نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران
3 استادیار میکروبیولوژی، بخش زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Biodegradation of hydrocarbons in the saline environment is diminished due to the reduced solubility of hydrocarbons and oxygen and lower microbial diversity because of inhibitory effect of salt.
Materials and methods: In this research, fungi isolation was carried out from salty oil contaminated soil from different parts of Iran. Then, the ability of crude oil degradation was measured for each isolate in the presence of 50 g/l NaCl by total petroleum hydrocarbon (TPH) assay. The salt tolerance and crude oil degradation capacity of the selected isolate was evaluated in medium containing different salt concentration by analysis of TPH, FTIR and dried cell weight assay. Finally, the selected isolate was studied for biosurfactant production and identified using morphological and molecular approach.
Results: In this study, 15 different halotolerant fungal species were isolated. TPH assay in medium containing crude oil (1%) and salt (50 g/l) showed that the isolate S-05 with 60 % oil removal was the best strain. FTIR analysis revealed that 90% of aliphatic compounds were removed when treated with S-05. Biosurfactant production assay indicated that this strain can produce surface active compounds in presence and absence of salt. Molecular identification confirmed that the S-05 belongs to Mucor circinelloides with 100% similarity.
Discussion and conclusion: Our results indicate that M. circinelloides UTMC 5032 is potent fungus for bioremediation in saline oil contaminated soils.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
فراوردههای نفتی از پرمصرفترین مواد شیمیایی در دنیای مدرن امروز محسوب میشوند. محصولات مشتق از نفت خام، منبع اصلی انرژی مورداستفاده در صنعت و زندگی روزمرۀ بشر هستند (1). روزانه مقادیر زیادی نفت و فراوردههای نفتی، در حجم زیاد و از راههای مختلف به محیطزیست وارد میشود که آثار منفی و طولانیمدتی را بر منابع طبیعی و زندگی موجودات زنده به دنبال دارد (2). این آلودگیها تهدید بزرگی برای حیات موجودات زنده و همچنین سلامت انسانها است. وجود این آلایندهها تعادل اکولوژیکی را بر هم میزند که این عدمِتعادل ممکن است تا سالها در محیط باقی بماند (3). در این میان توجه به این نکته بسیار ضروری است که منشأ بسیاری از مخازن نفتی، محیطهایی با شوری بالا است. به عبارت دیگر، نفت خام بهطور معمول با آب شور همراه است و معمولاً در مجاورت با محیطهای آبی با شوری بالا و تبخیر زیاد یافت میشود. با توجه به فعالیتهای صنعت نفت مانند حفاری، انتقال و پالایش نفت در اینگونه مناطق، همواره احتمال آلودگی مناطق شور با آلایندههای نفتی اجتنابناپذیر است (4). علاوه بر این، پساب خروجی بسیاری از تأسیسات نفتی دارای درصد بالایی نمک محلول است و همچنین آب خروجی از چاهها معمولاً بیش از 10درصد و گاه در حد اشباع دارای نمک است که پس از جداسازی نفت از آن، میزان قابلتوجهی ترکیبات آروماتیک در آن به جا میماند. رهاسازی این پساب در محیط علاوه بر آلودگی هیدروکربنی، سبب افزایش شوری محیط میشود (5). بنابراین لازم است قبل از رهاسازی این پساب در محیط، بازیافت و تصفیهسازی انجام گیرد. تصفیۀ اینگونه پسابها با روشهای متداول بسیار دشوار و گاه غیرممکن بوده و نیازمند توسعۀ روشهای پاکسازی با قابلیت کاربرد در محیطهای شور است (5 و 6). یکی از روشهای اصلی در جهت حذف آلودگیهای نفتی استفاده از توان میکروارگانیسمهای زنده یا دراصطلاح پاکسازی زیستی[1] است (7). روش پاکسازی زیستیکه بهطور معمول شامل تبدیل آلایندهها به مواد غیرسمی با استفاده از فعالیت میکروارگانیسمها است، فرایند بسیار امیدوارکنندهای برای تیمار آلودگیهای نفتی به شمار میرود (7 و 8)؛ اما در این راستا، در پاکسازی زیستی محیطهای آلوده به نفت مناطق شور بسیاری از انواع میکروارگانیسمها توانایی تحمل تنش شوری و سمیت نفت را ندارند و پاکسازی زیستی بهکندی صورت میگیرد. درواقع با توجه به کاهش حلالیت هیدروکربنها و اکسیژن در آب شور و کاهش تنوع میکروبی بهسبب آثار بازدارندۀ نمک، ترکیبات هیدروکربنی در محیطهای شور، ماندگاری بالایی دارد و پاکسازی اینگونه مکانهای آلوده با روشهای زیستی متداول مقدور نیست و نیازمند استفاده از میکروارگانیسمهای با توان تحملکنندگی نمک است. این امر سبب شده که زیستپالایی آلایندههای نفتی در محیطهای شور بهسختی انجام گیرد که تاکنون کمتر به آن پرداخته شده است (9 و 10). علاوه بر این، تاکنون محدودۀ پژوهشهای انجامشده در این زمینه بر باکتریها تمرکز داشته؛ حال آنکه پاکسازی زیستی این محیطها با استفاده از قارچها بهعلت وجود توانمندیهای خاص موجود در این میکروارگانیسمها و نیز برتری آنها در برخی موارد نسبت به باکتریها در پژوهشهای مختلف تا حدودی نادیده گرفته شده است؛ در این راستا، میتوان به قارچها اشاره کرد که در برخی از شرایط محیطی سخت مثل فشار اسمزی بالا و یا خشکی و یا pH پایین نسبت به باکتریها مقاومت و فعالیت بیشتری دارند؛ علاوه بر این، گزارشهای متعددی دربارۀ برخی از قارچها منتشر شده است که نشان میدهد که این قارچها، میکروارگانیسمهای توانمندی در تجزیۀ ترکیبات هیدروکربنی هستند که علت این توانمندی بالا ترشح آنزیمهای خارج سلولی از قبیل لاکاز، لیگنین پراکسیداز و منگنز پراکسیداز است (11). بنابراین هدف از انجام این پژوهش در گام نخست غربالگری جدایههای قارچی توانمند در تحمل نمک از مناطق شور آلوده به آلایندههای نفتی و دستیابی به جدایۀ قارچی بومی توانمند در تولید ترکیبات فعال زیستی و حذف ترکیبات نفتی است که برای این منظور بعد از جداسازی و غربالگری جدایههای قارچی، با استفاده از روشهای استاندارد تولید ترکیبات سورفکتانتی و حذف آلایندههای نفتی در حضور نمک برای بهترین ایزولۀ قارچی بررسی شد.
مواد و روشها.
سنجش میزان حذف نفت: جهت تعیین توانمندی جدایههای حاصله در حذف نفت خام در حضور50 گرمبرلیتر نمک، هریک از جدایهها با استفاده از روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی براساس روش رحمان[8] و همکاران از طریق اسپکتروفتومتری در طول موج 420 نانومتر ارزیابی شد و جدایۀ برگزیده حاصل از این مرحله برای ادامۀ آزمایشها استفاده شد. برای این منظور، به ارلنها همحجم با محیط کشت، حلال تلوئن به منظور استخراج هیدروکربنهای نفتی از محیط کشت و ورود به فاز آلی اضافه شد. برای جداسازی و تفکیک بهتر فاز آبی از آلی، مخلوط فوق برای مدت 5 دقیقه با استفاده از ورتکس بهخوبی همزده و بهمدت 15 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفوژ شود. در مرحلۀ بعدی فاز آلی حاوی هیدروکربنهای نفتی جدا شد و میزان جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 420 نانومتر تعیین گشت. نهایتاً برای تعیین میزان حذف نفت، جذب نمونههای تیمار با نمونۀ کنترل مقایسه شد و میزان حذف گزارش گردید (16 و 17).
.تعیین بازده میزان تحملپذیری نمک و میزان حذف: جدایۀ برتر ازنظر میزان تحملپذیری نمک در غلظتهای متفاوت نمکی شامل صفر، 25، 50، 75، 100، 150 و 200 گرمبرلیتر نمک طعام در محیط کشت PDB در طی مدت یک هفته ارزیابی شد؛ در این راستا، اندازهگیری وزن خشک زیستتوده بهعنوان معیار تحملپذیری نمک و رشد جدایههای قارچی استفاده شد. زیستتودۀ قارچی حاصله، از محیط با استفاده از کاغذ فیلتر واتمن شماره 1 جدا شد و بهمدت یک شبانهروز در دمای 105 درجه سانتیگراد خشک گردید. سپس وزن خشک بهدستآمده براساس گرمدرلیتر گزارش شد (18). با توجه به بهینۀ شرایط رشد قارچ منتخب در حضور نمک، جدایۀ قارچی در غلظتهای متفاوت نمک همراه با 1درصد نفت خام در محیط پایۀ نمکی کشت شد و میزان حذف نفت و بیومس تولیدی سنجش شد.
.ارزیابی تولید بیوسورفاکتانت در حضور نمک: بهمنظور تشخیص تولید بیوسورفاکتانت و اثر آن در حذف نفت، در حضور 25 گرمبرلیتر نمک و بدون نمک، جدایۀ منتخب در محیط پایۀ نمکی دارای روغن آفتابگردان با غلظت 5درصد کشت داده شد و محلول رویی کشت قارچی در طی مدت 12 روز با استفاده از روشهای گسترش روغن و تنسیومتری حلقه دونوی[9] ارزیابی شد. این روش براساس اندازهگیری نیروی لازم برای جداکردن یک حلقۀ سیمی از سطح یا بین دو سطح است که این نیروی جداسازی متناسب با کشش بین سطحی است و میتوان آن را با یک تنسیومتر اتوماتیک اندازهگیری کرد. در هربار اندازهگیری کشش سطحی آب مقطر و محیط کشت فاقد تلقیح نیز بهعنوان شاهد سنجیده شد (5).
شناسایی جدایۀ قارچی: برای شناسایی جدایههای قارچی، ویژگیهای ریختشناسی آنها از قبیل شکل میسلیوم، آرایش اسپورها، آرایش و رنگ کلنی و پیگمانهای تولیدی، ازطریق رنگآمیزی با لاکتوفنل کاتن بلو و تهیۀ اسلاید کالچر و نیز با توجه به کلیدهای شناسایی ریختشناسی بررسی شد (19). بهمنظور شناسایی مولکولی ابتدا جدایۀ منتخب در محیط PDB بهمدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سپس میسلیومهای قارچ با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا و بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته شد. در ادامه ازطریق شکستن فیزیکی با کمک روش کوبیدن زیستتوده منجمد شد و با استفاده از ازت مایع، سلولها شکسته شد و DNA آن بهروش استخراج با فنل-کلروفرم جداسازی شد (20). در این روش ابتدا عصارۀ سلولی بهدستآمده در میکروفیوژ با دور rpm 8000 بهمدت 5 دقیقه قرار داده شد. سپس روشناور جداشده که حاوی مولکولهای DNA است، به یک ویال استریل منتقل شد. در این مرحله همحجم روشناور، از مخلوط فنل-کلروفرم (به نسبت 1:1) به ویال افزوده شد. سپس ویال بهمدت دو دقیقه تکان داده شد تا محتویات آن با هم مخلوط شود. در ادامه ویال در میکروفیوژ با دور rpm 13000 بهمدت 5 دقیقه قرار داده شد و پس از این مدتزمان بهآرامی ویال از درون دستگاه خارج شد تا فازها با هم مخلوط نشوند و فاز رویی درون یک ویال استریل دیگر ریخته شد. در ادامه حجم تقریبی محتوای ویال تعیین شد و بهمیزان 1/0 آن محلول سدیماستات 3 مولار با pH برابر 5 و 3 برابر حجم تعیین شد و اتانول مطلق سرد افزوده شد. سپس ویال بهمدت 30 دقیقه به فریزر با دمای 20- درجه سانتیگراد منتقل شد. در ادامه فاز رویی با دور rpm 13000 بهمدت 5 دقیقه جدا و دور ریخته شد و 700 میکرولیتر اتانول 70درصد به رسوب DNA افزوده شد و مجدداً با دور rpm 13000 بهمدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد و فاز رویی موجود در ویال دور ریخته شد. درنهایت رسوب حاصل در 15 تا 20 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد. PCR توالی ناحیۀ فاصلهانداز رونویسیشوندۀ داخلی[10] با پرایمرهای ITS1 و ITS4 (ITS1: 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′ و ITS4: 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) انجام شد. جهت اضافهکردن مواد بهمنظور انجام واکنش PCR، 1 میکرولیتر پرایمر رفت و 1 میکرولیتر پرایمر برگشت با غلظت 10 پیکومول بههمراه 1 میکرولیتر از DNA قارچی با غلظت 40 نانوگرم به 5/12 میکرولیتر مخلوط آمادۀ شرکت آمپلیکون دانمارک[11] اضافه شد و حجم نهایی ویال با آب مقطر استریل به 25 میکرولیتر رسانیده شد. برنامۀ PCR به شکل 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد تقلیب اولیه انجام شد و در ادامه 30 سیکل دمایی به شکل 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در 54 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام شد. درنهایت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد ویال گرمادهی شدند (جدول 1 و 2). محصول بهدستآمده بعد از خالصسازی از روی ژل جهت تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. نتایج تعیین ترادف در بانک ژنی و ازطریق همردیفی توالی ارزیابی شد (20).
نتایج.
جمعآوری نمونه و جداسازی قارچهای تجزیهکنندۀ نفت: در این مطالعه از 4 منطقۀ آلوده به نفت نمونهبرداری انجام و میزان شوری و pH نمونهها اندازهگیری شد. pH تمام نمونهها خنثی و براساس نتایج هدایتسنجی الکتریکی، بیشترین شوری بهترتیب مربوط به نمونههای خاک پوند پالایشگاه تهران و مارون بود و منطقۀ سیری و قم شوری متوسطی داشتند (جدول ۳). در ادامه با کشت نمونههای موردنظر با استفاده از دو تکنیک غنیسازی و گسترده در حضور نمک، 15 جدایۀ قارچی مختلف با ویژگیهای ریختشناسی متفاوت جداسازی شد.
جدول 1- برنامۀ دمایی PCR برای تکثیر ژن ITS
|
تکرار |
زمان (دقیقه) |
دما (درجه سانتیگراد) |
مراحل واکنش |
|
1 |
5 |
94 |
واسرشتشدن اولیه |
|
30 |
5/0 |
94 |
واسرشتشدن |
|
30 |
5/0 |
57 |
اتصال پرایمر |
|
30 |
1 |
72 |
پلیمریزاسیون |
|
1 |
5 |
72 |
پلیمریزاسیون نهایی |
جدول 2- مواد استفادهشده در واکنش زنجیره پلیمراز
|
حجم (میکرولیتر) |
اجزای واکنش PCR |
|
متغیر وابسته به DNA استخراجی |
آب مقطر استریل |
|
1 |
پرایمر رفت[12] |
|
1 |
پرایمر برگشت[13] |
|
متغیر |
DNA استخراجشده |
|
5/12 |
Master mix |
|
25 |
حجم کل |
جدول 3- محل نمونهبرداری و ویژگیهای هریک از نمونههای آلوده به نفت جمعآوریشده
|
محل نمونهبرداری |
موقعیت (ثانیه-دقیقه-درجه) |
علت آلودگی |
EC (ds/m) |
pH |
|
قم |
5/43 44 34 N: 6/43 53 50 E: |
چشمۀ طبیعی نفت |
9/7 |
62/7 |
|
سیری |
51 54 25 :N 38 31 54 : E |
پایانۀ اصلی صادرات نفت کشور |
8/5 |
3/7 |
|
پوند 3 پالایشگاه تهران |
12.7 31 35 : N 56.6 24 51 : E |
حوضچۀ تبخیر پسابهای پالایشگاه نفت |
6/9 |
51/7 |
|
مارون |
13 51 30 : N 19 50 49 : E |
میدان نفتی در اهواز |
10 |
9/7 |
سنجش میزان حذف نفت و رشد در جدایهها: پس از خالصسازی، توانایی هریک از جدایهها در حذف نفت و تولید زیستتوده در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت خام و 50گرمبرلیتر نمک طی مدت 15روز بررسی شد (شکل 1).
در این میان جدایۀ S-05 جداسازیشده از خاک آلوده به نفت منطقۀ مارون با بیش از 55درصد حذف نفت خام در غلظت 50 گرمبرلیتر نمک بهعنوان توانمندترین جدایه در حذف نفت خام انتخاب شد (شکل 2).
شکل 1- توانایی حذف نفت خام جدایۀ S-05 در محیط کشت پایۀ نمکی در مقایسه با نمونۀ شاهد
شکل 2- درصد حذف نفت خام توسط جدایههای قارچی در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت همراه با غلظت 50 گرمبرلیتر نمک بعد از 15 روز
در ادامه، بررسی میزان تحملپذیری نمک در این سویه در حضور غلظتهای متفاوت نمک شامل صفر، 25، 50، 75، 100، 150 و 200 گرمبرلیتر در محیط کشت PDB سنجش شد. نتایج گویای آن بود که با افزایش غلظت نمک میزان رشد قارچی نیز کاهش مییابد؛ با این حال، قارچ موردنظر تا غلظت 75 گرمبرلیتر نمک کلرید سدیم رشد مناسبی را نشان داده و تا غلظت 150 گرمبرلیتر همچنان قادر به تولید زیستتوده و تحمل نمک است (شکل 3).
شناسایی سویۀ منتخب: نتیجۀ انجام آزمایشهای ریختشناسی و نیز مولکولی لازم برای شناسایی جدایۀ S-05 از PCR و تعیین ترادف ژن ITS و مقایسۀ توالی بهدستآمده در بانک ژنی نشان داد که جدایۀ S-05 با میزان شباهت 99درصد متعلق به Mucor circinelloidesاست. این جدایه در بانک ژنی با کد دستیابیKR263057 ثبت شد و با کد M. circinelloides UTMC 5032در کلکسیون میکروارگانیسمهای دانشگاه تهران ثبت و نگهداری شد. تصویر ماکروسکوپی و میکروسکوپی جدایه S-05 در شکل 4 مشاهده می شود (شکل4). رسم درخت فیلوژنی این جدایه نشان داد که این سویه بیشترین نزدیکی را به f. circinelloides M. circinelloidesدارد (شکل 5).
شکل 3- میزان تحملپذیری نمک وتولید بیومس خشک در غلظتهای مختلف نمک توسط جدایۀ S-05
|
ب) |
|
الف) |
شکل4- الف) مورفولوژی کلنی، ب) شمای میکروسکوپی M. circinelloides UTMC 5032
شکل 5- درخت فیلوژنی 5032 UTMC Mucor circinelloides با استفاده از پرایمرهای ITS، با الگوریتم اتصال- همسایگی برای همردیفی و تعیین فاصلۀ توالیها و نیز نرمافزارهای مگا 5 نشان میدهد
.بررسی میزان حذف نفت در حضور غلظتهای مختلف نمک: میزان حذف نفت خام توسط سویۀ منتخب در حضور غلظتهای متفاوت نمک 0، 25،50، 75 و 100 گرمبرلیتر همراه با 1درصد نفت خام سنجش شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که سویۀ M. circinelloides UTMC 5032در حضور نمک همچنان قادر به حذف ترکیبات نفتی است؛ ولی با افزایش میزان نمک قدرت تجزیهکنندگی نفت توسط این سویه کاهش مییابد (شکل6)؛ با این حال، همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، میزان حذف نفت و تولید زیستتوده در غلظت 25 گرمبرلیتر نمک نسبت به محیط بدون نمک تغییر معنیداری نشان نداده و این میزان نمک اثر بازدارندگی بر جدایۀ موردنظر نداشته و بهمیزان حدود 90درصد حذف ترکیبات نفتی در حضور 25 گرمبرلیتر نمک توسط این جدایه انجام شده است. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نمک به غلظت 50 گرمبرلیتر 55درصد حذف و در غلظتهای 75 و 100 گرمبرلیتر بهترتیب تنها 15 و 18درصد حذف نفت حاصل میشود (شکل 6).
شکل 6- درصد حذف نفت خام در M. circinelloides UTMC 5032در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت همراه با غلظتهای مختلف 0، 25، 50، 75 و 100 گرم بر لیتر نمک کلرید سدیم
طیفسنجی FTIR: در ادامه جهت بررسی و تخمین دقیقتری از حذف ترکیبات آلیفاتیک توسط سویۀ M. circinelloidesUTMC5032، در محیط پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت خام در حضور 25 گرمبرلیتر نمک و بدون نمک مورد آنالیز باقیماندۀ نفت خام با روش FTIR قرار گرفت. بررسی طیف بهدستآمده از این روش نشان داد که پیک ایجادشده بین طول موجهای cm-1 2960-2930 که مربوط به ترکیبات آلیفاتیک است در نمونههای کشتدادهشده با سویۀ قارچی در حضور و عدمِحضور نمک کاهش قابلتوجهی را نشان میدهد که نشان از حذف این ترکیبات آلیفاتیکی توسط سویۀ قارچی دارد. نتایج حاصل از این سنجش و مقایسۀ آن با نمونۀ شاهد و تیمارنشده نشان داد که این ایزوله قادر به تجزیه و کاهش 90درصدی ترکیبات آلیفاتیک در حضور و نیز بدون حضور نمک بوده و این میزان نمک تغییر محسوسی در حذف ترکیبات آلیفاتیک نفتی ایجاد نکرده است (شکل 7).
شکل 7- طیفسنجی FTIR – مقایسۀ میزان کاهش ترکیبات آلیفاتیک توسط M. circinelloides UTMC 5032در حضور 1درصد نفت خام و 25 گرمبرلیتر نمک و بدون حضور نمک
سنجش تولید بیوسورفاکتانت در حضور نمک: ارزیابیهای انجامشده با استفاده از روش گسترش روغن نشان داد که سویۀ منتخب توانایی تولید ترکیبات فعال در سطح را دارد؛ بهطوری که پس از تلقیح در محیط کشت نمکی حاوی روغن بهعنوان تنها منبع کربن، سویۀ ذکرشده با تولید بیوسورفکتانت از روغن موجود در محیط استفاده کرده و بهمیزان قابلملاحظهای رشد میکند. با افزودن یک قطره از سوپرناتانت کشت قارچی در آزمون گسترش روغن، هالۀ شفاف بهقطر 12 سانتیمتر در محیط بدون نمک و 6 سانتیمتر در حضور 25 گرمبرلیتر نمک بعد از گذشت 6 روز از تلقیح ایجاد شد (شکل 8).
شکل 8- قطر هالۀ شفاف تولیدی در روش گسترش روغن در طی روزهای مختلف در محیط بدون نمک کلرید سدیم و دارای 25 گرمبرلیتر نمک
اندازهگیری کشش سطحی سوپرناتانت کشت قارچی در روزهای مختلف با استفاده از روش تنسیومتری نیز نشان داد که میزان کشش سطحی محیط کشت از mN/m 45 به عدد mN/m 28 در محیط بدون نمک و mN/m 33 در محیط حاوی نمک کاهشیافته و سویهای توانمند در تولید ترکیبات فعال سطحی طی تجزیۀ ترکیبات نفتی است (شکل 9).
شکل9- میزان کشش سطحی در طی روزهای مختلف در محیط بدون نمک و دارای 25 گرمبرلیتر نمک
بحث و نتیجهگیری.
آلودگی محیطهای شور به انواع ترکیبات آلایندۀ نفتی مشکلات زیستمحیطی متعددی را برای انسان و سایر موجودات اکوسیستمها ایجاد کرده و توسعه روشهای پاکسازی زیستی با قابلیت کاربرد در شرایط شور از دیدگاه کاربردی بسیار مهم است؛ با وجود این، اطلاعات درخصوص تجزیۀ هیدروکربنها در محیطهای شور بسیار کم است (21). یک پاکسازی زیستی موفق نیازمند به جمعیت توانمندی از میکروارگانیسمها در محل آلوده است که قادر باشند از ترکیبات نفتی بهعنوان منبع کربن و انرژی استفاده کنند و با تحمل شرایط تنشزای محیطی و تولید ترکیباتی مانند مواد فعال زیستی موجبات حذف آلاینده را از محیط زیست فراهم کنند (22). روشهای پاکسازی زیستی در محیطهای شور بسیار پیچیدهتر و با کارآمدی کمتری نسبت به محیطهای بدون این تنش انجام میگیرد. نمک بهدلیل ایجاد حالت پلاسمولیز، بر متابولیسم میکروارگانیسمها تأثیر میگذارد و کارآمدی حذف آلودگی را کاهش می دهد و پاکسازی را بسیار زمانبر میکند (17)؛ بنابراین برای پاکسازی این مناطق استفاده از میکروارگانیسمهای نمکدوست و یا تحملکنندۀ نمک یک ضرورت است.
در میان پژوهشهای انجامشده بر میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی، اطلاعات موجود درخصوص تجزیۀ هیدروکربنها توسط قارچها بهعنوان یک عامل بسیار مؤثر و توانمند در حذف ترکیبات نفتی و تحملکنندۀ شرایط تنشزای محیطی بسیار کم است و نیازمند بررسیهای بیشتر درزمینۀ یافتن و بررسی سازوکارهای حذف در این گروه از میکروارگانیسمها است (23 و 24). در این پژوهش بهمنظور بررسی تجزیۀ هیدروکربنهای نفتی در شرایط شور، در گام اول از خاکهای مناطق شور آلوده به نفت ایران بهمنظور جداسازی قارچهای تجزیهکننده نمونهگیری و غنیسازی انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که سمیت آلایندههای نفتی و نیز شرایط شوری محیط از رشد جدایههای قارچی جلوگیری نمیکنند و آنها میتوانند از ترکیبات نفتی موجود در محیط بهعنوان منبع کربن و مواد غذایی برای رشد و تولید زیستتوده استفاده کنند. آزمایشات حاکی از آن بود که با افزایش غلظت نمک توانایی جدایههای قارچی در حذف نفت کاهش مییابد. این موضوع با نتایج سایر پژوهشگران همراستا است (21 و 25) که در ارتباط با کاهش تنوع و فعالیت متابولیکی جدایههای تخریبکننده در محیطهای با شوری بالا هستند.
از میان 15 جدایۀ خالصسازیشده در این مطالعه سویۀ M. circinelloides UTMC 5032با توانایی حذف بیش از 55درصد نفت خام در محیط با شوری 50 گرمبرلیتر و توانایی رشد و تولید زیستتوده تا غلظت 150 گرمبرلیتر نمک بهعنوان سویۀ منتخب تحملکنندۀ نفت و نمک انتخاب شد (شکل 2 و ۴)؛ درحالیکه بررسی توانمندی سایر جدایههای قارچی در حذف نفت در غلظت 50 میلیگرمبرلیتر نمک نشان داد که این جدایهها توانمندی کمتری نسبت به M. circinelloides UTMC 5032دارند و میزان حذف آنها بین 2 تا 40 درصد گزارش شده است. ابکوی[xiv] و همکاران در مطالعه بر قارچهای جداسازیشده از محیط دارای استرس شوری، دو قارچ Fusarium lateritiumو Drechslera sp. را بهعنوان قارچهای تحملکننده 10درصد نمک NaCl و توانمند در حذف ترکیبات نفتی معرفی کردند (26). در مطالعۀ دیگری نیز که بهنود[xv] و همکاران بر تخریب زیستی نفت خام از پسابهای شور با استفاده از قارچ Phanerochaete chrysosporium انجام دادند، نشان داده شد که با افزایش غلظت نمک از 0 تا 40 گرمبرلیتر میزان حذف نفت از 50درصد به 20درصد کاهش مییابد (17). بررسیهای FTIR باقیماندۀ هیدروکربنهای نفتی توسط سویۀ M. circinelloides UTMC 5032نشان داد که بیش از 90درصد ترکیبات آلیفاتیک بعد از گذشت 12روز در محیط بدون نمک و نیز 25 گرمبرلیتر نمک توسط این سویه تجزیه شدهاند و وجود این میزان نمک بر حذف نفت تأثیر بسزایی نداشته است (شکل 7).
پژوهشهای زیادی در رابطه با توانایی میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی و ارتباط آن با تولید بیوسورفاکتانت انجام شده است؛ با این حال، پژوهشهای اندکی بر آثار مهارکنندگی نمک بر رشد و تولید بیوسورفاکتانت و نیز ارتباط میان غلظت نمک و میزان آثار بازدارندگی حذف نفت در قارچها انجام پذیرفته است. نتایج بهدستآمده از تولید بیوسورفکتانت توسط M. circinelloides UTMC 5032در محیط با نمک و بدون نمک در مقایسه با نمونۀ شاهد نیز نشان داد که جدایۀ معرفیشده مولد ترکیبات فعال سطحی است و بهمیزان قابلتوجهی قادر به کاهش کشش سطحی محیط کشت است. این موضوع را میتوان به یکی از دلایل حذف نفت بالا توسط این جدایه نسبت داد (شکل 8 و 9). نتایج بهدستآمده در این پژوهش نشان داد که مقدار تولید بیوسورفکتانت در طی 6 روز اول رو به افزایش است و بیشترین میزان تولید در روز ششم است؛ درحالیکه بعد از این مدت مقدار بیوسورفکتانت موجود کاهش یافته است که علت این نتیجه را میتوان به این صورت تفسیر نمود که احتمالاً یا میزان پایداری بیوسورفکتانت در محیط پایین است و بعد از تولید بهدلیل ناپایداری در محیط فعالیت خود را از دست میدهد و یا اینکه بهدلیل فقر مواد غذایی در روزهای پایانی، سویۀ قارچی از این ترکیب بهعنوان منبع کربن و انرژی خود برای رشد استفاده میکند و با این کار موجب کاهش مقدار بیوسورفکتانت محیط میشود. همچنین نتایج نشان داد که وجود نمک در محیط موجب کاهش تولید بیوسورفکتانت در محیط میشود که علت احتمالی آن را میتوان تأثیر منفی نمک بر رشد سلول قارچی و عملکرد بیوسورفکتانت دانست.
مطالعات نشان داده است که آنزیمهای تولیدشده از M. cirninelloidesقادر به افزایش تجزیۀ هیدروکربنهای روغنهای دیزل است (27)؛ همچنین مطالعات نشان از توانمندی اینگونه قارچ در تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی داشته است (28)؛ همچنین بررسیها نشان داده است که اینگونه قارچی توانمند در تولید گاما-لینولنیک اسید است (29). براساس نتایج بهدستآمده در این پژوهش برای اولین بار Mucor cirninelloides UTMC 5032 با ویژگی نفتخواری در عدمِحضور و غلظت 25 گرمبرلیتر نمک با درصد حذف بیش از 90 ترکیبات آلیفاتیک و حدود 55درصد حذف نفت در غلظت 50 گرمبرلیتر نمک از خاکهای بومی ایران جداسازی و خالصسازی شده است با توجه به توانایی این سویه در تولید بیوسورفاکتانت و کاهش کشش سطحی محیط کشت بهمیزان mN/m 6/17 واحد در محیط بدون نمک و mN/m 94/8 واحد در محیط نمکی نسبت به نمونۀ شاهد و گزارشنکردن آن بهعنوان عامل زیستی حذفکننده ترکیبات نفتی در محیطهای با این میزان شوری، این جدایه میتواند بهعنوان گزینۀ ارزشمند و مناسبی در جهت پاکسازی زمینهای شور آلوده به نفت در کشور معرفی شود.
[1]- Bioremediation
[2]- Enrichment technique
[3]- Spread plate technique
[4]- MSM
[5]- Potato dextrose agar(PDA)
[6]- Sabouraud dextrose agar (SDA)
[7]- Ultrasonic
[8]- Rahman
[9]- Du Nouyring method
[10]- Internal Transcribed Spacer (ITS)
[11]- Ampliqon master mix, Denmark
[12]- Forward primer
[13]- Reverse primer
[xiv]- Obuekwe
[xv]- Behnood
)