق یکی از دو مسیر ذکرشده تولید لیزین صورت می‌گیرد) (2 و 3)، توانایی انتقال لیزین تولیدی به بیرون از باکتری (3) و توانایی استفاده از محدودۀ وسیعی از منابع کربنی جهت تولید لیزین (3). جهت افزایش تولید لیزین در سویۀ وحشی از روش‌های مختلفی همچون مهندسی ژنتیک و یا بهینهسازی محیط کشت استفاده می‌شود. در مهندسی ژنتیک می‌توان با دستکاری ژن مربوط به برخی از آنزیم‌های مهم در سنتز لیزین مانند آنزیم آسپارتوکیناز که به‌صورت مستقیم در تولید لیزین دخیل است، میزان تولید لیزین را افزایش داد (4). اسیدآمینۀ لیزین بر آنزیم آسپارتوکیناز تأثیر منفی دارد و افزایش غلظت آن باعث مهار این آنزیم می‌شود (4). ایجاد تغییر ژنتیکی در این آنزیم به‌گونه‌ای که نسبت به افزایش غلظت لیزین حساس نباشد می‌تواند گام مثبتی درجهت افزایش تولید لیزین باشد (4). روش دیگر، بهینهسازی محیط کشت جهت افزایش تولید لیزین است که با ایجاد تغییر در شرایط فیزیکی مانند هوادهی، pH، دما و شرایط محیطی انجام می‌شود. از شرایط محیطی می‌توان به تغییر منابع کربنی و نیتروژنی و افزودن یک سری مواد به محیط کشت مانند متیونین و بیوتین اشاره کرد (5). امروزه برای بررسی تأثیر هم‌زمان چندین عامل بر یک عامل خاص مانند تولید لیزین و گزینش بهترین شرایط با حداکثر تولید، از روش‌های مدل‌سازی ریاضی مانند روش رویه پاسخ[1] استفاده می‌شود (6 و 7). در روش رویه پاسخ از فنون ریاضی و آماری سودمند جهت یافتن ترکیبی از متغیرهای مستقل برای رسیدن به شرایط بهینه همچنین بررسی تأثیر هم‌زمان این متغیرهای مستقل استفاده می‌شود. در روش رویه پاسخ ممکن است در مدل و تخمین به‌کاررفته خطا وجود داشته باشد. با این حال این روش نسبت به روش‌های دیگر دقت بالایی دارد و می‌تواند یک مسئلۀ پیچیده را به یک مسئلۀ ساده‌تر تبدیل کند، حساسیت پاسخ در برابر هر عامل را مشخص کند و با کاهش چشمگیر تعداد آزمایش‌ها باعث صرفه‌جویی در وقت و هزینه شود (5 و 6). روش رویه پاسخ معمولاً به دو روش طراحی ترکیب مرکزی[2](CCD) و باکس-بنکن[3] انجام می‌پذیرد. در طرح CCD ماتریس پیشنهادشده جهت انجام آزمایش‌ها از سه بخش مجزا تشکیل شده است:
الف) بخش اول آزمایش‌ها شامل یک طرح فاکتوریل کامل k2 است که در آن k تعداد عامل‌های مؤثر بر فرآیند است.
ب) بخش دوم آزمایش‌ها شامل نقاط مرکزی[4] است که در آن تمام عامل‌ها در سطوح میانی یا صفر خود هستند و معمولاً بیش از یکب ار تکرار می‌شوند تا ارتوگونالیتی[5] ماتریس حفظ شود.
ج) بخش سوم شامل نقاط محوری[6] است که به‌منظور دوران‌پذیرکردن طرح آزمایش‌ها در نظر گرفته می‌شوند. دوران‌پذیربودن بدین معنا است که میزان دقت طرح در تخمین پاسخ در تمام جهات برابر است (5 و 8).
در سال 2002 از روش رویه پاسخ و با استفاده از عواملی همچون گلوکز (14درصد)، عصارۀ ماهی، برخی نمک‌ها و بیوتین به‌عنوان افزاینده، سعی در بهینهسازی تولید لیزین کردند (9). پس از آن در سال 2008 نیز با استفاده از روش رویه پاسخ و گونۀ جهش‌یافتۀ کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀAEC-2 در محیط کشت حاوی گلوکز، سولفات آمونیوم و تغییر برخی از فاکورهای فیزیکی مثل دما و pH، سعی شد در طی دو مرحله تولید لیزین بهینهسازی شود (10).
در این پژوهش پس از انتخاب یک محیط کشت پایه براساس محیط M9 سعی شد تا با بررسی فاکتورهای دخیل در تولید لیزین، عامل‌های مؤثر در تولید لیزین در باکتری موردنظر شناسایی شود. سپس با استفاده از این فاکتورها تولید لیزین با روش رویه پاسخ، بهینه شود.
مواد و روشها.
مواد: همه مواد به‌کاررفته در این پژوهش همچون گلوکز، سولفات آمونیوم، متیونین و لیزین (جهت رسم منحنی استاندارد) از شرکت مرک (آلمان) خریداری شد.
میکروارگانیسم: میکروارگانیسم مورداستفاده یعنی باکتری کورینه‌باکتریوم‌گلوتامیکومسویۀATCC15032 بود و از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران به‌صورت کشت‌داده‌شده بر روی محیط جامد (فعال‌سازی‌شده) تهیه شد. جهت استفاده و همچنین تهیۀ استوک (محلول ذخیره‌ای باکتری) از باکتری، یک تک‌کلونی از محیط کشت جامد برداشته و به محیط کشت LB مایع انتقال داده شد. پس از گرماگذاری در دمای 37 درجه به‌مدت 14 ساعت از آن استوک تهیه شد.
محیط‌های کشت: جهت رشد باکتری و تهیۀ استوک از آن، از محیط کشت LB استفاده شد. محیط کشت M9 نیز به‌عنوان محیط کشت پایه جهت تولید لیزین استفاده شد. این محیط کشت، حاوی گلوکز (2 گرم بر لیتر) و نمک‌های کلرید سدیم (5/6 گرم بر لیتر)، کلرید پتاسیم (3 گرم بر لیتر)، کلرید آمونیوم (1 گرم بر لیتر)، کلرید منیزیم (5/0 گرم بر لیتر) و کلرید کلسیم (0005/0 گرم بر لیتر) است (11).
کشت باکتری جهت تولید لیزین: بهترین میزان گزارش‌شده برای تلقیح کشت باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀATCC15032 20درصد است (5). به همین دلیل از استوک مایع تهیه‌شده در گلیسرول 30درصد با نسبت ذکرشده تلقیح صورت گرفت. کشت‌ها در حجم 5 میلی‌لیتری با pH برابر 4/7، تهیه و در زمان‌های معین در دمای 30 درجه سانتیگراد در انکوباتور با شیک 180 دور بر دقیقه (RPM) قرار داده شدند.
اندازه‌گیری غلظت لیزین: جهت اندازه‌گیری غلظت لیزین تولیدی از روش چینارد[7] استفاده شد. در این روش، اول معرفی حاوی 25 میلی‌گرم نین هیدرین در 10 میلی‌لیتر محلول حاوی اسید‌سولفوریک (4 میلی‌لیتر، 6 مولار) و اسیداستیک (6 میلی‌لیتر، گلاسیال) تهیه شد. سپس 1 میلی‌لیتر از نمونه‌های حاوی لیزین به یک میلی‌لیترمعرف اضافه شد و نمونه‌ها به‌مدت یک ساعت در حمام آب جوش قرار داده شدند. بعد از آن به نمونه‌ها یک میلی‌لیتر اسیداستیک اضافه شد و درنهایت جذب نمونه‌ها در 500 نانومتر خوانده شد (12). جهت اندازه‌گیری غلظت لیزین براساس میزان جذب نمونه‌ها، منحنی استاندارد از میزان جذب لیزین خالص در غلظت‌های مختلف رسم شد. جهت رسم منحنی استاندارد، غلظت‌های مختلف از لیزین در محدودۀ غلظتی 0001/ تا 002/0 درصد (درصد وزنی/حجمی) تهیه شد و با استفاده از روش گفته‌شده، جذب آنها به دست آمد و درنهایت منحنی استاندارد رسم شد (شکل 1). با استفاده از منحنی حاصل، مقدار لیزین موجود در هر نمونه اندازه‌گیری شد. در این تست غلظت استاندارد لیزین براساس درصد وزنی به حجمی تهیه شد. بنابراین می‌توان گفت هر 1درصد لیزین معادل 10 گرم بر لیتر خواهد بود.
بهینهسازی تولید لیزین: بهینهسازی مقدار لیزین تولیدی با روش رویه پاسخ با کمک نرم‌افزار مینی‌تب[8]صورت گرفت.
در این روش پس از مشخص‌کردن فاکتورهای موردبررسی یک بازه از حداقل و حداکثر مقادیر مؤثر هر یک از موارد تعیین شد و با استفاده از نرم‌افزار به‌روش طراحی ترکیب مرکزی[9] (CCD) در پنج سطح قرار گرفتند (جدول 1).
شکل 1- نمودار استاندارد لیزین. جهت رسم نمودار، غلظت‌های مختلفی از لیزین (درصدهای مختلف وزنی به حجمی) در آب مقطر تهیه شد سپس با روش چینارد میزان جذب (OD) نمونه‌ها به دست آمد.
جدول 1-مقادیر واقعی و کدبندی‌شدۀ متغیرهای مستقل استفاده‌شده در طراحی آزمایش‌ها
|
متغیر مستقل (فاکتور) |
بازه و مقادیر واقعی سطوح کدبندی‌شدۀ فاکتورها |
||||
|
-α* |
1- |
صفر |
1+ |
+α |
|
|
گلوکز (g/l%):x1 |
8 |
10 |
12 |
14 |
16 |
|
سولفات آمونیوم (g/l%):x2 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
متیونین (mM) :x3 |
5/0 |
2 |
5/2 |
5 |
5/6 |
|
زمان (day) : x4 |
1 |
5/2 |
4 |
5/5 |
7 |
2* α=
جدول 2- شرایط آزمایش‌های پیشنهادشده توسط CCD جهت بهینهسازی و مدل‌سازی فرآیند
|
شماره آزمایش |
گلوکز (%) |
آمونیوم سولفات (%) |
متیونین (میلی مولار) |
زمان (روز) |
|
1 |
10 |
5 |
2 |
5/2 |
|
2 |
14 |
3 |
5 |
5/5 |
|
3 |
10 |
5 |
5 |
5/5 |
|
4 |
10 |
5 |
5 |
2.5 |
|
5 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
6 |
10 |
3 |
2 |
5/2 |
|
7 |
14 |
5 |
5 |
5/2 |
|
8 |
14 |
5 |
2 |
5/5 |
|
9 |
10 |
3 |
5 |
5/5 |
|
10 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
11 |
12 |
4 |
6/5 |
4 |
|
12 |
10 |
5 |
2 |
5/5 |
|
13 |
14 |
3 |
5 |
5/2 |
|
14 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
15 |
12 |
6 |
3/5 |
4 |
|
16 |
14 |
3 |
2 |
5/5 |
|
17 |
14 |
5 |
2 |
5/2 |
|
18 |
8 |
4 |
3/5 |
4 |
|
19 |
14 |
5 |
5 |
5/5 |
|
20 |
14 |
3 |
2 |
5/2 |
|
21 |
12 |
2 |
3/5 |
4 |
|
22 |
12 |
4 |
3/5 |
7 |
|
23 |
16 |
4 |
3/5 |
4 |
|
24 |
12 |
4 |
3/5 |
1 |
|
25 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
26 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
27 |
12 |
4 |
0/5 |
4 |
|
28 |
10 |
3 |
2 |
5/5 |
|
29 |
10 |
3 |
5 |
5/2 |
|
30 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
|
31 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
سپس توسط نرم‌افزار، به‌طوری که در جدول 2 دیده می‌شود، 31 ماتریس از مقادیر مختلف هریک از این چهار فاکتور در کنار هم طراحی شد. این آزمایش‌ها شامل 16 آزمایش فاکتوریل در سطوح 1- و 1+ عامل‌ها، 13 آزمایش تکرار در سطوح مرکزی (0) و 2 آزمایش در نقاط محوری بود.
گرانوله‌کردن: برای گرانوله‌کردن محیط کشت حاوی لیزین، pH آن کاهش داده و بر روی هات پلیت با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده شد. با کمک همزن مکانیکی محیط کشت حاوی لیزین همزده شد و در این حین نشاسته، نمک کلرید سدیم (به‌عنوان پرکننده) و سولفات آمونیوم (افزایندۀ نسبی pH) در بازه‌های زمانی مشخص به آن اضافه شد (2 و 13).
نتایج.
.بررسی فاکتورهای مؤثر بر تولید لیزین در کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀ ATCC15032: با تغییر شرایط محیطی از جمله شرایط تغذیه‌ای می‌توان تولید لیزین را افزایش داد، از جملۀ این شرایط می‌توان به تغییر منابع کربنی، نیتروژنی و افزودنی‌های محیط کشت اشاره کرد. در این پژوهش اثر منابع کربنی مختلف (همچون نشاسته، لاکتوز، ساکارز و گلوکز)، منابع نیتروژنی متفاوت (همچون اوره، کلرید آمونیوم و سولفات آمونیوم) و همچنین افزودنی‌های مختلف (همچون بیوتین و متیونین) بر تولید لیزین توسط کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀ ATCC15032 بررسی شد. نتایج مشخص کرد از بین مواد به‌کاررفته، گلوکز به‌عنوان منبع کربنی، سولفات آمونیوم به‌عنوان منبع نیتروژنی و متیونین به‌عنوان افزودنی در محیط کشت پایه M9 بیشترین تأثیر را بر تولید لیزین داشتند (نتایج نشان داده نشده است). بنابراین گلوکز، سولفات آمونیوم و متیونین جهت بررسی بیشتر انتخاب شدند. همان‌طور که در جدول 3 نشان داده شده است، با بررسی تأثیر عوامل ذکرشده بر تولید لیزین، نتایج نشان داد که در محیط M9 میزان تولید لیزین 0007/0 گرم بر لیتر است. با افزودن گلوکز، سولفات آمونیوم و متیونین، میزان تولید به‌ترتیب به مقدار 4/2، 8/2 و 5/6 برابر افزایش یافته است. درنهایت میزان تولید لیزین در محیط M9، متیونین 3درصد (وزنی/حجمی)، سولفات آمونیوم 3درصد (وزنی/حجمی) و گلوکز 3درصد (وزنی/حجمی) بررسی شد. نتایج نشان داد (جدول 3) که در این محیط کشت میزان تولید لیزین نسبت به محیط M9 تا 200 برابر افزایش یافته است.
بهینهسازی تولید لیزین با روش رویه پاسخ: با توجه به نتایج حاصل در این پژوهش بر تولید لیزین، جهت بهینهسازی تولید لیزین چهار متغییر غلظت گلوکز، آمونیوم سولفات، متیونین و همچنین زمان گرماگذاری انتخاب شد. سپس با استفاده از روش رویه پاسخ، 31 محیط کشت با شرایط مختلف پیشنهاد شد (جدول 3). گفتنی است که محدوده‌های (سطوح) مورداستفاده برای هر کدام از عوامل بررسی‌شده به‌طوری بود که در این محدوده‌ها این عوامل باعث افزایش و سپس باعث کاهش میزان تولید لیزین می‌شدند (نتایج نشان داده نشده است). براساس شرایط پیشنهادشده توسط نرم‌افزار، محیط‌های کشت مختلف تهیه شد و بعد از تلقیح باکتری در آنها، در زمان‌های مختلف پیشنهادی (توسط نرم‌افزار) گرماگذاری شد. سپس مقدار لیزین تولیدی اندازه‌گیری شد. گفتنی است که آزمایش‌ها تا 4 بار تکرار شدند. از مقایسۀ نتایج تجربی و محاسبه شده مشخص شد R2منحنی حاصل، 94/0 است (شکل2 و جدول4).
جدول 3- میزان لیزین تولیدی در محیط کشت M9 و محیط کشت‌های M9 تغییریافته
|
نام محیط کشت |
مقدار لیزین تولیدی خالص (گرم بر لیتر) |
مقایسۀ میزان تولید نسبت به محیط M9 (برابر) |
|
M9 |
0007/0 |
1 |
|
M9 + گلوکز 3درصد |
0017/0 |
4/2 |
|
M9 + آمونیوم سولفات 3درصد |
002/0 |
8/2 |
|
M9 + متیونین 3درصد |
0046/0 |
5/6 |
|
M9 + متیونین 3درصد+ سولفات آمونیوم 3درصد+ گلوکز 3درصد |
14/0 |
200 |
شکل 2- مقایسۀ نتایج تجربی لیزین تولیدی با نتایج تخمین‌زده‌شده لیزین تولیدی توسط مدل پیشنهادیRSM
جدول 4- شرایط آزمایش‌های پیشنهادشده توسط CCD جهت بهینهسازی و مدل‌سازی فرآیند
|
شماره آزمایش |
گلوکز (درصد وزنی به حجمی) |
آمونیوم سولفات (درصد وزنی به حجمی) |
متیونین (میلی‌مولار) |
زمان (روز) |
مقدار لیزین تولید شده به‌لحاظ تجربی (درصد وزنی به حجمی) |
مقدار لیزین تولیدشده تخمین‌زده‌شده توسط مدل (درصد وزنی به حجمی) |
|
1 |
10 |
5 |
2 |
5/2 |
0017/0 ± 0351/0 |
0289/0 |
|
2 |
14 |
3 |
5 |
5/5 |
0022/0 ± 05940/0 |
0594/0 |
|
3 |
10 |
5 |
5 |
5/5 |
0031/0± 0837/0 |
0774/0 |
|
4 |
10 |
5 |
5 |
2.5 |
0030/0± 0804/0 |
0758/0 |
|
5 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0022/0 ± 0588/0 |
0541/0 |
|
6 |
10 |
3 |
2 |
5/2 |
0007/0 ± 0194/0 |
0154/0 |
|
7 |
14 |
5 |
5 |
5/2 |
0034/0 ± 0985/0 |
0915/0 |
|
8 |
14 |
5 |
2 |
5/5 |
0017/0 ± 0496/0 |
0480/0 |
|
9 |
10 |
3 |
5 |
5/5 |
0020/0 ± 0587/0 |
0546/0 |
|
10 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0020/0 ± 0562/0 |
0541/0 |
|
11 |
12 |
4 |
6/5 |
4 |
0025/0 ± 0713/0 |
0822/0 |
|
12 |
10 |
5 |
2 |
5/5 |
0015/0 ± 0356/0 |
0378/0 |
|
13 |
14 |
3 |
5 |
5/2 |
0022/0 ± 0650/0 |
0593/0 |
|
14 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0020/0 ± 0521/0 |
0541/0 |
|
15 |
12 |
6 |
3/5 |
4 |
0022/0 ± 0671/0 |
0733/0 |
|
16 |
14 |
3 |
2 |
5/5 |
0014/0 ± 0331/0 |
0342/0 |
|
17 |
14 |
5 |
2 |
5/2 |
0016/0 ± 0445/0 |
0451/0 |
|
18 |
8 |
4 |
3/5 |
4 |
0008/0 ± 0214/0 |
0298/0 |
|
19 |
14 |
5 |
5 |
5/5 |
0029/0 ± 0865/0 |
0870/0 |
|
20 |
14 |
3 |
2 |
5/2 |
0008/0 ± 0267/0 |
0268/0 |
|
21 |
12 |
2 |
3/5 |
4 |
0009/0 ± 0289/0 |
0321/0 |
|
22 |
12 |
4 |
3/5 |
7 |
0023/0 ± 0712/0 |
0699/0 |
|
23 |
16 |
4 |
3/5 |
4 |
0018/0 ± 0500/0 |
0509/0 |
|
24 |
12 |
4 |
3/5 |
1 |
0017/0 ± 0501/0 |
0609/0 |
|
25 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0017/0 ± 0500/0 |
0541/0 |
|
26 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0020/0 ± 0524/0 |
0541/0 |
|
27 |
12 |
4 |
0/5 |
4 |
0004/0 ± 0117/0 |
0101/0 |
|
28 |
10 |
3 |
2 |
5/5 |
0008/0 ± 0280/0 |
0288/0 |
|
29 |
10 |
3 |
5 |
5/2 |
0019/0 ± 0531/0 |
0485/0 |
|
30 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0021/0 ± 0531/0 |
0541/0 |
|
31 |
12 |
4 |
3/5 |
4 |
0016/0 ± 0500/0 |
0541/0 |
در روش رویه پاسخ از تحلیل پارتو جهت تعیین عوامل مؤثر استفاده می‌شود (14) در این روش تأثیر هر عامل ازطریق محاسبۀ درصد تأثیر هر جمله در پاسخ پیش‌بینی‌شده، توسط رابطۀ زیر به دست می‌آید (15 و 16). معادله 1:
در این رابطه Pi درصد تأثیر هر جمله و bi معرف ضریب هر جمله است. همچنین در این معادله i نمی‌تواند صفر باشد (i≠0). نتایج حاصل از تحلیل پارتو در شکل 3 ارائه شده است. براساس نتایج حاصل، غلظت متیونین مهم‌ترین عامل مؤثر در فرآیند است (%23/71 =P1). پس از آن درصد گلوکز، مقدار سولفات آمونیوم و زمان گرماگذاری به‌ترتیب بیشترین تأثیر را دارند. گفتنی است براساس آنالیز واریانس انجام‌گرفته و همچنین آنالیز پارتو(شکل 3) جمله به توان یک زمان، تأثیری در فرآیند ندارد؛ اما با توجه به نتایج جدول 5 که حاصل از آنالیز واریانس و محاسبه‌شده توسط نرم‌افزار مینی‌تب است هرچند مقدار P-Value مربوط به زمان بزرگ‌تر از 05/0 است که مؤید عدم تأثیر معنادار زمان است. با این حال همان‌طور که در جدول 5 نشان داده شده است، جمله به توان دو زمان (D2) و همچنینن برهم‌کنش زمان با غلظت متیونین (CD) معنی‌دار است. مقادیرP-Value جمله‌های ذکرشده به‌ترتیب برابر 0013/0 و 0138/0 است که کمتر از 05/0 هستند؛ بنابراین جملۀ عامل زمان باید در مدل حفظ شود تا تأثیر جمله‌های توان دو زمان (D2) و برهم‌کنش زمان با غلظت متیونین (CD) در نظر گرفته شود. در غیر این صورت کلیۀ فاکتورهای مربوط به زمان بایستی از مدل حذف می‌شدند.
شکل 3-نتایج حاصل از تحلیل پارتو
جدول 5- ضرایب محاسبه شده برای مدل توصیف‌کنندۀ فرآیند تولید لیزین
|
جمله مدل |
ضریب محاسبه‌شده |
P-value |
|
b0 |
054/0 |
0013/0 |
|
A- گلوکز |
271/5E-003 |
<0001/0 |
|
B- سولفات آمونیوم |
010/0 |
<0001/0 |
|
C- متیونین |
018/0 |
1140/0 |
|
D- زمان |
257/2E-003 |
476/0 |
|
AB |
206/1E-003 |
9318/0 |
|
AC |
-1/437E-004 |
3758/0 |
|
AD |
-506/1E-003 |
0529/0 |
|
BC |
456/3E-003 |
5037/0 |
|
BD |
-131/1E-003 |
2844/0 |
|
CD |
-831/1E-003 |
0138/0 |
|
A^2 |
-419/3E-003 |
7847/0 |
|
B^2 |
-436/3E-004 |
1310/0 |
|
C^2 |
-969/1E-003 |
0362/0 |
|
D^2 |
828/2E-003 |
0013/0 |
.تأثیر متقابل عامل‌های مورد بررسی بر تولید لیزین: ازطریق نمودار‌های سه‌بعدی و کانتور حاصل از تجزیه و تحلیل نرم‌افزار می‌توان تأثیر هم‌زمان دو عامل را بر تولید لیزین بررسی کرد.
شکل ۴ رابطۀ بین تولید لیزین با افزایش میزان گلوکز و آمونیوم سولفات را نشان می‌دهد. همان‌طور که در شکل 4 دیده می‌شود در بررسی تأثیر متقابل گلوکز و سولفات آمونیوم، غلظت متیونین و زمان گرماگذاری تایت در نظر گرفته شده‌اند. با افزودن گلوکز به محیط تولید لیزین تا یک حد خاص (غلظت 12درصد) افزایش تولید لیزین مشاهده می‌شود؛ اما بعد از آن غلظت، افزایش گلوکز باعث کاهش تولید لیزین می‌شود. آمونیوم سولفات نیز تا غلظت 5درصد باعث افزایش تولید لیزین می‌شود.
|
سولفات آمونیوم (%) |
|
گلوکز (%) |
|
لیزین (%) |
|
لیزین (%) |
|
گلوکز (%) |
|
(الف) |
|
(ب) |
شکل4- اثر هم‌زمان گلوکز و سولفات آمونیوم بر تولید لیزین در غلظت 5/3 میلی‌مولار متیونین طی 4 روز گرماگذاری. (الف) تأثیر متقابل گلوکز و سولفات آمونیوم بر تولید لیزین (ب) نمودار کانتور تولید لیزین در غلظت‌های مختلف از گلوکز و سولفات آمونیوم
با توجه به شکل 5 که نشان‌دهندۀ رابطۀ تأثیر افزایش مقدار متیونین و گلوکز در تولید لیزین است، مشخص شد که با افزایش مقدار متیونین تا غلظت 5 میلی‌مولار مقدار تولید لیزین نیز افزایش می‌یابد؛ از طرف دیگر همان‌طور که قبلاً نیز اشاره شد، گلوکز نیز تا غلظت 14درصد باعث افزایش و سپس باعث کاهش تولید می‌شود. در این بررسی غلظت آمونیوم سولفات و زمان گرماگذاری ثابت فرض شد.
|
متیونین (میلی‌مولار) |
|
گلوکز (%) |
|
لیزین (%) |
|
لیزین (%) |
|
گلوکز (%) |
|
(الف) |
|
(ب) |
|
الف) |
|
|
|
ب) |
|
|
شکل 5- تأثیر هم‌زمان غلظت‌های مختلف از گلوکز و متیونین بر تولید لیزین در غلظت 4درصد از سولفات آمونیوم و طی 4 روز گرماگذاری. (الف) ارتباط بین تولید لیزین با مقدار گلوکز و متیونین. (ب) نمودار کانتور رابطۀ تولید لیزین با مقدار گلوکز و متیونین.
همان گونه که در شکل 6 (تأثیر متقابل مقدار گلوکز و زمان گرماگذاری در غلظت ثابت متیونین و آمونیوم سولفات) دیده می‌شود، افزایش زمان گرماگذاری نیز تولید لیزین را افزایش می‌دهد (جز بخش 0-4 روز که با کاهش روبه‌رو است و آن نیز می‌تواند به‌علت خطای آزمایش باشد) درواقع زمان تأثیر مثبتی در تولید لیزین دارد. افزایش زمان به‌همراه افزایش مقدارگلوکز باعث افزایش تولید لیزین می‌شود.
|
زمان (روز) |
|
گلوکز (%) |
|
لیزین (%) |
|
(الف) |
|
(ب) |
|
لیزین (%) |
|
گلوکز (%) |
شکل6- تأثیر متقابل غلظت‌های مختلف گلوکز و زمان‌های متفاوت بر تولید لیزین در غلظت 4درصد از سولفات آمونیوم و غلظت 5/3 میلی‌مولار از متیونین. ( الف) ارتباط تولید لیزین با مقدار گلوکز و متیونین. (ب) نمودار کانتور رابطۀ تولید لیزین با مقدار گلوکز و زمان گرماگذاری.
درنهایت نتایج نشان داد که با مقایسۀ نتایج حاصله از تولید لیزین در محیط کشت M9 در مدت یک هفته (7/0 میلی‌گرم درلیتر) (جدول 1) با محیط کشت شماره 7 (جدول 4) یعنی محیط کشت M9 حاوی 14درصد گلوکز، 5درصد آمونیوم سولفات و متیونین 5 میلی‌مولار (تولید 98/0 گرم در لیتر لیزین در مدت 5/2 روز) دیده می‌شود که تولید لیزین تقریباً 1400 برابر افزایش یافته است.
گرانوله‌کردن: با توجه به اهمیت محیط حاوی لیزین در صنعت غذای دام و طیور محیط کشت حاوی لیزین گرانوله شد. همان‌طور که در شکل 7 نشان داده شده است، گرانول‌های حاوی لیزین تهیه شدند. این گرانوال‌ها به‌دلیل دارابودن عصارۀ باکتری علاوه بر آمینواسید دارای پروتئین و ویتامین نیز هستند.
شکل 7-گرانول‌های لیزین
بحث و نتیجهگیری.
افزایش تولید آمینواسید لیزین هم با تغییرات مهندسی ژنتیک و یا با مهندسی محیط می‌تواند از دید میکروبیولوژی صنعتی مهم باشد. با این حال با توجه به کم‌هزینه‌بودن و کم‌خطربودن مهندسی محیط نسبت به مهندسی ژنتیک (به‌لحاظ ایمنی زیستی) امروزه استفاده از آن بیشتر مورد توجه واقع شده است.
در این پژوهش با تغییر میزان گلوکز (منبع کربنی)، آمونیوم سولفات (منبع نیتروژنی)، مقدار متیونین (افزودنی) و زمان گرماگذاری، افزایش 1400 برابری نسبت به محیط کشت پایه M9 حاصل شد. با توجه به میزان R2بالا (94/0) می‌توان گفت نتایج تجربی و تخمین‌زده‌شده در این پژوهش هم‌خوانی بالایی دارد و بنابراین مدل پیشنهادی در این پژوهش قابل‌اعتماد است. نتایج حاصل از تحلیل پارتو نشان داد که در افزایش میزان تولید لیزین، متیونین بیشترین اهمیت را دارد و سپس گلوکز، مقدار آمونیوم سولفات و زمان گرماگذاری اهمیت دارند. متیونین به‌عنوان یک افزودنی، تأثیر زیادی در تولید لیزین دارد. دلیل این امر تأثیر متیونین در مهار عمکرد اپرون سازندۀ آنزیم‌های دخیل در ساخت آمینواسیدهایی است که از یک پیش‌ساز مشترک با لیزین ساخته می‌شوند (17). از جملۀ این آمینواسیدها ترئونین و ایزولوسین است که در حضور متیونین میزان تولید آنها از 7 به 2 میلی‌مولار کاهش می‌یابد و درنتیجه پیش‌ساز مشترک آنها توسط آنزیم‌های تولیدکنندۀ لیزین بیشتر مصرف می‌شود و لیزین بیشتری تولید می‌گردد (17). بنابراین می‌توان گفت در باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀ ATCC15032 مسیر تولید ترئونین و ایزولوسین از پیش‌ساز مشترک با لیزین بیشتر است به‌طوری که با مهار این مسیر توسط متیونین، تولید لیزین در مقایسه با سایر عوامل موردبررسی به‌میزان زیادی افزایش می‌یابد. در ردۀ دوم اهمیت جهت افزایش تولید لیزین گلوکز قرار دارد. نتایج این پژوهش نشان داد مقدار 14درصد گلوکز، بیشترین تأثیر را در افزایش تولید لیزین دارد و غلظت‌های بالاتر از آن باعث کاهش تولید لیزین می‌شود. برای تولید لیزین در دسترس‌بودن سوبسترا به‌عنوان یک فاکتور مهم نقش بسزایی دارد. این امر نه تنها برای تولید لیزین بلکه برای توانایی زیستن و رشد باکتری نیز مهم است. گلوکز یکی از انواع منابع کربنی قابل‌استفاده توسط کورینهباکتریومگلوتامیکوم و در عین حال بهترین آنهاست (18). طبق مطالعات انجام‌شده در سال 1985، مشخص شد که افزایش غلظت گلوکز از یک حد مشخص، رشد باکتری را در سطح پایینی محدود می‌کند (18). درواقع علت این امر تأثیر مقدار سوبسترای اضافی بر کاهش تولید محصول است؛ زیرا با افزایش گلوکز مقدار رشد باکتری تا حدی که شرایط ایجاب می‌کند افزایش می‌یابد (18). بعد از رسیدن باکتری به مرحلۀ ایستایی از رشد خود، از یک طرف تولید آمینواسید و خروج آنها از باکتری افزایش می‌یابد و از طرف دیگر باکتری با کمبود فاکتور مهمی مانند آمینواسیدها روبه‌رو می‌شود. درنتیجه رشد باکتری در زمانی که غلظت لیزین به حداکثر می‌رسد شروع به کاهش‌یافتن می‌کند؛ پس از مدتی کاهش رشد باکتری باعث کاهش تولید لیزین می‌شود (19). از این رو در این پژوهش تا غلطت 14درصد از گلوکز افزایش تولید و پس از آن کاهش تولید کاهش مشاهده شد. نتایج این پژوهش نشان داد که آمونیوم سولفات به‌لحاظ اهمیت در تأثیر بر تولید لیزین، نسبت به متغییرهای دیگر در ردۀ سوم قرار می‌گیرد. حضور منبع نیتروژنی مانند آمونیوم سولفات یکی از عوامل مؤثر در افزایش تولید لیزین است. لیزین در باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم برخلاف سایر باکتری از دو مسیر سوکسینیلاز و دهیدروژناز ساخته می‌شود. دسترسی باکتری به آمونیوم، تعیین‌کنندۀ مسیر نهایی تولید لیزین از پیش‌ساز پپریدین 6،2 دی‌کربوکسیلات به دی‌آمینوپیمیلات است. درواقع حضور آمونیوم باعث استفاده باکتری از آنزیم دی‌آمینوپیمیلات دهیدروژناز می‌شود. تمایل این آنزیم به آمونیوم بالا است (با Km بالای 35 میلی‌مولار) و باعث می‌شود در حضور مقدار بالای آمونیوم، 50درصد از مسیر سنتز لیزین را به عهده بگیرد (20). برعکس در حضور نیتروژن‌های آلی مانند اوره و گلوتامیک‌اسید این فرآیند به سمت آنزیم خانواده سوکسینیلاز سوق پیدا می‌کند (20). با این حال افزایش بیش‌ازحد یون آمونیوم با ایجاد تغییر در فشار اسمزی از رشد باکتری و تولید لیزین جلوگیری می‌کند (21). افزایش زمان تا یک حد معقول باعث افزایش تولید لیزین می‌شود؛ اما پس از گذشت مدت‌زمان طولانی باکتری با کمبود مواد غذایی روبه‌رو می‌شود و تولید لیزین کاهش می‌یابد (9). در این پژوهش در محیط کشت شماره 7 (جدول4) که دارای گلوکز 14درصد، آمونیوم سولفات 5درصد و متیونین 5 میلی‌مولار است و به‌مدت 5/2 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شده است، مقدار لیزین تولیدی نسبت به محیط کشت پایه M9 (0007/0 گرم بر لیتر) تا 1400برابر (98/0 گرم بر لیتر) افزایش داشت. در یک پژوهش نلوفر[x] و همکاران با استفاده از گلوکز (14درصد)، با کمک عصارۀ ماهی، برخی نمک‌ها و بیوتین به‌عنوان افزاینده، در طی سه روز میزان تولید لیزین را 6/2 برابر افزایش دادند (9). در پژوهشی دیگر در باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀ ATCC 13032 با تغییرات ژنتیکی محدود به یک یا دو ژن تولید تا 70 برابر (از 1 میلی‌مولار به 70 میلی‌مولار) افزایش یافت (22). امروزه با افزایش تغییرات در بیش از ده‌ها ژن تولید را تا تقریباً یک مول بر لیتر رسانده‌اند (افزایش تولید تا 1000 برابر) (23). در سال 2008 با استفاده از گونۀ جهش‌یافتۀ کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀAeC-2 در محیط کشت حاوی گلوکز، آمونیوم سولفات و تغییر برخی از فاکورهای فیزیکی مثل دما و pH و در دو مرحله استفاده از روش رویه پاسخ و با 84/0=R2مقدار تولید لیزین تا 6/2 برابر افزایش داده شد (10). در این پژوهش بعد از انتخاب 4 متغییر از بین چندین متغییر مؤثر در تولید لیزین و طی یک مرحلۀ رویه پاسخ با 94/0=R2، میزان تولید لیزین تا حدود 1400 برابر افزایش یافت؛ بنابراین با توجه به افزایش چشمگیر در میزان افزایش لیزین و همچنین صحت بالای مدل پیشنهادی توسط روش رویه پاسخ می‌توان گفت که با به‌کاربردن روش حاضر می‌توان تا مقدار قابل‌توجهی میزان تولید لیزین را در کورینهباکتریومگلوتامیکوم بدون نیاز به دستکاری ژنتیکی و در یک محیط کشت قابل‌دسترس بهبود بخشید. در این پژوهش با تغییر تنها چهار فاکتور که از ویژگی‌های بارز آنها دردسترس‌بودن است مقدار تولید لیزین طی 60 ساعت به‌طرز چشمگیری افزایش یافت.
ازآنجاکه لیزین آمینواسید صنعتی است، گرانوله‌کردن آن اهمیت ویژه‌ای دارد؛ به همین منظور سعی شده تا با مواد ارزان و دردسترس گرانوله‌کردن محیط کشت حاوی لیزین صورت گیرد. گرانوله‌کردن آن هم ازطریق جداکردن و تخلیص لیزین از محیط کشت و هم به محیط کشت (به‌همراه باکتری) صورت می‌گیرد. با توجه به هزینه‌بَربودن تخلیص لیزین و همچنین غنای بالای گرانول‌ها (به‌لحاظ غذایی) در حضور باکتری (2) در این پژوهش سعی شد روشی آسان جهت گرانوله‌کردن محیط کشت حاوی لیزین ارائه شود.
درنهایت می‌توان گفت با توجه به میزان R2بالای (94/0) منحنی ارتباط بین نتایج تجربی و نتایج تخمین‌زده‌شده، مدل پیشنهادی در این پژوهش از صحت بالایی برخوردار بوده و از بین عوامل موردبررسی، متیونین بیشترین تأثیر را در افزایش تولید لیزین داشته است. همچنین نتایج نشان داد محیط کشت M9 حاوی 14درصد گلوکز، 5درصد آمونیوم سولفات و متیونین 5 میلی‌مولار باعث افزایش چشمگیر تولید لیزین در باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم سویۀ ATCC15032 (تا 1400 برابر بیشتر از محیط M9) شد که این میزان افزایش با روش‌های تغییر گسترده ژنتیکی در باکتری کورینهباکتریومگلوتامیکوم برابری می‌کند. با این حال با توجه به اینکه سویۀ باکتری مورداستفاده در این پژوهش سویۀ صنعتی نیست، می‌توان جهت افزایش تولید تا حد موردقبول در صنعت (200 گرم در لیتر) از سویۀ صنعتی و با به‌کاربردن محیط کشت و روش پیشنهادی در این پژوهش استفاده کرد.
تشکر و قدردانی:
نویسندگان مقاله از حمایت‌های مالی معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه شهید مدنی آذربایجان کمال تشکر و قدردانی را دارند.
)