نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 استادیار بیوتکنولوژی میکروبی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تبریز، ایران
2 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه زابل، ایران
3 دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه زابل، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: The chemical fungicides are used widely in the world. To reduce the application of synthetic fungicides in treating plant diseases, biological methods are considered as an alternative way to control plant diseases. Many actinomycetes, particularly Streptomyces species are biological agents against a broad spectrum of fungal plant pathogens. The purpose of this study was using the kitinolitik actinomycetes isolated from soil of Eastern Azerbaijan province In order to produce biological pesticides.
Materials and methods: Soil samples were taken from different areas of Eastern Azerbaijan province. According to Streptomyces morphological features, single colonies were isolated. To identify the bacteria by molecular characteristic, the genomic DNA was extracted and then the sequences of 16S rDNA were replicated. By using specific primers the bacterial isolates containing chitinase gene were screened. The isolates consisted Chitinase enzyme and were antagonistically cultured with Alternaria genus which is a fungal plant pathogen.
Results: Out of 60 soil collected samples, 31 Streptomyces bacterial isolates were separated. Four isolates showed positive results to selectivity action of the chitinase enzyme. Treatment of 3 bacterial isolates with 2 pathogenic fungi showed that AE09 is the most effective anti-fungal isolates.
Discussion and conclusion: Soils in Eastern Azerbaijan province are rich of Streptomyces bacteria which generate antifungal compounds. Obtaining the Streptomyces bacteria which have chitinase gene, can lead to identification of very effective strains as anti-fungal.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
اکتینومیستها[1] حدود 40 درصد از جمعیت باکتریایی خاک را تشکیل میدهند (1 و 2) و ویژگیهایی دارند که آنها را برای عوامل بیوکنترل بر علیه قارچهای خاکزاد[2] بیمارگر گیاهی مفید میسازد این باکتریها توانایی تولید متابولیتهای ثانویه مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها را دارند و احتمالا دارای آثار ضدقارچی هستند. همچنین، آنها هدایتگرهای اصلی بافرهای زیستی خاکها بوده و با تجزیه مواد آلی در تولید محصول نقش دارند (3 و 5). از جمله ویژگیهای شاخص این باکتریها که آنها را برای کنترل برخی از عوامل خسارتزای گیاهی مناسب نموده است، ترشح آنزیم کیتیناز است؛ به گونهای که این باکتریها تجزیه کننده اصلی کیتین[3] و عامل اصلی برگرداندن این ماده سخت به چرخه طبیعت هستند (6). کیتین یک پلیساکارید[4] خطی بدون شاخه غیر محلول است که از واحدهای N استیل گلوکز آمین[5] تشکیل و از طریق پیوند (4→1)β به یکدیگر متصل شدهاست. کیتین ماده اصلی تشکیل دهنده دیواره سلولی قارچی است (7).
گزارشهای متعددی در ارتباط با اثر آنتاگونیستی اکتینومایستهای جدا شده از خاک علیه قارچهای بیماریزای گیاهی منتشر شده است (8 و 9). اثبات شده است که بسیاری از اکتینومیستها، به ویژه گونههای استرپتومایسس، عوامل کنترل زیستی وسیع الطیف در برابر پاتوژنهای قارچی گیاهان هستند (10). فعالیت آنتاگونیستی استرپتومایسسها با قارچهای پاتوژن به طور معمول مربوط به تولید ترکیبات ضدقارچی و آنزیمهای هیدرولیتیک است. به نظر میرسد که کیتیناز تولیدی باکتریهای استرپتومایسس، آنزیم هیدرولیتیک مهمی در لیز دیواره سلولی قارچی است (11).
کنترل زیستی به عنوان راهکار جایگزین سموم شیمیایی گوناگون برای کنترل بیماریهای گیاهی توسعه یافته است. بر خلاف عوامل سنتتیک، موادی که به شکل میکروزیستی از گونههای مؤثر گرفته شدهاند سمیت کمتر داشته، به راحتی قابل تجزیه بوده، و آلرژیزایی کمی دارند. این مواد در محصولات غذایی انباشته نمیشوند و نیز ارزان و مناسب برای مصرف در مقیاس صنعتی هستند. با استفاده از کنترل زیستی، خود میکروارگانیسمها، میتوانند با تولید آنتیبیوتیک و یا آنزیمهای تجزیه کننده به طور مستقیم بر علیه بیماریهای گیاهی گوناگون به کار روند (12 و 13). برای مثال، بر اساس رتبهبندی اداره کل مطالعات و بررسیهای اقتصادی و اطلاعات برگرفته شده از اداره آمار و فنآوری سازمان جهاد کشاورزی، در سال زراعی 89- 90، استان آذربایجانشرقی رتبه ششم تولید سیبزمینی در کشور را دارد. همچنین، با توجه به گستردگی سطح زیر کشت سیبزمینی در سایر استانها و وابسته بودن بشر از لحاظ تامین کربوهیدراتها به این محصول، گسترش راهکارهایی برای مبارزه غیر شیمیایی با بیماریهایی که متوجه سیب زمینی و سایر گیاهان خانواده سولاناسه مانند گوجه فرنگی است، ضروری به نظر میرسد. هدف از این بررسی، جداسازی و شناسایی گونههایی از باکتری استرپتومایسس در خاکهای استان آذربایجان شرقی است که برای کاهش عوارض ناشی از استفاده از کود و سموم شیمایی با تولید آنزیم کیتیناز قابلیت بیوکنترلی داشته باشند(30).
مواد و روشها
در این پژوهش وسایل، مواد شیمیایی، بافرها و محیطهای کشت به شرح ارایه شده در جدول 1 استفاده شدند.
جدول 1- فهرست مواد شیمیایی، وسایل، دستگاهها
|
مواد شیمیایی |
||
|
مواد |
شرکت سازنده |
|
|
SDS |
سیناژن |
|
|
Trisbase |
سیناژن |
|
|
Tris-HCl |
سیناژن |
|
|
Primer(F/R) |
سیناژن |
|
|
Mastermix |
سیناژن |
|
|
Ethidiumbromide |
سیناژن |
|
|
آب مقطرDNasefree |
سیناژن |
|
|
EDTA |
سیناژن |
|
|
PVP |
سیگما |
|
|
Glucose |
سیگما |
|
|
Starch |
سیگما |
|
|
CTAB |
مرک |
|
|
DMSO |
مرک |
|
|
HighPurePCRProductPurificationkit |
مرک |
|
|
Isoamylalcohol |
مرک |
|
|
Chloroform |
مرک |
|
|
CaCO3 |
مرک |
|
|
FeSO4 |
مرک |
|
|
K2HPO4 |
مرک |
|
|
KNO3 |
مرک |
|
|
MgSO4 |
مرک |
|
|
1kbDNALadder |
فرمنتاز |
|
|
Agar |
لیوفیلم |
|
|
Glycerol |
باکر |
|
|
Casein |
کیمیا |
|
|
Agarose |
اینویتروژن |
|
|
Isopropanol |
دکتر مجللی |
|
|
Nystatin |
جابر بن حیان |
|
|
NaCl |
ارج |
|
|
اتانول 96 درصد |
جهان الکل طب |
|
|
آب مقطر |
کسری |
|
|
ازت مایع |
- |
|
|
وسایل و دستگاهها |
||
|
نامدستگاهها |
شرکت سازنده- کشور |
|
|
هودلامینار(JLBVI2Ors) |
ژال ایران |
|
|
هودشیمیایی(VWR105) |
فرپژوه ایران |
|
|
ورتکسمیکسر(S0100-230V) |
لابنت ایران |
|
|
بنماری(1092) |
فاطر ایران |
|
|
هیتراستریر(MR3003) |
هایدولف آلمان[6] |
|
|
ترمال سایکلر(M) |
بیوسیستم آمریکا |
|
|
میکرو سانتریفیوژ یخچالدار (VS-15000CFNII) |
ویژن کره[7] |
|
|
ترازوی دو صفر(GP5202) |
سارتریوس آلمان |
|
|
ترازوی چهار صفر(CP324S) |
سارتریوس آلمان[8] |
|
|
شیکرانکوباتور(3527-6) |
سهندیران |
|
|
انکوباتور رومیزی(B34) |
بندر آلمان[9] |
|
|
ژل داک(BioDocAnalyze) |
بیومترا آلمان[10] |
|
|
اسیدتیه سنج(1.691.0020) |
متروم سوییس[11] |
|
|
اتوکلاو(SX-300E) |
تومی ژاپن[12] |
|
|
الکتروفورز افقی |
اختریان |
|
|
فریزر منفی 80 درجه سانتیگراد |
ویژن کره |
|
|
فریزر منفی 20 درجه سانتیگراد |
فیلور- ایران |
|
|
یخچال 4 درجه سانتیگراد |
فیلور- ایران |
|
در این بررسی نمونههای خاک از استان آذربایجانشرقی و از عمق 10 تا 20 سانتیمتری جمعآوری شد. نمونهها بر حسب موقعیت مکانی کدگزاری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. از نمونههای خاک، رقتهای 1- 10 و 2- 10 به شکل سری تهیه و همزمان اسیدیته تمامی نمونهها اندازهگیری و ثبت شد (14). با کشت 50 مایکرو لیتر از رقت دوم در محیط کشت استارچ کازئین آگار[13](S.C.A) (جدول 2)، تک کلونیهای استرپتومایسس بر اساس ویژگیهای ریختشناسی خاص کلونیشان (شامل: ظاهری خشک و گچی، سفید یا رنگی، چسبیده به محیط و دارای میسلسومهای رویشی) از محیط کشت جداسازی شد (15). برای تهیه استوک باکتریایی به منظور نگهداری طولانی مدت جدایهها برای مطالعات بعدی، یک تک کلون از هر جدایه باکتریهای استرپتومایسس به محیط کشت مایع ISP2[14] (جدول 2)، انتقال داده و پس از ورتکس به همراه گلیسرول در فریزر منفی 80 درجه سانتیگراد نگهداری شد (16).
جدول 2- اجزا و مقادیر بافر استخراج DNA و محیط کشت
|
گرم/ لیتر DNA بافر استخراج |
گرم/ لیتر (ISP2) |
گرم/ لیتر (SCA) |
|
Tris-base: 1/12 |
Maltextract:10 |
Starch:10 |
|
EDTA-Na2:44/7 |
Yeastextract:10 |
Casein:3/0 |
|
PVP(%2) :1 |
CaCO3:2 |
CaCO3:02/0 |
|
NaCl:182/8 |
اسیدیته: 3/7 |
FeSO4:01/0 |
|
اسیدیته: 8 |
|
K2HPO4:2 |
|
|
|
KNO3:2 |
|
|
|
MgSO4:05/0 |
|
|
|
NaCl:2 |
|
|
|
Agar:15 |
|
|
|
Nystatin:02/0 |
|
|
|
DMSO: 1 میلیلیتر |
|
|
|
اسیدیته: 2/7 |
استخراج DNAژنومی باکتریایی: با توجه به این نکته که دیواره پپتیدوگلیکانی باکتری استرپتومایسس بسیار سخت و مقاوم است، روشهای متداول لیز سلولی برای از بین بردن و لیز کردن آن کافی نیست. بنابراین، به کمک اعمال شوک حرارتی شدید یعنی با استفاده از انجماد و ذوب متناوب، ابتدا دیواره پپتیدوگلیکانی[15] باکتری شکسته شده و سپس، بقیه مراحل استخراج بر اساس روش یاد شده در بالا انجام گرفت.
برای استخراج DNA ژنومیک جدایههای باکتری استرپتومایسس، ابتدا نمونههای باکتریایی بر روی محیط استارچ کازئین آگار (S.C.A) کشت و به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس، باکتریها از روی پلیتها برداشته و به یک میکروتیوب حاوی 300 مایکرو لیتر بافر لیزکننده (17) (جدول 2)، منتقل شد. میکروتیوبها ابتدا داخل ازت مایع قرار گرفته و بلافاصله به بنماری 65 درجه سانتیگراد منتقل و سپس ورتکس شدند (این عملیات 7 بار تکرار شد). پس از افزودن 200 مایکرو لیتر دیگر از بافر لیز کننده، میکروتیوبها به مدت 10 دقیقه با g 58/126 سانتریفیوژ شدند. سپس، مایع رویی برداشته شده و هم حجم آن محلول کلروفرم- ایزوامیل[16] الکل (به نسبت 1:24) افزوده شد و به مدت 10 دقیقه با g 74/6 سانتریفیوژ شدند. دوباره مایع رویی برداشته شده، هم حجم آن ایزوپروپانول[17] سرد افزوده و به مدت 8 ساعت در منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته، محتویات درون تیوب با 100 مایکرو لیتر الکل 70 درصد شستشو داده و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته، 100 مایکرو لیتر آب مقطر به ویالها اضافه و در فریزر منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت DNA استخراجی، از طریق مقایسه با سایز مارکر بر روی ژل آگاروز تخمین زده شد (17).
تکثیر قطعه 16S rDNA:برای تایید شناسایی جنس استرپتومایسس از طریق روشهای ریختشناسی، توالی 16SrDNA تمامی جدایهها با استفاده از آغازگرهای جهانی AF, AR تکثیر شد (جدول 3) (18).
واکنش PCR شامل مخلوط (DionizedH2: 50 میکرو لیتر، MasterMix: 25 میکرو لیتر، PR: 2 میکرولیتر، PF: 2 میکرو لیتر، DNATemplate: 1 میکرو لیتر)، طبق برنامه دمایی جدول 4، انجام شد. سپس، محصول PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد.
. غربالگری جدایههای مولد ترکیبات ضدقارچی (آنزیم کیتیناز): برای تکثیر ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19 و غربال جدایههای مولد این نوع آنزیم، واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) برای ژنوم تمامی جدایههای مورد آزمایش انجام گرفت. برای تکثیر قطعه مربوط به ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19، از آغازگرهای به کار برده شده توسط هاستر[18] و همکارانش در سال 2005 استفاده شد، که طراحی آنها بر اساس تکثیر یک قطعه bp 885 از ژن کیتیناز خانواده 19 بوده است (19). ویژگیهای آغازگرهای رفت CH19F(ForwardPrimer) و برگشت CH19R (ReversePrimer& ComplementaryPrimer) به شرح جدول 5 است. توالی آغازگر همولوگوس دقیقاً همان توالی ژنومیک است و نقطه ابتدایی قطعه تکثیر شده را مشخص میکند و توالی آغازگر برگشت نوکلئوتیدهای انتهایی قطعه مورد تکثیر است.
برای تکثیر ژن کیتیناز، واکنش زنجیرهای پلیمراز در حجم 15 میکرولیتر (MasterMix: 7 میکرو لیتر، PR: 5/. میکرو لیتر، PF: 5/. میکرو لیتر، DNATemplate: 1 میکرولیتر) طبق برنامه دمایی جدول 6 انجام شد.
جدول 3- آغازگرهای جهانی تکثیر قطعه 16S rDNA
|
طول محصول حاصل پس از PCR |
توای آغازگر |
F/R |
|
1500 bp |
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′ |
AF |
|
1500 bp |
5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′ |
AR |
جدول 4- برنامه دمایی واکنش PCR برای تکثیر ژن 16SrDNA
|
مرحله |
دما (سانتیگراد) |
زمان |
تعداد چرخه |
|
واسرشت اولیه |
95 |
5 دقیقه |
1 |
|
واسرشت |
95 |
1 دقیقه |
40 |
|
اتصال |
56 |
1 دقیقه |
|
|
تکثیر |
72 |
90 ثانیه |
|
|
تکثیر نهایی |
72 |
15 دقیقه |
1 |
جدول 5- آغازگرهای جهانی تکثیر ژن کیتیناز
|
طول محصول حاصل پس از PCR |
توای آغازگر |
F/R |
|
bp 885 |
5′-ACGTGTATCGACGTGTCATGAGT-3′ |
CH19F |
|
bp 885 |
5′-TACGACATCAGCAGCTCAGGTTC-3′ |
CH19R |
جدول 6- برنامه دمایی واکنش PCR برای تکثیر ژن کیتیناز
|
مرحله |
دما (سانتیگراد) |
زمان |
تعداد چرخه |
|
واسرشت اولیه |
96 |
5 دقیقه |
1 |
|
واسرشت |
96 |
1 دقیقه |
35 |
|
اتصال |
54 |
1 دقیقه |
|
|
تکثیر |
72 |
1 دقیقه |
|
|
تکثیر نهایی |
72 |
10 دقیقه |
1 |
برای آشکارسازی محصولات PCR، نمونهها به مدت 1 تا 5/1 ساعت در بافر (LoadingBuffer) 6X با ولتاژ 85 تا 100 میلیولت بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شدند. سپس، به مدت 10 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید[19] رنگآمیزی و باندهای مربوطه در زیر نور UV (دستگاه ژل داک)، مشاهده شد. جدایههایی که ژن کیتیناز در آنها تکثیر شد، در پلیتهای حاوی محیط کشت اختصاصی باکتریها (NA) برای بررسی آثار آنتاگونیستی ذخیره شدند.
. ارزیابی میزان قدرت آنتاگونیستی جدایههای مولد آنزیم کیتیناز: به منظور تعیین توانایی آنتاگونیستی باکتریهای جداسازی شده در تولید مواد ضدقارچی، 5 جدایه از جدایههای مولد آنزیم کیتیناز با دو جدایه قارچ بیماریزا گیاهی (آلترناریا آلترناتا[20]، الترناریا سولانی[21]) کشت متقابل داده شد. آزمون آنتیبیوگرام[22] به روش کشت متقابل[23] انجام و بر اساس قطر ناحیه بازدارنده رشد[24]، فعالترین جدایه انتخاب شد.
1- جدا سازی عامل بیماری: به منظور تهیه و جداسازی عامل بیماری، از مزارع آلوده سیب زمینی و گوجه فرنگی اطرف شهر تبریز نمونهبرداری شد. نمونهها به طور جداگانه در پاکتهای کاغذی قرار داده و پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. با استفاده از اسکالپل استریل قطعات کوچکی به اندازه 1 سانتیمتر از بافتهای آلوده بریده شد. قطعات بریده شده به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلرید سدیم[25] 10 درصد ضدعفونی سطحی شده و بلافاصله دو بار با آب شستشو شد. نمونهها پس از آبگیری با کاغذ صافی بر روی محیط مغذی (سیبزمینی دکستروز آگار)[26]PDA کشت داده شد. سپس، پلیتها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. از کلونیهای رشد یافتهایی که دارای ویژگیهای آلترناریا بودند با برداشتن تک هاگ یا زنجیره هاگ خالص شدند. قطعاتی به اندازه 5 میلیمتر از کلونیهای درحال رشد برداشته شده و بر روی محیط غذایی (سیب زمینی هویج آگار)[27] PCA کشت داده شد. برای تحریک الگوی هاگزایی، پلیتها در دمای 24 درجه سانتیگراد با چرخه نوری 8 ساعت روشنایی و 16 ساعت تاریکی به مدت 5 تا 7 روز انکوبه شدند. شناسایی جدایهها با استفاده از کلید قوستا[28] و همکاران (الگوهای کلی هاگزایی شامل آرایش هاگها رو هاگبر، تعداد هاگها در هر زنجیره و الگوی انشعاب یافتن زنجیرهها هستند) انجام شد و آزمون بیماریزایی جدایهها به اثبات رسید (20).
2-آزمون هاله بازدارندگی: برای بررسی اثر آنتاگونیستی جدایههای Streptomyces علیه قارچهای بیمارگر یاید شده از روش کشت متقابل بر روی محیط کشت PDA استفاده شد. بدین صورت که ابتدا از هر کدام از جدایههای باکتری مقطعی به قطر 5 میلیمتر برداشته و در یک سمت پلیت حاوی محیط کشت PDA قرار داده شد. باکتریهای کشت داده شده به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از این مدت، از هر کدام از قارچهای آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتا یک بلوک میسلیوم چهار روزه به قطر 5 میلیمتر برداشته شده و در مقابل هر جدایه باکتری کشت شده در پلیتها قرار داده شد (شکل 4).این عمل در 5 تکرار برای هر کشت آنتاگونیستی انجام گرفت. به طور همزمان 5 نمونه از هر کدام از جدایههای قارچ نیز به عنوان شاهد در محیط مغذی PDA کشت داده شد. کشتهای انجام گرفته شده به مدت 20 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از سپری شدن مدت یاد شده، میانگین شعاع هالههای ایجاد شده در اطراف هر باکتری آنتاگونیست با استفاده از کولیس اندازهگیری و ثبت شد.
نتایج.
نمونهبرداری و جداسازی اکتینومایستها: از مناطق مختلف استان آذربایجانشرقی 60 نمونه خاک جمعآوری شد و طبق روش گفته شده در بخش مواد و روشها در مجموع 31 جدایه استرپتومایسس جداسازی شد (شکل 1) (21).
شکل1- نمای ریختشناسی کلونی تعدادی از جدایههای جداسازی شده
تکثیر قطعه 16SrDNAجدایهها: تعداد 31 ایزوله، از 60 نمونه خاک، به تکثیر قطعه 16S rDNA پاسخ مثبت دادند (شکل 2).
تکثیر ژن آنزیم کیتیناز: ژن آنزیم کیتیناز خانواده 19، بر اساس برنامه یاد شده در جدول 6 تکثیر شد. نتیجه این واکنش نشان داد که از 31 جدایه مورد آزمایش، تنها 4 جدایه دارای این ژن بودند که اندازه قطعه تکثیری در تمامی آنها در محدوده بین 750 تا 1000 bp بود (شکل 3).
. ارزیابی میزان قدرت آنتاگونیستی جدایهها و تعیین جدایه فعال: در این بررسی 3 جدایه از جدایههای مولد آنزیم کیتیناز با دو جدایه قارچ بیماریزا گیاهی (آلترناریا آلترناتا و آلترناریا سولانی) کشت متقابل داده شد. پس از 20 روز انکوباسیون تمامی جدایههای استرپتومایسس توانستند رشد میسلیوم قارچی را مهار و در اطرافشان هاله عدم رشد قارچ ایجاد کنند. این در حالی است که کشتهای شاهد قارچ توانستند در طی این مدت تمامی قطر پلیت را پر کنند.
نتایج تجزیه واریانس صفات مورد بررسی نشان میدهد که اختلاف معناداری بین صفات اصلی وجود نداشته است و بنابراین به تجزیه و تحلیل آنها پرداخته نشده است. اما بین آثار متقابل اختلاف معناداری وجود داشته وطبق نمودار زیر بررسی شده است (جدول 7).
جدول 7- نتایج تجزیه واریانس تیمارهای باکتری و قارچ بر شعاع هاله عدم رشد
|
منابع تغییر |
درجات آزادی |
میانگین مربعات |
|
باکتری |
2 |
ns0423/0 |
|
قارچ |
1 |
ns0333/0 |
|
باکتری×قارچ |
2 |
*0803/0 |
|
خطا |
24 |
0157/0 |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
70/13 |
|
|
ضریب تبیین (درصد) |
57/42 |
|
ns، ٭٭ و ٭ به ترتیب غیر معنادار و معنادار در سطح احتمال 1 و 5 درصد هستند.
شکل 2- نتابج PCR مربوط به تکثیر قطعه 16S rDNA به طول bp1500 با جفت آغازگرهای AF/AR
شکل 3- نتایج PCR مربوط به تکثیر قطعه bp885
شکل 4- میانگین آثار اصلی شعاع هاله عدم رشد قارچهای آلترناریا توسط باکتریهای استرپتومایسس
حروف در نمودار بیانگر اختلاف معنادار میانگین تیمارها با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.
در مجموع جدایههای Streptomyces توانستند قارچ آلترناریا آلترناتا را بهتر از آلترناریا سولانی کنترل کنند. در بین جدایههای استرپتومایسس بیشترین میزان ایجاد هاله بازدارندگی بر روی قارچ آلترناریا آلترناتا را، جدایه AE12 با 92/0 سانتیمتر شعاع هاله ثبت کرده (a2b1)و پس از آن به ترتیب جدایههای AE09 و AE30 قرار داشتند. بیشترین میزان ایجاد هاله بازدارندگی بر روی قارچ آلترناریا سولانی را، جدایه AE09 با 06/1 سانتیمتر ثبت کرد (a1b2) و پس از آن به ترتیب جدایههای AE30 و AE12 قرار داشتند. بیشترین میزان مهارکنندگی بر روی رشد هردو قارچ آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتا توسط جدایه AE9 به میزان 98/0 سانتیمتر ایجاد شد و پس از آن به ترتیب جدایههای AE30 و AE12 قرار داشتند. ، جدایه AE9 به عنوان مؤثرترین باکتری Streptomyces در کنترل رشد قارچ آلترناریا تشخیص داده شد.
بحث و نتیجه گیری.
دامنه اسیدیته نمونههای خاک مورد آزمایش در این بررسی بین 7/7 تا 9 بوده است. دانشمندان دریافتهاند که باکتریهای Streptomyces به طور معمول اسیدیتههای قلیایی و خنثی را برای رشد ترجیح میدهند (22). باتوجه به ویژگیهای ظاهری تک کلونیهای رشد یافته در محیط کشت، 31 جدایه باکتری Streptomyces جداسازی شد. این باکتریها دارای شکلهای مختلف با خواص ریختشناسی متفاوت هستند. در ضمن بر اساس رنگدانه (پیگمنت) پشت کلونی نیز امکان جداسازی نمونهها وجود دارد. بنابراین، باکتریهای Streptomyces، بر اساس ریختشناسی خاص کلونیشان از محیط کشت جداسازی شدند (23).
تکثیر توالی 16S rDNAتوسط آغازگرهای جهانی اثبات کرد که جدایههای جداسازی شده به جنس Streptomyces تعلق دارند. استرپتومایسسها بیشتر باتوجه به معیارهای ریختشناسی و بیوشیمیایی شناسایی میشوند، و در نتیجه ترتیب گونهها به شکل گروههای خوشهای هستند و بر اساس رشتههای هوایی (اسپوروفورز) و بستر قارچ، رشد زنجیره اسپور مارپیچی و سطح صاف اسپور استرین، آنها تحت جنس استرپتومایسس قرار میگیرند. این هویت تاکسونومی مسلم و قطعی نیست، اما شاخصهای مختلف فیزیکی- شیمیایی و شناسایی توالی 16S rDNAروش مطمئنی بوده و میتوان جدایه را به عنوان جنس Streptomyces تعیین کرد. علاوه بر این، مطالعه ویژگیهای رشد در مواد محیط کشت مغذی تا حد زیادی بر رشد و ریختشناسی موجودات زنده تاثیر میگذارد (24). با تکثیر ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19 مشخص شد که تنها 4 جدایه از 31 جدایه باکتری Streptomyces جداسازی شده دارای این ژن هستند. این نتیجه نشان دهنده کمیاب بودن ژن کیتیناز خانواده 19 در بین باکتریهای استرپتومایسس است. اگر چه درصد نمونههای آنتاگونیست غربالگری شده کم است، اما این نتایج در مقایسه با مطالعات انجام شده قبلی، از این فرضیه که جدایههای Streptomyces چند اثر بوده و نویدی برای کاربرد در بسیاری از فرآیندهای بیوتکنولوژی، از جمله بیوکنترل پاتوژنهای قارچی خاکزاد هستند، حمایت میکند (25).
آنزیم کیتیناز یکی از مهمترین متابولیتهای ثانویه تولیدی باکتریهای استرپتومایسس است. زیرا این آنزیم با تجزیه کیتین دیواره سلولی قارچها، به نوعی یک فعالیت ضدقارچی را برای باکتریهای استرپتومایسس ایجاد میکند. کیتینازهای باکتریهای استرپتومایسس در دو خانواده 18 و 19 گلیکوزیل هیدرولازها طبقهبندی میشوند. در این میان کیتینازهای خانواده 19 مشابه کیتینازهای گیاهی بوده و فعالیت ضدقارچی در خور توجهی را نشان میدهند (18 و 26).
در بررسی آثار آنتاگونیستی، تمامی جدایههای باکتری Streptomyces مورد آزمایش توانستند از رشد هر دو قارچ پاتوژن گیاهی آلترناریا آلترناتا و آلترناریا سولانی ممانعت کنند، اما قادر به از بین بردن کامل آن نشدند. این در حالی بود که کشتهای شاهد قارچ توانستند در طی این مدت تمامی قطر پلیت را پر کنند. فعالیت آنتاگونیستی میکروارگانیسمهای بیوکنترلی، بیشتر با مهار رشد قارچ و یا کاهش علایم آلودگی بوتههاست (11).
از آن جا که بلوکهای قارچهای بیمارگر آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتای برداشته شده از حاشیه پرگنهها در ناحیة بازدارندگی آزمون کشت متقابل در محیط تازه دوباره احیا و رشد کردند، مشخص شد که متابولیتهای ترشح شده در محیط کشت جامد روی قارچهای یاد شده اثر بازدارندگی و نه کشندگی دارند. در بررسی آثار آنتاگونیستی 23 جدایه باکتری بر علیه آلترناریا سلولانی عامل بلالت زودرس در گوجه فرنگی در محیط اینویترو به روش دوئل کالچر و در حالت گلخانه ای توسط یازی جی[xxix] و همکاران در سال 2011 بیان شد که در ارزیابی اینویترو تمامی 23 جدایه بر روی میسلیومهای قارچی اثر کنترلی داشتند (27 و 28).
در سالهای قبل، تعدد ژن کیتیناز بر روی ژنوم باکتریهای Streptomyces، توسط پژوهشگران به اثبات رسیده بود؛ اما تعداد کمی از ژنهای مورد آزمایش، به کیتینازهای خانواده 19 که فعالیت ضد قارچی بالایی دارند، متعلق بودند. در کل کیتینازهای خانواده 19 در ارگانیسمهای پروکاریوتیک کمابیش کمیابند (26 و 29). بنابراین، دستیابی به باکتریهای Streptomyces دارای ژن رمزگردان کیتیناز خانواده 19 میتواند به شناسایی سویههای بسیار مؤثر برای دفاع ضد قارچی منجر شود. در نتیجه خاکهای استان آذربایجانشرقی مستعد وجود گونههایی از باکتریهای Streptomyces هستند که توانایی کنترل زیستی قارچهای بیماریزای گیاهی را دارند و دارای پتانسیل بالقوهای برای معرفی و استفاده به عنوان سم زیستی هستند. همچنین، این نتایج نشان میدهد که StreptomycesAE09 میتواند به عنوان یک عامل بالقوه بیوکنترلی برای توسعه آفتکشهای زیستی با طیف گستردهای باشد. شناسایی باکتریهای مولد آنزیم کیتیناز برای نخستین بار در منطقه آذربایجان بررسی شده است و میتوان از آن برای جایگزینی سموم و کودهای شیمیایی بهره گرفت.
تشکر و قدردانی
از پژوهشکده بیوتکنولوزی کشاورزی ایران وزارت جهاد کشاورزی و مرکز آموزش جهاد کشاورزی استان آدربایجان شرقی برای حمایتهای مالی و تبادل اطلاعات علمی تشکر و قدردانی میشود.
[1]- Actinomycetes
[2]- Soil borne
[3]- Chitin
[4]- Polysaccharide
[5]- N-Acetyl Glucose amin
[6]- Heidolph Persia
[7]- Vision Korea
[8]- Sartorius
[9]- Bender
[10]- Biometra
[11]- Metrohm
[12]- Tomy autoclave
[13]- Starch Casein Agar
[14]- International Streptomyces Project 2
[15]- Peptidoglycane
[16]- Chloroform Isoamyl
[17]- Isopropanol
[18]- Hoster
[19]- Ethidium Bromide
[20]- Alternaria alternata
[21]- Alternaria solani
[22]- Antibiogram
[23]- Dual Culture
[24]- Inhibitionzone
[25]- Sodium hypochlorite
[26]- Potato Dextrose Agar
[27]- Potato Carrot Agar
[28]- Ghosta
[xxix]- Yazici
)