نویسندگان
1 دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
2 دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
3 استاد بیوتکنولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
4 استاد مهندسی شیمی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
5 استادیار بیوتکنولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
 Introduction: Reduction of fossil fuels due to its increasing consumption caused the biofuels production as an important topic, today. Using resources that have not food application was regarded as the second generation biofuels and consisted of lignocelluloses. Since considerable amount of lignocellulosic material are pentoses, utilizing them is important for the production of biofuels.  Materials and methods: Sugarcane bagasse was pretreated with dilute acid method. Pichia stipitis was used for the fermentation of released sugars. A L27 Taguchi orthogonal array was considered to optimize the fermentation process and increase the amount of ethanol. The eight factors with three levels considering nitrogen, phosphorus, zinc, sulfur, magnesium, and vitamins sources were considered in this study.  Results: The analysis of the results shows that corn steep liquor, ammonium hydrogen phosphate, potassium di-hydrogen phosphate and magnesium sulfate have a significant effect on the production of ethanol, respectively. Confirmation of the optimal conditions shows that ethanol production was increased 97% relative to the mean of the observed results. The yield and productivity during 48 h of the fermentation were reached to 0.26 (g ethanol/g consumed sugar) and 0.125g (L.h), respectively.  Discussion and conclusion: At the optimum condition the production of ethanol from sugarcane bagasse hydrolysate had higher efficiency relative to previous studies. Results of medium optimization considering cheap resources showed showed an excellent potential toward an economical bioethanol production process . Â
کلیدواژهها [English]
مقدمه
با توجه به محدودیت سوختهای فسیلی و به علت مصرف روزافزون آنها، تولید سوختهای زیستی مایع از مواد لیگنوسلولوزی اهمیت ویژهای یافته است. بیواتانول به عنوان یکی از سوختهای جایگزین مطرح است که میتوان آن را به شکل ترکیبی با بنزین برای استفاده در وسایل نقلیه و بدون تغییر موتور استفاده کرد (1). روش متداول تولید اتانول استفاده از روشهای تخمیری است که با استفاده از سوبسترای قندی انجام میگیرد. سوبسترای قندی مانند ملاس یا به شکل قندهای قابل تخمیر است که مستقیما میتوان از آن اتانول تولید کرد و یا اینکه مانند ذرت سوبسترای نشاسته ایست که باید آن را به قندهای قابل تخمیر تبدیل و سپس برای تولید اتانول استفاده کرد. به سوختهای حاصل از سوبستراهای مانند نشاسته که میتوان آنها را برای مصرف غذایی نیز در نظر گرفت، سوختهای نسل اول میگویند. امروزه انتقادهای زیادی برای استفاده از سوختهای نسل اول مطرح است از این رو که مواد اولیه آنها سطح بالایی از زمینهای کشاورزی را به خود اختصاص میدهند و نیز مصرف غذایی دارند. استفاده از منابع اولیه ای که مصرف غذایی نداشته باشند برای تولید سوختهای زیستی نسل دوم مطرحاند و مواد لیگنوسلولزی را در بر میگیرند. با توجه به اینکه مقدار زیادی از مواد لیگنوسلولزی را قندهای پنتوز تشکیل میدهند، استفاده از این قندها برای تولید سوختهای زیستی اهمیت ویژه ای دارد. میزان تولید باگاس نیشکر در ایران سالیانه حدود 4 میلیون تن است (2). این میزان بقایای کشاورزی باعث اشغال فضای زیاد و اعمال هزینههای در خور توجه برای از بین بردن، سوزاندن، دفن کردن و از طرف دیگر اثرات زیست محیطی نامطلوب شده است. باگاس نیشکر را میتوان به طیف وسیعی از محصولات از جمله خوراک دام، کاغذ، نئوپان، و غیره تبدیل کرد. در این میان بیواتانول که جزو یکی از محصولات زیستی مهم است را میتوان از باگاس تولید کرد. از آنجایی که قندهای پنتوز سهم بیشتری از مواد لیگنوسلولزی را تشکیل میدهند، بنابراین، ایجاد فرآیندی اقتصادی برای تخمیر قندهای پنتوز مورد توجه واقع شده است. مخمر ساکارومایسس سرویزیه[1] که از متداولترین میکروارگانیسمهای صنعتی تولید اتانول است قابلیت مصرف پنتوزها را ندارد، بنابراین، باید از میکروارگانیسمی استفاده کرد که توانایی مصرف قندهای پنتوز و تبدیل آنها به اتانول را داراست. یکی از میکروارگانیسمهای شناخته شده ای که قابلیت تبدیل قندهای پنج کربن را به اتانول دارد مخمر پیکیا استیپیتیس[2] است که بهترین تخمیر کننده قندهای پنتوز به شمار میرود (3). یکی از ویژگیهای تخمیر قندهای پنتوز این است که برای تخمیر آنها به هوادهی محدود نیاز است. طی پژوهشی برای بهینهسازی مخمر پیکیا استیپیتیس با استفاده از محیط کشت کاملا معین، اوره و اسیدهای آمینه و یونهای منیزیم و روی و آهن و منگنز، دارای اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول بوده است (4). شربت ذرت خیسانده به عنوان یک منبع غنی از ویتامین و اسیدهای آمینه میتواند جایگزین مناسبی برای عصاره مخمر و پپتون در تولید اتانول با مخمر پیکیا استیپیتیس باشد (5). اگرچه تا کنون برای تولید اتانول از قند زایلوز به شکل خالص پژوهشهای متعددی انجام شده است با این حال برای بهینهسازی محیط کشت تولید بیواتانول با استفاده از مخمر پیکیا استیپیتیس و محیط آبکافته باگاس پژوهشی انجام نشده است. در این پژوهش، با استفاده از محیط پیش تیمار شده باگاس نیشکر، که مقدار بیشتری قندهای پنتوز دارد، تولید بیواتانول با مخمر پیکیا استیپیتیس و استفاده از روش تاگوچی بهینهسازی شده است.
مواد و روشها
پیش تیمار
باگاس نیشکر از شرکت کشت و صنعت کارون، اهواز تهیه، ابتدا آسیاب و با استفاده از غربالهای با مش 35 تا 80 غربال شد. رطوبت باگاس نیشکر 6 درصد اندازهگیری شد. برای پیش تیمار هر بار 30 گرم از باگاس نیشکر در 270 میلیلیتر محلول سولفوریک اسید 7/0 درصد (درصد حجمی) به مدت نیم ساعت خیسانده شد و سپس با استفاده از رآکتور 1 لیتری که از جنس استیل 316 ساخته شده بود پیش تیمار شد. برای تامین دمای مورد نظر در پیش تیمار از دستگاه اجاق[3] استفاده شد. رآکتور پس از آمادهسازی درون اجاق با دمای ثابت 180 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت قرار گرفت. پس از طی مدت زمان لازم رآکتور در یک ظرف بزرگ حاوی آب قرار گرفت تا خنک شود. پس از پیش تیمار باگاس، آبکافته[4] با استفاده از کاغذ صافی از جامد جدا شد. تفاله جامد یکبار شستشو و سپس برای استفادههای بعدی نمونهها در فریزر منجمد شد.
تخمیر
دو سوش پیکیا استیپیتیس از مرکز کلکسیون قارچها و باکتریهای ایران با مشخصه PTCC 5309 و PTCC 5310 به شکل اسلنت روی محیطPDA تهیه شد. آبکافته باگاس نیشکر که مطابق روش فوق به دست آمد، دارای مقدار زیادی قند پنتوز است و به عنوان منبع کربن برای تولید اتانول استفاده شد. منابع نیتروژن و فسفر و یونهای فلزی هر کدام به شکل محلولهای جداگانه تهیه و استریل شدند. محلول ویتامین ب کمپلکس حاوی ب 1، ب 2، ب 3، ب 5، ب 6 با درجه خلوص دارویی با غلظت به ترتیب 1، 4/0، 4، 6/0 و 4/0 میلیگرم بر میلیلیتر تهیه شد. محلولهایی حاوی 200 گرم در لیتر پودر خیسانده شربت ذرت و 160 گرم در لیتر از اوره، دی آمونیوم هیدروژن فسفات، آمونیوم سولفات، 40 گرم در لیتر پتاسیم دی هیدروژن فسفات، منیزیم سولفات، سولفات روی هر کدام به شکل جداگانه و به ترتیب در اتوکلاو و اوره با صافی 45/0 میکرون استریل شدند. برای هر آزمایش مقدار معینی از این محلولها به هر ارلن اضافه شد و تخمیر در ارلنهای 100 میلیلیتری در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm 100 کشت داده شدند.
انتخاب بین دو زیر گونه پیکیا استیپیتیس PTCC 5309 و PTCC 5310
برای انتخاب یکی از دو مخمر پیکیا استیپیتیس که در کلکسیون میکروبی وجود داشت چند آزمایش مقدماتی انجام شد. بدین شکل که تولید اتانول بر روی محیط حاوی زایلوز 3 و 6 درصد و محیط آبکافته باگاس انجام شد. محیط کشت دارای شربت ذرت خیسانده 10، آمونیوم سولفات 2/1 و آمونیوم فسفات 6/0 گرم بر لیتر بود.
روشهای سنجش
اندازهگیری مقدار قندهای آزاد شده با روش DNS (3 و 5 دی نیتروسالیسیلیک اسید) انجام شد (6). مقدار اتانول با روش دی کرومات پتاسیم اندازهگیری شد بدین ترتیب که محلول دی کرومات پتاسیم 1/0 مولار در سولفوریک اسید 5 مولار تهیه شد. 3/0 میلیلیتر نمونه تقطیر شده حاوی اتانول را به 3 میلیلیتر معرف اضافه، به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه گرم خانهگذاری و جذب آن در طول موج 590 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد (7) .
روش طراحی آزمایشها
برای بهینهسازی مقدار اتانول تولیدی، انتخاب عاملهای اثر گذار با استفاده از مرور مقالات و آزمایشهای مقدماتی بر روی آبکافته انجام شد. از روش تاگوچی و نرم افزار Minitab 16 استفاده شد. در این طراحی آزمایشها هشت عامل در 3 سطح با استفاده از آرایه L27 با دو تکرار بررسی شد. هر یک از عاملها و سطوح و واحد آنها در جدول 1 آمده است. برای ارزیابی طراحی تاگوچی میتوان از میانگین تکرار آزمایشها یا از نسبت سیگنال به نویز[5] (S/N) استفاده نمود. در آزمایشهایی که تکرار شده اند استفاده از تحلیل سیگنال به نویز (S/N) نسبت به میانگین دادهها اولویت دارد (8). در طراحی تاگوچی مقدار S/N طبق رابطه زیر برای بهدست آوردن مقدار بیشینه اتانول استفاده شد:
(1)
در رابطه بالا S/N نسبت سیگنال به نویز ،Y پاسخ هر آزمایش و n تعداد آزمایشها است. در طراحی تاگوچی نسبت S/N هر چه بیشتر باشد نشان دهنده شرایطی است که در آن عاملهای کنترل کننده اثر عاملهای اغتشاشی (نویز) را در پاسخ به کمترین مقدار میرساند (8). با توجه به اینکه در طراحی تاگوچی L27 با هشت عامل فقط میتوان اثرات متقابل دو عامل را در نظر گرفت در این آزمایشها اثرات متقابل CSL با اوره و ویتامین در نظر گرفته شد.
جدول 1- فاکتورها و سطوح انتخاب شده برای فاکتورهای مطالعه شده
|
فاکتورها |
اختصار |
واحد |
سطح 1 |
سطح 2 |
سطح 3 |
|
دی آمونیوم هیدروژن فسفات |
DAHP |
گرم در لیتر |
0 |
1 |
2 |
|
آمونیوم سولفات |
AS |
گرم در لیتر |
0 |
1 |
2 |
|
اوره |
Urea |
گرم در لیتر |
0 |
1 |
2 |
|
پودر خیسانده شربت ذرت |
CSL |
گرم در لیتر |
0 |
10 |
20 |
|
سولفات روی |
Zn |
گرم در لیتر |
0 |
25/0 |
5/0 |
|
سولفات منیزیم |
Mg |
گرم در لیتر |
0 |
25/0 |
5/0 |
|
پتاسیم دی هیدروژن فسفات |
K |
گرم در لیتر |
0 |
25/0 |
5/0 |
|
محلول ویتامین |
Vitamin |
میکرو لیتر در لیتر |
0 |
2 |
4 |
نتایج
انتخاب سوش برتر
تولید اتانول با استفاده از دو مخمر پیکیا نشان داد که مخمر PTCC 5309 نسبت به مخمر PTCC 5310 در تولید اتانول برتری دارد(شکل 1). علاوه براین بازدهی تولید اتانول در مخمر PTCC 5309 نسبت به مخمر PTCC 5310 بالاتر بوده است.
بهینهسازی محیط کشت برای مخمر پیکیا PTCC 5309
غلظت نهایی اتانول در هر آزمایش (با دو تکرار) به عنوان پاسخ در نظر گرفته شد و در جدول 2 آمده است. نتایج بهینهسازی عاملهای محیط کشت برای تولید اتانول نشان داد که دی آمونیوم هیدروژن فسفات اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول دارد. دی آمونیوم هیدروژن فسفات به عنوان منبع نیتروژن و نیز منبع فسفر محسوب میشود و اثر این عامل بر روی تولید اتانول را میتوان به هر کدام از این دو منبع ارتباط داد. آمونیوم سولفات که به عنوان منبع گوگرد و منبع نیتروژن مطرح است اثر در خور توجهی بر روی تولید اتانول نداشته و در مقادیر صفر، 1 و 2 گرم بر لیتر تغییری در تولید اتانول حاصل ایجاد نمیکند.
شکل 1- مقایسه دو سویه از مخمر پیکیا استیپیتیس. (چپ: غلظت تولید اتانول، راست: بازدهی تولید اتانول)
جدول 2- طراحی آزمایشها و پاسخ مربوطه (غلظت نهایی اتانول)
|
شماره |
DAHP |
AS |
Urea |
CSL |
Zn |
Mg |
K |
Vitamin |
اتانول1 (g/L) |
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
38/0±77/0 |
|
2 |
1 |
1 |
0 |
0 |
025/0 |
25/0 |
1 |
80 |
12/0±83/1 |
|
3 |
2 |
2 |
0 |
0 |
05/0 |
5/0 |
2 |
160 |
14/0±25/2 |
|
4 |
1 |
1 |
2 |
10 |
0 |
5/0 |
0 |
80 |
19/0±63/3 |
|
5 |
2 |
2 |
2 |
10 |
025/0 |
0 |
1 |
160 |
26/0±21/3 |
|
6 |
0 |
0 |
2 |
10 |
05/0 |
25/0 |
2 |
0 |
00/0±6/3 |
|
7 |
2 |
2 |
4 |
20 |
0 |
25/0 |
0 |
160 |
1/0±53/3 |
|
8 |
0 |
0 |
4 |
20 |
025/0 |
5/0 |
1 |
0 |
02/0±54/3 |
|
9 |
1 |
1 |
4 |
20 |
05/0 |
0 |
2 |
80 |
43/0±06/3 |
|
10 |
1 |
2 |
2 |
20 |
0 |
0 |
2 |
0 |
14/0±83/3 |
|
11 |
2 |
0 |
2 |
20 |
025/0 |
25/0 |
0 |
80 |
26/0±65/3 |
|
12 |
0 |
1 |
2 |
20 |
05/0 |
5/0 |
1 |
160 |
24/0±09/3 |
|
13 |
2 |
0 |
4 |
0 |
0 |
5/0 |
2 |
80 |
21/0±11/3 |
|
14 |
0 |
1 |
4 |
0 |
025/0 |
0 |
0 |
160 |
00/0±34/1 |
|
15 |
1 |
2 |
4 |
0 |
05/0 |
25/0 |
1 |
0 |
24/0±45/2 |
|
16 |
0 |
1 |
0 |
10 |
0 |
25/0 |
2 |
160 |
19/0±29/3 |
|
17 |
1 |
2 |
0 |
10 |
025/0 |
5/0 |
0 |
0 |
02/0±75/3 |
|
18 |
2 |
0 |
0 |
10 |
05/0 |
0 |
1 |
80 |
1/0±76/3 |
|
19 |
2 |
1 |
4 |
10 |
0 |
0 |
1 |
0 |
00/0±49/3 |
|
20 |
0 |
2 |
4 |
10 |
025/0 |
25/0 |
2 |
80 |
00/0±12/3 |
|
21 |
1 |
0 |
4 |
10 |
05/0 |
5/0 |
0 |
160 |
07/0±51/3 |
|
22 |
0 |
2 |
0 |
20 |
0 |
5/0 |
1 |
80 |
05/0±33/3 |
|
23 |
1 |
0 |
0 |
20 |
025/0 |
0 |
2 |
160 |
17/0±41/3 |
|
24 |
2 |
1 |
0 |
20 |
05/0 |
25/0 |
0 |
0 |
00/0±5/4 |
|
25 |
1 |
0 |
2 |
0 |
0 |
25/0 |
1 |
160 |
43/0±89/2 |
|
26 |
2 |
1 |
2 |
0 |
025/0 |
5/0 |
2 |
0 |
00/0±92/2 |
|
27 |
0 |
2 |
2 |
0 |
05/0 |
0 |
0 |
80 |
12/0±06/1 |
1) غلظت اتانول بر اساس میانگین دو تکرار ± انحراف معیار نشان داده شده است
آزمایشهایی که با عامل اوره در مقادیر صفر، 2 و 4 گرم بر لیتر انجام شد، نشان داد که وجود اوره در حد 2 گرم بر لیتر نسبت به نبودن آن تولید اتانول را بهبود میبخشد ولی استفاده از 4 گرم بر لیتر اوره تغییر چندانی بر تولید اتانول ندارد. نتایج نشان داد که در شرایط عدم حضور پودر شربت ذرت خیسانده، نسبت S/N 26/5 برای تولید اتانول حاصل شده است. در حالی که در مقدار 10 گرم بر لیتر از این عامل، نسبت S/N افزایش چشمگیری نشان داده و به مقدار 82/10 رسیده و افزایش بیشتر CSL از 10 به 20 گرم بر لیتر تغییر در خور توجهی در نسبت S/N ایجاد نمیکند. نتایج نشان میدهد که از شرایط بدون حضور یون منیزیم تا 25/0 گرم بر لیتر، نسبت S/N از 05/7 تا 84/9 تغییر میکند و در مقدار 5/0 گرم در لیتر نسبت S/N به 1/10 میرسد. پتاسیم دی هیدروژن فسفات در اینجا به عنوان یک منبع فسفر دیگر بررسی شده است تا بتوان اثر منبع فسفر را به طور جداگانه بررسی کرد. طبق شکل 2، نسبت S/N در غلظتهای 0، 25/0 و 5/0 گرم بر لیتر پتاسیم دی هیدروژن فسفات به ترتیب به54/7، 52/9، 93/9 گرم بر لیتر میرسد. افزودن محلول ویتامین که دارای چند نوع ویتامینهای گروه ب بوده، تاثیر در خور توجهی بر نسبت S/N نداشته است. شکل 2 اثر هر یک از عاملها را بر نسبت S/N نشان میدهد. جدول 3 تحلیل واریانس را برای این طراحی آزمایش نشان میدهد. طبق این جدول دی آمونیوم هیدروژن فسفات، پودر شربت ذرت خیسانده، منیزیم فسفات و پتاسیمدیهیدروژن فسفات جزو عاملهای مهم تاثیرگذار (05/0 p <) هستند.
جدول 3- تحلیل واریانس برای عاملهای انتخابی
|
P |
F |
درجه آزادی |
عامل |
|
020/0 |
49/48 |
2 |
DAHP |
|
812/0 |
23/0 |
2 |
AS |
|
232/0 |
31/3 |
2 |
Urea |
|
007/0 |
06/142 |
2 |
CSL |
|
962/0 |
04/0 |
2 |
Zn |
|
025/0 |
71/38 |
2 |
Mg |
|
043/0 |
03/22 |
2 |
K |
|
705/0 |
42/0 |
2 |
Vitamin |
|
100/0 |
29/9 |
4 |
Urea×CSL |
|
228/0 |
61/3 |
4 |
CSL×Vitamin |
|
|
|
2 |
Residual Error |
|
|
|
26 |
Total |
شکل 2- اثرات اصلی هر عامل با استفاده از بررسی سیگنال به نویز (S/N)
جدول 4-تایید شرایط بهینه برای تولید اتانول با مخمر PTCC 5309
|
مقدار واقعی الکل (g/L) |
مقدار پیش بینی شده الکل (g/L) |
Vitamin |
K |
Mg |
Zn |
CSL |
Urea |
AS |
DAHP |
|
04/6 |
3/5 |
0 |
5/0 |
5/0 |
0 |
10 |
2 |
0 |
2 |
تایید شرایط بهینه
بررسی شرایط بهینه تولید اتانول نشان میدهد که تولید اتانول پس از 48 ساعت به 6 گرم بر لیتر رسید. مقدار اتانول تولیدی با مقدار پیش بینی شده در جدول 4 آمده است.
تولید اتانول در شرایط بهینه
تولید اتانول طی 48 ساعت بر حسب زمان در شکل 3 آمده است. همانطور که شکل نشان میدهد، تعداد سلولها در فلاسکهای صد میلیلیتری با حجم محیط 40 میلیلیتر پس از طی 48 ساعت از 107×8/5 در هر میلیلیتر، به 108×6/5 در هر میلیلیتر رسیده است. میزان قند اولیه نیز که 8/26 گرم بر لیتر بوده پس از 48 ساعت به 5/3 گرم بر لیتر رسیده است و در اینحال، میزان اتانل پس از 48 ساعت به بیش از 04/6 گرم بر لیتر بالغ شده است.
شکل 3- تولید اتانول در شرایط بهینه
بحث و نتیجهگیری
نتایج نشان داد بین دو سوش آزمایش شده پیکیااستیپیتیس، سوش PTCC 5309 تولید اتانول بیشتری داشته است. مطالعات گذشته نیز برای تولید اتانول در محیط زایلوز 2 درصد با این دو مخمر نتیجه مشابهی داشته است و مخمر (CBS 5773(PTCC 5309 نسبت به مخمر (CBS 5776(PTCC 5310 تولید اتانول بیشتری داشته است (9).
بهینهسازی محیط کشت
محیط کشت بر روی حالت فیزیولوژی و زیستی مولکولی مخمر تاثیر میگذارد و میتواند در نهایت باعث تاثیر بر روی عملکرد و بازدهی میکروارگانیسمها شود. مخمرها به ترکیبات نیتروژن دار با وزن مولکولی پایین مثل یون غیر آلی آمونیم، اوره، آمینواسیدها و پپتیدها نیاز دارند (10). معمولا نیتروژن به شکل یون آمونیم و با اضافه کردن اوره، نمک فسفات و سولفات برای مخمر فراهم میشود. اوره توسط مخمر شکسته شده تا دو مولکول آمونیاک و یک مولکول دی اکسید کربن تولید کند. در تحقیقات انجام شده در مقیاس آزمایشگاهی معمولا از عصاره مخمر و پپتون استفاده شده است. با این حال این مواد برای استفاده در تخمیرهای صنعتی صرفه اقتصادی ندارد. بنابراین نیاز است از ترکیبات ارزان استفاده کرد که نیازهای تغذیهای مخمر را مرتفع کند. پژوهشهای دیگر نشان داده است که با استفاده از CSL در مقایسه با محیط کشتهایی که دارای عصاره مخمر و پپتون بوده اند اتانول بیشتری تولید شده است (5). نتایج بهینهسازی محیط کشت از روش تاگوچی نشان میدهد که CSL در تولید اتانول دارای اثر در خور توجهی بوده است. CSL که محصول جانبی کارخانههای تولید نشاسته از ذرت است منبع ارزانی است که دارای پروتئین، اسیدهای آمینه مختلف و ترکیبات معدنی و ویتامین و عناصر فلزی کم مقدار است که میتوان آن را جایگزین عصاره مخمر و پپتون نمود (10). اثر یونهای فلزی بر روی رشد و تخمیر مخمر اثبات شده است. طبق مطالعات انجام شده منیزیم، روی و کلسیم بر سرعت مصرف قند تاثیرگذار بوده و به علاوه این فلزات به عنوان کوفاکتورهای مورد نیاز در چرخههای متابولیکی مطرح هستند (11). اثر یون منیزیم و کلسیم برای افزایش تحمل مخمر برای اتانول گزارش شده است. ساز و کار اثر یون منیزیم در حفاظت مخمر با کاهش تراوایی پذیری غشای سلول تحت تاثیر اتانول انجام میگیرد (12). طبق شکل 3 تولید اتانول با تغییر مقدار روی یا مقدار ویتامین تغییر چندانی نداشته است. دلیل این عدم تاثیر را میتوان این گونه توجیه کرد که چون شربت ذرت خیسانده (CSL) خود دارای مقدار کافی یون روی و همچنین، مقدار کافی از انواع مختلف ویتامینها است این عامل در تولید اتانول تاثیر ندارد.
در شرایطی که هر یک از عاملهای مورد بررسی در مقدار مناسب خود قرار داشتند تولید اتانول طی 48 ساعت بررسی شد و نتیجه نشان میدهد که تولید اتانول نسبت به بیشترین مقدار مشاهده شده (4/5 گرم در لیتر) در طراحی آزمایشها بالاتر بوده است. مطالعات دیگر نشان میدهد که تولید اتانول با استفاده از باگاس نیشکر و بدون سم زدایی پس از 120 ساعت به9/4 گرم بر لیتر رسیده است بازده تخمیر در این حالت 2/0 بوده است. با سم زدایی با زغال فعال اتانول تولیدی 1/6 و با سمزدایی با رزین تبادل یونی 5/7 گرم بر لیتر بوده و بازده تولید 3/0 و مدت زمان تخمیر 48 ساعت بوده است (13). همچنین، تحقیق دیگری برای تولید اتانول از باگاس نیشکر نشان داده است که تخمیر آبکافته باگاس نیشکر که با استفاده از زغال فعال تیمار شده است با مقدار قند اولیه 68 گرم در لیتر موجب تولید 24 گرم در لیتر اتانول و بازده 35/0 شده است (14). اگر چه در این تحقیقات سم زدایی آبکافته باعث بهبود تولید اتانول شده است اما باید توجه داشت سم زدایی مشکلات فرآیندی متعددی دارد و هزینههای بسیار زیادی بر فرآیند تولید اتانول تحمیل میکند و از همه مهمتر سم زدایی باعث افت مقدار قندها میشود (15). بنابراین، استفاده از محیط بهینه شده ای که در آن تولید اتانول بیشتر و بدون سم زدایی به دست آید بسیار مطلوبتر است.
استفاده از محیط شربت ذرت خیسانده برای تولید اتانول نه تنها به عنوان یک منبع ارزان قیمت میتواند استفاده شود بلکه از آنجایی که محیطی بسیار غنی است میتواند با عصاره مخمر و پپتون در فرآیند تولید اتانول رقابت کند. نتایج حاصل نشان میدهد که با بهینهسازی محیط کشت مقدار اتانول بدون سم زدایی نسبت به مطالعات مشابه از مقدار بالاتری برخوردار بوده و حتی با نتایج مطالعات دیگر که از تخمیر محیط سم زدایی شده بهدست آمده قابل رقابت است
)