نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
2 استادیار بیوشیمی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
3 استادیار میکروبیولوژی دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
 Introduction: Biofertilizers are the microorganisms that can convert useless nutrient to usable compounds. Unlike fertilizer, cost of biofertilizer production is low and doesnât produce ecosystem pollution. Phosphate fertilizers can be replaced by phosphate biofertilizer to produce improvement. So, it is necessary to screen the climate-compatible phosphate solubilizing bacteria .  Materials and methods: In this project samples were picked up from Loriya hot spring, which are located in Jiroft. Samples were incubated in PKV medium for 3 days. Screening of phosphate solubilizing bacteria was performed on the specific media, based on clear area diameter. The best bacterium was identified based on 16s rDNA gene. Phosphate solubilizing activity of this strain was considered in different carbon, nitrogen, phosphate and pH sources .  Results: Sequence alignment and phylogenetic tree results show that B. sp. LOR033 is closely related to Bacillus licheniformis , with 97% homology. In addition, results show that maximum enzyme production was performed after 2 days that incubation pH was decreased simultaneously when the time was increased. Carbon sources investigation show that glucose is the most appropriate in enzyme production and phosphate releasing. Furthermore, results show that the optimum initial pH for phytase production was pH5.0. Different phosphate sources show that tricalcium phosphate has the suitable effect on enzyme activity in three days of incubation . Discussion and conclusion : Phosphatase enzyme production capacity, growth in acidic pH and phosphate solubilizing potential in different salt and phosphate sources show that this strain has considerable importance as biofertilizers .
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
فسفر یک ماده غذایی مهم و محدود کننده رشد گیاهان بوده و بر خلاف نیتروژن، منبع اتمسفری بزرگی ندارد (1). توسعه ساقه، استحکام ریشه و ساقه، رسیدن محصولات، تثبیت نیتروژن در لوگوم، کیفیت محصولات و مقاومت به بیماریهای گیاهی، مرتبط با تغذیه فسفر هستند (2-4). یکی از راههای برطرف ساختن نیاز فسفر گیاهان استفاده از کودهای شیمیایی است؛ ولی بهعلت محدود بودن این منابع، افزایش قیمت تمام شده آن، مخاطرات زیست محیطی ناشی از کاربرد آنها و تثبیت شدن قسمت اعظم کود فسفاته مصرفی به شکل غیر قابل استفاده برای گیاه، توجه به کودهای زیستی فسفاته ضرورت یافته است. فسفر در نهشتههای معدنی یافت میشود و به عنوان منابع طبیعی غیرقابل تجدید محسوب میشود. این مسئله برای تعداد زیادی از کشورهایی که بدون سنگ فسفات هستند، بسیار مهم و جدی است. استخراج کانیهای فسفردار و پخش کود فسفر دار در زمینها به علت محدود بودن منابع فسفر، پایدار نیست و آینده تولید این کود با مشکل روبروست. علاوه بر این، در عمل بازدهی کودهای شیمیایی فسفاته بین10 تا 25 درصد است. یعنی حدود 75 درصد آن در خاک در اثر واکنش با کاتیونهای فلزی به شکل رسوب و غیرقابل استفاده گیاه تبدیل میشود (5).
از این رو ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی فسفاته احساس میشود.
میکروارگانیسمهای خاک در برخی از فرآیندهای حلکنندگی فسفات دخالت دارند که تغییر شکل فسفر و در نهایت زیست فراهمی آن را برای گیاه تحت تاثیر قرار میدهند (6). باکتریها در مقایسه با قارچها در انحلال فسفات بسیار موثرتر بوده و جمعیت بالایی را به خود اختصاص میدهند (7). میکروارگانیسم‌ها نقش مرکزی را در چرخه فسفر طبیعی دارا هستند. این چرخه فسفات به وسیله اکسیداسیون و احیا ترکیبات فسفر انجام میشود و واکنش انتقال الکترون، بین مرحله اکسیداسیون از فسفین[1] (3-) به فسفات (5+)، انجام میشود. غلظت فسفر محلول در خاک معمولا بسیار پایین است و به طور معمول حدود ppm 1 یا کمتر است (8). سلول ممکن است به چند شکل فسفر را جذب کند اما مناسبترین آنها در شکل H2PO4- و HPO42-جذب میشود. نمونههای متنوعی از میکروارگانیسم‌ها قادر به رهاسازی فسفر از منابع رسوب یافته فسفر گزارش شده اند. استفاده از آنها به عنوان کود زیستی یا عامل کنترل برای بهبود کشاورزی به طور گسترده طی سالها بررسی شده است (9). در میان آنها سویههایی از جنس سودوموناس، آزوسپریلیوم، بورخولدریا، باسیلوس، انتروباکتر، ریزوبیوم، اروینیا، سراشیا، فلاوباکتریوم، آلکالیژنز، آرتروباکتر و اسنیتوباکتر قرار گرفتهاند (10 و 11). برای اینکه این فسفر برای گیاهان قابل دسترس شود، باید به فسفات معدنی هیدرولیز شود. معدنی شدن بیشتر ترکیبات فسفر آلی به وسیله آنزیمهای فسفاتاز انجام میشود.
اگر چه چندین باکتری حلکننده فسفات در خاک وجود دارد ولی معمولا تعداد آنها به اندازه کافی زیاد نیست تا با باکتریهای متداول دیگر موجود در ریزوسفر رقابت کنند. بنابراین، مقدار فسفر آزاد شده به وسیله آنها برای افزایش رشد اساسی گیاه کافی نیست. از این رو تلقیح گیاه به وسیله این میکروارگانیسم‌ها در غلظت بالاتر از معمول در خاک ضروری است تا خاصیت حلکنندگی فسفات برای افزایش محصولات گیاهی انجام شود (12). کودهای زیستی فسفاته به دست آمده از ریزسازوارهها میتوانند به منظور افزایش محصول، جایگزین بخشی از کودهای شیمیایی شوند. این کودها از نظر هزینه ارزانتر بوده و بسیار سازگار با محیط هستند (13 و 14). با توجه به سازگاری میکروارگانیسم‌ها با شرایط محیط و اقلیمی زیستگاه اصلی آنها، تولید کود زیستی از باکتریهای غیربومی که از مناطقی با ویژگی‌های اقلیمی متفاوت نسبت به شرایط داخلی کشور به دست آمده‌اند کارایی مطلوبی نخواهد اشت. به عنوان نمونه تلقیح باسیلوس مگاتریوم واریته فسفوریکم[2]، به طور موفق در روسیه و هند استفاده شد اما تاثیر مشابهی در خاکهای امریکا نشان نداد (15). بنابراین، استفاده از باکتریهای بومی که با شرایط زیستی کشور سازگار هستند در تولید کودهای زیستی مناسب‌تر خواهد بود. در این تحقیق، از چشمه آب گرم لریا در استان کرمان نمونهبرداری شد. این چشمه دارای دمای 68 درجه سانتیگراد و اسیدیته 5/5 است. باکتریهای حلکننده فسفات در محیط اختصاصی غربالگری شدند. سپس، پتانسیل حلکنندگی بهترین گونه باکتریایی حلکننده فسفات در حضور ترکیبات مختلف ارزیابی شد. این باکتری با روش مولکولی S rRNA16 شناسایی شد.
مواد و روشها
نمونهبرداری
از چشمه آب گرم لریا در شهرستان جیرفت استان کرمان نمونهبرداری شد. دمای این چشمه 68 درجه سانتیگراد و اسیدیته آن 5/5 است. این چشمه از دیر باز مورد استفاده مردم منطقه بوده است. آنها معتقد هستند که دردهای مفاصل و غیره را تسکین میدهد. این چشمه جزو چشمههای آب گرم معدنی و اسیدی است که برای یافتن باکتریهایی زیستی سازگار با خاکهای اسیدی مطالعه شده است.
غربالگری باکتری حلکننده فسفات
نمونههای خاک و آب چشمه یاد شده ابتدا در محیطهای مایع PKV کشت داده شدند. ترکیبات این محیط شامل: گلوکز (10گرم در لیتر)، تری کلسیم فسفات (5 گرم در لیتر)، سولفات آمونیوم (5/0 گرم در لیتر)، کلرید سدیم (2/0 گرم در لیتر)، سولفات منیزیوم
(1/0 گرم در لیتر)، کلرید پتاسیم (2/0 گرم در لیتر)، عصاره مخمر (5/0 گرم در لیتر)، سولفات منگنز
(002/0 گرم در لیتر)، سولفات آهن (002/0 گرم در لیتر) با اسیدیته 7 بودند. پس از 48 ساعت محیطهای کشت با محیط تازه تعویض شد. پس از رشد در این محیطهای مایع، از هر محیط مقدار 100 میکرولیتر برداشت و در محیط جامد PKV کشت داده شد. پس از 48 ساعت میزان تولید آنزیم و قدرت حلکنندگی فسفات با بررسی قطر هالهها و اندازهگیری فعالیت آنزیمی بررسی شد.
سنجش فعالیت آنزیمی و اندازهگیری میزان فسفات آزاد شده
سنجش آنزیم به وسیله گرمخانهگذاری 25 میکرولیتر آنزیم در 37 درجه سانتیگراد، برای مدت30 دقیقه با 950 میکرولیتر محلول 40 میلیمولار سوبسترا در بافر 100 میلیمولار استات سدیم اسیدیته (5/5) انجام شد. پس از گرمخانهگذاری، واکنش با افزودن1میلیلیتر محلول 5 درصد TCA متوقف شده و فسفات معدنی آزاد میشود. سپس 2 میلیلیتر معرف رنگی(5/1 درصد مولیبدات آمونیوم در 5/5 درصد سولفوریک اسید و 7/2 درصد از محلول سولفات آهن) افزوده شد و مقدار فسفات رها شده در700 نانومتر بررسی شد. در این مثال، یک واحد فعالیت آنزیمی، مقدار آنزیمی است که (1 میکرومول) فسفات معدنی در هر دقیقه، تحت شرایط سنجش آزاد کند (16).
شناسایی باکتری حلکننده فسفات با روش مولکولی
s rDNA16
ابتدا باکتری روی محیط نوترینت آگار کشت چمنی داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای40 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. باکتریهای رشد یافته به کمک لوپ از سطح محیط کشت جمع آوری و سوسپانسیونی از آن در آب مقطر استریل تهیه شد. با سانتریفیوژ سوسپانسیون حاصل در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه و در دور g5000 رسوب باکتری به دست آمد. جداسازی DNA ژنومی با استفاده از کیت سیناکلون انجام شد. به منظور تخمین کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده، جذب محلول رقیق شده DNA (با رقت 100) در طول موجهای 260 و 280 نانومتر اندازهگیری شد. با استفاده از رابطه DNA (میکروگرم/میلی لیتر) =50. d. A260Conc. و نسبت A260/A280 به ترتیب غلظت DNA و میزان خلوص آن تخمین زده شد (17). پرایمرها مطابق با پرایمرهای عمومی برای تکثیر ژن S rRNA16 به شکل زیر طراحی شدند (16): پرایمر Forward: 5' -AGTTTGATCCTGGCTCAG – 3'. با Tm = 53/7 ºCو Reverseprimer: 5' -GGC/T TAC CTT GTT ACG ACT T-3'با Tm = 53/4 ºC. واکنش PCR مطابق با برنامه ذیل انجام شد: 1. دمای اولیه 94 درجه سانتیگراد، برای مدت 5 دقیقه 2. 30 سیکل که هر کدام شامل: 94 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه و 54 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه و72 درجه سانتیگراد، 90 ثانیه 3. برای تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد، برای مدت 8 دقیقه. محصول PCR پس از الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد با استفاده از کیت استخراج DNA خالصسازی شد. سپس توالی DNA با استفاده از توالییاب DNA توسط بیونیر[3](کره) تعیین شد.
بررسی میزان تولید آنزیم فسفاتاز در طی زمان
باکتری مولد فسفاتاز که دارای بیشترین هاله در محیط جامد حاوی تریکلسیم فسفات بود، برای تعیین بهترین زمان تولید آنزیم استفاده شد. برای این منظور، این باکتری در محیط PKV در دمای 40 درجه سانتیگراد و 180 دور در دقیقه کشت داده شدند و به مدت 5 روز با روش مولیبدینیوم- بلو[4]، تولید آنزیم اندازهگیری شد (18). بازه زمانی که در آن بیشترین غلظت فسفات آزاد در محیط حاصل شود، به عنوان زمان بهینه حلکنندگی فسفات در نظر گرفته شد. همزمان با تعیین زمان بهینه حلکنندگی فسفات، اسیدیته اولیه محیط کشت PKV نیز اندازهگیری شد. علاوه بر این منحنی رشد باکتری نیز در شرایط ذکر شده نیز بررسی شد.
اثر منابع کربنی بر میزان حلکنندگی فسفات
برای تعیین بهینهسازی منبع کربن، باکتری مورد نظر در محیط PKV، دمای 40 درجه و 180 دور در دقیقه کشت داده و به مدت 3 روز با روش مولیبدینیوم- بلو، میزان حلکنندگی فسفات آنها اندازهگیری شد. در این محیط از 3 نوع منبع کربن گلوکز، گالاکتوز و گلوکز + گالاکتوز به عنوان منبع انرژی استفاده شدند. به جز تفاوت در منبع کربن، سایر شرایط کشت و سنجش در همه محیطها یکسان در نظر گرفته شد.
اثر منابع نیتروژنی بر میزان حلکنندگی فسفات
در بهینهسازی منبع نیتروژن برای افزایش میزان حلکنندگی فسفات، 3 نوع ترکیب متفاوت شامل: آمونیوم سولفات، گلیسین و عصاره مخمر با غلظت (5/0 درصد) استفاده شد. باکتریهای مورد بررسی در محیط PKV، دمای 40 درجه و 180 دور در دقیقه کشت داده و در مدت 3 روز با روش مولیبدینیوم بلو، میزان حلکنندگی فسفات آنها اندازهگیری شد.
اثر اسیدیته محیط بر میزان حلکنندگی فسفات
برای بررسی تاثیر اسیدیته محیط، باکتری مورد نظر در محیط PKV با سه نوع اسیدیته متفاوت (5، 6 و 7) و به مدت 3 روز کشت داده شد. سپس با استفاده از روش مولیبدات بلو، میزان حلکنندگی فسفات آنها اندازهگیری شد.
اثر منابع فسفات بر میزان حلکنندگی فسفات
در بهینهسازی منبع فسفات، باکتریهای مورد نظر در محیط PKV یک بار با سدیم فیتات به عنوان منبع فسفات (محیط پایه PKV) و یک بار با تری کلسیم فسفات و بار دیگر فیتات (25/0 درصد)+ تری کلسیم فسفات (25/0 درصد) بررسی شدند. همچنین، محیط نوترینت براث (NB) هم بهعنوان شاهد (بدون افزودن فسفات) کار رفت. باکتریها در دمای 40 درجه و 180 دور در دقیقه کشت داده شدند و میزان حلکنندگی فسفات آنها به مدت 3 روز اندازهگیری شد.
اثر غلظتهای مختلف نمک بر میزان حلکنندگی فسفات
برای این منظور از غلظتهای متفاوت نمکهای موجود در محیط PKV یعنی NaCl، KCl، MgSO4 و FeSO4 استفاده شد. غلظتهای 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 از هر یک از نمکهای ذکر شده در محیط PKV تهیه شد و باکتری مورد نظر در این محیطها کشت داده شد. پس از 48 ساعت میزان فسفات آزاد شده اندازهگیری شد.
نتایج
غربالگری باکتری حلکننده فسفات
نمونه برداری از چشمه آب گرم لریا با دمای 68 درجه سانتیگراد انجام شد. نمونهها ابتدا به محیط مایع PKV با منبع تریکلسیم فسفات (به میزان 5/0درصد)، تلقیح و در انکوباتور با دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 2 روز گرمخانهگذاری شدند. پس از 48 ساعت این محیطها تعویض و به مدت 3 روز در دمای 40 درجه سانتیگراد در انکوباتور گرمخانهگذاری شدند. سپس، 100 میکرولیتر از این محیطها روی محیطهای جامد PKV با منبع تریکلسیم فسفات کشت داده و در گرمخانه با دمای 40 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از 48 ساعت میزان هاله اطراف کلونیها بررسی شد (شکل1). باکتریی که بیشترین هاله را نشان داد بهعنوان سوش بهینه برای مطالعات بعدی استفاده شد. با توجه به اینکه در اثر حلکنندگی فسفات اسیدیته محیط کاهش مییابد، ضروری است که باکتری حلکننده فسفات بتواند اسیدیته پایین را تحمل کند. باکتریهای این چشمه با توجه به اسیدیته محیط زیست خود، توانایی زندگی در اسیدیته پایین را دارا هستند.
شکل 1- باکتری حلکننده فسفات در محیط PKV
تعیین گونه میکروارگانیسم با استفاده s rDNA16
با استفاده از اطلاعات حاصل از توالی ژن
S rDNA16 تعیین گونه باکتریایی انجام شد (19). DNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج DNA سیناکلون استخراج شد وDNA تکثیر یافته، به طول1400 نوکلئوتید، توسط کیت تخلیص DNA شرکت سیناژن از روی ژل تخلیص و سپس برای تعیین توالی به شرکت بیونیر (کره) ارسال شد. پس از تعیین توالی، برای ژن مورد نظر در مقایسه با سایر ژنهای
S rDNA16 درخت فیلوژنتیکی رسم شد. رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزار MEGA4 و مقایسه توالی S rDNA16 باکتری LOR033 با 19 گونههای باسیلوس موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی NCBI انجام شده است (20 و 21). نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق به licheniformisB. شباهت دارد که میزان شباهت نوکلئوتیدی آنها 97 درصد است (شکل 2).
شکل 2- درخت فیلوژنی باکتری
بررسی تولید آنزیم در طی زمانهای گرمخانهگذاری
نتایج حاصل از شکل 3 نشان میدهد که میزان تولید آنزیم تا 48 ساعت پس از گرمخانهگذاری افزایش در خور توجهی نشان میدهد ولی پس از آن به تدریج کاهش مییابد. به طوری که پس از 5 روز گرمخانهگذاری میزان تولید آنزیم نصف مقدار بیشینه گزارش میشود. همزمان با تعیین بهینه زمان تولید آنزیم، اسیدیته محیط کشت نیز اندازهگیری شد. اسیدیته اولیه محیط کشت 80/6 بود که پس از 24 ساعت این میزان کاهش یافت و محیط اسیدیتر شد.
شکل 3- منحنی تولید آنزیم در طی زمان
بررسی اثر عوامل مختلف بر قدرت حلکنندگی فسفات
اثر منابع کربنی بر میزان حلکنندگی فسفات
منبع کربن به عنوان عامل مهم و موثر در رشد و متابولیسم میکروبی است. حتی سرعت رشد ویژه بهوسیله شرایط مختلف محیطی، به ویژه، پیچیدگی محیط کشت و ماهیت منبع کربن و انرژی اصلی تحت تاثیر قرار میگیرد. بنابراین، یکی از راههای افزایش تولید متابولیت در باکتریها، تعیین بهترین منبع کربن است که بالاترین اثر را در رشد یا بیشترین تولید دارد. برای تعیین بهینهسازی منبع کربن، باکتری مورد نظر در محیط PKV در دمای 40 درجه کشت داده شد. در این محیط از 3 نوع منبع کربن گلوکز، گالاکتوز و گلوکز+گالاکتوز به عنوان منبع انرژی استفاده شدند و میزان حلکنندگی فسفات آنها بررسی شد.
نتایج حاصل در شکل4 نشان میدهد که میزان فسفات آزاد شده در محیط واجد گلوکز به میزان در خور توجهی از سایر محیطها بیشتر است. البته بیشترین میزان تولید در تمام محیطها در زمان 48 ساعت پس از گرمخانهگذاری گزارش میشود و پس از آن کاهش مییابد. نتایج خاطر نشان میسازد که میزان رهاسازی فسفات در محیط واجد گلوکز در زمانهای 24 و 72 ساعت پس از گرمخانهگذاری به ترتیب 70 و 85 درصد میزان بهینه (48 ساعت) است. از این رو محیط واجد گلوکز، محیط مناسبتری برای تولید آنزیم و افزایش قدرت حلکنندگی فسفات در شرایط آزمایشگاه گزارش میشود.
شکل 4- اثر منابع کربنی بر میزان حلکنندگی فسفات
اثر منابع نیتروژنی بر میزان حلکنندگی فسفات
منبع نیتروژن از عوامل مهم در رشد و تولید محصولات میکروبی است. همچنین، باید توجه داشت که باکتری در مصرف منبع نیتروژن، به انرژی نیاز دارد. به عنوان نمونه مصرف موادی مانند نیترات نسبت به آمونیاک به انرژی بیشتری در باکتری نیاز دارد. بنابراین، بر روی سرعت رشد و در نهایت محصولات میکروبی موثر است. برای بهینهسازی منبع نیتروژن برای رهاسازی فسفات، با توجه به مقالههای مشابه، 3 نوع ترکیب متفاوت شامل: آمونیوم سولفات، گلیسین و نیترات سدیم با غلظت (5/0 درصد) استفاده و میزان فسفات رها شده در طی زمان اندازهگیری شد (22 و 23).
نتایج بهینهسازی منبع نیتروژن برای باکتری مورد نظر نشان داد که در محیط واجد آمونیوم سولفات، در هر 3 روز، بیشترین میزان تولید آنزیم به دست آمد (شکل 5). نتایج نشان میدهد که افزایش زمان گرمخانهگذاری تاثیر قابل ملاحظهایی در تولید آنزیم در محیط واجد گلیسین ندارد. بالاترین و کمترین تولید آنزیم به ترتیب در محیطهای واجد آمونیوم سولفات و سدیم نیترات گزارش میشود. زمان 48 ساعت بهترین زمان تولید آنزیم برای محیط واجد آمونیوم سولفات گزارش میشود. در این زمان میزان تولید آنزیم در محیطهای واجد گلیسین و سدیم نیترات به ترتیب 70 و 30 درصد محیط واجد آمونیوم سولفات است.
شکل 5- اثر منابع نیتروژنی بر میزان حلکنندگی فسفات
اثر اسیدیته محیط بر میزان حلکنندگی فسفات
برای بررسی تاثیراسیدیته محیط، باکتری مورد نظر در محیط PKV با سه نوع اسیدیته متفاوت (5، 6 و 7) کشت داده شد و به مدت 3 روز تولید آنزیم و میزان فسفات آزاد شده بررسی شد. بیشترین میزان تولید آنزیم در اسیدیته 5 پس از 48 ساعت گرمخانهگذاری مشاهده شد. به نظر میرسد که اسیدیته 6 تأثیر قابل ملاحظهایی در تولید آنزیم و حلکنندگی فسفات نشان نمیدهد. قدرت حلکنندگی فسفات در اسیدیته 7 در زمانهای 24 و 48 ساعت پس از گرمخانهگذاری تاثیر قابل ملاحظه ایی را نشان نمیدهد؛ ولی پس از 48 ساعت گرمخانهگذاری کاهش مییابد. میزان تولید آنزیم در اسیدیتههای 6 و 7 به ترتیب 90 و 85 درصد میزان بهینه (اسیدیته 5) است (شکل 6). این نتایج قابلیت استفاده از این باکتری را در خاکهای اسیدی نشان میدهد.
شکل 6- اثر اسیدیته بر میزان حلکنندگی فسفات
اثر منابع فسفات بر میزان حلکنندگی فسفات
برای بهینهسازی منبع فسفات، باکتری مورد نظر در محیط PKV یک بار با فیتات به عنوان منبع فسفات (محیط پایه PKV) و یک بار با تری کلسیم فسفات (فسفر رایج خاک) و بار دیگر فیتات (25/0 درصد) + تری کلسیم فسفات (25/0 درصد) بررسی شدند. همچنین، محیط نوترینت براث (فاقد فسفات افزودنی) هم به کار رفت. باکتریها در دمای 40 درجه و180 دور در دقیقه کشت داده شدند و در نهایت تولید آنزیم آنها به مدت 3 روز اندازهگیری شد.
شکل 7- اثر منابع فسفات بر میزان حلکنندگی فسفات
نتایج نشان دادند که در هر 3 روز بیشترین تولید آنزیم در محیط واجد تریکلسیم فسفات حاصل شد که بیشینه آن پس از 48 ساعت گرمخانهگذاری بدست آمد. پس از آن محیط دارای سدیم فیتات+ تری کلسیم فسفات بالاترین فعالیت را پس از 48 ساعت داشت که میزان آن90 درصد مقدار بیشینه تولید آنزیم بود. تولید آنزیم محیط واجد سدیم فیتات پس از 48 ساعت در جایگاه سوم قرار داشت. همه محیطها پس از 72 ساعت تا حدود قابل ملاحظهایی تولید آنزیم خود را از دست داده اند. علاوه بر این نسبت تفاوت میزان تولید آنزیم محیطها در هر روز، در طی هر سه روز تقریبا ثابت باقی ماند (شکل 7).
اثر غلظتهای مختلف نمک بر میزان حلکنندگی فسفات
برای این منظور از نمکهای NaCl، KCl، MgSO4 و FeSO4 با غلظتهای 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 در محیط PKV تهیه شد و باکتری مورد نظر در این محیطها کشت داده شد. پس از 48 ساعت میزان فسفات آزاد شده اندازهگیری شد. نتایج نشان داد که تولید آنزیم در حضور غلظت 4/0 درصد NaCl به میزان 10 درصد افزایش داشت. بیشترین میزان تولید آنزیم در حضور 3/0 درصدKCl به میزان 40 درصد افزایش بود. در حضور غلظتهای مختلف MgSO4 تولید آنزیم به میزان یکسان حدود 15 درصد افزایش داشت. در حضور FeSO4 تا 2/0 درصد تولید آنزیم به میزان 20 درصد افزایش پیدا کرد ولی پس از آن با افزایش غلظت، کاهش پیدا کرد و در غلظت 4/0 درصد به حدود 80 درصد مقدار اولیه کاهش پیدا نمود (شکل 8). این نتایج خاطر نشان میسازد که این باکتری قابلیت تولید آنزیم و قدرت حلکنندگی فسفات در حضور غلظتهای مختلف نمکها را داراست که قابلیت استفاده آن را در خاکهای شور نشان میدهد.
شکل 8- اثر غلظتهای مختلف نمک بر میزان حلکنندگی فسفات
بحث و نتیجهگیری
مطالعات تولید آنزیمی نشان داد که حداکثر تولید آنزیم پس از 2 روز گرمخانهگذاری است و همزمان با افزایش زمان گرمخانهگذاری اسیدیته نیز کاهش مییابد. در مطالعاتی که توسط حسین خانی و همکارانش[v] در خصوص زمان بهینه تولید فسفاتاز توسط یکی از گونههای باکتری سودوموناس (جداسازی شده از فضولات ماکیان) انجام شد، مشخص شد که این باکتری پس از 72 ساعت بهترین تولید آنزیم را داشته است (22). این در حالی است که ساسیرخا و همکارانش[vi] گزارش کردند که باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6(جداسازی شده از خاک) پس از 24 ساعت، بیشترین تولید آنزیم را داشت (23). شایان ذکر است که در برخی مطالعات، زمان بهینه فعالیت با تغییر نوع محیط کشت باکتری تغییر یافت. کاهش اسیدیته مشاهده شده در اثر تولید آنزیم و رها شدن فسفات معدنی به محیط به تدریج روی تولید آنزیم نیز اثر منفی میگذارد.
بررسی منابع کربنی در میزان حلکنندگی فسفات نشان داد که گلوکز مناسبترین منبع کربنی در تولید آنزیم و رهاسازی فسفات است. در تحقیقات حسینخانی و همکارانش باکتری سودوموناس بیشترین تولید آنزیم را در محیط دارای گلوکز+ساکارز به عنوان منبع کربن داشت (22). همچنین، در آزمایشهای ساسیرخا و همکارانش، باکتری سودموناس آئروژینوزا P6، در محیط واجد گلوکز به میزان زیادی آنزیم سنتز کرد (در مقایسه با محیطهای دیگر دارای منبع کربن مختلف) (23).
در تحقیقاتی که چاندرا شخارنایوتیال و همکارانش[vii] بر روی بهینهسازی منبع کربن برای 4 باکتری حلکننده فسفات جدا شده از خاکهای قلیایی انجام دادند، مشاهده شد که برای دو سویه، گزیلوز و یکی از باکتریها، لاکتوز و دیگری گلوکز از بهترین منابع کربن هستند و در واقع سویهها از نظر منبع کربن مناسب با هم اختلاف داشتند (14). همچنین، در مطالعه دیگری توسط ترافدار[viii] روی باکتریهای حلکننده فسفات جهش یافته، گلوکز به عنوان بهترین منبع کربن مشاهده شد (10). به طور کلی با استنباط از این آزمایش و مطالعات دیگران میتوان نتیجه گرفت که تاثیر تغییر منبع کربن با سویه حلکننده و سایر شرایط مرتبط است. نتایج بهینهسازی منبع نیتروژن و اندازهگیری میزان رشد نشان داد که آمونیوم سولفات مناسبترین منبع نیتروژنی برای رشد باکتری و تولید آنزیم مورد نظر است که زمان بهینه در حلکنندگی فسفات نیز 48 ساعت پس از گرمخانهگذاری گزارش میشود. ساسیرخا و همکارانش در بررسی منبع نیتروژن بهینه برای باکتری سودوموناس آئروژینوز اP6نتیجه گرفتند که این باکتری در محیط حاوی عصاره مخمر، بیشترین تولید آنزیم را دارد (23). در حالی که حسین خانی و همکارانش نتیجه گرفتند که باکتری سودوموناس جداسازی شده از خاک، در محیط واجد عصاره جو، بیشترین تولید را دارد (22). بنابراین، میتوان نتیجه گرفت که منبع نیتروژن بهینه برای باکتریهای مختلف، متفاوت است.
چاندرا شخارنایوتیال و همکارانش گزارش کردند که در 4 سویه مورد مطالعه، 2 مورد حلکنندگی بیشتری در نیترات پتاسیم و یکی از آنها در نیترات سدیم و دیگری در نیترات کلسیم داشتند. همچنین، آنها اعلام کردند که به نظر میرسد باکتریهای حلکننده فسفات دارای مکانیسمهای متفاوت و تطبیقپذیری برای حلکنندگی فسفات باشند و به همین دلیل این باکتریها در منابع متفاوت از هم، بالاترین حلکنندگی را نشان میدهند که این موضوع بر خلاف قارچهای حلکننده فسفات است که فقط از طریق دو مکانیسم (تولید اسید) عمل میکنند (14). همچنین، سانگتا متا و شخار نایوتیال نشان دادند در سویههای موتانت مورد بررسی، آمونیوم سولفات بیشترین تاثیر را دارد (10).
بررسی حلکنندگی فسفات در حضور اسیدیتههای مختلف نشان داد که اسیدیته 5 مناسبترین است. البته باید توجه داشت که رشد باکتری و متابولیتهای میکروبی در مدت 3 روز نیز باعث تغییر اسیدیته اولیه محیط کشت میشود. بنابراین، بر خلاف دیگر عاملهای موثر برای بهینهسازی تولید آنزیم (مانند منبع کربن، فسفات و نیتروژن) ، میزان اسیدیته محیط متغیر است.
ساسیرخا و همکارانش گزارش کردند که ماکزیمم تولید فیتاز توسط باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6در اسیدیته 6 به دست آمد و در حدود 80 اسیدیته فعالیت در محدوده اسیدیته 4 تا 5/7 مشاهده شد. همچنین، با افزایش اسیدیته، تولید آنزیم کاهش یافت، به طوری که فقط 30 اسیدیته فعالیت در 10 اسیدیته به دست آمد (23). باکتری در محیط دارای اسیدیته 5، مشابه محیط دارای اسیدیته 6 و حتی بیشتر از این محیط عمل میکند. بنابراین، با تغییر شرایط محیط که به علت رشد و فعالیت باکتری است، فعالیت حلکنندگی در محیطها در زمانهای مختلف، با هم تفاوت پیدا میکند. اما در این باکتری هم به نظر میرسد که محدوده اسیدیته بهینه 5 تا 6 است. در باکتری حلکننده فسفات Pantoeastewartiisubsp. Stewartiig6بیشترین تولید در اسیدیته 5 مشاهده شد (24). البته شخارنایوتیال و همکارانش مشخص کردند که در سویههای PSB جدا شده از خاکهای قلیایی در اسیدیته 8 و بالاتر (یکی از سویهها در اسیدیته 12) بالاترین حلکنندگی را نشان میدهند. این موضوع به علت تطابق سویههای جدا شده از محیط بومی قابل توجیه بود (14).
اثر منابع مختلف فسفات نشان داد که تریکلسیمفسفات اثر در خور توجهی در افزایش تولید آنزیم در طی 3 روز گرمخانهگذاری دارد. شایان ذکر است که علاوه بر نوع منبع فسفات، غلظت بالای فسفات نیز به عنوان مهار کننده سنتز فسفاتازها شناخته شده است، در حالی که میزان محدود فسفات باعث بیان بالای این آنزیمها میشود. باکتری سودوموناس آئروژینوزا P6 در محیط دارای غلظت فیتات سدیم (5/1 درصد)، بالاترین تولید آنزیم را نشان میدهد. در حالی که در غلظت بالاتر، میزان تولید آنزیم کاهش مییابد (23). در مطالعات حسین خانی و همکارانش، باکتری سودوموناس در 3 محیط نوترینت براث، محیط PKV واجدتری کلسیم فسفات و محیط PKV دارای فیتین به عنوان منبع فسفات کشت داده که بهترین تولید آنزیم را در فیتین داشت. در این مورد ممکن است فیتات سدیم، تولید فیتاز را القا کند (22). اثر غلظتهای مخلف نمک بر قدرت حلکنندگی نشان داد که در غلظت 1/0 درصد، تمامی نمکها افزایش در خور توجهی در تولید آنزیم دارند. بیشترین افزایش در میزان حلکنندگی فسفات به میزان 40 درصد در حضور 3/0 درصد KCl مشاهده شد.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان و صندوق حمایت از پژوهشگران و فن آوران کشور (INSF) انجام شده است که بدینوسیله از ایشان قدردانی و سپاسگزاری میشود.
)