نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکربی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: L-Asparaginase is an anti-neoplastic drug used in lymphoblastic leukemia chemotherapy. Nowadays, this enzyme derived from bacterial sources, mostly L-asparaginase II from Escherichia coli and in lesser amount L-asparaginase of Erwinia sp. has medical utilization. The long-term usage of these agents leads to allergic reactions; therefore new
L- asparaginase with new immunological characteristics is required. Halophilic bacteria might contain L-asparaginase with novel immunological properties that can be used in hypersensitive patients.
Materials and methods: In this study, the production of L-asparaginase by 130 halophilic and halotolerant bacteria isolated from saline environments in Iran was screened. Modified M-9 agar medium was used for qualitative analysis. In the selected strain, growth curve plotting, asparaginase activity assay and analysis for the effect of some factors on the production and enzyme activity were done.
Results: 40 strains produced L-asparaginase. Most of L-asparaginase producers were member of genus Halomonas and Marinobacter (21.4%). GBPx3 is potent bacteria in L-asparaginase production which belonged to Vibrio sp. based on 16S rRNA analysis. Optimized factors for
L-asparaginase production were 350C (0.65 IU/ml), pH 8 (0.926 IU/ml) and 2.5% NaCl (0.903 IU/ml). The highest activity of L-asparaginase was in 350C (0.781 IU/ml), pH 8 (0.82 IU/ml) and without NaCl (0.806 IU/ml).
Discussion and conclusion: The aim of this study was to screen the production of
L-asparaginase through 130 halophilic and halotolerant bacteria which were isolated from saline environments in Iran. The results of this work indicate that the bacterium, Vibrio sp. GBPx3 displays to be potent for asparaginase production.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
رشد هجومی و غیرقابلکنترل سلولها را سرطان میگویند. این سلولها ممکن است به سایر بخشهای بدن انتشار یابند که به این حالت، متاستاز میگویند (1). اگرچه درمانهای سنتی سرطان شامل عمل جراحی، رادیوتراپی و شیمیدرمانی در مدیریت بیماری بسیاری از بیماران سرطانی مؤثر است، برای نیمی از سرطانها غیراختصاصی و غیرمؤثر است و اثرات جانبی برای بیماران ایجاد میکند؛ بنابراین بهبود، تکمیل و یا جایگزینکردن روشهای سنتی در حال توسعه است (2).
آنزیمدرمانی، یک روش مؤثر در درمان اختصاصی سرطان است. آنزیمها دارای دو ویژگی مهم هستند که باعث تمایز آنها از سایر انواع داروها میشود؛ اول، آنزیمها اغلب با تمایل و اختصاصیت بالا به هدف خود متصل میشوند و دوم، مولکولهایی واکنشگر هستند که مولکول(های) هدف را به محصول مدنظر تبدیل میکنند. این دو ویژگی باعث شده است که آنزیمها تبدیل به مولکولهایی قوی و اختصاصی شوند به گونهای که مسیرهای درمانی بیوشیمیایی را در بدن انجام دهند که مولکولهای کوچکتر قادر به انجام آنها نیستند. این خصوصیات سبب توسعه بسیاری از داروهای آنزیمی جهت درمان طیف وسیعی از اختلالات از جمله سرطان شده است (3). بهطور بالقوه، فقر آمینواسیدی بهعنوان یک روش کارآمد جهت درمان سرطان شناخته شده است. کاهش یک آمینواسید خاص در جریان خون از طریق رژیمی با محتوای آمینواسیدی کم و یا به کارگیری آنزیمهای کاتابولیکی خاص جهت هیدرولیز آمینواسید موردِنظر، امکانپذیر است (4 و 5).
آنزیم L-آسپاراژیناز یکی از آنزیمهای مؤثر در درمان لوسمی لنفوسیتی حاد است که برای مدتزمان طولانی استفاده شده است. برای اولین بار در سال 1922، مشاهده شد که سرم خوکچه هندی منبع غنی از آنزیم L-آسپاراژیناز است که دارای فعالیت ضدلنفوما است (6 و 7). سوبسترای L-آسپاراژین برای رشد سلولهای تومور ضروری است که با تزریق آنزیم L-آسپاراژیناز و به دنبال آن هیدرولیز L-آسپاراژین، تراکم آن در مایعات بدن کاهش یافته و درنتیجه سوبسترای لازم برای تکثیر سلولهای توموری غیرقابلِدسترس میشوند. درواقع، سلولهای نرمال L-آسپاراژین را با استفاده از آنزیم آسپاراژینسینتتاز سنتز میکنند؛ درحالیکه سلولهای توموری به منبع L-آسپاراژین خارجی جهت عملکردهای سلولی نیازمندند؛ زیرا آنزیم سنتزکننده آن را ندارند (8 و 9). میتوان سوبسترای L-آسپاراژین را که برای رشد سلولهای توموری مفید است، با تزریق آنزیم L-آسپاراژیناز کاهش داد و بدین ترتیب سوبسترای موردِنیاز برای تکثیر سلولهای توموری را از دسترس این سلولها خارج کرد.
آسپاراژیناز بهطور گسترده میان ارگانیسمهای مختلف جانور، گیاه و منابع میکروبی توزیع شدهاند. این آنزیم در باکتریهای Bacillus subtilis (10)، Corynebacterium glutamicum، Erwinia chrysanthemi (11)، Serratia marcescens (12)، Vibrio succinigenes (13)، E.coli (14)و قارچهای Aspergillus terreus (15) و Candida utilis (16) گزارش شده است. از نظر تجاری، در میان منابع میکروبی Escherichia coli، Erwinia carotovora و Serratia marcescens بیشترین توجه را به خود جلب کردهاند (17 و 18) درحالیکه L-آسپاراژیناز از این منابع میکروبی باعث تحریک سیستم ایمنی بیماران و ایجاد اثرات جانبی میشوند. میکروارگانیسمهایی که در محیطهای شور زندگی میکنند دارای ویژگیهایی متفاوت از ویژگیهای پروتئینهای ارگانیسمهای غیرنمکی هستند؛ به عبارت دیگر پروتئینهایی با ساختار تغییریافته هستند که قادرند غلظتهای زیاد نمک و فعالیت آبی کم را تحمل کنند. فوکوچی[1] و همکارانش نشان دادند که تفاوت محتوای آمینواسیدی میان پروتئینهای نمکدوست و مزوفیلیک یا گرمادوست بیشتر در سطح آنهاست تا درون آنها (19)؛ بنابراین باکتریهای نمکدوست ممکن است دارای آنزیمهایی با ویژگیهای ایمونولوژیکی جدید باشند که بتوان آنها را در بیمارهای فوقحساس استفاده کرد؛ در نتیجه میتوانند نسبت به سویههای صنعتی کنونی مانند E.coliبرتر باشند.
طبق مطالب گفتهشده در این پروژه، تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و شرایط بهینه تولید آن از سویه نمکدوست (Vibrio sp.) سویه GBPx3 انجام شد. سرعت رشد باکتریایی نیز در محیط سنجش آنزیمی (حاوی L-آسپاراژین) مطالعه شد.
مواد و روش ها.
سویههای باکتریایی و محیطهای کشت: از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، 130 سویه نمکدوست و تحملکننده نمک که از مناطق شور ایران جداسازی شدهاند، دریافت شد و در محیط کشت پیچیده MH2.5%[2] آگار محتوی ترکیبات زیر نگهداری شدند (گرم در لیتر آب مقطر):
NaCl 20/25، MgCl2 1/75، MgSO4 2/4، CaCl2 0/09، NaHCO3 0/015، NaBr 0/0065، proteose peptone 5، yeast extract 10، Glucose 1، آگار 15. pH محیط نیز توسط باز تریس در 5/7 تنظیم شد.
.محیط کشت حداقل تغییریافته M9 (20) دارای .ترکیبات زیر، برای بررسی تولید L-آسپاراژیناز استفاده شد (گرم در لیتر آب مقطر): KH2 PO43، NaCl 20/25، MgCl2 1/75، MgSO4 2/4، CaCl2 0/09، L-آسپاراژین، فنل رد 07/0، گلوکز 1، آگار 20. pH محیط توسط محلول باز تریس بر 4/7-2/7 تنظیم شد. محلول ذخیره 5/2درصد فنلرد در اتانول مطلق تهیه و pH آن توسط باز تریس در 4/7-2/7 تنظیم شد. بهعنوان کنترل، در محیط کشت M9 تغییریافته به جای آمینواسید L-آسپاراژین، از NaNO3 به عنوان منبع نیتروژن استفاده شد.
برای بررسی فاکتورهای مختلف دما، pH، درصد سدیمکلرید و منبع کربن از محیط مایع M9 با ترکیبات گفتهشده و بدون فنلرد استفاده شد.
کلیه ترکیبات استفادهشده در این پروژه از شرکت مرک تهیه شده است.
تولید L-آسپاراژیناز: جهت مشاهده و بررسی تولید آنزیم L-آسپاراژیناز، سویهها در محیط کشت جامد M9 (حاوی 5/2درصد غلظت کلی نمک) کشت و در دمای 34 درجه سانتیگراد بهمدت 48 ساعت گرماگذاری شدند. L-آسپاراژیناز طی واکنش خود آمونیاک تولید میکنند و آمونیاک باعث افزایش pH میشود؛ بنابراین میتوان از شاخص pH فنلرد برای شناسایی میکروارگانیسمهای تولیدکننده L-آسپاراژیناز استفاده کرد. تولید آنزیم L-آسپاراژیناز با ایجاد و توسعه هاله صورتیرنگ اطراف کلنیهای باکتریایی تعیین میشود. در میان سویههای تولیدکننده، بیشترین میزان تولید (با تلقیح یکسان) متعلق به سویه GBPx3 بود که برای مراحل بعدی انتخاب شد.
.رسم همزمان منحنی رشد و سنجش آنزیمی: بهمنظور بررسی میزان رشد با تولید آنزیم، ایزوله منتخب در 70 میلیلیتر محیط کشت مایع M9 موجود در ارلن 250 میلیلیتری تلقیح شد (به میزان 108×5/1 CFU/ml) و در شیکر انکوباتور در دمای 34 درجه سانتیگراد و دور 150 rpm گرماگذاری شد. رشد باکتریایی بهروش اسپکتروفوتومتری در طولموج 620 نانومتر اندازهگیری شد. همزمان با رسم منحنی رشد، سنجش آنزیمی نیز براساس روش زیر انجام گرفت.
فعالیت L-آسپاراژیناز با استفاده از معرف نسلر اندازهگیری شد. فرآیند سنجش برپایه نسلریزاسیون مستقیم آمونیاک تولیدشده توسط L-آسپاراژیناز صورت گرفت. بدینمنظور، 500 میکرولیتر محلول L-آسپاراژین 10 میلیمولار (در بافر تریس-بیس 50 میلیمولار، pH 7) و 450 میکرولیتر بافر تریس-بیس 50 میلیمولار، pH 7 به 50 میکرولیتر سوپرناتانت اضافه و در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سپس واکنش آنزیمی با افزودن 500 میکرولیتر محلول تریکلرواستیکاسید 5درصد (w/v) متوقف و با سانتریفیوژ در rpm 11500× بهمدت 10 دقیقه، پروتئینهای رسوبی حذف و از سوپرناتانت آن برای انجام واکنش نسلریزاسیون استفاده شد. به یک میلیلیتر سوپرناتانت، یک میلیلیتر آب مقطر و 200 میکرولیتر معرف نسلر اضافه شد و پس از 10 دقیقه گرماگذاری در دمای اتاق، جذب آن در طول موج 490 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد با غلظتهای مختلف آمونیومسولفات رسم شد (20).
.بررسی اثر فاکتورهای مختلف (pH، دما، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن) بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: برای بررسی فاکتورهای مختلف، از 25 میلیلیتر محیط کشت M9 مایع محتوی L-آسپاراژین در ارلن 100میلیلیتری استفاده شد. پس از تلقیح (بهمیزان 5درصد نیم مکفارلند)، بهمدت 72 ساعت گرماگذاری و فعالیت آنزیمها با روش نسلریزاسیون اندازهگیری شد (21).
اثر دما بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: اثر دما با تلقیح سویهها (بهمیزان 5درصد کدورت نیم مکفارلند، 108×5/1 CFU/ml) در محیط کشت M9 که حاوی L-آسپاراژین است و گرماگذاری در دماهای مختلف 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتیگراد بررسی شد (21).
اثر pH بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: برای تعیین اثر pH بر تولید، محیط M9 محتوی L-آسپاراژین در pHهای مختلف 5، 6، 7، 8 و 9 تهیه شد و بعد از استریلیزاسیون بهمیزان 5درصد کدورت نیم مکفارلند (108×5/1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از 72 ساعت گرماگذاری، فعالیت آنزیمی بررسی شد (21).
اثر درصد NaCl بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: محیط M9 با درصدهای مختلف NaCl، 0، 5/2، 5، 5/7 و 10درصد تهیه شد و بهمیزان 5درصد کدورت نیم مکفارلند (108×5/1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از 72 ساعت گرماگذاری، سنجش آنزیمی بررسی شد.
.اثر درصد گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: محیط M9 با درصدهای مختلف گلوکز 1/0، 5/0 و 1درصد تهیه شد و بهمیزان 5درصد کدورت نیم مکفارلند، (108×5/ 1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از مدتزمان لازم برای گرماگذاری، سنجش آنزیمی آن انجام شد.
اثر منبع کربن بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: منابع کربنی مختلف مانند گلوکز، سوکروز، مالتوز و فروکتوز بهمیزان 5/0درصد در محیط کشت تولیدی اضافه شدند و بعد گرماگذاری شدند. فعالیت آنزیمی توسط سوپرناتانت حاصل از سانتریفیوژ محیط تخمیر اندازهگیری شد.
.بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیم: 25 میلیلیتر محیط کشت M9 محتوی L-آسپاراژین در ارلن 100 تهیه شد. شایان ذکر است که در اینجا pH، درصد NaCl و گلوکز و دمای گرماگذاری محیطهای کشت، همان مقادیر بهینه بهدستآمده است. پس از تلقیح بهمیزان 5درصد کدورت نیم مکفارلند، بهمدت 72 ساعت گرماگذاری شد. بعد از گرماگذاری، در دور 4000× بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و از سوپرناتانت جهت سنجش آنزیمی براساس نسلریزاسیون مطابق مراحل گفتهشده، استفاده شد.
بررسی اثر فاکتور دما بر فعالیت آنزیم: برای بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم پس از مخلوطکردن سوپرناتانت، بافر و سوبسترا، از سه دمای 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتیگراد جهت گرماگذاری آن استفاده شد.
بررسی اثر فاکتور pH بر فعالیت آنزیم: در اینجا بافر مخلوط (محتوی بافر استات، فسفات و تریس-بیس 50 میلیمولار) در محدوده pH 9-5 تهیه شد و همان بافر برای آمادهسازی محلول سوبسترا به کار برده شد. از هریک از این بافرها برای انجام سنجش آنزیم استفاده شد و میزان آمونیاک بهوسیله معرف نسلر اندازهگیری شد.
بررسی اثر فاکتور درصد NaCl بر فعالیت آنزیم: مخلوط واکنشی آنزیم با درصدهای مختلف نمک 0، 5/2، 5، 5/7 و 10درصد تهیه شد و سپس گرماگذاری و بررسی میزان آمونیاک تولیدشده بهوسیله معرف نسلر انجام شد.
نتایج.
.تولید L-آسپاراژیناز، بررسی رشد باکتریایی و سنجش آنزیمی: از میان 130 سویه باکتریایی 40 سویه تولیدکننده آنزیم L-آسپاراژیناز تولید شد که بیشترین میزان تولید آنزیم در سویه GBPx3 از جنس Vibrio مشاهده شد. سویه مدنظر نیز در محیط کشت M9 دارای فنلرد، پس از 24 ساعت هاله صورتیرنگی تولید کرد (شکل 1)
شکل 1- هاله صورتی ایجادشده نشاندهنده تولید L-آسپاراژیناز
همانطور که در شکل 2 دیده میشود، همزمان با رشد سویه، آنزیم نیز تولید میشود و در طی فاز لگاریتمی نیز میزان تولید افزایش مییابد؛ بهنحویکه فعالیت آنزیمی در انتهای فاز لگاریتمی و فاز سکون به بیشترین میزان خود میرسد و بعد ثابت میماند. بیشترین میزان تولید آنزیم 81/0 IU/ml است.
اثر فاکتورهای دما، pH، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن بر تولید آنزیم: این سویه در محدوده دمایی 40-30 درجه سانتیگراد رشد میکند و دارای فعالیت آنزیمی است؛ اما دمای ایدهآل برای تولید آنزیم L–آسپاراژیناز 35 درجه سانتیگراد است که در این دما فعالیت آنزیمی آن 65/0 IU/ml و رشد 645/0 (A620 nm) بود (شکل 3). pH بهینه برای تولید آنزیم 8 است که در این pH بهینه دارای فعالیت آنزیمی 926/0 IU/ml و جذب در طول موج 620 نانومتر 73/0 بود (شکل 4). این آنزیم در سدیمکلرید و گلوکز با درصد بهترتیب 5/2 و 5/0 درصد و با منبع کربن ساکاروز بیشترین میزان تولید آنزیم را نشان میدهد که بهترتیب دارای فعالیت 903/0، 948/0 و 971/0 IU/ml بودند (شکل 5، 6 و 7). سویه بررسیشده در صفر درصد سدیمکلرید هیچگونه رشدی نداشته است؛ اما در محدوده 5/2 تا 10درصد سیر نزولی رشد و تولید آنزیم را نشان داد.
شکل 2- منحنی رشد و فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 3- اثر دما بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 4- اثر pH بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 5- اثر درصد سدیمکلرید بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 6- اثر درصد گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیمها: بیشترین فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز در دمای 35 درجه سانتیگراد مشاهده شد و در دماهای 25 و 45 درجه سانتیگراد فعالیت آنزیم دیده نشد (شکل 8). pH بهینه فعالیت آنزیم 8 بود که فعالیت آنزیمی آن 82/0 IU/ml بوده است (شکل 9). بهترین شرایط فعالیت آنزیم در محیط بدون نمک بود که در این حالت فعالیت آنزیمی 806/0 IU/ml بود (شکل 10). با افزایش میزان سدیمکلرید، فعالیت آنزیمی کاهش یافت که نشاندهنده طبیعت هالوتولرانتبودن آنزیم است.
شکل 7- اثر منبع کربن بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 8- اثر دما بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 9- اثر pH بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
شکل 10- اثر درصد NaCl بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3 (Vibrio sp.)
بحث و نتیجه گیری.
برایناساس که آنزیم L-آسپاراژیناز طی واکنش خود آمونیاک تولید میکنند و آمونیاک باعث افزایش pH میشود میتوان از شاخص pH برای شناسایی میکروارگانیسمهای تولیدکننده آنها استفاده کرد. گالتی[iii] و همکاران در سال 1996، یک روش سریع برپایه pH و رنگ (فنلرد) جهت بررسی تولید L-اسپاراژیناز توسط میکروارگانیسمها گزارش کردند که نتایج آن با تخمین کمی در محیط مایع هماهنگ بود. در این مطالعه غلظتهای مختلف فنلرد را بررسی کردند و غلظت مناسب رنگ را براساس توانایی رشد میکروارگانیسم و مشخصبودن هاله تولید آنزیم گزارش کردند (22). همچنین قاسمی[iv] و همکاران در سال 2008، یک محیط بهینه شده برای بررسی تولید L-آسپاراژیناز Escherichia coli گزارش کردند و طبق نتایج بهدستآمده اعلام کردند که میتوان از آن در بررسی تولید L-آسپاراژیناز در سایر میکروارگانیسمها (باکتریها و قارچها) استفاده کرد (23). در این پروژه جهت بررسی سریع و پلیتی L-اسپاراژیناز از شاخص pH فنلرد (007/0درصد w/v) استفاده شد که این مقدار از رنگ فنلرد باعث ایجاد رنگ زرد-نارنجی شد و درنتیجه تغییر رنگ محیط در اثر تولید آنزیم قابلِتشخیص است؛ در دو گزارش ذکرشده نیز از همین میزان فنلرد در محیط استفاده شده است. محیط M9 دارای ترکیب KH2PO4 و K2HPO4، بهعنوان عوامل بافری است اما در این پروژه K2HPO4حذف شد زیرا با حذف آن خاصیت بافری محیط کاهش یافت و درنتیجه مقادیر کم آمونیاک در محیط قابلِتشخیص بود؛ قاسمی و همکاران نیز در گزارش خود به این نتیجه رسیده بودند (23). دیستاسیو[v] و همکاران در سال 1976، L-آسپاراژیناز را از باکتری بیهوازی Vibrio succinogenes روده گاو جداسازی و تخلیص کردند؛ این آنزیم فاقد فعالیت گلوتامینازی بود (13، 24 و 25). تاکنون آنزیم L-آسپاراژیناز از تعدادی باکتری از جنس Pseudomonas sp. یافت و بعضی از آنها تخلیص شده است؛ مانند Pseudomonas aeruginosa (26)، Pseudomonas stutzeri MB-405 (27)وPseudomonas acidovorans. (28).
آلبانس[vi] و همکاران در سال 1978 گزارش کردند که Vibrio succinogenesدر طول مرحله رشد لگاریتمی و ابتدای فاز سکون آنزیم L-آسپاراژیناز را تولید میکند (29). در این پژوهش نیز تولید آنزیم L-آسپاراژیناز از سویه بررسیشده، در طی فاز لگاریتمی افزایش یافت و در فاز سکون به حداکثر میزان تولید خود رسید.
.بررسی اثر فاکتورهای مختلف (pH، دما، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن) بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: طبق نتایج بهدستآمده مشخص شد که دما، pH، درصد NaCl و منبع کربن مناسب برای تولید حداکثر میزان آنزیم همان میزانی هستند که برای رشد بهینه سویه، نیاز است؛ چراکه با حداکثر میزان بیومس تولیدشده، مقدار تولید آنزیم نیز افزایش مییابد. همانطور که در نمودارها نیز نشان داده شده است، در شرایطی که بیشترین میزان جذب در 620 نانومتر وجود داشت، بیشترین میزان تولید آنزیمها نیز دیده شد. آلبانس و همکاران در سال 1978، در طی بررسی اثر ترکیبات محیط کشت در رشد و تولید L-آسپاراژیناز از Vibrio succinogenes، pH محیط را 4/7 در نظر گرفتند. مهاجا[vii] و همکاران در سال 2012، با بررسی اثر فاکتورهای مختلف بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز در Bacillus licheniformisبه این نتیجه رسیدند که در pH 6 و دمای 37 درجه سانتیگراد بیشترین میزان تولید آنزیم وجود دارد (البته تولید آنزیم در دماهای 50-35 درجه سانتیگراد وجود داشت) و تغییرات میزان NaCl (0/25-1/25 g/l) اثری بر تولید آنزیم نگذاشته است (30). بهترین pH برای حداکثر میزان تولید آنزیم L-آسپاراژیناز توسط Staphylococcus، 5/7 بود (31). مورسی[viii] و همکاران در سال 2010، دمای 37 درجه سانتیگراد را دمای بهینه تولید L-آسپاراژیناز از سویه از جنس Bacillusگزارش کرد (32)؛ درحالیکه pH و دمای بهینه برای E.coli (33)و Erwinia carotovora (34)، بهترتیب 7 و 37 درجه سانتیگراد بود. جنینگس[ix] و همکاران در سال 1989 نشان دادند که ژن ansB (کدکننده آنزیم L-آسپارزیناز II) در E.coliرا پروتئین فعالکننده کاتابولیت[x] (CAP) (پروتئین پذیرنده AMP حلقوی[xi] نیز نامیده میشود) تنظیم میکند. مقادیر کم گلوکز درونسلولی باعث افزایش سطح AMP حلقوی و به دنبال آن افزایش کمپلکس AMP حلقوی-CAP میشود. این کمپلکس به یک جایگاه اختصاصی بر DNA که در مجاورت پروموتور ژنهای تنظیمشونده توسط CAP قرار دارد متصل میشود و اتصال 70σRNA پلیمراز را افزایش میدهد و بدین ترتیب باعث افزایش بیان ژن میشود؛ بنابراین گلوکز در E.coliیک مهارکننده برای ژن ansB است (35)؛ اما در این پژوهش، میزان تولید L-آسپاراژیناز توسط سویه موردِنظر در غلظت 5/0درصد گلوکز بیش از غلظت 1/0درصد بود ولی غلظت 1درصد بر تولید آنزیم اثر مهاری داشت. پرما[xii] و همکاران در سال 2013 طی بررسی اثر غلظتهای مختلف گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز از سویههای موتانت و وحشی Pseudomonas fluorescensنتیجه گرفتند که غلظت 1درصد گلوکز باعث مهار کلی فعالیت آنزیم میشود درحالیکه غلظت 1/0درصد اثر تحریکی کمی بر تولید این آنزیم دارد (36).
بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز: به دلیل خارجسلولیبودن آنزیمهای بررسیشده، از سوپرناتانت محیطهای تلقیحشده با سویه مثبت برای بررسی اثر فاکتورهای مختلف بر فعالیت آنزیمها استفاده شد.
دیستاسیو و همکاران در سال 1976، pH بهینه فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز Vibrio succinogenesرا 3/7 گزارش کردند (24). کوشواها[xiii] و همکاران در سال 2012، اثر فاکتورهای مختلف pH و دما را بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز از سویه منتخب A2 که بهعنوان Bacillus subtilisشناخته شده بود، بررسی کردند. این آنزیم در دامنه pH 9-7 و دمای 50-25 درجه سانتیگراد دارای فعالیت آنزیمی بود؛ اما بیشترین میزان فعالیت آنزیم در pH 7 با فعالیت آنزیمی 436/0 IU/mg و دمای 37 درجه سانتیگراد با فعالیت آنزیمی 44/0 IU/mg بود (37). طبق گزارشات قبلی دمای بهینه برای فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز از E.coli، Bacillus sp.، E.coliپاتوژنیک و Aspergillus terreus 37 درجه سانتیگراد است (38 و 39). در این پژوهش، L-آسپاراژیناز از سویه نمکدوست بررسیشده دارای دمای بهینه 35 درجه سانتیگراد و pH بهینه 8 بود؛ بیشترین میزان فعالیت در نبود NaCl بود ولی با افزایش غلظت نمک در مخلوط واکنشی، میزان فعالیت کاهش یافت که نشان از این است که این آنزیم تحملکننده NaCl است.
محیطهای شور، دارای انواع وسیعی از میکروارگانیسمها با ویژگیهای نوین بیوتکنولوژیک هستند. نتایج این پروژه نشان میدهد که باکتری Vibrio sp. GBPx3 از نظر تولید آنزیم ضدتومور L-آسپاراژیناز توانمند است؛ بنابراین برای ادامه پژوهشها به آن توجه شده است.