نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشیار بیوتکنولوژیست، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهر قدس، تهران، ایران
2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، موسسه ایرانیان ژن فناور (IGF)، تهران، ایران
3 استادیار سلولی و مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شرق، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Different data resulting from non-standard molecular techniques in laboratories were considered as one of the deficiencies about amplification techniques. One of the most important aspects about the articles published in PCR detection until now, is absence of internal control (IC) in majority of them. The aim of this study is to design and develop a simple and rapid method to produce internal control for PCR test and its future application in the routine recognition laboratories.
Materials and methods: To produce competitive internal control in this study, composite primers and PCR-Cloning method were used. We designed and synthesized the forward and reverse primers of PCR diagnostic test of Hepatitis B virus(HBV), Herpes simplex virus(HSV), Mycobacterium tuberculosis(MTB), Mycoplasma pneumonia(Mpn), Cryptococcus neoformans(Cne), Salmonella spp (Sal.sp) and Mycoplasma spp (M.sp) in the 5’ primers of Leishmania Kintoplast gene in the tail form. The amplified internal controls were attached to pTZ57R and transformed in E.coli JM107 bacteria. The minimum IC number was studied using dilution technique and also PCR response spectrum with IC.
Results: The size of HBV, HSV, MTB, MPN, C.ne, Sal.sp, M.sp diagnostic product with specific primers were 262, 454, 245, 345, 415, 284, 272 bp and corresponding internal control also were 660, 662, 660, 669, 661, 668, 672 bp respectively, and desirable difference observed between PCR, IC regarding the size was easy to separate in the gel. The minimum IC was identified to 1000 in each reaction and maximum PCR test sensitivity with IC was provided for entire agents appropriately. Further, in specific test using different agents any unwanted product was not observed too.
Discussion and conclusion: The negative and positive false results in PCR tests are one of the difficulties of this exacting technique which may lead to decrease its performance. Using an internal control in molecular detection method as an internal controlling system, could identify these errors.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
پیشرفتهای شگرف بیوتکنولوژی و زیستشناسی مولکولی در سالهای گذشته موجب تغییر روشهای تشخیصی عوامل میکروبی، از روشهای بر پایه کشت به روشهای مولکولی و بیشتر بر اساس تکثیر اسیدهای نوکلئیک شده است (1). کاربرد روشهای مولکولی بر پایه PCR برای شناسایی و تعیین مقدار اسیدهای نوکلئیک در پژوهش و درمان، روز به روز گستردهتر میشود. از دهه 90 یک افزایش انفجاری در تعداد مقالات چاپ شده در زمینه روشهای تکثیر اسید نوکلئیک به ویژه روش PCR در شناسایی عوامل بیماریزا اتفاق افتاده است. شایان ذکر است، متغیرهایی مانند: نوع آزمایشگاه، دستگاههای مورد استفاده، نوع و بازده DNA پلیمراز مورد استفاده، کارکنان و سطح آموزش و مهارتها، حضور ممانعت کنندهها، هدفهای ژنی متفاوت در عامل مورد شناسایی، سطح بهینهسازی آزمون با توجه به مهارتها در آزمایشگاهها، روش هایPCR خانگی [1] و شاخصهای دیگر، باعث شده که در برخی موارد جوابهای صحیح و قابل تکرار گزارش نشده و فقط برخی از پروتکلهای چاپ شده در مقالات به طور عملی در آزمایشگاهها تکرار شود (2- 8).
با وجود حساسیت بالا در PCR، موانع و مسایلی نیز در تکثیر قطعات DNA وجود دارد که به عنوان یک سد، مانع از تکثیر و ایجاد جوابهای منفی کاذب میشود. حضور مواد بازدارنده در نمونههای مرضی مانند مایع پلور [2]، مایع مغزی/ نخاعی [3]، خلط [4]، خون محیطی [5]، و دیگر نمونهها مانع از تکثیر میشود (9- 11). روشهای متعددی برای نظارت بر حضور مواد ممانعت کننده در PCR گزارش شده است (12- 14) که مهمترین آنها به کارگیری اینترنال کنترل در یک آزمون PCR است.
در بیشتر مقالات چاپ شده در زمینه تشخیص PCR عوامل عفونی، اینترنال کنترل تکثیری [6] (IAC) وجود ندارد. بر خلاف کنترل مثبت، اینترنال کنترل بیشتر یک توالی DNA غیر هدف حاضر در نمونه است که به طور همزمان با توالی هدف تکثیر میشود. در یک PCR بدون IAC، یک پاسخ منفی یعنی اینکه توالی هدف حضور ندارد. اما، آن میتواند در عین حال به معنای این باشد که واکنش به علتی مانند: اختلال در دستگاه ترموسایکلر، مخلوط PCR غلط، فعالیت آنزیم DNA پلیمراز، یا حداقل حضور مواد بازدارنده در ماتریکس نمونه، ممانعت شده است. به طور بر عکس، در یک PCR با IAC، یک سیگنال کنترل همیشه تولید میشود که تکثیر اینترنال کنترل است. این کنترل داخلی حتی در عدم حضور توالی هدف مورد آزمایش تکثیر میشود و اگر تکثیر نشود یعنی اشکالی در تکثیر (به علتهای متفاوت) وجود دارد (2 و 6- 8).
هدف از پژوهش حاضر، معرفی استراتژی سریع و ساده برای طراحی و ساخت اینترنال کنترل آزمون PCR تشخیصی، برای عواملی مانند ویروس هپاتیت B (HBV) – ویروس هرپس سیمپلکس 1 و 2 (HSV) – مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MTB) – کریپتوکوکوس نئوفورمنس (Cne) – جنس سالمونلا (Sal. sp) – و جنس مایکوپلاسما (M. sp) به روش رقابتی و از طریق PCR-Cloning، و همینطور تعیین حداقل و حداکثر حساسیت آزمون به جهت حد تشخیص LOD [7] است.
مواد و روشها.
تهیه سوشهای استاندارد: در این پژوهش گونههای متعلق به مولیکوتس به کار رفته برای آزمون PCR مایکوپلاسما پنومونیه[8] و جنس مایکوپلاسما[9] عبارت بودند از: مایکوپلاسما پنومونیه (NCTC 10119)، مایکوپلاسما گالیسپتیکوم[10] (رازی 1355)، مایکوپلاسما گالیناروم[11] (رازی 1350 و 1346)، مایکوپلاسما اویاپنومونیه[12] (رازی 1364)، مایکوپلاسما آگالاکتیا[13] (رازی 1343)، اوره آپلاسما اوره آلیتیکوم[14] (رازی 1369) مایکوپلاسما آرجینینی[15]، مایکوپلاسما هیورینیس[16]، مایکوپلاسما ارال[17]، مایکوپلاسما سینوویه[18] و اکول پلاسما لیدلاوی[19] (تهیه شده از انستیتو رازی). سوش استانداردکریپتوکوکوس نئوفورمنس[20] از مرکز کلکسیون قارچ و باکتری سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران به شکل لیوفلیزه (ATCC number: 13690) تهیه ودر محیط کشت yeast malt agar حاوی کلرامفنیکل به میزان 400 (میلیگرم در لیتر) به طور اسلنت کشت و سپس، روی آن با محیط کشت سابورو دکستروز براث پوشانده شد. لولهها به مدت 72 ساعت تا یک هفته در دمای 34 تا 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. ایجاد کلونی روی سطح شیبدار و کدورت در بخش مایع نشانه رشد مناسب بود.
سوش استاندارد باسیل سل [21] از آزمایشگاه مایکوباکتریولوژی بیمارستان مسیح دانشوری تهیه شد. همینطور DNA چندین گونه مختلف مایکوباکتریوم مانند مایکوباکتریوم چلونی– آویوم – گوردونه – اینتراسلولار – سزولگای و گزنوپی نیز از دکتر جیم ورنگرن و دکتر سیون هافنر از انستیتو کنترل بیماریهای عفونی سوئد[22] تهیه شد. سالمونلا تیفی موریومATCC 14028 و چندین نوع سالمونلای دیگر و همینطور ویروس هپاتیت B و ویروس هرپس سیمپلکس I و II نیز از بخش ویروسشناسی انستیتو پاستور ایران تهیه شد.
استخراج DNA: برای استخراج DNA از میکروارگانیسمهای مورد مطالعه، از کیت استخراج DNA تولید شرکت سیناکلون بنام DNG با شماره کاتالوگ (DN8118C) استفاده شد. مراحل کاری به طور خلاصه عبارت بود از:قرار دادن محلول DNG Plus در ۳٧ درجه و آرام تکان دادن آن، تا به شکل یک محلول هم دما و یکنواخت در آید. سپس، ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون عامل با ۴۰۰ میکرولیترمحلول DNG Plus مخلوط و به مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شد. نمونه در این مرحله باید به طور کامل به شکل سوسپانسیون درآید و هر گونه تجمع و یا تودهای، تخریب شده و از بین رود. سپس، ۳۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه شده، 10 مرتبه وارونه و متعاقب آن، لولهها در فریزر به مدت ۲۰ دقیقه قرار داده شد. سپس، در rpm۱۲۰۰۰ برای مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی به آرامی خالی و تیوب به طور واژگون بر روی دستمال کاغذی قرار داده شد. 1 میلیلیتر اتانول سرد ٧۵ درصد به رسوب اضافه، به مدت 3 تا 5 ثانیه ورتکس و سپس، در دور rpm ۱۲۰۰۰ برای مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. اتانول کاملاً خالی و رسوب در ۶۵ درجه خشک شد. رسوب که محتوی DNA است در ۵۰ میکرولیترآب همراه با تکان دادن آرام و قرار دادن در ۶۵ درجه خوب حل شد.
پرایمرها و شرایط PCR: بهینه نمودن آزمون PCR برای تشخیصHBV–HSV–MTB–MPN–Cne–Sal. sp– و M. sp، از طریق بهینه نمودن غلظت اجزایی که در واکنش PCR به کار میروند و همچنین، طراحی و انتخاب برنامه حرارتی مناسب در دستگاه ترموسایکلر انجام شد (جدول 1 و 2). پرایمرهای مورد استفاده در تشخیص کریپتوکوکوس نئوفورمنس، از مطالعات انجام گرفته توسط لویتز[23] در سال 1991 و وون چانگ [24] در سال 1992 به دست آمدهاند، که توالی آنها در جدول 1 آمده است (15- 18). پرایمرهای مورد استفاده در تشخیص ویروس هپاتیت B، پرایمرهای مخصوص ژن آنتیژن سطحی این ویروسHBS است (19- 21). برای تشخیص HSV از ژن DNA-Polymerase استفاده و پرایمرها طراحی شد (22). درتشخیص MTB ژن هدف IS6110 (23- 27)، و در مایکوپلاسما پنومونیه P1 adhesin (28)، در جنس مایکوپلاسما 16S rRNA(29- 30) و در جنس سالمونلا ژن invA (31) در نظرگرفته شد.
واکنش PCR با مقادیر زیر انجام شد: ۵ میکرولیتر از DNA استخراج شده با استفاده از پرایمرهای جلویی و عقبی با غلظت نهایی ٤/٠ میلیمول (یک میکرولیتر از غلظت 10 میلیمولار)، ٥/٢ میکرولیتر از بافر PCR (X۱۰)، ٧٥/٠ میکرولیتر کلرید منیزیم (2MgCl) (از غلظت ۵۰ میلیمولار)، ٥/٠ میکرولیتر مخلوط dNTP (۱۰ میلیمولار) و 5/1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase (بیوفلوکس)، در حجم نهایی ٢٥ میکرولیتر تکثیر شد. پروفایل حرارتی هر آزمون در جدول 2 آمده است. پس از به پایان رسیدن سیکلهای حرارتی، برای مشاهده DNA تکثیر شده از روش الکتروفورز استفاده شد. محصولات PCR در کنار سایز مارکر و کنترلها، در ژل آگاروز 5/1 درصد و با استفاده از سایبرگرین و نور UV در دستگاه ژل داکومنتیشن بررسی شد.
حساسیت و ویژگی: برای بررسی حساسیت جفت پرایمرهای مورد استفاده، رقتهایی از سوسپانسیون عوامل با تعداد مشخص تهیه شد و استخراج DNA از این رقتها به روش DNG-Plus (سیناکلون) انجام و سپس، آزمون PCR برای رقتهای تهیه شده انجام شد. آزمون ویژگی هم با استفاده از گونههای مختلف آزمایش و ارزیابی شدند.
ساخت اینترنال کنترل (IC): برای ساخت اینترنال کنترل رقابتی به روش PCR-Cloning، پرایمرهای جلویی و عقبی هر عامل در بخش '5 پرایمرهای ژن کینتوپلاست لیشمانیا (32- 33) با اندازه محصول 620 جفت باز، به شکل دم (Tail) طراحی و سنتز شد (جدول 1).
برای انجام واکنش PCR برای تکثیر قطعه اینترنال کنترل، ۵ میکرولیتر از DNA استخراج شده لیشمانیا با استفاده از پرایمرهای جلویی و عقبی IC با غلظت نهایی ٤/٠ میکرومول، ٥/٢ میکرولیتر از بافر 10X PCR، ٧٥/٠ میکرولیتر کلرید منیزیم (2MgCl) (از غلظت ۵۰ میلیمولار)، ٥ /٠ میکرولیتر مخلوط dNTP (۱۰ میلیمولار) و 5/1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase، در حجم نهایی ٢٥ میکرولیترتکثیر شد. چرخههای حرارتی شامل 35 سیکل متوالی (شامل: ٩۴ درجه سانتیگراد ۳۰ ثانیه، ۶0 درجه سانتیگراد ۳۰ثانیه و ٧۲ درجه سانتیگراد ۱دقیقه) و یک سیکل پلیمریزاسیون نهایی ٧۲ درجه سانتیگراد به مدت 25 دقیقه بود. پس از به پایان رسیدن سیکلهای حرارتی، برای مشاهده DNA تکثیر شده از روش الکتروفورز استفاده شد. قطعه حاصل با پلاسمید pTZ57R کمپانی فرمنتاس به مدت 60 دقیقه در 22 درجه سانتیگراد لایگیت و سپس، در باکتری اشریشیا کلی JM107 ترانسفورم و کانستراکت حاصل از طریق غربالگری سفید/ آبی [25] در محیط حاوی آمپیسیلین، X-GAL و IPTG انتخاب شد. کلونهای مناسب از طریق استخراج پلاسمید با کیت استخراج پلاسمید
(Thermo scientific Inc.) و آزمون PCR، تأیید شدند.
کلونینگ محصول PCR و اینترنال کنترل: پس از خالصسازی محصولات PCR و ICها که در جدول 1 آمده است، با استفاده از کیت T/A cloning کمپانی Thermo scientific، محصولات PCR در وکتور pTZ57/R کلون شدند. پلاسمیدهای حاوی محصولات PCR حاصل با GeneJET Plasmid Miniprep Kit (K0502) کمپانی Thermo Scientific استخراج شد. سپس، با روش PCR، پلاسمیدهای حاوی محصولاتPCR و ICها با استفاده از پرایمرهای تشخیصی تأیید شدند.
تعیین غلظت ایده آل IC: هدف از تعریف غلظت DNA ایده آل IC برای PCR، تأیید غلظت بهینه IC است که با ژن هدف، کمترین رقابت در تکثیر را انجام دهد (9). برای به دست آوردن غلظت بهینه، غلظتهای متفاوت پلاسمید حاویIC و DNAهای استاندارد آزمایش شد. غلظت DNA عوامل مورد استفاده در آزمون و همچنین IC، به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج260 نانومترتعیین شد. رقتهای حاوی مقادیر DNA متفاوت عوامل میکروبی که از طریق رقتهای سری [26] تهیه شده بود با مقادیر ثابت IC، آزمون شد. برای PCR، 5 میکرولیتر از DNA عامل میکروبی با 1 میکرولیتر از IC مخلوط و در میکس PCR استفاده شد.
توالییابی: تعیین توالی DNAها در دو جهت با استفاده از روش ختم زنجیره [27] و به وسیله کمپانی ماکروژن کره انجام شد.
جدول ۱- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تشخیص DNA عوامل و تکثیر اینترنال کنترل
|
عامل |
آغازگر |
توالی (5´………..3´) |
ژن هدف |
سایز محصول (جفت باز) |
|
کریپتوکوکوس نئوفرمنس |
ITS1 |
TCC GTA GGT GAA CCT GCG G |
Internal transcribed spacer (ITS) regions |
415 |
|
CN4 |
ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T |
|||
|
ICFCneo |
TCC GTA GGT GAA CCT GCG GTCgCAgAACgCCCCTACC |
661 |
||
|
ICRCneo |
ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT TAGGGGTTGGTGTAAAATAGGC |
|||
|
ویروس هپاتیت B |
HBVF |
CAA ggT ATg TTg CCC gTT Tg |
HBS |
262 |
|
HBVR |
AAA gCC CTg CgA ACC ACT gA |
|||
|
ICFHBV |
CAA ggT ATg TTg CCC gTT TgT CgC AgA ACg CCC CTA CC |
660 |
||
|
ICRHBV |
AAA gCC CTg CgA ACC ACT gAA ggg gTT ggT gTA AAA TAg gC |
|||
|
هرپس سیمپلکس ویروس |
HSV-F |
ACC TAC Cgg CAT ACA AgC TCA |
DNA polymerase |
454 |
|
HSV-R |
AAg Tgg CTC Tgg CCT ATg TCC |
|||
|
ICFHSV |
ACC TAC Cgg CAT ACA AgC TCATCg CAg AAC gCC CCT ACC |
662 |
||
|
ICRHSV |
AAg Tgg CTC Tgg CCT ATg TCCAgg ggT Tgg TgT AAA ATA ggC |
|||
|
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس |
MTBF |
CgT gAg ggC ATC gAg gTg gC |
IS61110 |
245 |
|
MTBR |
gCg TAg gCg TCg gTg ACA AA |
|||
|
ICFMTB |
CgT gAg ggC ATC gAg gTg gCT CgC AgA ACg CCC CTA CC |
660 |
||
|
IICRMTB |
gCg TAg gCg TCg gTg ACA AAA ggg gTT ggT gTA AAA TAg gC |
ادامه جدول ۱- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تشخیص DNA عوامل و تکثیر اینترنال کنترل
|
مایکوپلاسما پنومونیه |
MPNF |
Agg CTC Agg TCA ATC Tgg CgT ggA |
P1 adhesin |
345 |
|
MPNR |
ggA TCA AAC AgA TCg gTg ACT ggg T |
|||
|
ICFMPN |
Agg CTC Agg TCA ATC Tgg CgT ggA TCg CAg AAC gCC CCT ACC |
669 |
||
|
ICRMPN |
ggA TCA AAC AgA TCg gTg ACT ggg TAg ggg TTg gTg TAA AAT Agg C |
|||
|
جنس مایکوپلاسما |
MspF |
ggg AgC AAA CAg gAT TAg ATA CCC T |
16 S rRNA |
272 |
|
MspR |
TgC ACC ATC TgT CAC TCT gTT AAC CTC |
|||
|
ICFMsp |
ggg AgC AAA CAg gAT TAg ATA CCC TTC gCA gAA CgC CCC TAC C |
672 |
||
|
ICRMsp |
TgC ACC ATC TgT CAC TCT gTT AAC CTC Agg ggT Tgg TgT AAA ATA ggC |
|||
|
جنس سالمونلا |
SalspF |
gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AA |
invA |
284 |
|
SalspR |
TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC C |
|||
|
ICFSal |
gTg AAA TTA TCg CCA CgT TCg ggC AAT CgC AgA ACg CCC CTA CC |
668 |
||
|
ICRSal |
TCA TCg CAC CgT CAA Agg AAC CAg ggg TTg gTg TAA AAT Agg C |
جدول 2- پروفایل حرارتی و سایز محصولات بعد از تکثیر
|
عامل |
پروفایل حرارتی |
سایزمحصول (جفتباز) |
|
کریپتوکوکوس نئوفرمنس |
Pre-Denaturation 6 دقیقه، 94 درجه سانتیگراد Denaturation 30 ثانیه، 94 درج (1) Shahhosseiny MH., Tehrani R. Polymerase Chain Reaction (PCR). Ed 2. Shahre Ghods: Islamic Azad University; 2011: 89- 105.
(2) Hoorfar j., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M., Fatch P. Practical considerations in design of internal amplification controls for Diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology 2004; 42 (5): 1863- 8.
(3) Protocol for the validation of alternative microbiological qualitative methods 2001. Document NV- DOC. D- 2001 -04 -25 (http://nmkl.org/NordVal/NodVal.htm). NordVal, Oslo, Norway.
(4) Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of alternative methods (EN ISO 16140) 2002. European Committee for Standardization, AFNOR; Paris, France.
(5) Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of foodborne pathogens. General method and specific requirements. 2002. Draft international standard ISO/DIS 22174. DIN, Berlin, Germany. 4. Hoorfar, J. 1999. EU seeking to validate and standardize PCR testing of food pathogens. ASM News (41) 65: 799.
(6) Hoorfar J., and Cook N. Critical aspects of standardization of PCR. Methods Molecular Biology 2002; 216 (69): 51- 64.
(7) Malorny B., Tassios PT., Ra°dstro¨m P., Cook N., Wagner M., and Hoorfar J. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens. Int. J. Food Microbiol. 2003; 83 (2): 39- 48.
(8) Schoder DA., Schmalwieser G., Schauberger M., Kuhn J., Hoorfar M. Physical characteristics of six new thermocyclers. Clinical Chemistry 2003; 49 (43): 960- 3.
(9) Cortez-Herrera E., Sperhacke RD., Becker D., Kritski A., Zaha A., Rosa-Rosetti., ML. Internal control in PCR for Mycobacterium tuberculosis: Usefulness and improvement of the diagnosis. Braz. Arch. Biology and Technology 2008; 51 (4): 685- 91.
(10) Kolk AHJ., Noordhoek GT., De Leeuw O., Kuijper S., Van Embden JDA. Mycobacterium smegmatis strain for detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR used as internal control for inhibition of amplification and for quantification of bacteria. Journal of Clinical Microbiology 1994; 32 (10): 1354- 6.
(11) Wilson IG. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and Environmental Microbiology 1997; 63(10): 3741- 51.
(12) Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (353): 367- 77.
(13) Osaki M., Adachin H., Gomyo Y., Yoshida H., Ito H. Detection of mycobacterial DNA in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens by duplex polymerase chain reaction: Application to histopathologic diagnosis. Modern Pathology 1997. 10 (51): 78- 83.
(14) Picard FJ., Gagnon M., Bernier MR., Parham NJ., Bastien M., Boissinot M., et al. Internal control for nucleic acid testing based on the use of purified Bacillus atrophaeus sub sp. Globigii spors. Journal of Clinical Microbiology 2009; 47 (2): 751- 7.
(15) Levitz S. M. The ecology of Cryptococcus neoformans and the epidemiology of Cryptococcosis. Review of Infectious Diseases 1991; 13 (6): 1163- 9.
(16) Kwon-Chung KJ., Edman JC., Wickes BL. Genetic association of mating types and virulence in Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity 1992; 60 (6): 602- 5.
(17) Chen J., Varma A., Diaz MR., Litvintseva AP., Wollenberg KK., Kwon-Chung KJ. Cryptococcus neoformans Strains and Infection in Apparently Immunocompetent Patients, China. Emerging Infectious Diseases 2008; 14 (5): 755- 62.(18) Kwon- Chung KJ., Varma A. Do major species concepts support one, two or more species within Cryptococcus neoformans? FEMS Yeast Research 2006; 6 (6): 574- 87.
(19) Pawlotsky JM., Bastiec A., He´zodec Ch., Lonjon I., Darthuy F., Re´mire´ J., et al. Routine detection and quantification of hepatitis B virus DNA in clinical laboratories: performance of three commercial assays. Journal of Virological Methods 2000; 85 (34): 11- 21.
(20) Weber B., Berge A. Molecular detection of hepatitis B virus: recent developments. Journal of Laboratory Medicine 2005; 29 (1): 33- 43.
(21) Moslemi E., Shahhosseiny MH., Javadi G., Parivar K., Sattari TN., Keyvani-Amini H. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran. African Journal of Microbiol Research 2009; 3 (8): 439- 45.
(22) Bahrami A., Shahhosseiny M.H., Azadmanesh K., Moslemi E., Noormohamadi Z., Jadali F. Optimization of Loop- Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method for detection of herpes simplex virus type 1 and 2. Scientific Journal of Kurdestan University of Medical Sciences 2011; 16 (59): 56- 63.
(23) Greenaway C., Menzies D., Fanning A., Grewal R., Yuan L., FitzGerald JM. Canadian Collaborative Group in nosocomial Transmission of Tuberculosis. Delay in diagnosis among hospitalized patients with active tuberculosis predictors and outcomes. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine 2002; (165): 927- 33.
(24) Aryan E., Makvandi M., Farajzadeh A., Huygen K., Bifani P., Mousavi SL., et al. A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complex. Microbiology Research 2010; 165 (5): 211- 20.
(25) Su WJ. Recent advances in the molecular diagnosis of tuberculosis. Journal of Microbiology and Immunology Infection 2002; 35 (4): 209- 14.
(26) Green C., Huggett JF. Talbot E., Mwaba P., Reither K., Zumla AI. Rapid diagnosis of tuberculosis through the detection of mycobacterial DNA in urine by nucleic acid amplification. Lancet Infectious Diseases 2009; 9 (3): 505- 11.
(27) Kohan L., Shahhosseiny MH., Razavi MR., Parivar K., Moslemi E., Verngren J. Evaluation of loop mediated isothermal amplification for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (26): 5096- 101.
(28) Shahhosseiny MH., Mardani M., Hosseini Z., Khoramkhorshid HR., Rahimi AA., Vande-yusefi J. Comparison of PCR and culture tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections. Journal of Zanjan University of Medical Sciences & Health Services 2006; 14 (56): 12- 23.
(29) Shahhosseiny MH., Hosseini Z., Khoramkhorshid HR., Azari S., Shokrgozar MA. Rapid and sensitive detection of Mollicutes in cell culture by polymerase chain reaction. Journal of Basic Microbiology 2010; 50 (56): 171- 8.
(30) Shahhosseiny MH., Gharibdust F., Allahyari E., Khoramkhorshid HR., Vande-Yusefi J. Detection of Mycoplasmal DNA in rheumatoid arthritis patients serum by PCR. Journal of Medical Council of Islamic Republic of IRAN 2007; 25 (2): 178- 91.
(31) Soltani-Banavandi MJ., Shahhosseiny MH., Shahbazzadeh V., Karimi H., Mirzahosseiny F., Mahboudi D., et al. Selective amplification of prt., tyV and invA genes by multiplex PCR. Iranian Biomedical Journal 2005; 9 (3): 135- 8.
(32) Mahboudi F., Abolhassan M., Yaran M., Mobtaker H., Azizi M. Identification and differentiation of Iranian Leishmania species by PCR amplification of kDNA. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 2001; 33 (8): 596- 8.
(33) Mahboudi F., Abolhassani M., Tehrani S.R., Azimi M., Asmar M. Differentiation of old and new world leishmania species at complex and species levels by PCR. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 2002; 34 (10): 756- 8.
(34) Burkardt H.J. Standardization and Quality control of PCR analyses. Clinical Chemistry Laboratory Medicine 2000; 38 (2): 87- 91.
(35) Sachadyn P., Kur J. The construction and use of a PCR internal control. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (5): 259- 62.
(36) Siebert P.D., W. Larrick J. Competitive PCR. Nature 1992; 359 (26): 557- 8.
(37) Rosenstraus M., Wang Z., Chang S.Y., DeBonville D., Spadoro J.P. An internal control for routine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. Journal of clinical and Microbilogy1993; 36 (8): 191- 7.
(38) Ra dstro¨m P., fstro¨m C. Lo., Venklev M., Knutsson R., Wolffs P. Strategies for overcoming PCR inhibition, In C. W. Diefenbach and G.S. Dveksler (ed.), PCR primer: a laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N. Y. 2003. P. 149- 61.
(39) Lu¨beck P.S., Wolffs P., Ra dstro m P., Hoorfar J. Toward an international standard for PCR-based detection of food-borne thermotolerant campylobacters: assay development and analytical validation. Apply Environmental Microbiology 2003; 69 (2): 5664- 69.
(40) Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Molecular and Cellular Probes 1998; 12 (22): 367- 77.
(41) Abdulmawjood A., Roth S., Bu lte M. Two methods for construction of internal amplification controls for the detection of Escherichia coliO157 by polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes 2002; 16 (5): 335- 9.
(42) Belotserkovskii B P., Johnston BH. Polypropylene tube surfaces may include denaturation and multimerisation of DNA. Science 2003; 271 (42): 222- 3. |
)