مقدمه.

قارچ‌ها جزء یوکاریوت‌های پستی هستند که فضای امیدبخشی را در پژوهش‌های زیست‌فناوری ایجاد کرده‌اند. این موجودات به‌ دلیل داشتن ویژگی رشد خوب در محیط‌های متفاوت، پژوهش‌های بسیاری را به خود جلب کرده است (1- 2). امروزه از قارچ‌ها به‌شکل گسترده‌ای در صنعت کشاورزی و پزشکی استفاده می‌شود که این امر مرهون قابلیت این موجودات در سنتز آنزیم‌های تک‌یاخته‌ای، انواع اسیدهای آلی، پروتئین و روغن‌های تک‌سلولی[1] است (3- 4).

قارچ Mortierella alpina قارچی رشته‌ای، خاکزی و از راسته زیگومیست‌ها[2] است که منبع مهم و سرشاری از انواع اسیدهای چرب غیراشباع به‌ویژه آراشیدونیک اسید است (5). آراشیدونیک اسید میکروبی از سال 1998 در فرمول غذایی کودک در استرالیا و نیوزلند استفاده می‌شد. در برخی از کشورهای اروپایی نیز از سال 1994 در فرمول غذای کودک اضافه شد. در سال 2001 تا 17درصد فرمول غذای کودک آراشیدونیک اسید میکروبی استفاده می‌شد که در مدت 6 ماه به‌حدود 78درصد رسید (6). کارلسون[3] و همکاران در سال 1993 پیشنهاد دادند که آراشیدونیک اسید بهبود رشد کودکان نارس در سال اول زندگی‌شان را به دنبال دارد (7).

تاکنون روش‌های مختلف تراریختی از جمله تراریختی پروتوپلاست قارچی، استفاده از تفنگ ژنی، تیمار با لیتیوم استات، الکتروپوریشن و استفاده از Agrobacterium در قارچ‌ها به کار برده شده است (8- 16). ویژگی‌های بارز تراریختی با واسطه Agrobacterium از این قرار است: بازده بالای تراریختی، پایین‌بودن هزینه تراریختی و قابلیت استفاده از بافت‌های هدف مختلف (17). تراریختی مخمر Sacharomyces cerevisaeبا کمک A. tumefaciens در سال 1995 بانداک[4] و همکاران گزارش شد (18). گووکا[5] و همکاران نیز در سال 1999 تراریختی‌های موفقی را در قارچ‌های رشته‌ای توسط A. tumefaciensگزارش کرده‌اند(18 و 19). اولین گزارش تراریختی قارچ رشته‌ای با استفاده از A. rhizogenes توسط وی[6] و همکارانش در سال 2010 ارایه شد (20).

 با توجه به بررسی مطالعات پیشین هدف از اجرای این پژوهش، بررسی و معرفی روشی با بازده بالا و کم‌هزینه جهت تراریختی قارچ M. alpina بود. به این منظور با استفاده از باکتری‌های A. tumefaciens و A. rhizogenes، میسلیوم‌های قارچ تراریخت شدند و بازده تراریختی و پایداری میتوزی بررسی و مقایسه شد.

‏‏مواد و روش ‏ها.

در این پژوهش از قارچ 754/68 alpina CBS M. که از مجموعه میکروبی کشور هلند به‌صورت میسیلیوم در لوله آزمایش شیب‌دار خریداری شده بود و از باکتری‌های A. rhizogenes سویه ATCC15834 و A. tumefaciens سویه LBA4404 که هر دو حاوی ناقل pBI121 بودند استفاده شد.

به‌منظور شناسایی نشانگر مناسب برای تراریختی قارچ چهار نشانگر، آنتی بیوتیک کانامایسین و هیگرومایسین B با غلظت‌های 50 تا 400 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، سنجش فلوروسنت داخلی (بررسی میسیلیوم‌های قارچی زیر میکروسکوپ فلوروسنت) و ژن نشانگر gus بررسی شد.

جهت تراریختی این قارچ از محیط‌های کشت القا[7] و هم کشتی[8] (16)، برای رشد و نگهداری قارچ از محیط کشت مالت اکسترکت آگار و برای رشد باکتری‌ها از محیط کشت Luria-Bertani استفاده شد.

جهت شناسایی بهترین سن ریسه برای تراریختی از ریسه‌های 1، 3 و 6 روزه استفاده شد. برای القای تراریختی قارچ توسط باکتری از محیط کشت القا استفاده شد. اجزای این محیط کشت عبارت بودند از (16):

(10 mM K₂HPO₄, 2.5 mM NaCl, 10mMKH₂PO₄, 2mMMgSO₄.7H₂O, 0.7mM CaCl₂, 9 μM FeSO₄.7H₂O, 4 mM (NH4)2SO4, 10 mM glucose, 0.5% glycerol (w/v), 200 μM acetosyringone, 40 mM 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid (MES), pH:5.3 )

محیط کشت هم کشتی دارای اجزایی تقریباً مشابه با محیط کشت القاء بود؛ با این تفاوت که مقدار گلوکز از 10 میلی‌مولار به 5 میلی‌مولار تقلیل یافته بود و 5/1درصد آگار برای ایجاد محیط کشت جامد به آن افزوده شده بود (16).

از محیط کشت مالت اکسترکت آگار حاوی 200 ماکرومولار آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم[9] برای حذف سلول‌های باکتریایی استفاده شد.

برای تهیه سلول‌های قارچی موردنیاز جهت تراریختی 3 روز پس از کشت سویه قارچی، به کمک لوپ، ریسه‌های قارچی از روی محیط کشت مالت اکسترکت آگار جمع‌آوری شد و در دو و نیم میلی‌لیتر آب مقطر استریل محلول شد. به هر 10 میلی‌لیتر محیط کشت القاء 100 ماکرولیتر سلول‌های باکتریای تازه از کشت شبانه (OD₆₆₀=0.6) و 100 ماکرولیتر از سوسپانسیون سلول‌های قارچی اضافه شد. استوسیرنگون در این محیط کشت به‌منظور فعال‌سازی ژن‌های vir باکتریایی اضافه شد.

سپس محیط کشت در شیکر انکوباتور با دمای 27 درجه سانتی‌گراد و سرعت 150 دور در دقیقه نگهداری شد. پس از طی تیمارهای 1، ۲ و 3 ساعته محیط کشت القاء به‌مدت 3 دقیقه با دور 4000 در دمای اتاق سانتریفوژ شد. 7 میلی لیتر از مایع رویی بیرون ریخته شد و مابقی به محیط کشت هم کشتی که سطح آن با فیلترهای غشایی پوشانده شده بود، منتقل شد. مخلوط سوسپانسیون سلول‌های قارچی و باکتریایی به‌مدت 5 روز در این محیط و در انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. سپس جهت جلوگیری از رشد سلول‌های باکتریایی، فیلترهای غشایی به محیط کشت انتخاب‌گر مالت اکسترکت آگار حاوی سفوتاکسیم منتقل شدند که این عمل 4 تا 5 بار به فواصل یک تا دو روز تکرار شد. پس از گذشت حدود 7 روز از ظاهرشدن کلونی‌های قارچی و با اطمینان از نابودی تمام سلول‌های باکتریای از طریق مشاهده زیر میکروسکوپ و کشت دوباره در محیط کشت بدون آنتی‌بیوتیک و رشدنکردن سلول‌های باکتری در روی محیط کشت، رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS با جداکردن قسمتی از کلونی‌های قارچی رشدکرده انجام شد و در محلول رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS در تاریکی به‌مدت 5 تا 7 روز قرار داده شد (21). با به‌دست‌آوردن نسبت تعداد کلونی‌هایی که به آزمون GUS جواب مثبت داده بودند به کل کلونی‌های رشدکرده، راندمان تراریختی به دست آمد. به‌طور تصادفی از قارچ‌هایی که بیان ژن gus  در آن‌ها مثبت بود هشت کلونی انتخاب و استخراج DNA به‌روش صفایی و همکاران[10] در سال 1384 انجام گرفت (22). این DNA جهت آزمون PCR استفاده شد. آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای[11] پیش‌برنده و معکوس برای راه‌انداز[12] انجام گرفت. اثبات وجود این راه‌انداز در قارچ، درواقع اثبات ورود قطعه خارجی به قارچ و تراریخت‌شدن آن است.

توالی آغازگر برای راه‌انداز CaMV 35S عبارت بودند از: آغازگر پیش‌برنده

5′ GCTCCTACAAATGCCATCA 3′

و آغازگر معکوس

 5′ GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3′

شرایط دمایی واکنش PCR عبارت بود از واسرشت‌سازی 94 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه، اتصال 64 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه و طویل‌شدن 72 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه که 30 سیکل تکرار می‌شد.

به‌منظور بررسی میزان پایداری ژنتیکی در کلونی‌های قارچی تراریخت 10 روز پس از کشت در محیط کشت مالت اکسترکت آگار جدید بار دیگر آزمون رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS بر روی قارچ‌های تراریخت انجام گرفت. ورود و بیان ژن خارجی gus با این رنگ‌آمیزی اثبات می‌شود. با بررسی تعداد کلونی‌های قارچ‌هایی که تغییر رنگ داده بودند نسبت به تعداد کل کلونی‌های آزمون‌شده هیستوشیمیایی، میزان پایداری میتوزی ژنتیکی برآورد می‌شد. این آزمون برای نسل T2 نیز تکرار شد.

نتایج.

مقایسه میزان رشد میسلیوم‌های قارچی در محیط‌های کشت حاوی کانامایسین و هیگرو مایسین B نشان داد که هیچ‌کدام از این آنتی‌بیوتیک‌ها، اثر بازدارنده‌ای بر روی رشد قارچ ندارند. بررسی میسیلیوم‌های قارچی زیر میکروسکوپ فلوروسنت، وجود میزان زیادی از فلوروسنت داخلی را در تیپ وحشی این قارچ نشان داد که این امکان استفاده از ژن gfp به‌عنوان ژن گزارشگر را سلب می‌کرد (شکل 1).

شکل 1- میزان بیان بالای فلورسنت داخلی در تیپ وحشی قارچ M. alpinaسویه CBS 754/68

شکل 2- مقایسه بافت قارچی تراریخت A) و غیرتراریخت (B) M. alpina در پاسخ به رنگ‌آمیزی هیستو شیمیایی GUS

با مقایسه نشانگرهای آزمون‌شده ژن نشانگر gus  برای تراریختی این قارچ انتخاب شد)شکل 2).

در بررسی سن مناسب ریسه برای تراریختی، نتایج نشان از مناسب‌بودن ریسه 3روزه بود. زیرا با توجه به رشد اندک میسیلیوم‌ها بر روی محیط کشت در روز اول جداسازی میسیلیوم‌های قارچی امکان‌پذیر نبود و در قارچ‌های 6روزه پلیت قارچی تشکیل‌شده پس از جدایی از محیط کشت به‌سختی در آب استریل از هم جدا می‌شد و سلول‌های قارچی اغلب به‌صورت توده‌ای به‌هم‌پیوسته بودند که بی‌تردید بر روی انتقال ژن به‌طور مستقیم بر روی تک‌تک سلول‌های قارچی اثر عکس به جا می‌گذاشت. جداسازی سلول‌های میسیلیومی 3روزه از هم، با ورتکس شدید راحت‌تر انجام می‌گرفت و سوسپانسیون سلولی مناسب‌تر و یکنواخت‌تری را ایجاد می‌کرد. به‌این‌ترتیب، تک‌ریسه‌های سه‌روزه با باکتری دارای پلاسمید pBI121 تراریخت شد و بیان ژن gus در کلونی‌های رشدیافته از تک‌ریسه تراریخت، ارزیابی شد (شکل 3).

 بررسی داده‌های به‌دست‌آمده از آزمایش مدت‌زمان القا و نوع باکتری (جدول 1) به‌وضوح بیانگر این نکته بود که مدت‌زمان القای سلول‌های قارچی بااگرو باکتریوم به‌میزان زیادی بر روی فراوانی سلول‏های تراریخت اثرگذار است؛ به این دلیل که استوسیرینگون اضافه‌شده به محیط کشت القا بر ژن‏های vir باکتری تأثیر مستقیم دارد و درنهایت باعث افزایش بازده تراریختی می‌شود (جدول 1).

راندمان تراریختی در هنگام استفاده از
A. tumefaciens بیش از A. rhizogenesبود؛ اما پایداری میتوزی تراریخت‌های حاصل از A. rhizogenesبیش از تراریخت‌های حاصل از A. tumefaciensبود (جدول 1).

با مشاهده باند موردنظر ( قطعه 200 جفت بازی) در نتایج آزمون زنجیره‌ای پلیمراز انجام‌شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز CaMV 35S  بر روی هشت کلونی منتخب، انتقال ژن gus را در سطح مولکولی تأیید کرد (شکل 4).

شکل 3- عکس میکروسکوپی تک‌ریسه (10X) بافت قارچی تراریخت M. alpina با پلاسمید pBI121 حاوی ژن gus

جدول 1- اثر نوع باکتری و مدت‌زمان تیمار بر روی درصد تراریختی و اثر نوع باکتری بر روی پایداری میتوزی

شکل 4- محصولات PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز CaMV 35S از ژنومقارچ M. alpina. M: 1Kb ladder (Fermentas). 1: کنترل مثبت (ناقل(pBI121،2 و 7: قارچ M. alpina غیرتراریخت بدون بیان ژنgus، 4-6: قارچ‌های تراریخت دارای بیان ژن gus، 3: کنترل منفی (واکنش بدون الگو)