نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران
2 دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران
3 دانشیار اصلاح نباتات ، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران
4 دانشیار صنایع غذایی، دانشگاه ارومیه، ایران
5 استادیار بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Ethanol made by a biomass is one of the useful strategies in terms of economic and environmental and as a clean and safe energy to replace fossil fuels considered and examined.
Materials and methods: In this study, key enzyme in the production of ethanol (Pyruvate decarboxylase) from Zymomonas mobilis bacteria was isolated and cloned at E. coli bacteria by freeze and thaw method. For gene cloning, we used specific primers of pdc and PCR reaction and then pdc gene isolated and pET 28a plasmid double digested with (Sal I and Xho I) enzymes. Digestion Products were ligated by T4 DNA ligase in 16 °C for 16 hours.
Results: Results of bacteria culture showed that a few colonies containing pET 28a plasmid could grow. Result of colony pcr of pdc gene with specific primers revealed 1700 bp bands in 1% agarose gel electrophoresis. The results of PCR with T7 promotor forward primer and pdc revers primer have proved the accurate direction of integration of pdc gene into plasmid and revealed 1885 bp band. Double digestion of recombinant plasmid with SalI and XhoI enzymes revealed same bands. Finally, RT showed the expected band of 1700 bp that implies the desired gene expression in the samples.
Discussion and conclusion: Due to the increased production of ethanol via pyruvate decarboxylase gene cloning in expression plasmids with a strong promoter upstream of the cloning site can conclude that, pyruvate decarboxylase cloning as a key gene would be useful and according to beneficial properties of E. coli bacteria, transfering the gene to bacteria appears to be reasonable.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
پیشرفتهای اخیر در صنعت و افزایش سرعت شهرنشینی، نیاز به منابع انرژی پایدار را افزایش داده است. اتانول ساختهشده از زیستتوده یکی از راهبردهای بینظیر و سودمند ازنظر اقتصادی و محیطی است و میتواند بهعنوان یک سوخت پاک و ایمن، بهعنوان جایگزینی برای سوختهای فسیلی ملاحظه و بررسی شود. در سراسر جهان مقدار زیادی از زیستتودههای لیگنوسلولزی موجود است که میتواند بهمنظور استخراج و تولید اتانول زیستی استفاده شود (۱).
بیواتانول (اتانول زیستی، الکل اتیلیک زیستی) الکلی است دوکربنه[1]، شفاف بیرنگ با سمیت پایین و با خاصیت زیست تجزیهپذیری و آلودگی کمتر در محیط زیست است. در اثر سوختن اتانول، دیاکسید کربن و آب تولید میشود، مواد اولیه زیستی استفادهشده در تولید بیواتانول عمدتاً منشأ گیاهی دارند، از بعضی مواد اولیه با منشأ حیوانی نیز میتوان بیواتانول تولید کرد (۲). بخش بزرگی از محصولات کشاورزی، ضایعات و پسماندهای محصولات کشاورزی، فراوردههای جانبی صنایع تبدیلی کشاورزی، محصولات و ضایعات فرآوردههای جانبی جنگل و صنایع مربوط، و البته ضایعات و پسماندهای زیستی شهری و صنعتی برای تولید بیواتانول به کار گرفته میشوند (۳). افزایش عملکرد اتانول همگام با بهبود فرایندهای اقتصادی تولید و پیشرفتهای تکنیکی، پارامترهای کلیدی در تولید اتانول هستند. دستیابی به عملکرد بالای اتانول بدین معنی است که باید سویههایی تولید کرد که محصولات جانبی کمتری تولید کنند و قادر به متابولیزهکردن همه قندهای اصلی باشند (۴). یکی از اصلیترین موانع در پیشرفت تولید اتانول زیستی، کمبود میکروارگانیسمهای صنعتی مناسب جهت تبدیل زیستتوده به سوخت اتانول بوده است. تغییر و تبدیل کمی گلوکز به الکل بهوسیله مخمرها و نیز تعدای از باکتریها انجام میگیرد. زیستتودههای لیگنوسلولزی حاوی کربوهیدراتهای پیچیدهای هستند که استفاده از میکروارگانیسمهای همراه را ضروری میکند؛ برای اینکه مخمر قندهای غیرقابلِتخمیر را تخمیر کند. مهمترین این قندها زایلوز است. بیشتربن موفقیتها در زمینه مهندسی باکتریها، هم در مقیاس آزمایشگاهی و هم در مقیاس صنعتی در باکتریهای گرم منفی اشرشیا کلای[2]، زایموموناس موبیلیس[3]و کلبسیلا اکسی توکا[4] مشاهده شده است. باکتری اشرشیا کلای و کلبسیلا اکسی توکا بهطور طبیعی قادر به تخمیر طیف وسیعی از قندها است و بنابراین بیشتر تلاشها در این دو میکروارگانیسم بهمنظور تولید اتانول متمرکز شده است (۵). در فرایندهای صنعتی، مخمرهای اصلی متعلق به جنس ساکارومایسس سرویزیه[5] به کار گرفته میشوند. اگرچه مخمرها سهم بسزایی بهعنوان تولیدکنندگان اتانول دارند، محدودیتهایی نیز نظیر طیف محدود مصرف ماده اولیه، تحمل پایین به الکل و تبعیت کمتر از دستکاری ژنتیکی دارند (۳).زایموموناس موبیلیس بهعنوان یک باکتری گرم منفی میتواند بهعنوان ارگانیسم جایگزین در تولید سوخت اتانول برای مقیاسهای بزرگ در نظر گرفته شود که مقاومت آن به ۱۲۰ گرم/ لیتر (در حدود ۱۲درصد) میرسد (۶). گونههای وحشی زایموموناس موبیلیس تنها قادر به استفاده از گلوکز، فروکتوز و ساکارز هستند؛ برای حل این مشکل از راهبرد دستکارزی ژنتیکی استفاده شده است. به همین منظور و برای برطرفکردن برخی از مشکلات میتوان از روشهای زیر استفاده کرد:
۱. زایموموناس موبیلیس با ژنهای مورد نظر که از سایر موجودات به زایموموناس موبیلیس انتقال یافتهاند؛
۲. انتقال ژنهای مورد نظر از زایموموناس موبیلیس به سایر گونهها (۷).
ایجاد سویههایی از اشرشیا کلای که بهصورت انتخابی محصول اتانول را تولید میکردند از اولین موفقیتهای مهندسی متابولیت بوده است. در این باکتری سویههای وحشی قندها را به مخلوطی از اتانول و اسید آلی تبدیل میکند. اتانول در این باکتری از پیروات و توسط آنزیم پیروات فورمات لیاز[6] تولید میشود. این مسیر تخمیر، نامتوازن است زیرا یک مولکول +NADH,H برای هر پیروات ساختهشده از قند تولید میشود؛ درحالیکه برای تبدیل پیروات به اتانول از طریق این مسیر به دو مولکول NADH,H+ نیاز است. مخمرها و باکتری موبیلیس، پیروات را ازطریق آنزیم الکل دهیدروژناز[7] و پیروات دکربوکسیلاز[8] به اتانول تبدیل میکنند که تنها یک مولکول +NADH,H برای تولید هر مولکول اتانول استفاده میکنند؛ بنابراین انتظار میرود که بیان ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز در باکتری اشرشیا کلای باعث شوند میزان تولید اتانول در این باکتری بهمیزان قابلتوجهی افزایش پیدا کند (۵). کندی[9] و همکاران همسانهسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز جداشده از مخمر را در باکتری اشرشیا کلای با موفقیت انجام دادند و افزایش تولید اتانول در باکتری اشرشیا کلی را بهمیزان ۱۵ گرم/ لیتر نشان دادند، برای این منظور از راهاندازهای قوی استفاده استفاده شد (۸).
همسانهسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز در باکتری کلبسیلا اکسی توکا M5A1، آشکار کرد که درنهایت غلظت اتانول از تخمیر مالت بیش از ۴۰ گرم بر لیتر با کارایی ۴ گرم از اتانول مربوط به زایلوز و ۵ گرم از اتانول مربوط به گلوکز برای هر گرم قند به دست آمد. حداکثر کارایی حجمی در هر ساعت برای دو قند ۰/۲ گرم بر لیتر بود (۹).
گودن[10] و همکاران ژن پیروات دکربوکسیلاز را از باکتری زایموموناس به باکتری سیانوباکتریا سلولوتریکم[11] منتقل کردند (این باکتریها اتوتروف هستند و گلیکوژن اصلیترین منبع ذخیره کربنی آنها است). در مقایسه با سویههای وحشی، سویههای نوترکیب با سرعت رشد یکسان در طول ۱۴۵ ساعت رشد افزایش ۱۵۰درصدی مصرف سلولز و افزایش ۱۸۰درصدی در وزن خشک سلولها را در پی داشت. غلظت محصولات تخمیر استات و اتانول بهترتیب ۹۳ و ۵۳درصد افزایش پیدا کرد. این مطالعات ثابت کرد که تخمیر سلولز که فراوانترین پلیمر موجود در زمین است، میتواند توسط مهندسی ژنتیک بهمقدار زیادی بهبود یابد (۱۰). جیانگ[12] و همکاران و رن[13] و جیانگ ژنهای پیروات دکربوکسیلاز را از مخمر ساکارومایسس سرویزیه[14] و باکتری زایموموناس موبیلیس جداسازی و سپس در پلاسمیدهای بیانی با قدرت بالا (pSC-22b و pZM-22b) قرار دادند. نتایج SDS-PAGE نشاندهنده افزایش بیان پیروات دکربوکسیلاز بود و پروتئین هدف بهمیزان ۶/۱۸درصد افزایش یافت و ۹/۳۷درصد از کل پروتئینهای محلول در سویه میزبان را به خود اختصاص داده بود (۱۱ و ۱۲).
به نظر میرسد یکی از مهمترین مشکلات در بیوسنتز اتانول از مواد زیستی محدودیت عملکرد آنزیمهای درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول باشد. این آنزیمها در تبدیل مواد اولیه به محصول نهایی در باکتری نقش اساسی دارند. با توجه به بررسی منابع و نیز بررسی فرایند تولید، به نظر میرسد افزایش بیان[15] ژن پیروات دکربوکسیلاز تحت کنترل راهاندازهای قوی منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد شد. محصول ژن پیروات دکربوکسیلاز نقش کلیدی در مسیر تولید بیواتانول دارد و در تغییر مسیر مصرف پیروات به سمت تولید بیواتانول مهمترین آنزیم است به همین منظور، همسانهسازی ژن بهعنوان مقدمه دستورزی سنتز بیواتانول از مواد اولیه سلولزی ضروری است و با این هدف ژن پیروات دکربوکسیلاز در باکتری زایموموناس موبیلیس شناسایی شد و با استفاده از روشهای همسانهسازی ژن در باکتری اشرشیا کلای همسانهسازی شد.
مواد و روشها.
پلاسمید و باکتریهای مورد نیاز و شرایط رشدی: باکتری زایموموناس موبیلیس سویه ATCC جهت استخراج ژنوم، و باکتری اشرشیا کلای سویههای Dh5α و BL21 جهت تهیه سلولهای شایسته، نگهداری، تکثیر پلاسمیدهای اصلی و نوترکیب و انتقال ژن استفاده شدند )مرکز منطقهای کلکسیون قارچها و باکتریهای صنعتی[16] ایران- تهران). سویههای باکتری اشرشیا کلای بهصورت مایع و جامد در محیط کشت LB در شرایط دمایی ۳۷ درجه سانتیگراد و شرایط تقریباً خنثی از نظر اسیدیته (حدود۵/۷) کشت شدند. باکتری زایموموناس در محیط کشت رشد باکتری شامل: پپتون ۱۰ گرم، عصاره مخمر ۱۰ گرم، گلوکز ۲۰ گرم، آگار ۱۵ گرم و ۵/۵ pH= در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد کشت شد (۱۳). جهت انتقال ژن پیروات دکربوکسیلاز از پلاسمید pET28a+استفاده شد، این پلاسمید یک پلاسمید باکتریایی مهندسیشده است و دارای جایگاه نشانگر انتخابی مقاومت به آنتیبیوتیک کانامایسین است (پژوهشکده زیست فناوری کشاورزی-کرج).
طراحی آغازگرهای[17] مناسب:در این مرحله براساس الگوی توالی مورد نظر انتخابشده از بانک اطلاعاتی NCBI، با استفاده از انواع نرمافزارهای طراحی آغازگر نظیر OLIGO6,Vector NTI و Fast PCR آغازگرهای مناسب جهت جداسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز طراحی شدند. در طراحی آغازگرهای مورد نظر، جایگاههای برشی آنزیمهای Sal I و Xho I بهترتیب در ابتدای ´۵ آغازگر رفت و برگشت طراحی شد. دلیل این کار وجود این جایگاههای برشی در جایگاه برشی پلاسمید است که ورود ژن به داخل آن بهصورت صحیح را تضمین میکند. (پیش از این نبودِ جایگاه برشی این دو آنزیم در داخل ژن پیروات دکربوکسیلاز با نرمافزار Verctor NTI و سایت nebcutter [18]تأیید شده بود). پس از طراحی آغازگرها، توالی آنها بههمراه آغازگر رفت راهانداز T7 سنتز شد (تکاپو زیست[19]- تهران).
تراریزش پلاسمید بهروش ذوب- انجماد: به سلولهای شایستهای که با استفاده از روش CaCl2تهیه شده بودند (۱۴) بهصورت تدریجی ۵ میکرولیتر از DNAی پلاسمید اضافه شد و ۳۰ دقیقه بر روی یخ نگهداری شدند. با افزایش دما به ۴۲ درجه سانتیگراد شوک حرارتی وارد شد و دوباره به روی یخ انتقال داده شدند، در مرحله بعد محیط کشت تازه LB (بهمنظور رشد باکتریها) اضافه و بهمدت ۲ ساعت با دور۲۰۰ و دمای ۳۷ درجه سانتیگراد گرماگذاری انجام شد. در نهایت سلولهای تراریخته و سلولهای فاقد پلاسمید به محیط کشت حاوی کانامایسین LB منتقل شدند و بهمدت یک شب در انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد گرماگذاری[20] شدند (۱۵).
استخراج پلاسمید:استخراج پلاسمید بهروش مینی پرب[21] انجام شد (۱۶)، در این روش ابتدا به رسوب باکتریهای کشتدادهشده، محلول شماره ۱ سرد اضافه شد و تیوبها بهمدت ۵ دقیقه در دمای محیط نگهداری شدند. محلول شماره ۱ شامل گلوکز استریل، EDTA، Tris-HCl و آب دوبارتقطیر است. این محلول در حفظ فشار اسمزی، تنظیم pH و تضعیف لایه لیپیدی نقش مهمی دارد. سپس محلول شماره ۲ اضافه شد و ویالها ۵ دقیقه در یخ نگهداری شدند. این محلول، شامل SDS (سبب تخریب اجزای لیپیدی و پروتئینی میشود) و NaoH (سبب محافظت کروموزومهای تکرشتهای و دورشتهای پلاسمیدها میشود) است. بعد از ۵ دقیقه محلول شماره ۳ اضافه شد و مجدداً به یخ انتقال یافتند، محلول شماره ۳ شامل استات پتاسیم، اسید استیک و آب است. این محلول در تنظیم pH، رسوب پروتئین، لیپید و DNA کروموزومی که بهشکل توده سفیدرنگ قابلِمشاهده هستند، نقش مهمی دارد. پس از سانتریفوژ هم، حجم مایع شفاف به دست آمد و محلول کلروفرم ایزوآمیل الکل (به نسبت ۱:۲۴) بهمنظور حذف پروتئینها استفاده شد (۱۷)، بهمنظور رسوب باکتریها از الکل ۹۶درصد استفاده شد و بهمدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ شدند، نهایتاً پلاسمید رسوب کرد و مایع رویی دور ریخته شد، درستی استخراج پلاسمید با استفاده از الکتروفورز ژل ۱درصد، رنگ آمیزی شد و با اتیدیوم بروماید بررسی شد (۱۸).
.پیسیآر و بهینهسازی شرایط پیسیآر جهت جداسازی ژنهای مورد نظر: با توجه به اینکه دمای ذوب دو آغازگر (رفت[22] و برگشت[23]) نزدیک به هم بودند، متوسط دمای ذوب آنها یعنی ۵۶ درجه سانتیگراد انتخاب شد و ۲ درجه پایینتر از آن (۵۴ درجه سانتیگراد) بهعنوان دمای اتصال اولیه انتخاب شد و پروفیلهای دمایی مختلف برای دماهای بالاتر و پایینتر از آن، جهت مشاهده نتیجه بهتر اعمال شد.
.هضم دوگانه آنزیمی ژن پیروات دکربوکسیلاز و پلاسمید pET28a توسط آنزیمهای Sal I وXho I:جهت هضم دوگانه ژن و پلاسمید توسط آنزیمهای Sal I (فرمنتاز[24]- آمریکا) و Xho I (فرمنتاز- آمریکا) بایستی شرایط مطلوب بافری برای این دو آنزیم بهطور همزمان ایجاد میشد که جهت ایجاد شرایط مطلوب برای این دو آنزیم از بافر تانگو (فرمنتاز- آمریکا) استفاده شد، مخلوط واکنش که شامل آب، DNA، بافر تانگو و آنزیمهای Sal I و Xho I بود و بهمدت ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شد (۱۵).
.اتصال ژن پیرات دکربوکسیلاز به پلاسمید pET28a توسط آنزیم T4 DNA Ligase:۳ میکرولیتر از پلاسمید pET و ۱۰ میکرولیتر از ژن پیروات دکربوکسیلاز هضم و پس از خالصسازی به کمک کیت وی وانتیس[25] (وی وانتیس- آلمان)، در یک تیوب جدید اضافه شد. بافر لیگاسیون، آب و یک مایکرولیتر از آنزیم لیگاز (فرمنتاز- آمریکا) اضافه شد و تیوبها بهمدت ۱۶ ساعت در دمای ۱۶ درجه سانتیگراد نگهداری شدند (۱۳).
.انتخاب سلولهای نوترکیب در محیط انتخابی حاوی آنتیبیوتیک کانامایسین:در این مرحله جهت انتخاب سلولهای نوترکیب حاوی پلاسمید مورد نظر، سلولها بر روی محیط کشت LB جامد حاوی ۵۰ میلیگرم آنتیبیوتیک کانامایسین کشت و کلونیهای تشکیلیافته در محیط انتخابی جهت انجام آنالیزهای بعدی استفاده شدند.
.انتخاب پلاسمید نوترکیب و تأیید وجود ژنهای مورد نظر از طریق پیسیآر: از کلونیهای رشدیافته در محیط انتخابی، کلونی پیسیآر انجام شد. برای این منظور کلونی باکتری بهعنوان الگوی تکثیر DNA به مخلوط واکنش اضافه شد و پیسیآر با آغازگرهای رفت و برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز انجام شد.
.هضم دوگانه پلاسمیدهای نوترکیب جهت تأیید وجود ژن مورد نظر: در این مرحله پلاسمیدهای استخراجی از کلونیهایی با پیسیآر مثبت جهت هضم آنزیمی استفاده شدند. برای این منظور، مشابه روش بالا هضم آنزیمی با استفاده از آنزیمهای Sal I و Xho I انجام شد.
.انجام پیسیآر با استفاده از آغازگر راهانداز رفت T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز:در این مرحله بهمنظور تأیید صحیحبودن جهت ژن واردشده، به جای استفاده از آغازگرهای رفت و برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز از آغازگر رفت راهانداز T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز برای انجام پیسیآر استفاده شد.
آنالیز RT- PCR:بهمنظور تأیید بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز در باکتری اشرشیا کلای pET 28a pdc از آنالیز RT-PCR استفاده شد، بدین منظور باکتریها بهصورت سه برابر با ۳/۰= OD600 رشد کردند، جهت تحریک عوامل رونویسی برای آغاز رونویسی از پروموتورT7 ، گزیلوز ۵/۰% (w/v) به نمونهها اضافه شد و نمونهها بهمدت سه ساعت در این شرایط نگهداری شدند. پس از سه ساعت نمونهها سانتریفوژ شدند (با دور ۵۰۰۰ بهمدت ۱۰دقیقه در دمای ۴درجه سانتیگراد) و سلولهای بهدستآمده در ویالهای ۱میلی لیتری حاوی محلول تثبیتکننده RNA قرار گرفتند و بهمدت یک روز در دمای ۴ درجه سانتیگراد و سپس تا زمان استفاده در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. RNA تام براساس دستورالعمل کیت Total RNA Extraction Kit استخراج شد و بهوسیله الکتروفورز و اسپکتروفتومتری کمیت و کیفیت آن تعیین شد.
RNA تام استخراجشده، براساس دستورالعمل کیت Roche) Titan on tube RT_PCR، آلمان) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای ژن پیروات دکربوکسیلاز (آغازگر استفادهشده در PCR) در آنالیز RT-PCR استفاده شد. همچنین آغازگرهای اختصاصی s rRNA18 برای تکثیر رونوشت آن بهعنوان کنترل داخلی به کار رفت. برای سنتز cDNA دورشتهای بهطور همزمان در یک ویال طبق جدول ١ انجام و محصول RT-PCR حاصل در ژل آگارز ۱درصد بررسی شد.
نتایج.
نتایج کشت هوازی باکتری اشرشیا کلای در محیط کشت LB و کشت بیهوازی باکتری زایموموناس موبیلیس در محیط کشت مایع و جامد مخصوص این باکتری نشان داد که شرایط برای رشد و تکثیر آنها بهینه است و بهراحتی تشکیل کلونی دادند(شکل ۱).
جدول ۱- برنامه تکثیر آغازگرهای اختصاصی برای RT_PCR
|
چرخه |
مراحل |
دما (درجه سانتیگراد) |
زمان (دقیقه) |
|
1X |
واسرشتسازی اولیه |
95 |
10 |
|
1X |
واسرشتسازی |
94 |
6 |
|
اتصال |
54 |
2 |
|
|
بسط |
72 |
40 |
|
|
35X |
واسرشتسازی |
94 |
1 |
|
اتصال |
54 |
2 |
|
|
بسط |
72 |
5 |
شکل ۱- تشکیل کلونی باکتری در محیط کشت LB در شرایط دمایی ۳۷ و ۳۰ درجه سانتیگراد، الف: باکتری زایموموناس موبیلیس ب: اشرشیاکلای
.جداسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز توسط پیسیآر: نتایج الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد محصولات پیسیآر تکثیر باندهایی با اندازه تقریبی ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد (شکل ۲). با توجه به باندهای مشاهدهشده در ژل الکتروفورز، این نتایج آشکار کرد که تمامی دماهای اعمالشده باعث تکثیر ژنهای مورد نظر بهصورت اختصاصی میشوند (شکل ۲).
.خالصسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز از ژل
آگارز: نتایج الکتروفورز خاصسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز از ژل آگارز ۱درصد نشان داد که این ژن بهخوبی از ژل خالص و باندهای آن بهصورت مشخص بر ژل قابلِمشاهده است. باندها عاری از هرگونه آلودگی و بدون شکستگی بودند (شکل ۳).
شکل ۲- الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد جداسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز از ژنوم باکتری زایموموناس موبیلیس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن pdc با استفاده از پیسیآر، پروفیلهای دمایی مختلف پیسیآر (چاهکها بهترتیب ۱- مارکر ۱۰۰۰۰ جفت باز و چاهکهای ۲ تا ۵ باندهای مربوط به محصولات پیسیآر ژنوم باکتری زایموموناس موبیلیس با آغازگرهای طراحیشده در دماهای مختلف که بهترتیب دماهای ۵۲، ۵۴، ۵۶ و ۵۸ درجه سانتیگراد است.)
(الف) (ب)
شکل ۳- خالصسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز از ژل آگارز ۱درصد: الف. برش ژن پیروات دکربوکسیلاز از روی ژل آگارز. ب. محصول خالصسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز از ژل بر روی ژل آگارز ۱درصد (چاهک بهترتیب ۱- مارکر ۱۰۰۰۰ جفت باز، ۲، ۳، ۴ و ۵ ژن خالصسازیشده از ژل)
.استخراج پلاسمید به روش مینی پرب پس از افزایش تعداد کپی آن: الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد استخراج موفق پلاسمید pET 28a از باکتری اشرشیا کلای را بهروش مینیپرب آشکار کرد (شکل ۴).
.هضم دوگانه پلاسمید pET 28a و ژن پیروات دکربوکسیلاز توسط آنزیمهای Sal I و Xho I:در این مرحله ابتدا بهمنظور تأیید عملکرد صحیح آنزیمهای برشی Sal I و Xho I، پلاسمید pET 28a توسط هرکدام از این آنزیمها بهصورت تکی برش یافت. در صورت عملکرد صحیح این آنزیمها پلاسمید از یک نقطه برش میخورد و بهصورت خطی در میآمد که در این صورت اندازه آن (حدود ۵۰۰۰ جفت باز) نیز روی ژل قابلمشاهده میشد (شکل ۵ و ۶).
شکل ۴- الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد استخراج پلاسمید
(۱- مارکر ۱۰۰۰۰ جفت باز، ۲- پلاسمید pET 28a)
.همسانهسازی ژن پیروات دکربوکسیلاز در پلاسمید pET 28a:پس از انجام واکنش اتصال آنزیمی توسط آنزیم لیگاز، ژن پیروات دکربوکسیلاز و ناقل pET 28a برشیافته توسط آنزیمهای Sal Iو Xho I توسط آنزیم لیگاز به همدیگر متصل و سازه نوترکیبpET 28a pdc ایجاد شد (شکل ۷).
.تراریزش باکتری اشرشیا کلای توسط پلاسمید نوترکیب pET 28a pdc:پس از تراریزش سلولهای شایسته، باکتریها با استفاده از روش ذوب-انجماد و کشت در محیط کشت LB حاوی آنتیبیوتیک کانامایسین، کلونهای رشدیافته در این محیط بهعنوان سلولهای نوترکیب حاوی پلاسمید مورد نظر شناسایی و جهت انجام ادامه آزمایشها آنالیز شدند. تمامی باکتریهایی که حاوی هر یک از این پلاسمیدها هستند، قادر به رشد در محیط حاوی کانامایسین هستند (شکل ۸)؛ بنابراین در مراحل بعدی برای تعیین باکتری نوترکیب حاوی ژن مورد مطالعه، بهصورت صحیح غربال باکتریهای مورد نظر انجام شد.
شکل ۵- نتایج الکتروفورز هضم آنزیمی پلاسمید pET 28a توسط آنزیمهای Sal I و Xho I (چاهک شماره ۱- مارکر ۱۰۰۰۰ جفت باز، چاهک ۲ و ۳ برش پلاسمید توسط آنزیم Sal I، چاهک ۴ و ۵- برش پلاسمید توسط آنزیم Xho I).
شکل ۶ - الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد هضم آنزیمی ژن pdc توسط آنزیمهای SalI و XhoI (چاهک شماره ۱ -مارکر، چاهک شماره ۲- برش ژن پیروات دکربوکسیلاز)
شکل ۷- سازه نوترکیب pET 28a pdc ژن پیروات دکربوکسیلاز در ناقل pET 28a تحت کنترل راهانداز T7
کلونی پیسیآر و انتخاب کلونیهای حاوی پلاسمیدهای نوترکیب: از کلونیهای رشدیافته در محیط انتخابی حاوی ۵۰ میلیگرم در لیتر کانامایسین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پیروات دکربوکسیلاز، کلونی پیسیآر انجام شد. این روش، یکی از روشهای سریع جهت بررسی کلونیهای نوترکیب است. نتایج الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که امکان شناسایی تعدادی از کلونیهای نوترکیب حاوی ژن مورد نظر با استفاده از کلونی-PCR وجود دارد و باند مورد نظر (۱۷۰۰ جفت باز) تکثیر شد (شکل ۹).
شکل ۸- تشکیل کلونی باکتریهای اشرشیا کلای ترانسفورمشده در محیط LB حاوی ۵۰ میلیگرم آنتیبیوتیک کانامایسین
شکل ۹- الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد محصول کلونی-PCR ژن پیروات دکربوکسیلاز. ۱: مارکر۱۰۰۰۰ جفت باز، ۲: کنترل منفی (آب)، ۳: کنترل مثبت (ژنوم باکتری پیروات دکربوکسیلاز) ۴-۱۴: کلونیهای (۶ و ۹ جواب مثبت).
.استخراج پلاسمیدهای حاوی ژن پیروات .دکربوکسیلاز و هضم دوگانه آن توسط آنزیم برشی: پلاسمید کلونیهایی که در مرحله قبل نسبت به کلونی-PCR جواب مثبت داده بودند استخراج شد و هضم دوگانه بهمنظور تأیید دوباره وجود ژن انجام شد. نتایج الکتروفورز هضم دوگانه توسط آنزیمهای Sal I و Xho I آشکار کرد که پس از انجام هضم آنزیمی دو باند در پلاسمیدهای نوترکیب شامل پلاسمید خطیشده (۵۰۰۰ جفت باز) و ژن (۱۷۰۰ جفت باز) پیروات دکربوکسیلاز بر روی ژل آگارز ظاهر میشوند (شکل ۱۰).
.تأیید سازه pET 28a pdc بهوسیله پیسیآر با .آغازگرهای رفت راهانداز T7 و برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز: بهمنظور تأیید اتصال صحیح ژن و امکان بیان بعدی آن، با استفاده از آغازگر رفت راهانداز T7 و آغازگر برگشتی ژن پیروات دکربوکسلاز واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شد. الکتروفورز محصول PCR با آغازگرهای رفت راهانداز T7 و وآغازگر برگشتی ژن پیروات دکربوکسیلاز جهت صحیح ورود ژن در پلاسمید pET28a را نشان داد. در صورت واردشدن صحیح ژن باندهای مربوط به پیروات دکربوکسیلاز بایستی ۱۸۵ جفت باز پیوسته بزرگتر از ژن پیروات دکربوکسیلاز میشد؛ زیرا با توجه به این که ژن پیروات دکربوکسیلاز مقابل راهانداز T7 قرار داده شده بود و اندازه این راهانداز تا ابتدای جایی که ژن در پلاسمید درج شده است ۱۸۵ جفت پیوسته است و اندازه نهایی باندهای تکثیریافته در حدود ۱۸۸۵ جفت باز است (شکل ۱۱).
شکل ۱۰- الکتروفورز ژل آگارز ۱درصد هضم دوگانه ژن (۱: مارکر ۱۰۰۰۰ جفت باز، ۲: هضم دوگانه پلاسمید نوترکیب حاوی ژن، ۳: هضم دوگانه پلاسمید شاهد بدون ژن)
شکل ۱۱- الکتروفورز ژل آگارز محصول PCR پلاسمید نوترکیب با استفاده از آغازگر رفت راهانداز T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز
.بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز در سطح mRNA: بهمنظور بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز در باکتریهای تراریختشده اشرشیا کلای pET 28a pdc از آنالیز RT-PCR استفاده شد. در این آنالیز از ژن s rRNA18 بهعنوان کنترل داخلی بهصورت نسبت ۱:۱ با پرایمر s rRNA18 و 18s rRNA –competimer، بهمنظور کنترل میزان تکثیر آن استفاده شد. پلاسمید نوترکیب pET 28a pdc بهعنوان کنترل مثبت باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را تولید کرده است. واکنش RT بدون RNA الگو بهعنوان کنترل منفی اول هیچ نواری تشخیص داده نشد که نبودِ باند در آنها نشان از آلودهنبودن واکنش RT با هرگونه DNA حاوی توالی ژن پیروات دکربوکسیلاز بود. باکتریهای غیرتراریخته بهعنوان کنترل منفی دوم و واکنش RT (تیمارشده با RNase عاری از DNase) و انجام واکنش با آنزیم Taq DNA polemeraseبهعنوان کنترل منفی سوم بود؛ نبودِ باند در این چاهک نشاندهنده آلودهنبودن نمونهها به هرگونه DNA بود. باکتریهای تراریخت مثبت در واکنش RT باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را نشان دادند که حاکی از بیان ژن مورد نظر در این نمونهها بود (شکل ۱٢).
شکل ۱۲-آنالیز RT- PCR برای کلونیهای باکتری E. coli pET 28a pdc، ۱: نشانگر Kb DNA Ladder (Fermantas)۱، ۲: واکنش RT بدون RNA الگو بهعنوان کنترل منفی اول، ۳: باکتری غیرتراریخته بهعنوان کنترل منفی دوم، ۴:پلاسمید نوترکیب pET 28a pdc بهعنوان کنترل مثبت، ۵: باکتری تراریخته E. coli pET 28a pdc، ۶: واکنش RT (تیمارشده با RNase عاری از DNase) و انجام واکنش با آنزیم Taq DNA polemerase بهعنوان کنترل منفی سوم
بحث و نتیجه گیری.
افزایش قیمت نفت در چندین سال اخیر، کاهش منابع فسیلی، تجدیدپذیر نبودن این سوختها و نگرانیهای زیستمحیطی منجر به افزایش علاقه جهانیان به تولید سوختهای زیستی شده است. سوختهای زیستی تجزیهپذیرند و میتوانند جایگزین سوختهای فسیلی و باعث کاهش گازهای گلخانهای شوند، همچنین تولید آنها باعث میشود کشورها از لحاظ نیاز به سوختهای فسیلی، وابسته نباشند (۱۹).
سلولز بعد از اینکه عملیات پیشتیمار و شیرینسازی آنزیماتیک بر آن انجام شد به منوساکاریدهایی مثل گلوکز، زایلوز و پنتوزهایی که میتوانند بهوسیله میکروارگانیسمها استفاده شوند، هیدرولیز میشود. همه این منوساکاریدها به ماده حد واسط مهم متابولیک یعنی پیروات از طریق مسیر امبدن میرهوف[xxvi] و انتنر دودروف[xxvii] و تعدادی مسیر دیگر تبدیل میشوند. تبدیل پیروات به استالدئید و CO2 توسط آنزیم پیروات دکربوکسیلاز یک مرحله حیاتی در فرایند تخمیر اتانول است. سرانجام استالدئید بهوسیله الکل دهیدروژنازII و در حضور NADH به اتانول تبدیل میشود. در این فرایند تولید، آنزیمهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژنازII برای میکروارگانیسمهایی که بهمیزان کم و یا اصلاً الکلی تولید نمیکنند بسیار مهم هستند. در حال حاضر، بهدلیل حضور آنزیمهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز در میکروارگانیسمهای زایموموناس موبیلیس و ساکارومایسس سرویزیه، از آنها بهطور گسترده در فرایند تخمیر الکلی استفاده میشود. گفتنی است که توالی کدکننده این ژنها در این دو میکروارگانیسم متفاوت است. ژن ساختاری پیروات دکربوکسیلاز از زایموموناس موبیلیس، ۱۷۰۷ نوکلئوتید طول دارد که پلی پپتیدی بهاندازه ۵۶۸ اسید آمینه بهوزن ۷۹۰.۶۰ دالتون را کد میکند. چهارچوب خواندن اصلی ژن ۱۶۴۷ جفت پیوسته است. رونویسی از ژن در ۳۰- و پایان رونویسی ۱۰۰ پیوسته پایین دست از کدون پایان اتفاق میافتد (۲۰).
پیروات دکربوکسیلاز یکی از آنزیمهای کلیدی و مشترک در تمامی موجودات تولیدکننده اتانول است. اگرچه این آنزیم بهطور وسیع در گیاهان، مخمرها و قارچها توزیع شده است، این آنزیم در جانوران وجود ندارد و در باکتریها نادر است (۲۱). فعالیت این آنزیم در باکتری زایموموناس موبیلیس در حدود۶۰۰ (میکرومول. دقیقه۱-) است که بالاتر از هر منبع دیگری است. این میزان فعالیت بالای آنزیم را حتی مخمرها نیز ندارند(۲۲).
استفاده از میکروارگانیسمهای زایموموناس موبیلیس و ساکارومایسس سرویزیه در تولید صنعتی اتانول با محدودیتهایی نظیر تحمل به اتانول، تحمل به اسید، توانایی تجزیه سلولز، محدودیت متابولیسم منوساکاریدها و ... مواجه هستند (۲۳).
بینگ زائو[xxviii] و همکاران طی پژوهشهایی به این نتیجه رسیدند که عملکرد تولید اتانول به بیان سطوح بالایی از ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز که در سرعت و کارایی تولید اتانول تاثیر میگذارند و بهعنوان فاکتورهای مهم وکلیدی در مسیر کاتابولیک تخمیر اتانول هستند، بستگی دارد. بنابراین همسانهسازی ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز از باکتری زایموموناس موبیلیس با ساخت یک پلاسمید بیانی و بیان این ژنها بهصورت ژنتیکی در سویههای مختلف هدف محققان برای کاربرد مهندسی ژنتیک بهمنظور بهبود تجزیه سلولز و تولید اتانول است (۲۳).
ژن پیروات دکربوکسیلاز بهدلیل نقش کلیدی که در متابولیسم پیروات و تولید اتانول دارد و همچنین میزان فعالیت بالای این ژن در باکتری زایموموناس موبیلیس، بهعنوان ژن کاندید جهت جداسازی و همسانهسازی در این پژوهش انتخاب شد.
بهدلیل نقش مهم متابولیسم پیروات، پژوهش بر ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز دارای اهمیت بیشتری در جهت ساخت سویههای مهندسی ژنتیک است که میتوانند در تخمیر و هیدرولیز سلولز به اتانول استفاده شوند. از دهه ۱۹۹۰ تاکنون پژوهش بر ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز افزایش یافته است (۵).
در پژوهشی که اینگرام[xxix] و همکاران انجام دادند، ژن پیروات دکربوکسیلاز از باکتری زایموموناس موبیلیس به باکتری اشرشیا کلای انتقال یافت. مقایسه سویههای والدینی و نوترکیب از باکتری اشرشیا کلای نشان داد که میزان تولید اتانول زیستی در باکتریهای نوترکیب افزایش مییابد، این بدین معنی است که جریان کربن بهطور مؤثر از پیروات به سوی تولید اتانول روانه میشود (۲۴). باکتری زایموموناس موبیلیس تنها میکروارگانیسمی است که گلوکز را بهطریق بیهوازی از مسیر انتنردودرف متابولیزه میکند. تمامی آنزیمهای درگیر در مسیر تخمیر با تمام توان بیان میشوند (۲۵).
تولان و فین[xxx] یک پلاسمید چند کپی شامل ژن پیروات دکربوکسیلاز از زایموموناس موبیلیس با اندازه ۱۷۰۷ جفت باز را تهیه و به باکتری کلبسیلا spp منتقل کردند. بعد از غربال سویهها، آنها سویه نوترکیبی از کلبسیلا پلنتی کلا[xxxi] ATCC 33531 را به دست آوردند که بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز بهطور چشمگیری در آن افزایش یافته بود. ژن بیانشده در باکتری کلبسیلا بر ژل الکتروفورز باندی بهاندازه ۱۷۰۷ جفت باز نمایان کرد. عملکرد اتانول در این سویه نوترکیب از زایلوز ۳/۱ مول/مول (۲۵/۱ گرم/ لیتر) بود. همزمان با افزایش اتانول، افزایش قابلملاحظهای در عملکرد فورمات، استات، لاکتات و بوتاندیال مشاهده شد. این محققان همچنین ژنهای پیروات دکربوکسیلاز و الکل دهیدروژناز II از باکتری زایموموناس موبیلیس را به باکتری اروینیا spp[xxxii] منتقل کردند. ژن پیروات دکربوکسیلاز بر روی ژل آگارز باندی بهاندازه۱۷۰۰ جفت باز و ژن الکل دهیدروژناز باندی بهاندازه ۱۱۵۰ جفت باز را نمایان کردند. بیان این ژنها بهطور قابلملاحظهای عملکرد اتانول را (در زایلوز از ۷/۰ مول/ مول به ۴/۱) افزایش و عملکرد فورمات، استات و لاکتات را کاهش داد (۲۶). در این پژوهش ژن پیروات دکربوکسیلاز از باکتری زایموموناس موبیلیس با اندازه ۱۷۰۰ جفت باز جداسازی شد. پس از انتقال این ژن به باکتری اشرشیا کلای، این ژن بر روی ژل الکتروفورز باندی با اندازه ۱۷۰۰ جفت باز را نمایان کرد.
با توجه به پژوهشهای انجامشده بر این ژن توسط محققان میتوان چنین نتیجه گرفت که ژن پیروات دکربوکسیلاز از باکتری زایموموناس موبیلیس اصلیترین و کلیدیترین ژن تولیدکننده الکل است و همچنین آنزیمهایی که تولید کرده، دارای بیشترین فعالیت آنزیمی در میان تمامی آنزیمهای مشابه در دیگر میکروارگانیسمها است که همسانهسازی و انتقال این ژن از این باکتری به دیگر میکروارگانیسمها همواره باعث افزایش تولید اتانول شده است؛ بنابراین در این پژوهش، این ژن جهت جداسازی و همسانهسازی انتخاب شد. هدف اصلی در این پژوهش همسانهسازی ژن مدِنظر بود ولی جهت بیان مناسب و افزایش تولید آنزیم پیروات دکربوکسیلاز، این ژن تحت راهانداز قوی T7 در داخل پلاسمید pET 28a قرار داده شد و به باکتری اشرشیا کلای انتقال یافت. انتظار میرود با افزایش بیان این ژن تحت پروموتور قوی T7، در باکتری اشرشیا کلای میزان تولید اتانول در این باکتری نیز افزایش یابد.
[1]- C2H5OH
[2]- Escherchia coli
[3]- Zymomonas mobiles
[4]- Klebsiella oxytoca
[5]- Saccharomyces cereviseae
[6]- PFL
[7]- ADH
[8]- PDC
[9]- Candy
[10]- Guedon
[11]- Cyanobacteria cellulotricum
[12]- Jiang
[13]- Ren
[14]- Sacharomyces cervisiae
[15]- Over Expression
[16]- PTCC
[17]- Primer
[18]- www.nebcutter.com
[19]- Takapouzist
[20]- incubation
[21]- Miniprep
[22]- Forward
[23]- Reverse
[24]- Fermentase
[25]- Vivantis
[xxvi]- EMP
[xxvii]- ED
[xxviii]- Bingzhao
[xxix]- Ingram
[xxx]- Tolan and Finn
[xxxi]- Klebsiella planticula
[xxxii]- Erwinia spp
)