نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم دارویی، تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران
3 استاد تمام میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم دارویی، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Different Bacillus subtilis products of secondary metabolits include iturin lipopeptids, that may control plant disease effectively. The aim of this study was to investigate the antifungal activity of Indigenous strains Bacillus subtilis against plant pathogenic fungi Pythium ultimum and Fusarium solani.
Materials and methods: Seven soil samples were collected and B. subtilis were isolated from each soil sample. The isolates were screened by antifungal activity. Best strains were identified by 16srDNA sequence. The culture conditions were optimized for the best production of antifungal metabolites. The bacterial metabolites were then obtained from 4 days grown isolates, purified and were confirmed iturin existence by chromatography method. The iturin A (Sigma) was used as standards.
Results: Totaly, 91 strains were isolated from soil samples, 23 spp were confirmed as B. subtilis by morphological and biochemical features. In subsequent experiments, two strains 48 and 83 showed the greatest activity against the Pythium ultimum and Fusarium solani respectively. 16srDNA sequence analyses for selected isolates confirmed 100% similarity to B. subtilis. Then nutrient broth with carbon and nitrogen sources glucose, yeast extract, neutral pH and 30⁰c incubation temperature were optimized for best production. The HPLC results showed the best productivity of iturin A for two isolates B. subtilis by comparing peaks and retention times between iturin A (Sigma) and native strains.
Discussion and conclusion: Iranian native strains also have the ability to produce antifungal metabolites. Therefore, this strain can be a good candidate for biological control of plant pathogenic fungi and an alternative for chemical fungicides.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
بیماری‌های گیاهی ایجادشده توسط عوامل بیماری‌زای موجود در خاک، از مشکلات عمده در تولید محصولات کشاورزی به شمار می‌آیند (1). قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم[1] و فوزاریوم‌سولانی[2] از جمله شایع‌ترین قارچ‌های مؤثر در ایجاد بیماری در گیاهان هستند. قارچ پیتیوم‌اولتیموم از معمول‌ترین قارچ‌های جداسازی‌شده در استرالیا، برزیل، چین، کره و بسیاری از مناطق جهان، عامل مرگ گیاهچه و بیماری‌های ریشه‌ای در گیاهانی ازجمله کلم، هویج، خیار، خربزه و گندم است. بیماری مرگ گیاهچه با پوسیدگی طوقه و ریشۀ گیاهچه همراه است به‌طوری‌که قسمت پوسیده‌شده تحمل وزن اندام هوایی گیاهچه را نخواهد داشت و درنتیجه گیاهچه به زمین می‌افتد و می‌پوسد (2). قارچ فوزاریوم‌سولانی از قارچ‌های جداسازی‌شده در آرژانتین و سایر مناطق جهان عامل بیماری‌های پوسیدگی و خشکیدگی گیاهان است که در بسیاری از محصولات زراعی از جمله لوبیا، خیار و سیب زمینی شیرین ازطریق پژمردگی به‌میزان درخورِتوجهی سبب ازبین‌رفتن محصول می‌شود. سویه‌های فوزاریوم‌سولانی به‌قدری فراوانی‌شان در خاک و مواد گیاهی فاسد زیاد است که تجزیه‌کننده نیز محسوب می‌شوند (3). قارچ‌کش‌های شیمیایی برای مدت طولانی به‌عنوان عوامل قدرتمند جهت کاهش بروز بیماری‌های قارچی استفاده می‌شدند؛ اما به‌دلایل پرهزینه‌بودن، ایجاد آلودگی در محیط زیست و مقاومت عوامل بیماری‌زا نسبت به آنها، استفاده از مواد شیمیایی کاهش یافته است. کنترل زیستی با استفاده از میکروارگانیسم‌ها از بروز بیماری‌های گیاهی جلوگیری می‌کند و جایگزین مناسبی برای روش‌های شیمیایی به حساب می‌آید (4). از میان باکتری‌های مؤثر در کنترل زیستی اعضای جنس باسیلوس[3] به‌دلیل داشتن مزایایی از قبیل تشکیل اندوسپور و مقاومت در شرایط دشوار نسبت به سایر عوامل کنترل زیستی مهم هستند (5). جنس باسیلوس شامل باکتری‌های میله‌ای شکل، گرم مثبت، هوازی و اکثراً ساپروفیت بوده که می‌توانند متابولیت‌های ثانویه با طیف وسیعی از فعالیت‌های آنتی‌بیوتیکی علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی تولید کنند (6 و7). تولید طیف وسیعی از آنتی‌بیوتیک‌های ضدقارچی از جمله خانواده‌های لیپوپپتیدی ایتورین[4]، سورفاکتین[5] و فنجیسین[6] توسط سویه‌های کنترل زیستی باسیلوس‌سوبتیلیس[7] می‌تواند نقش کلیدی در سرکوب بیماری‌های گیاهی ایفا کند زیرا این آنتی‌بیوتیک‌ها دارای مزایایی نسبت به دیگر آفت‌کش‌ها از جمله سمیت کم، تجزیه زیستی بالا و خصوصیات مساعد و سازگار با محیط زیست هستند و به‌خوبی می‌توانند از رشد و تکثیر قارچ‌ها و برخی باکتری‌های بیماری‌زا ممانعت کنند (8 و 9 و 10). مهم‌ترین عضو خانواده ایتورین، ایتورینA شامل 7 αآمینواسید متصل به βآمینوفتی‌اسید است که فعالیت سمیت قارچی قوی علیه عوامل بیماری‌زای مختلف دارد (11). این آنتی‌بیوتیک با مولکول استرول غشای سلولی قارچ‌های بیماری‌زا واکنش و نفوذپذیری غشا سلول را تغییر داده و و از هدایت یونی جلوگیری می‌کند و درنهایت سبب مرگ سلول هدف می‌شود (12). ازاین‌رو در این پژوهش به بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌های بومی باسیلوس‌سوبتیلیس در ایران علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی پیتیوم‌اولتیموم ATCC20692 و فوزاریوم‌سولانی ATCC1460 و انتخاب بهترین سویۀ مولد آنتی‌بیوتیک انجام شده است. همچنین شرایط تولید آنتی‌بیوتیک برای سویه‌های منتخب از نظر منبع کربن، منبع نیتروژن، اسیدیته و دما بهینه‌سازی شد.
مواد و روشها.
جداسازی و شناساییباسیلوس‌سوبتیلیس: سویه‌های باسیلوس استفاده‌شده در این پژوهش از 7 نمونه خاک پارک‌های جنگلی تهران (چیتگر، طالقانی، شیان، سرخه حصار، پردیسان، مناطق جنگلی بوستان نهج‌البلاغه، مناطق جنگلی بوستان گفتگو) جداسازی شدند، به این طریق که به‌فاصلۀ 1 متر از ریشه و از عمق 3 تا 10سانتی‌متری خاک تحت شرایط استریل نمونه‌برداری انجام گرفت (13) و سپس نمونه‌ها سریعاً در دمای 4 درجه سانتیگراد جهت آزمایش به آزمایشگاه منتقل شدند. در ابتدا نمونه‌های موردنظر طی روش غنی‌سازی حرارتی به‌مدت 10 دقیقه در 80 درجه سانتیگراد جهت حفظ اسپورها و حذف سلول‌های رویشی تیمار شدند (14). سپس از روش تهیۀ رقت استفاده شد به این صورت که طی روش پورپلیت[8] رقت‌های متوالی از نمونه‌ها در آب‌مقطر استریل تهیه شد و از رقت 1/0 رقت‌های متوالی تا 10/10 از هر نمونه خاک تهیه شد و میزان 1 میلی‌لیتر از هر یک از این رقت‌ها در داخل پلیت استریل ریخته شد و سپس محیط کشت نوترینت آگار[9](شامل 5 گرم بر لیتر پپتون، 3 گرم بر لیتر عصارۀ گوشت و 15 گرم بر لیتر آگار) اتوکلاو شد و در شرایط استریل روی آنها ریخته شد و محیط‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند (15). سپس از کلنی‌های مشابه باسیلوس‌سوبتیلیس براساس خصوصیات مرفولوژیکی (رنگ، شکل ظاهری کلنی و قوام) طی کشت 4 منطقه‌ای در محیط نوترینت آگار کشت خالص تهیه شد و به‌منظور جداسازی انحصاری سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس، بررسی‌های میکروسکوپی (رنگ‌آمیزی گرم و مالاشیت‌گرین) و بررسی‌های بیوشیمیایی شامل تست‌های کاتالاز، استفاده از سیترات، هیدرولیز لستین، حرکت، احیای نیترات و تخمیر قندهای گلوکز، آرابینوز، مانیتول و گزیلوز انجام شد.
سویه‌های قارچی: سویه‌های قارچی پیتیوم‌اولتیموم ATCC20692 و فوزاریوم‌سولانی ATCC1460که از بانک میکروبی سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران تهیه شدند، به‌ترتیب در محیط‌های کشت کورن میل آگار[10] (شامل 2 گرم بر لیتر کورن میل و 15 گرم بر لیتر آگار) و سابروز دکستروز آگار[11] (شامل 5 گرم بر لیتر پپتون کازئین، 5 گرم بر لیتر پپتون گوشت، 40 گرم بر لیتر دی-گلوکز و 15 گرم بر لیتر آگار) که پس از تهیه، در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتیگراد به‌مدت 15 دقیقه استریل شده بودند،کشت داده شدند و سپس در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند.
.بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌های بومی باسیلوس‌سوبتیلیس: جهت بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس به‌دست‌آمده از نمونه‌های خاک علیه قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی از روش چاهک‌گذاری استفاده شد. در این روش از کشت 72ساعته هر قارچ، به‌طور جداگانه، مطابق با شاهد نیم‌مک‌فارلند (CFU/ml 108× 5/1) در محیط سابروز دکستروز براث[12]، سوسپانسیون تهیه شد، به این صورت که در ابتدا برای شاهد، یک استاندارد نیم‌مک‌فارلند تهیه شد به این منظور 5/0 میلی‌لیتر کلرور باریم را به 5/99 میلی‌لیتر اسیدسولفوریک اضافه کرد و جذب نوری این محلول برابر با 1 خوانده شد. سپس مقداری از کلنی رشدکرده روی پلیت 72ساعته قارچی در 3 تا 5 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل شد و کدورت آن را با نیم‌مک‌فارلند تنظیم شد (مطابق با استاندارد نیم‌مک‌فارلند سوسپانسیون میکروبی تهیه‌شده با این روش باید کدورتی معادل CFU/ml 108× 5/1کلنی داشته باشد) (16). سپس هر سوسپانسیون قارچی به یک پلیت منتقل و به‌کمک سواپ استریل کشت متراکم داده شد. سپس 50 میکرولیتر از سوسپانسیون 24ساعته جدایه‌های باکتریایی تهیه شده در محیط نوترینت براث[13] معادل شاهد نیم‌مک‌فارلند، به‌طور جداگانه در داخل هر چاهک ریخته شد. پلیت‌ها در انکوباتور با دمای 25-26 درجه سانتیگراد به‌مدت 72 ساعت گرماگذاری شدند (17). برای هر آزمایش 3 بار تکرار در نظر گرفته شد. به‌عنوان شاهد عدمِرشد 50 میکرولیتر محیط نوترینت براث استریل در یک چاهک ریخته شد. درنهایت قطر هاله‌های عدمِرشد قارچ در اطراف چاهک‌ها و نیز میانگین قطر هاله‌ها با استفاده از خط‌کش آنتی‌بیوگرام اندازه‌گیری شد. آنالیز آماری داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه[14] انجام شد که به‌منظور بررسی وجود اختلاف معنادار در میانگین مقادیر گروه‌های مورد آزمایش است.
.شناسایی مولکولی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس با بیشترین میزان فعالیت ضدقارچی: شناسایی تکمیلی سویه‌های منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن 16srRNA انجام شد. به این منظور ابتدا باکتری‌ها روی محیط نوترینت آگار کشت چمنی داده شدند و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. سپس با استفاده از کیت استخراج DNA(شرکت سیناژن، ایران) DNA ژنومی استخراج شد و با استفاده از آغازگرهای
27F: 5- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 و
1492R: 5- GGTTACCTTGTTACGACTT_3، برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد (18). واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 5/2 میکرولیتر بافر (x10)، 5/3 میلی‌مول MgCl2، 200 میکرو مول dNTPs، 25/1 واحد آنزیم از Taq DNA Polymerase، 4/0 میکرومول از هر آغازگر، 1 میکرولیتر از نمونه DNA و 1 میکرولیتر آب‌مقطر دی‌یونیزه انجام شد. واکنش PCR با شرایط دمایی واسرشت‌شدن ابتدایی در دمای 95 درجه سانتیگراد به‌مدت 5 دقیقه و در ادامه 30 چرخه شامل واسرشت در دمای 95 درجه سانتیگراد به‌مدت 5/0 دقیقه، اتصال در دمای 56 درجه سانتیگراد به‌مدت 30 ثانیه، طویل‌شدن در دمای 72 درجه سانتیگراد به‌مدت 90 ثانیه و طویل‌شدن نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به‌مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR با استفاده از الکتروفورز در ژل آگاروز 8/0درصد بررسی شد. محصول PCRجهت تعیین توالی به مرکز ملی ذخایر ژنتیکی ایران فرستاده شد. جهت تأیید شناسایی باکتری‌ها، توالی‌های حاصله با استفاده از نرم‌افزار بلاست[15] با توالی نوکلئوتیدی موجود در بانک اطلاعات ژنی، تطبیق داده شد.
.بهینه‌سازی پارامترهای محیطی جهت تعیین بهترین فعالیت ضدقارچی سویه‌های منتخب: پس از سنجش فعالیت ضدقارچی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس، در این مرحله، تأثیر عوامل و پارامترهای محیطی و اکولوژیکی بر میزان فعالیت ضدقارچی سویه‌های برگزیده بررسی شد. در همۀ مراحل فوق، به‌عنوان شاهد در یک چاهک 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بدون تغییر شرایط محیط کشت استفاده شد و برای هر آزمایش 3 تکرار در نظر گرفته شد. داده‌های جمع‌آوری‌شده در این مرحله با استفاده از آزمون دامنۀ چندگانه دانکن[16] تحلیل شدند که یک شیوۀ متداول برای مقایسۀ تمام جفت‌های میانگین‌هاست.
الف- منبع کربن: به‌منظور بررسی تأثیر منبع کربن از سه قند گلوکز (منوساکارید)، لاکتوز (دی‌ساکارید) و نشاسته (پلی‌ساکارید) استفاده شد که جایگزین عصارۀ گوشت (منبع کربن در محیط نوترینت براث) شدند. پس از کشت سویه‌های منتخب در این محیط‌ها، در دمای 30 درجه سانتیگراد به‌مدت 24 ساعت گرماگذاری شدند. پس از آن با استفاده از روش چاهک‌گذاری و اندازه‌گیری قطر هالۀ عدمِرشد ایجادشده با استفاده از خط‌کش آنتی‌بیوگرام و آزمون آنالیزی دامنۀ دانکن تأثیر این مواد در روند میزان تولید متابولیت ضدقارچی ایتورین بررسی شد.
ب- منبع نیتروژن: در این مرحله تأثیر منابع نیتروژن مختلف شامل ازت آلی (عصارۀ مخمر) و ازت معدنی (نیترات‌آمونیوم) ارزیابی شد. این مواد جایگزین پپتون شدند که به‌عنوان منبع اصلی نیتروژن در محیط نوترینت براث تلقی می‌شود. سوسپانسیون باکتری‌ها طبق روش ذکرشده در بند الف تهیه و پس از گرماگذاری، فعالیت ضدقارچی آنها بررسی شد. سپس بهترین منبع نیتروژن با توجه به میانگین قطر هالۀ عدمِرشد قارچ تعیین شد.
ج- اسیدیته: با استفاده از اسیدکلریدریک و هیدروکسیدسدیم محیط‌های کشت نوترینت براث حاوی مناسب‌ترین منابع کربن و نیتروژن با pH اسیدی و قلیایی تهیه شد. پس از کشت و گرماگذاری سوسپانسیون جدایه‌های منتخب در دمای 30 درجه سانتیگراد طبق روش ذکرشده در مراحل قبلی، فعالیت ضدقارچی آنها بررسی و با هم مقایسه شد.
د-دما: محیط کشت نوترینت براث حاوی مناسب‌ترین منابع کربن و نیتروژن و همچنین مناسب‌ترین میزان اسیدیته (طبق نتایج حاصله، pH 7) ساخته شد و پس از تهیه و کشت سوسپانسیون جدایه‌های منتخب، محیط‌ها در 3 دمای 25، 30 و 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. پس از مدت‌زمان 24 ساعت، میزان فعالیت ضدقارچی بررسی شد (19 و 20).
.تخلیص متابولیت‌های ضدقارچی از سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس: باکتری‌های منتخب در داخل ارلن‌مایرهای 1 لیتری حاوی 250 میلی‌لیتر محیط کشت بهینه، کشت و به‌منظور تولید متابولیت ثانویه به‌مدت 4 روز در انکوباتور شیکردار (شرکت ژال تجهیز[17] مدل gtsl90) با دمای 30 درجه سانتیگراد و دور گردشی معادل 100 دور در دقیقه (rpm/min 100( گرماگذاری شدند. سپس محیط‌ها در دستگاه سانتریفیوژ یخچال‌دار ( شرکت هتیک[18]) با دور g× 8000 به‌مدت 25 دقیقه در دمای 5 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. مایع رویی فاقد سلول‌های باکتری با اسیدکلریدریک به pH معادل 2 رسانده شد و رسوب شکل‌گرفته مجدداً با دور g× 12000 به‌مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. رسوب ایجادشده در 2 تا 3 میلی لیتر متانول حل و در دمای 4 درجه سانتیگراد و دور گردش
g× 20000 برای مدت‌زمان 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و درنهایت مایع رویی حاصله حاوی متابولیت‌های ضدقارچی به‌صورت عصارۀ متانولی برداشته و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (5).
.آنالیز متابولیت‌های ضدقارچی با استفاده از HPLC: میزان lµ 20 از عصاره‌های متانولی سویه‌های منتخب به‌دست‌آمده از مرحلۀ قبل به دستگاه کروماتوگرافی با شرایط زیر تزریق شد: ستون 18 C- به‌عنوان فاز ثابت (mm4 ×mm250 ) و مخلوط استونیتریل و آب با نسبت 30:70 به‌عنوان فاز متحرک، سرعت 1 میلی‌لیتر در دقیقه و مدت‌زمان 20 دقیقه، طول موج دستگاه نیز روی 240 نانومتر تنظیم شد. پس از تزریق نمونه به دستگاه با شرایط ذکرشده نتیجه به‌صورت پیک‌هایی در منحنی کروماتوگرام حاصله بر روی دستگاه مانیتور متصل به دستگاه کروماتوگرافی ظاهر و زمان ظهور[19] و محدوده زیر هر پیک نیز جداگانه ثبت شد. در این بررسی از متابولیت ضدقارچی ایتورین A که به‌صورت خالص از شرکت سیگما خریداری شد به‌عنوان شاهد استفاده گردید. به این منظور محلول 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر آن در حلال متانول، تهیه و lµ 20 از آن به‌عنوان شاهد، قبل از نمونه‌های مجهول به دستگاه تزریق شد (5).
نتایج.
.جداسازی و شناسایی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس: در مرحلۀ جداسازی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس از نمونه‌های خاک براساس خصوصیات مرفولوژیک،91 کلنی سفیدرنگ، مایل به کرم، دوکی- گرد با قوام کره‌ای، سطحی خشن، حاشیه‌ای مضرس و بویی نامطبوع جداسازی و از آنها کشت 4منطقه‌ای تهیه شد و طی بررسی‌های میکروسکوپی و بیوشیمیایی با کنارگذاشتن سویه‌های مشابه در هر نمونه، درنهایت 23 سویه به‌عنوان باسیلوس‌سوبتیلیس تعیین هویت شدند که در مرحلۀ بعد براساس فعالیت ضدقارچی علیه قارچ‌های ذکرشده غربالگری شدند.
سویه‌های قارچی: قارچ پیتیوم‌اولتیموم قارچی تند رشد، دارای کلنی‌های مخملی سفیدرنگ است که به‌تدریج خاکستری می‌شود. طبق بررسی‌های انجام‌شده و نتایج به‌دست‌آمده از مقالات مشابه، مشخص شد که این قارچ در محیط‌کشت کورن‌میل‌آگار بهتر و بیشتر از سایر محیط‌ها رشد می‌کند (21).
قارچ فوزاریوم‌سولانی قارچی تندرشد، دارای کلنی‌های مخملی سفید- صورتی‌رنگ است که به‌سرعت تغییر رنگ داده و به کلنی‌هایی با سطح مخملی یا پنبه‌ای تبدیل می‌شوند. می‌توان از محیط‌های کشت پوتیتودکستروزآگار[20]، سابروزدکستروزآگار و کورن میل آگار برای رشد این قارچ استفاده کرد که طی 24-72 ساعت روی این محیط‌ها رشد می‌کند.
.بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌های بومی باسیلوس‌سوبتیلیس: نتایج بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌های بومی جداسازی‌شده از خاک پارک‌های جنگلی تهران با استفاده از روش چاهک‌گذاری نشان داد که از میان 23 سویۀ منتخب در مرحلۀ قبل، 7 سویه علیه پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی فعالیت ضدقارچی از خود نشان دادند که طبق بررسی‌های آماری صورت گرفته، از این میان فعال‌ترین سویه‌ها دربارۀ قارچ پیتیوم‌اولتیموم، سویۀ شماره 48 با میانگین قطر هالۀ عدمِرشد 3/15 میلی‌متر و دربارۀ قارچ فوزاریوم‌سولانی سویۀ شماره 83 با میانگین قطر هالۀ عدمِرشد6/20 میلی‌متر بودند (جدول 1).
جدول 1- میانگین ± انحراف استاندارد قطر هاله‌های عدمِرشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب 48 و 83
|
شماره باکتری قارچ |
5 |
19 |
31 |
46 |
48 |
72 |
83 |
p-مقدار |
|
پیتیوم اولتیموم |
58/0±67/12 d |
00/0±00/13 d |
58/0±33/14 b |
00/0±00/13 d |
58/0±33/15 a* |
00/0±00/14 b,c |
58/0±33/13 c,d |
001/0> |
|
فوزاریوم سولانی |
00/0±00/18 c |
58/0±33/18 c |
58/0±67/19 b |
58/0±33/19 b |
58/0±33/18 c |
58/0±67/19 b |
58/0±67/20 a* |
001/0> |
گروه‌بندی آماری تیمارها با استفاده از آزمون چند دامنۀ دانکن در سطح (p-value<0/001) انجام شد و در هر ردیف تیمارهای دارای حروف مشابه در سطح احتمال 01/0 اختلاف معنی‌داری با یکدیگر ندارند (با توجه به نزدیک‌بودن مقادیر میانگین‌های سویه‌ها، هر سویه ممکن است در چندین گروه قرار بگیرد. میانگین هالۀ عدمِرشد سویه‌هایی که در یک گروه قرار گرفتند، تفاوت معناداری ندارد). طبق جدول دربارۀ قارچ پیتیوم‌اولتیموم سویۀ شماره 48 و دربارۀ قارچ فوزاریوم‌سولانی سویۀ شماره 83 در گروه آماری a قرار گرفته‌اند و درنتیجه بیشترین میزان فعالیت ضدقارچی را دارند که طبق نتایج حاصل از آنالیز 16srDNA و بررسی‌های ژنتیکی انجام‌شده شباهت 100درصد به گونۀ باسیلوس‌سوبتیلیس را نشان دادند.
.بهینه‌سازی پارامترهای محیطی جهت رسیدن به بهترین فعالیت ضدقارچی سویه‌های منتخب: طبق نتایج حاصل از مرحلۀ بهینه‌سازی که در جداول شماره 2، 3، 4 و 5 آمده است، می‌توان نتیجه‌گیری کرد که بهترین منبع کربن، بهترین منبع نیتروژن، بهترینpH و بهترین دما به‌ترتیب قند گلوکز، عصارۀ مخمر، pH خنثی و دمای 30 درجه سانتیگراد است.
با توجه به جدول 2، در هر دو قارچ بررسی‌شده، منابع کربن مختلف بر میزان هالۀ عدمِرشد تأثیرگذارند (p-value<0/001). با توجه به آزمون دامنۀ دانکن، میزان فعالیت ضدقارچی سویه‌های منتخب باسیلوس‌سوبتیلیس در حضور قندگلوکز به‌عنوان منبع کربن در بالاترین گروه آماری (a) قرار گرفتند و درنتیجه گلوکز به‌عنوان مناسب‌ترین منبع کربن در نظر گرفته می‌شود.
با توجه به جدول 3، در هر دو قارچ بررسی‌شده، منابع نیتروژن مختلف بر میزان هالۀ عدمِرشد تأثیرگذارند (p-(value<0/001. با توجه به آزمون دامنۀ دانکن، میزان فعالیت ضدقارچی سویه‌های منتخب باسیلوس‌سوبتیلیس در حضور عصارۀ مخمر به‌عنوان منبع نیتروژن در بالاترین گروه آماری (a) قرار گرفتند و درنتیجه عصارۀ مخمر به‌عنوان مناسب‌ترین منبع نیتروژن در نظر گرفته می‌شود.
جدول 2- میانگین ± انحراف استاندارد قطر هاله‌های عدمِ رشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب شماره 48 و 83 کشت داده شده در محیط نوترینت براث با منابع کربن مختلف برحسب میلی‌متر
|
منبع کربن قارچ |
گلوکز |
لاکتوز |
نشاسته |
p-مقدار |
|
پیتیوم اولتیموم |
00/0±00/16 a* |
58/0±33/10 c |
00/0±00/11 b |
001/0> |
|
فوزاریوم سولانی |
00/0±00/22 a⃰ |
58/0±67/11 c |
58/0±67/15 b |
001/0> |
جدول 3- میانگین ± انحراف استاندارد قطر هاله‌های عدمِرشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب شماره 48 و 83 کشت‌داده‌شده در محیط نوترینت براث با منابع نیتروژن مختلف بر حسب میلی‌متر
|
منبع نیتروژن قارچ |
پپتون |
عصاره مخمر |
نیترات آمونیوم |
p-مقدار |
|
پیتیوم‌اولتیموم |
00/0±00/16 b |
00/0±00/17 a⃰ |
58/0±33/7 c |
001/0> |
|
فوزاریوم سولانی |
00/0±00/22 b |
00/0±00/25 a⃰ |
58/0±33/13 c |
001/0> |
با توجه به جدول 4، در هردو قارچ بررسی‌شده، pHهای مختلف بر میزان هالۀ عدمِرشد تأثیرگذارند (p-value<0/001). با توجه به آزمون دامنۀ دانکن، مشخص شد که مناسب‌ترین pH، خنثی است که در بالاترین گروه آماری (a) قرار گرفته است.
با توجه به جدول 5، در هردو قارچ بررسی‌شده، دماهای مختلف بر میزان هالۀ عدمِرشد تأثیرگذارند (p-value<0/01). با توجه به آزمون دامنۀ دانکن مشخص شد که مناسب‌ترین دما، 30 درجه سانتیگراد است که در بالاترین گروه آماری (a) قرار گرفته است.
جدول 4- میانگین ± انحراف استاندارد قطر هاله‌های عدمِ رشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب شماره 48 و 83 کشت‌داده‌شده در محیط نوترینت براث با pHهای مختلف برحسب میلی‌متر
|
pH قارچ |
اسیدی |
خنثی |
قلیایی |
p-مقدار |
|
پیتیوم اولتیموم |
58/0±33/12 b |
00/0±00/17 a⃰ |
58/0±67/10 c |
001/0> |
|
فوزاریوم سولانی |
58/0±33/14 b |
00/0±00/25 a⃰ |
58/0±67/13 c |
001/0> |
جدول 5- میانگین ± انحراف استاندارد قطر هاله‌های عدمِرشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب شماره 48 و 83 کشت‌داده‌شده در دماهای مختلف برحسب میلی‌متر
|
دما قارچ |
25درجه سانتیگراد |
30درجه سانتیگراد |
37درجه سانتیگراد |
p-مقدار |
|
پیتیوم اولتیموم |
58/0±67/14 c |
00/0±00/17 a⃰ |
58/0±33/16 b |
002/0 |
|
فوزاریوم سولانی |
00/0±00/20 c |
00/0±00/25 a⃰ |
58/0±33/22 b |
001/0> |
شکل 1- قظر هالۀ عدمِرشد قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم (الف) و فوزاریوم‌سولانی (ب) در اثر فعالیت ضدقارچی به‌ترتیب سویه‌های منتخب 48 و 83 در بهینه‌ترین شرایط (منبع کربن گلوکز، منبع نیتروژن عصارۀ مخمر، pH خنثی و دمای 30 درجه سانتیگراد)
.شناسایی متابولیت ضدقارچی ایتورین A در سویه‌های منتخب: با بررسی کروماتوگرام‌های به‌دست‌آمده از نمونۀ شاهد و سویه‌های منتخب مشخص شد که پیک مربوط به ایتورین A استاندارد در کروماتوگرام حاصل از آن، در زمان 4 دقیقه و 44 صدم ثانیه ظاهر شد که با پیکی مشابه در همین بازۀ زمانی در کروماتوگرام حاصل از سویه‌های منتخب مطابقت دارد که این هم‌پوشانی در زمان ظهور یکسان این پیک در نمونه‌ها بیان‌کنندۀ حضور ایتورین A در سویه‌های بومی مورد آزمایش است. شکل‌های 2، 3 و 4 کروماتوگرام‌های حاصل از HPLC نمونۀ شاهد (ایتورین A) و سویه‌های بومی منتخب را نشان می‌دهد.
|
End Time (min) |
Start Time (min) |
Points Across Peak |
Integration Type |
%Height |
Height (V) |
%Area |
Area (V⃰Sec) |
Peak Type |
RT (min) |
|
|
000/20 |
017/0 |
1199 |
BB |
00/100 |
18542 |
00/100 |
1211216 |
Unknown |
446/4 |
1 |
شکل 2- کروماتوگرام حاصل از ایتورین A
|
End Time (min) |
Start Time (min) |
Points Across Peak |
Integration Type |
%Height |
Height (V) |
%Area |
Area (V⃰Sec) |
Peak Type |
RT (min) |
|
|
100/2 |
717/1 |
23 |
BB |
13/0 |
88 |
03/0 |
1065 |
unknown |
912/1 |
1 |
|
117/8 |
433/2 |
341 |
BB |
08/99 |
65689 |
16/99 |
3173034 |
unknown |
409/4 |
2 |
|
417/10 |
117/8 |
138 |
BB |
79/0 |
525 |
81/0 |
25967 |
unknown |
033/9 |
3 |
شکل 3- کروماتوگرام حاصل از HPLC سویۀ بومی شماره 48
|
End Time (min) |
Start Time (min) |
Points Across Peak |
Integration Type |
%Height |
Height (V) |
%Area |
Area (V⃰Sec) |
Peak Type |
RT (min) |
|
|
683/1 |
500/2 |
683/1 |
49 |
BV |
55/0 |
24/0 |
10850 |
unknown |
325/2 |
1 |
|
683/1 |
050/9 |
500/2 |
393 |
VV |
44/98 |
12/98 |
4382524 |
unknown |
441/4 |
2 |
|
683/1 |
983/12 |
050/9 |
236 |
VB |
80/0 |
53/1 |
68137 |
unknown |
249/10 |
3 |
|
817/17 |
350/22 |
817/17 |
271 |
BB |
19/0 |
04/0 |
1611 |
unknown |
012/18 |
4 |
|
733/41 |
217/52 |
733/41 |
628 |
BB |
02/0 |
07/0 |
3309 |
unknown |
486/49 |
4 |
شکل 4-کروماتوگرام حاصل از HPLC سویۀ بومی شماره 83
بحث و نتیجه‌گیری.
به این دلیل که استفاده از مواد شیمیایی به‌عنوان آفت‌کش برای ازبین‌بردن عوامل بیماری‌زای گیاهی، سبب آلودگی محیط زیست می‌شود و نیز به‌دلیل مقاومت عوامل بیماری‌زای گیاهی نسبت به این آفت‌کش‌ها، تلاش‌های زیادی جهت جایگزینی روش‌های مؤثرتر برای حفاظت از گیاهان انجام شده است (22). کنترل زیستی عوامل بیماری‌زای گیاهی با استفاده از میکروارگانیسم‌های مفید روش مؤثری جهت کنترل خسارات واردشده به محصولات کشاورزی است (8). باسیلوس‌سوبتیلیس به‌واسطۀ داشتن یک سری ویژگی‌های خاص، ازقبیل تولید ترکیبات آنتی‌بیوتیکی ضدقارچی به‌ویژه ایتورین و نیز آنزیم‌های هیدرولیتیک و توانایی تولید اسپور پایدار، به‌عنوان عامل کنترل آفات و بیماری‌های گیاهی مهم است (23). قارچ پیتیوم‌اولتیموم عامل بیماری مرگ گیاهچه و بیماری‌های ریشه‌ای (2) و قارچ فوزاریوم‌سولانی عامل بیماری خشکیدگی و پوسیدگی در گیاهان در بسیاری از مناطق جهان (3) هستند. بر همین اساس در پژوهش حاضر با توجه به اهمیت این دو قارچ بیماری‌زا در ایجاد خسارات عمده به محصولات کشاورزی و نقش مؤثر باسیلوس‌سوبتیلیس در سرکوب این قارچ‌ها، به مطالعۀ سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس جداشده از خاک پارک‌های جنگلی تهران و بررسی اثر آنتاگونیستی آنها روی این عوامل بیماری‌زا پرداخته شده است. 23 سویه از مجموع 91 سویۀ بومی جداسازی‌شده از خاک پارک‌های جنگلی تهران براساس خصوصیات ماکروسکوپی، میکروسکوپی و بیوشیمیایی به‌عنوان باسیلوس‌سوبتیلیس تعیین هویت شدند. آزمون‌های تکمیلی شامل بررسی فعالیت ضدقارچی سویه‌ها با استفاده از روش چاهک‌گذاری نشان داد که دو سویۀ 48 و 83 بیشترین توانایی را در کنترل زیستی پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی دارند. در مقایسه با مطالعاتی که در گذشته در زمینه اثر ضدقارچی سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی انجام‌شده این دو باکتری توانایی بالاتری در مهارکنندگی رشد قارچ‌های ذکرشده داشتند. براساس مطالعۀ گروور[xxi] و همکاران سویۀ باسیلوس‌سوبتیلیس RP24 جداسازی‌شده از ریزوپلن[xxii] لوبیای سودانی قادر است علیه قارچ‌های پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی، قطر هالۀ عدمِرشد به‌ترتیب 50/7 و 85/7 میلی‌متر را با استفاده از روش چاهک‌گذاری ایجاد کند که در مقایسه با نتایج حاصل از پژوهش حاضر که قطر هالۀ بازدارندگی به‌ترتیب17و25 میلی‌متر مشاهده شد، بسیار کمتر بودکه این تفاوت می‌تواند به‌علت تولید بیشتر متابولیت ضدقارچی ایتورین و اثر مهارکنندگی بیشتر سویه‌های بررسی‌شده علیه پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی نسبت به جدایۀ باسیلوس‌سوبتیلیسRP24 باشد (5). از این‌رو سویه‌های باسیلوس‌سوبتیلیس به‌دست‌آمده از مطالعۀ حاضر علی‌رغم بومی‌بودن و دسترسی ساده‌تر به آنها و نیز اثر مهارکنندگی بیشتر قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی در مقایسه با سویه‌های غیربومی می‌توانند مهم باشند. پیش‌تر نیز کومار[xxiii] و همکاران استفاده از روش چاهک‌گذاری و اندازه‌گیری قطر هالۀ عدمِرشد با استفاده از خط‌کش آنتی‌بیوگرام را نیز جهت تعیین سنجش اثر مهاری سویۀ باسیلوس‌سوبتیلیسMTCC8114 جداشده از نمونه‌های خاک باغ‌های ایالت آگرا در هند، روی قارچ‌های پاتوژن میکروسپوروم فولوُم[xxiv] و تریکوفیتون[xxv] را ارزیابی شدند و به نتایج قابلِ‌ملاحظه‌ای دست یافتند که دال بر تأیید این روش است (24).
نتایج ما نشان داد که باکتری‌های جداسازی‌شده در مرحلۀ بهینه‌سازی در محیط نوترینت براث دارای قند گلوکز به‌عنوان منبع کربن، عصارۀ مخمر به‌عنوان منبع نیتروژن، pH خنثی و دمای 30 درجه سانتیگراد، بیشترین فعالیت ضدقارچی را به‌ترتیب علیه قارچ‌های بیماری‌زای پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی نشان دادند. اوهنو[xxvi] و همکاران تأثیر بهینه‌سازی پارامتر دما را در تولید ایتورین A توسط باسیلوس‌سوبتیلیسRB14 بررسی شدند. آنها مشخص کردند بهترین دما برای تولید ایتورین A، 25 درجه سانتیگراد است که با نتایج به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر تفاوت دارد که می‌تواند به‌علت رشد بهتر جدایه‌های بررسی‌شده در دمای 30 درجه باشد (19). از طرفی ژانگ[xxvii] طی مطالعات خود تأیید کرد باسیلوس‌سوبتیلیس B-FS06 گرماگذاری‌شده در دمای 30 درجه سانتیگراد بیشترین فعالیت ضدقارچی را علیه قارچ آسپرژیلوس فلاووس[xxviii] دارد که با نتایج به‌دست‌آمده از پژوهش حاضر همسو است (25).
نتایج حاصل از تخلیص ماده مؤثره و بررسی و مقایسۀ کروماتوگرام‌های حاصل از HPLC حضور متابولیت ضدقارچی ایتورین A را در پژوهش جاری تأیید کرد. گروور وهمکاران، با روش HPLC به این نتیجه رسیدند که اثر آنتی‌بیوتیکی و فعالیت ضدقارچی سویۀ باسیلوس‌سوبتیلیسRP24 به‌علت توانایی این سویه در تولید لیپوپپتید ایتورین A است (5).
لیپوپتیدهای متعلق به خانوادۀ ایتورین، پپتیدهای حلقوی آمفی‌فیلیک‌اند که شامل 7 αآمینواسید متصل به βآمینوفتی‌اسید هستند و طول نیمه اسیدچرب ممکن است از C14تا C17 برای آنها متنوع باشد (11). اعضای این خانواده فعالیت ضدقارچی قوی دارند و می‌توانند از رشد طیف وسیعی از قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی ازطریق واکنش با استرول موجود در غشای قارچ و ایجاد منافذی در غشا و افزایش نفوذپذیری آن که درنهایت منجر به تخریب غشا و مرگ قارچ می‌شود، به‌خوبی ممانعت کنند (12). با توجه به آنچه گفته شد می‌توان نتیجه گرفت که سویه‌های بومی باسیلوس‌سوبتیلیس منتخب در این بررسی فعالیت ضدقارچی قوی علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی پیتیوم‌اولتیموم و فوزاریوم‌سولانی دارند که این توانایی آنها به‌علت تولید متابولیت‌های ثانویه به‌ویژه آنتی‌بیوتیک‌های لیپوپپتیدی خانوادۀ ایتورین است که با توجه به اثر مهارکنندگی بیشتر سویه‌های منتخب در مقایسه با سویه‌های غیربومی علیه قارچ‌های ذکرشده (5) می‌توان استدلال کرد که این سویه‌ها از سویه‌های غیربومی متابولیت بیشتری تولید کرده‌اند، ازاین‌رو این پژوهش تأییدی بر توانایی باکتری باسیلوس‌سوبتیلیس در کنترل زیستی عوامل بیماری‌زای گیاهی است که می‌توان از آن در جهت کنترل زیستی قارچ‌های بیماری‌زای محصولات کشاورزی که سبب بازده پایین این محصولات می‌شوند استفاده کرد و درنتیجه می‌توانند جایگزین مناسبی برای قارچ‌کش‌های شیمیایی شوند که با تجمع‌یافتن در خاک، سبب آلودگی محیط زیست شوند و نیز عوامل بیماری‌زا نسبت به آنها مقاومت حاصل می‌کنند.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از جناب آقای دکتر زمانی‌زاده مدیرگروه محترم مقطع دکتری رشته مهندسی کشاورزی گرایش بیماری‌شناسی گیاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پژوهشات تهران، برای اهدای سویه‌های قارچی و نیز از مرکز پژوهشات دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران پزشکی تشکر و قدردانی می‌کنیم.
[1]-Pythimultimum
[2] -Fusariumsolani
[3]-Bacillus sp.
[4]-Iturin
[5] -Surfactin
[6] - Fengycin
[7]-Bacillus subtilis
[8]- Pour plate
[9] -Nutrient Agar
[10]-Corn Meal Agar
[11] -Sabouraud Dextrose Agar
[12] -Sabouraud Dextrose Broth
[13] - Nutrient Broth
[14] One-way Analysis of Variance (ANOVA)
[15] - Blast
[16] Duncan's Test
[17] - JAL Tajhiz
[18] - Hettich
[19] - Retention Time
[20] - Potato Dextrose Agar
[xxi] - Grover
[xxii] - Rizoplane
[xxiii]- Kumar
[xxiv]-Microsporumfulvum
[xxv]-Trichophyton
[xxvi] - Ohno
[xxvii] - Zhang
[xxviii] - Aspergillus flavus
)