نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، گروه میکروبیولوژی، قم، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، گروه میکروبیولوژی، قم، ایران
3 دانشجوی دکتری تخصصی ژنتیک مولکولی، دانشگاه تربیت مدرس و مرکز تحقیقات سل و عفونی کودکان، علوم پزشکی اراک،ایران
4 دانشجوی دکتری تخصصی پزشکی مولکولی، مرکز تحقیقات پزشکی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، ایران
5 استادیار مرکز تحقیقات سل و ریه، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، ایران
6 استادیار باکتری شناسی پزشکی، مرکز تحقیقات سل و عفونی کودکان، دانشگاه علوم پزشکی اراک، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
 Introduction : Resistance to Fluroquinolones drugs are increasingly expanded. A molecular method was designed and compared for rapid detection of resistance to ofloxacin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis .  Materials and method s: From 136 M. tuberculosis clinical isolates, 41 strains were used for comparison of detection of mutations associated with resistance in gyrA gene by Allele Specific-PCR (AS PCR) . Specific i nternal primers were designed for detecting any changes in 90, 91 and 94 codons. Sequencing method was accomplished for evaluation of the results as gold standard .  Results : AS-PCR method could detect mutations by formation or not formation of internal bounds and had good performance. Totally, from 37 strains phenotypically resistant to ofloxacine 32 strains were mutant and 5 strains were non mutant that have Sensitivity and specificity, 86/11% and 100%, respectively. Sequence results were concordant by results molecular methods .  Discussion and conclusion : Results of the study showed that AS-PCR method could be used as a routine test for fast detection of resistance to fluroquinolones in M. tuberculosis . Â
کلیدواژهها [English]
مقدمه
امروزه یکی از بزرگترین مسائل بهداشتی جهان، بیماری سل است. حدس زده میشود که از هر سه نفر جمعیت جهان، یک نفر به باسیل سل آلوده بوده و در هر ثانیه یک نفر به تعداد آنان افزوده میشود. طبق برآوردهای موجود، 50 میلیون نفر از این افراد، به باسیل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند و این مساله به شدت نگران کننده است (1). در سالهای اخیر بروز گسترش سل مقاوم به دارو و همچنین، مقاومت به فلوروکینولونها و البته مقاومت به یکی از داروهای تزریقی نگرانیهای زیادی در کنترل سل به وجود آورده است (4). درمان نامناسب بیماران TB، به موتاسیون در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس منجر خواهد شد که سببب مقاومت دارویی میشود (5). تجمع موتاسیون در ژنهای هدف سبب ایجاد سویههای MDR-TB و XDR-TB میشود (2). از این رو تشخیص سریع مقاومت نکته کلیدی در کنترل و درمان سل است (1). هدف سلولی فلوروکینولونها در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، آنزیم DNAgyrase است که پیچش DNA را هنگام همانندسازی باز میکند تا همانندسازی DNA انجام گیرد (5 و 6). این آنزیم شامل دو زیر واحد آلفا و بتا است که زیر واحد آلفا توسط ژن gyrA و زیرواحد بتا توسط ژن gyrB کد میشوند. با توجه به مطالعاتی که تاکنون بر روی مقاومت به فلوروکینولونها در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس انجام شده، مشخص شده که مقاومت به این دارو وابسته به موتاسیون در یکی از کدونهای منطقه QRDR، ژن gyrA کد کننده زیر واحد آلفای آنزیم DNAgyrase است (5- 7) تحلیل ناحیه QRDR به تنهایی از طریق آزمایشهای ژنوتایپینگ انجام میشود که این آزمایشها به عنوان آزمایشهای سریع شناسایی، شناخته شده اند. تا کنون برای تعیین رخداد جهشها در ناحیه QRDR از کدون 89 تا 94 از روشهای تعیین ترادف، real-time PCR و SSCP استفاده شده است (5، 6، 8-10).
حالت وحشی[1] به عنوان شاخص در نظر گرفته شده و هر گونه حالت غیر طبیعی به عنوان موتان در نظر گرفته میشود. به این ترتیب فارغ از نوع موتاسیون و تبدیل اسید آمینه ASP به هر اسید آمینه دیگردر کدون 94 پرایمرهایی برای حالت وحشی طراحی شده که تمام انواع موتاسیونهای احتمالی شناخته شده یا نشده را پوششش میدهد.
از آنجایی که افلوکساسین، یکی از داروهای رده دوم درمان سل است که امروزه به شکل گسترده برای درمان سل مقاوم به چند دارو استفاده میشود، متاسفانه به علت مصرف فراوان و نامنظم دارو، مقاومت اکتسابی به این دارو، رو به افزایش است. بنابراین، پیدا کردن روش سریع برای تشخیص مقاومت فرد مبتلا به این دارو، بسیار مهم است. روش AS-PCR یک تکنیک مناسب برای تشخیص موتاسیونهای نقطه ای یا حذفهای کوچک است. این روش نوعی از PCR است که در آن علاوه بر پرایمرهای رفت و برگشت، یک پرایمر داخلی نیز استفاده میشود. طراحی این پرایمر داخلی کاملا اختصاصی بوده و مبتنی بر شناخت موتاسیونهای احتمالی در سایت مورد نظر است. با این توضیح که منطقه ای از پرایمر که باید کاملامنطبق با الگو باشد، انتهای 3′ است. پرایمر از قسمت 3′ به محل اختصاصی خود در الگو متصل شده و طویل شدن پرایمر (تشکیل رشته جدید) از همین بخش توسط DNA پلیمراز انجام میشود. پرایمر به گونهای طراحی میشود که محل موتاسیون احتمالی در محل اتصال 3′پرایمر به الگو باشد. بدین ترتیب در صورت رخداد موتاسیون در این نقطه، پرایمر متصل نشده و باند تشکیل نمیشود.
این تحقیق، با هدف دستیابی به روشی ساده به منظور تشخیص مقاومت سویههای کلینیکی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به فلوروکینولونها، بدون نیاز به دستگاههای پیشرفته و روشهای زمانبر انجام شده است.
مواد و روشها
در این تحقیق، DNAهای استخراج شده از 41 سویه کلینیکی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساس و مقاوم به افلوکساسین موجود در بانک DNA مرکز تحقیقات سل و بیماریهای عفونی با دو روش مولکولی
AS-PCR و تعیین ترادف، برای تعیین موتاسیون در منطقه مرتبط با مقاومت ژن gyrA با هم مقایسه شدند. از این میان 37 سویه از نظر فنوتیپی مقاوم و 4 سویه حساس به افلوکساسین بودند.
طراحی پرایمر
بدین منظور از Gene Blast و نرم افزارهای Mega و Integrated DNA Technology استفاده شد (جدول2).
انجام PCR
به منظور بررسی وجود موتاسیون در ژن gyrA و به منظور تکثیر قطعه 194bp، DNA استخراج شده به همراه پرایمرهای اختصاصی F و R (جدول 2) در واکنش PCR وارد شده و تکثیر بخش مورد نظر از ژن یاد شده در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. واکنش PCR با تغییر دمای اتصال پرایمرها Annealing و غلظت آنها بهینه شد (جدول 1).
جدول1- برنامه واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تکثیر ژن gyrA
|
مراحل |
دما (درجه سانتیگراد) |
زمان (دقیقه) |
تعداد سیکلها |
|
دناتوراسیون اولیه |
95 |
5 |
- |
|
دناتوراسیون هر چرخه |
96 |
5/0 |
40 |
|
اتصال پرایمرها |
68 |
1 |
|
|
طویل شدن |
72 |
5/0 |
|
|
طویل شدن نهایی |
72 |
10 |
- |
جدول 2- ویژگیهای پرایمرهای طراحی شده
|
ΔG (ΔH-TΔS) تشکیل ساختارهای ثانویه |
ΔS |
طول |
GC% |
Tm (درجه سانتیگراد) |
ΔH |
ترادف (5'-3') |
نام |
|
-76/2 تا -84/1 |
-77/101 تا -07/86 |
20 |
75 |
66 |
-33/1 تا -26/5 |
CGATTCCGGCTTCCGCCCGG |
F |
|
-2/0 تا + 78/0 |
-66/58 تا -24/51 |
21 |
4/71 |
9/65 |
-7/17 تا – 5/14 |
CGCCAGGCAATGACCCACCGG |
R |
|
-84/2 تا -31/2 |
-08/134 تا -82/138 |
23 |
9/69 |
2/66 |
-7/42 تا -8/43 |
GCACGGCGACGCGTCGATCTACG |
94 M1 |
|
-63/3 تا -94/1 |
-44/38 تا -38/128 |
24 |
7/66 |
8/66 |
-9/44 تا -2/40 |
GCACGGCGACGCGTCGATCTACGA |
94 M2 |
|
-31/2 تا -09/2 |
-46/82 تا -64/67 |
25 |
72 |
9/69 |
-9/26 تا -2/22 |
GCAACTACCACCCGCACGGCGACGC |
90 |
|
-31/2 تا -93/1 |
-46/82 تا -16/98 |
27 |
4/70 |
7/71 |
-9/26 تا-2/31 |
GCAACTACCACCCGCACGGCGACGCGT |
91 |
روشهای مولکولی برای تعیین موتاسیون
در این تحقیق، دو روش مولکولی AS-PCR و تعیین ترادف به شرح زیر برای تعیین موتاسیون در منطقه QRDR بررسی مقایسه ای شدند.
روش AS-PCR
روشی برای تشخیص SNP است. در این تکنیک طراحی دقیق پرایمرهای داخلی مهم است، به گونه ای که موتاسیونهای احتمالی در ناحیه 3′ آنها شناسایی شود. پرایمرهای اختصاصی برای تکنیک AS-PCR برای کدنهای 90، 91 و دو آلل کدن 94 (تحت عنوان پرایمرهای داخلی) طراحی و ساخته شدند (جدول 4) پرایمرهای انتخاب شده به شرح 1 و ترکیب پرایمرها و
شرایط واکنش به شرح جدول 3 هستند. در هر دو نوع سویههای حساس و مقاوم به افلوکساسین، طراحی و اجرای روش Allell specific (ARMS) برای تعیین موتاسیون در ژن gyrA در سویههای مقاوم به داروی افلوکساسین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به کار گرفته شد. این روش بر مبنای اتصال یا عدم اتصال پرایمر اختصاصی از انتهای 3′ به نوکلئوتید هدف است.
روش AS-PCR مورد استفاده برای شناسایی موتاسیونهای موجود در ژن gyrA، به منظور تشخیص سویههای حساس از سویههای مقاوم به افلوکساسین، طبق پروتکل زیر (جدول 3) و در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد.
شکل 1 - محل قرارگیری پرایمرهای طراحی شده برای MultiplexAllele specific-PCRبا کمک برنامه MEGA
جدول3- مقدار ترکیبات استفاده شده در مخلوط واکنشAllele Specific-PCR
|
بررسی موتاسیون در کدن - m294 |
بررسی موتاسیون در کدن -m194 |
بررسی موتاسیون در کدن 91 |
بررسی موتاسیون در کدن 90 |
||||
|
3/2 |
DNA |
3/2 |
DNA |
3/2 |
DNA |
5/2 |
DNA |
|
2/5 |
BUFFER |
2/5 |
BUFFER |
2/5 |
BUFFER |
5/2 |
BUFFER |
|
2/8 |
F |
2/8 |
GF |
2/8 |
GF |
8/2 |
GF |
|
2/5 |
R |
2/5 |
GR |
2/5 |
GR |
2/5 |
GR |
|
4/1 |
M2 |
3/4 |
M1 |
4 |
91 |
3/5 |
90 |
|
1 |
dNTP |
1 |
dNTP |
1 |
dNTP |
1 |
dNTP |
|
8/0 |
DNA taq polymerase |
8/0 |
DNA Taq polymerase |
8/0 |
DNA Taq polymerase |
8/0 |
DNA Taq polymerase |
میکروتیوبها در دستگاه ترمال سایکلر قرار داده و طبق برنامه داده شده به دستگاه PCR انجام شد. سپس، الکتروفورز روی ژل آگاروز 8/1درصد انجام و ژل، برای بررسی نتایج با دستگاه ترانس لومیناتور با اشعه U. V مشاهده شد. در پایان انطباق فنوتیپی و ژنوتیپی انجام شد.
انجام تعیین ترادف[2]
برای ارزیابی روش تعیین موتاسیون با کمک
AS-PCR، از روش تعیین توالی، بهعنوان استاندارد طلایی مولکولار استفاده شد. در این روش، قطعه مورد نظر که محتوی کدونهای موتان بود با انجام PCR با پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. محصول PCR پس از تخلیص برای انجام تعیین توالی با دستگاه
Applied Biosystem به شرکت SourceBioScience انگلستان فرستاده شد.
نتایج
نتایج PCR
انجام PCR ساده ژن gyrA روی تمامی 41 نمونه مطالعه شده، باند bp 194را ارائه کرد که نشان دهنده انتخاب صحیح پرایمرها و تعیین برنامه مناسب تکثیر بود. محصول PCR در شکل 1 برای 4 نمونه نشان داده شده است.
شکل2- باند 194bp حاصل از تکثیر ژن gyrA با استفاده از پرایمرهای f و r در 4 نمونه 12x, 668, 2n, 1511
نتایج AS-PCR
پرایمرهای اختصاصی برای تکنیک
AS-PCR برای کدنهای 90، 91 و دو آلل کدن 94 (تحت عنوان پرایمرهای داخلی) به خوبی قادر به تشکیل باند در محل اختصاصی خود شدند. این مسئله نشانگر صحت طراحی پرایمر، دمای آنیلینگ و برنامه PCR بود.
پرایمرهای طراحی شده در این تحقیق برای حالت وحشی (بدون موتاسیون)، باندهای مناسبی در حالت
AS-PCR ارائه کرد که نشانگر دقیق بودن طراحی و انتخاب برنامه مناسب PCR در این حالت است. با توجه به اینکه پرایمر از 3′ به رشته الگو متصل میشود، اگر ژن در آن ناحیه جهش داشته باشد پرایمر آن را شناسایی نکرده و اتصال انجام نمیشود (عدم تشکیل باند در الکتروفورز). تشکیل باند مشخص کننده سویه حساس (شکل 3) و عدم تشکیل آن اثبات کننده رخداد موتاسیون است (شکل 3 ستونهای E 1511 D,111). در مجموع، از 41 سویه کلونیکی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مطالعه شده، 37 سویه از نظر فنوتیپی مقاوم به افلوکساسین و 4 سویه حساس به این دارو بودند. از 37 سویه مقاوم از نظر فنوتیپی، 32 سویه با روش AS-PCR مقاوم به افلوکساسین و 5 نمونه حساس تعیین شدند.
شکل3- تصویر الکتروفورز دو نمونه حساس 73 و e 35: باندهای اصلی و داخلی تکثیر شده که نشانگر عدم موتاسیون و حساسیت نمونهها به افلوکساسین است.
جدول 4- الگوهای متفاوت ایجاد شده در روی ژل توسط پرایمرهای طراحی شده در این مطالعه
|
الگوی A |
الگویB |
الگویC |
الگویی D |
الگویE |
|
پرایمرهایF,R |
پرایمرهای F,R,90 |
پرایمرهای F,R,91 |
پرایمرهای F,R,94 (M1) |
پرایمرهای F,R,94 (M2) |
|
194bp باند اصلی |
194bp به تنهایی نشانه رخداد جهش (مقاوم) |
194bp به تنهایی نشانه رخداد جهش (مقاوم) |
194bp به تنهایی نشانه رخداد جهش (مقاوم) |
194bp به تنهایی نشانه رخداد جهش (مقاوم) |
|
88bp به همراه 194bp عدم جهش (حساس) |
90bp به همراه 194bp عدم جهش (حساس) |
100bp به همراه 194bp عدم جهش (حساس) |
101bp به همراه 194bp عدم جهش (حساس) |
در شکل 4 محصولات PCR زیر الکتروفورز شدهاند:
ستونA تکثیر نمونه 111 با استفاده از پرایمرهای
F ,R است که باند 194 جفت بازی میدهد.
ستونB تکثیر نمونه 111 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,90 است که باند اصلی 194 جفت بازی و باند داخلی 88 جفت بازی تشکیل شده است. بنابراین، در کدن 90 موتاسیونی رخ نداده است.
ستون C تکثیر نمونه 111 با استفاده از پرایمرهای
F ,R , 91 است که باند اصلی 194جفت بازی و باند داخلی 90 جفت بازی تشکیل شده است. بنابراین، در کدن 91 موتاسیونی رخ نداده است.
ستون D تکثیر نمونه 111 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,94-M1 است که باند اصلی 194 جفت بازی تشکیل شده اما باند داخلی 100جفت بازی تشکیل نشده است. بنابراین در نوکلئوتید اول کدن 94 موتاسیون رخ داده است.
ستونE تکثیر نمونه111 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,94-M2 است که باند اصلی 194جفت بازی و باند داخلی 101 جفت بازی تشکیل شده است. بنابراین در نوکلئوتید دوم کدن 94 موتاسیونی رخ نداده است. طبق نتیجه به دست آمده نمونه 111 با موتاسیون در نوکلئوتید اول کدن 94 ژن gyrA دچار مقاومت به افلوکساسین شده است.
علاوه بر این، تحلیل ژنتیکی سویه 1511 نیز در شکل 3 ارائه شده است.
ستون A تکثیر نمونه 1511 با استفاده از پرایمرهای
F, R است که باند 194 جفت بازی میدهد.
ستونB تکثیر نمونه 1511 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,90 است که باند اصلی 194 جفت بازی و باند داخلی 88 جفت بازی تشکیل شده است. بنابراین، در کدن 90 موتاسیونی رخ نداده است.
ستون C تکثیر نمونه 1511 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,91 است که باند اصلی 194 جفت بازی و باند داخلی 90 جفت بازی تشکیل شده است. بنابراین، در کدن 91 موتاسیونی رخ نداده است.
ستون D تکثیر نمونه 1511 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,94-M1 است که باند اصلی 194 جفت بازی و باند داخلی 100 جفت بازی هر دو تشکیل شده اند. بنابراین، در نوکلئوتید اول کدن 94 موتاسیونی رخ نداده است.
ستونE تکثیر نمونه1511 با استفاده از پرایمرهای
F ,R ,94-M2 است که باند اصلی 194 جفت بازی تشکیل اما باند داخلی 101 جفت بازی تشکیل نشده است. بنابراین، در نوکلئوتید دوم کدن 94 موتاسیون رخ داده است. طبق نتیجه به دست آمده نمونه 1511 با موتاسیون در نوکلئوتید دوم کدن 94 ژن gyrA دچار مقاومت به افلوکساسین شده است.
شکل 4- تصویر الکتروفورز محصولات AS-PCR دو نمونه XDR 1511 و 111
نمونه 290 که در شکل 4 مشاهده میشود، در کدن 90 دچار جهش است (ستونB شامل: محصول PCR با پرایمرهای f,r,90) زیرا باند داخلی مربوط به این کدن که 88 جفت بازی است تشکیل نشده است و تنها باند
اصلی 194 جفت بازی مربوط به تکثیر با پرایمرهای f,r تشکیل شده است. در نتیجه، این نمونه به افلوکساسین مقاوم است. در سایر ستونها (C, D, E) باندهای داخلی 90، 100 و 101 جفت بازی دیده میشوند که به ترتیب به کدنهای 91، m1 94 و m294 مربوط هستند.
|
200 bp |
شکل 5- تصویر الکتروفورز نمونه290 مقاوم به افلوکساسین با موتاسیون در کدن 90 (ستون B)
جدول 5- نتایج AS-PCR و تعیین توالی
|
ردیف |
نمونه |
فنوتیپی مقاومت به فلوروکینولونها |
90 |
91 |
94 |
وجود موتاسیون در منطقه QRDR |
نتیجه تعیین ترادف |
|
|
M2 |
M1 |
|||||||
|
1 |
568 |
R |
|
|
|
|
Y |
Mut:91 |
|
2 |
535 |
R |
|
|
|
|
Y |
Mut:90 |
|
3 |
124x |
R |
|
|
|
mut |
Y |
MUT90 GCGàGTG |
|
4 |
665 |
R |
|
|
|
|
Y |
Mut:m2 |
|
5 |
2n |
R |
mut |
|
|
|
Y |
Mut:90 |
|
6 |
194 |
R |
mut |
|
mut |
|
Y |
MUT:94 GACàAAC |
|
7 |
12x |
S |
حساس |
N |
MUT90 GCGàGTG |
|||
|
8 |
21N |
S |
حساس |
N |
MUT:M1 |
|||
|
9 |
35e |
S |
حساس |
N |
|
|||
|
10 |
26e |
S |
|
N |
|
|||
جدول نتایج AS-PCR و تعیین توالی
در جدول 5، همه 41 سویه به همراه نتیجه آزمایش AS-PCR آنها آورده شده است. همانطور که در این جدول مشاهده میشود با استفاده از روش یاد شده مشخص شده که هر یک از سویهها در کدام کدن خود دچار موتاسون شده و در نتیجه به افلوکساسین مقاومت نشان داده اند. نتایج به دست آمده به شکل تصادفی در مورد برخی نمونهها با نتایج تعیین ترادف مقایسه شده است. تطابق بین نتایج نشان دهنده دقت روش یاد شده است. همانگونه که در جدول مشاهده میشود 41 نمونه آزمایش شده اند که از بین آنها به لحظ فنوتیپی 31 نمونه مقاوم و 10 نمونه حساس بودند. با انجام آزمایش AS-PCR بر روی آنها مشخص شد که همه 31 نمونه به لحاظ ژنوتیپی هم مقاوماند. 10 نمونه به لحاظ فنوتیپی حساس بودند که به لحاظ ژنوتیپی و از طریق روش AS-PCR هم حساس شناسایی شدند. از 31 نمونه مقاوم 5 سویه به علت رخ دادن موتاسیون در کدن 90 9، سویه به علت رخداد موتاسیون در کدن 91، 9 سویه به علت رخداد موتاسیون در کدون 94-M1، و13 سویه به علت رخداد موتاسیون در کدن 94-M2 خود، ویژگی مقاومت نسبت به افلوکساسین را به دست آورده اند. تعداد 5 سویه نیز از 31 سویه مقاوم، در دو کدن خود دارای موتاسیون و مقاومت به افلوکساسین بودند. روش مولکولی استاندارد تعیین ترادف است. که روی 16 سویه (10 نمونه حساس و 6 سویه مقاوم) انجام شد. از این تعداد، 8 سویه حساس و 6 سویه مقاوم تعیین شدند. بدین ترتیب حساسیت روش AS-PCR در مقایسه با روش فنوتیپی 100 و ویژگی روش نیز 100 درصد است. در مقایسه با روش تعیین ترادف حساسیت و ویژگی به ترتیب 75 و 100 درصد است.
بررسی نتایج تعیین ترادف
نتایج تعیین ترادف نشان میدهد که کدن 90 دارای توالی GCG است که کدکننده اسید آمینه آلانین است. موتاسیون در این کدن سبب جانشینی T به جای C میشود و در نتیجه توالی به GTG تغییر مییابد که کد کننده اسید آمینه والین است. کدن 91 دارای توالی TCG است که کدکننده اسید آمینه سرین است. موتاسیون در این کدن سبب جانشینیC به جای T میشود و در نتیجه توالی به CCG تغییر مییابد که کد کننده اسید آمینه پرولین است. همچنین، این نتایج نشان میدهد که کدن 94 دارای توالی GAC است که کد کننده اسید آمینه آسپارژین است. اما موتاسیونهای متعدد در این کدن سبب انواع جانشینی میشود. از جمله G به جای A قرار گرفته و توالی GGC تشکیل میشود که گلایسین را کد میکند. حالت دیگر آن است که C به جای A قرار گرفته، توالی GCG تشکیل میشود که کد کننده آلانین است. در حالت سوم A جایگزین G میشود و توالی AAC تشکیل میشود که کدکننده آسپارژین است. و در حالت دیگر دو T به جای G و A قرار گرفته و توالی TTC شکل میگیرد که اسید آمینه فنیل آلانین را کد میکند.
بحث و نتیجهگیری
فلوروکینولونها، ترکیبات تازه تولید شده ای مثل موکزی فلوکساسین، گاتی فلوکساسین، افلوکساسین و آمینوگلیکوزیدهای تزریقی (کانامایسین و آمیکاسین) و پپتیدهای حلقوی کاپرئومایسین، همگی فعالیت آنتیباکتریال خوبی بر ضد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دارند که البته متاسفانه به علت افزایش رنج جهش یافتههای منجر به مقاومت به این آنتیبیوتیکها، سویههای XDR-TB و حتی TDR-TB ایجاد شده اند که درمان بسیار سخت و پر هزینه ای دارند و حتی ممکن است بیمار درمان نشود و ضمن رها بودن در جامعه، میتواند افراد بیشماری را بیمار کند که بیماری آنها نیز از همان ابتدا به شکل XDR یا
(Total Drug Resistance) TDR خواهد بود. که این مطلب از نظر همهگیر شدن بیماری بسیار حائز اهمیت است (3).
هدف سلولی فلوروکینولونها در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، آنزیم DNAgyrase است. این آنزیم شامل دو زیر واحد آلفا و بتا است که زیر واحد آلفا توسط ژن gyrA و زیرواحد بتا توسط ژن gyrB کد میشوند. جهشها در ناحیه کوچک gyrAانجام میشود که ناحیه معین مقاوم به کینولونها (QRDR) نامیده میشود. در تعداد کمتری از سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مکانیسم اولیه مقاومت به فلوروکینولونها، با رخداد جهش در ژن gyrB دیده شده است (11)
تحلیل ناحیه QRDR به تنهایی از طریق آزمایشهای ژنوتایپینگ انجام میشود. این آزمایشها به عنوان آزمایشهای سریع شناسایی، شناخته شدهاند. در حدود 90 تا 95 درصد سویههای مقاوم به یک یا بیش از یک داروی تزریقی شامل موتاسیونهایی در نزدیکی
انتهای 3′ ژن rrs ( S rRNA16) شامل نواحی نوکلئوتیدی A1401,C1402,G1484 است. تاکنون از روشهای تعیین ترادف و SSCP برای تعیین رخداد جهشها در ناحیه QRDR از کدون 89 تا 94 استفاده شده است.
حالت وحشی به عنوان شاخص و هرگونه حالت غیرطبیعی به عنوان موتان در نظر گرفته میشود. به این ترتیب فارغ از نوع موتاسیون و تبدیل ASP به هر اسیدآمینه دیگر در کدون 94 پرایمرهایی برای حالت وحشی طراحی شده و که تمام انواع موتاسیونهای احتمالی شناخته شده یا نشده را پوششش میدهد. اطلاعات به دست آمده نشان داده اند که تمرکز موتاسیونها در کدون 90-91 و 94 و البته به شکل پراکنده در کدونهای 74 و87 است. در این مطالعات روی این سه کدون اصلی 90-91 و 94 تمرکز شد. موتاسیون در کدون 90 به شکل Ala-90-Val و
Ser-91-Pro انجام میشود. اما در 94در هر دو جایگاه 1و 2 به شکل کاملا متنوع رخ میدهد (11 و 12).
در مطالعاتی که در کشور کویت انجام شده مشخص شده که اگرچه فلوروکینولونها، برای شیمی درمانی سل و آزمایشهای حساسیت دارویی برای داروهای خط دوم استفاده نمیشوند اما در 7درصد از سویههای MDR-TB موتاسیون در ژن gyrAوجود دارد. و بنابراین، آزمایشهای حساسیت دارویی عادی برای این داروی مهم خط دوم نیاز هستند. (13).
اهمیت تعیین موتاسیونهای منطقه QRDRژن gyrA بدین دلیل است که موتاسیون در هر یک از کدونهای 91، 90 و 94 باعث مقاومت به هر یک از فلوروکینولونها میشود (11 و 12). علاوه بر آن، براساس تعریف WHO و CDC اثبات موتاسیون در فلوروکینولونها به همراه موتاسیون در ژن rrs، در یک سویهMDR، بیانگر سویه XDR است (14). این مطالعه روی 3 کدون اصلی 90- 91 و94 تمرکز شد. موتاسیون در کدون 90 به شکل Ala-90-Val و Ser-91-Pro انجام میشود. اما در 94 در هر دو جایگاه 1و 2 به شکل کاملا متنوع رخ میدهد.
علت انتخاب کدونهای 90-91 و 94 بر اساس بررسی متون و رخداد موتاسیون در این کدونها در سویههای مقاوم بوده است. بدین معنی که سویههای مقاوم به فلوروکینولونها، بیشتر در کدون 94 با فراوانی بسیار زیاد (بیش از 70 درصد) در کدون 91 با فراوانی 10 تا 15درصد و در کدون 90 با فراوانی 5 درصد دچار جهش شده اند. موتاسیون در سایر کدونها در ناحیه QRDR با فراوانی کمتر از 2 درصد رخ میدهد (11)
علت مولکولی انتخاب این کدونها این است که کدون 94، اسید آمینه ای را کد میکند که در محل پیچش DNA به دور پروتئین، قرار میگیرد. بنابراین، هر گونه تغییر در این اسید آمینه باعث نقص در عملکرد زیرواحد آلفای آنزیم DNAgyrase میشود. به همین دلیل موتاسیون در کدون 95، که اسید آمینه کد شده توسط آن، ارتباط ساختاری با DNA ندارد، هیچگونه تاثیری در بروز مقاومت ندارد و بنابراین، این کدون، کدون پلی مورفیسم محسوب میشود (15).
تشخیص مقاومت به فلوروکینولونها، اهمیت ویژهای در همه گیری بیماری سل در جامعه دارد. استفاده از کیتها، بیشتر نیاز به تامین دستگاههای پرهزینه همراه داشته و وابستگی همیشگی آزمایشگاه به کیت را بهدنبال دارند. ضمن اینکه هزینه اجرای آزمایش را نیز بسیار افزایش میدهند. این روشها پرهزینه و وقت گیر بوده و امکان استفاده از آن به شکل عادی وجود ندارد. بنابراین، روشهای سادهتر در استفاده عادی ترجیح داده میشوند (4)
در اجرای عادی، روشهای موسوم به In-house، که شامل انواع روشهای PCR هستند، مناسبتر به نظر میرسند (16) در جدول7، از تعیین توالی به عنوان استاندارد طلایی مولکولی استفاده به شده است. نتایج به دست آمده، انطباق قابل قبولی به لحاظ حساسیت و ویژگی، بین نتایج یاد شده را نشان میدهد که اثبات کننده کارایی روش در استفاده عادی است. روش اصلی برای بررسی موتاسیون در ژنهای مرتبط با مقاومت، تعیین موتاسیونهای احتمالی با کمک تعیین توالی است (5 و 9 و 10 و17). این روش هزینه بر و پر زحمت بوده و با توجه به عدم امکان خرید دستگاه و تامین کارکنان متخصص در تمام مراکز، لازم است به مراکز خاص ارسال شود که زمان بیشتری میبرد. از این روش نمیتوان در اجرای عادی استفاده نمود (4). SSCP، روش دیگری است که در چند تحقیق برای بررسی رخداد موتاسیون به ویژه در کدون 94 استفاده شده است (18). این روش به خطای آزمایشگر بسیار حساس بوده و بنابراین، هر گونه بی دقتی آزمایشگر به تشخیص اشتباه مقاومت منجر میشود. به ویژه در تشابه الگوی به دست آمده از موتاسیون در کدون 94 (وابسته به مقاومت) و 95 (غیر مرتبط با مقاومت) میشود.
با توجه به نتایج این تحقیق، روش As-PCR ارائه شده میتواند به عنوان یک روش ساده و سریع برای تعیین مقاومت به افلوکساسین در سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده شود.
کوششها در برای دستیابی به روش RFLP و یافتن آنزیمهای اندونوکلئازی که قادر به برش منطقه 94 باشد، به جایی نرسیده است. بنابراین، در این تحقیق از روش آلل اسپسیفیک پی سی آر (AS-PCR)[3] استفاده شد. به این منظور پرایمرهای اختصاصی طراحی شدند. این پرایمرها برای شناسایی حالت وحشی در جایگاه شماره 2 در 90، 1 در 91، 1 و 2 در 94 تحت عنوان
m1 و m2. این طراحی با توجه به بررسی متون انجام شد و تعیین این مطلب که موتاسیون در کدون 94، در هر دو جایگاه1 و2 به کرات شناسایی شده است، انجام شد.
از میان 41 سویه ای که نتیجه آزمایش AS-PCR آنها موتاسیون و مقاومت را نشان داد: 5 سویه به علت رخ دادن موتاسیون در کدن 90، 8 سویه به علت رخداد موتاسیون در کدن 91، 8 سویه به علت رخداد موتاسیون در کدون 94-M1، و 12سویه به علت رخداد موتاسیون در کدن 94-M2 خود، ویژگی مقاومت نسبت به افلوکساسین را به دست آورده اند.
تعداد 5 سویه نیز از 41 سویه آزمایش شده نیز، در دو کدن خود دارای موتاسیون و مقاومت به افلوکساسین بودند. همچنین، از این تعداد سویه آزمایش شده، 5 سویه حساسیت به افلوکساسین را نشان دادند. از 4 سویه حساس فنوتیپی هم به عنوان شاهد در انجام آزمایشها استفاده شد.
جدول 6- پیشینه بررسی موتاسیون در ژن gyrA به روشهای متفاوت درسالها و کشورهای مختلف
|
کشور |
بازه زمانی |
هدف |
موتاسیون |
تعداد نمونههای آزمایش شده |
تعداد نمونههای مقاوم فنوتیپی |
درصد موتاسیون یافتهها |
روش مولکولی انجام شده |
||||
|
کل |
مقاوم |
حساس |
مقاوم |
حساس |
مقاوم |
حساس |
|||||
|
هند |
N. S. |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
118 |
72 |
46 |
1 |
0 |
40 |
0 |
Sequencing. QRDR of gyrA and gyrB |
|
هنگ کنگ |
1994-2004 |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
250 |
71 |
179 |
1 |
0 |
40 |
0 |
PCR-SSCP and Sequencing. QRDR of gyrA |
|
کره جنوبی |
2004 |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
73 |
63 |
10 |
2 |
0 |
20 |
0 |
Sequencing. QRDR of gyrA and gyrB |
|
هنگ کنگ |
1991-2000 |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
138 |
55 |
83 |
1 |
0 |
80 |
0 |
PCR-SSCP and sequencing. gyrA: 320bp fragment |
|
چین |
N. S. |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
68 |
44 |
24 |
0 |
0 |
0 |
0 |
PCR-SSCP and Sequencing. QRDR of gyrA |
|
روسیه |
2006 |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
70 |
48 |
22 |
10 |
0 |
20 |
0 |
Sequencing. QRDR of gyrA and gyrB |
|
روسیه |
N. S. |
gyrA |
D94N (GAC/AAC) |
185 |
67 |
118 |
8 |
0 |
90 |
0 |
Oligobased chip assay and sequencing. QRDR of gyrA |
همانگونه که در جدول 6 مشاهده میشود، روشهای مولکولی مورد استفاده تاکنون، برای تشخیص موتاسیون در منطقه QRDR، بیشتر مبتنی بر روش تعیین توالی است. این روش، کارایی مناسبی دارد اما با توجه به هزینه و زمان بر بودن اجرای این روش در آزمایشگاههای عادی، امکان استفاده از آن وجود ندارد. چنگ[iv] در سال 2004 و هوارد[v] در سال 1994، از روش sscp استفاده کرده اند. این روش که بر مبنای ژن خالص شده و بررسی مقایسه ای الگوی باندهای به دست آمده، در سویههای حساس و مقاوم است، بیشتر با احتمال بالای خطای کارکنان همراه است، که در استفاده عادی و حجم بالا، پاسخهای منفی و مثبت کاذب را افزایش میدهد. بر اساس جدول ذکر شده در بیشتر مطالعات، کدن 89 به عنوان کدن مرتبط با مقاومت مطرح نشده است. بنابراین، در مطالعه حاضر، با هدف سادهسازی روش، این کدن مطالعه نشده است. ضمن آنکه بررسی نتایج تعیین توالی نمونهها، هیچگونه موتاسیونی را در این کدن نشان ندادند.
در داخل کشور مطالعه ای روی این ژن در سویههای کلونیکی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با کمک روش AS-PCR یافت نشد. در خارج کشور نیز مطالعات انجام شده با کمک روش پرهزینه و وقت گیر تعیین ترادف بوده و در هیچ مطالعه ای استفاده از روش AS-PCR مشاهده نشد.
همانطور که ذکر شد مطالعات انجام شده در کشورهای مختلف به این شکل بوده که به منظور انجام تعیین ترادف یکPCR با حجم نهایی 50 یا 100 میکرولیتری انجام میشده و سپس نمونهها تعیین ترادف میشدند که این روشی وقتگیر و برای بیماران پر هزینه است و نیاز به کارکنانی با مهارت و امکانات آزمایشگاهی در آزمایشگاههای عادی دارد. از جمله این مطالعات میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
روش AS-PCR برای تعیین موتاسیون در ژن gyrA در سویههای مقاوم به داروی افلوکساسین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روشی سریع و در دسترس و همچنین با قدرت تشخیصی و دقت بالا است. نتایج این تحقیق نشان میدهد که AS-PCR میتواند به عنوان یک روش سریع و عادی در تشخیص مقاومت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به افلوکساسین در آزمایشگاههای تشخیص طبی استفاده شود. این روش برای تشخیص سریع و در دسترس سویههای مقاوم باکتری و درمان به موقع بیماران مبتلا و جلوگیری از افزایش هزینه بیماران انجام شد. استفاده از این روش میتواند به حذف سریعتر یک عامل انتشار بیماری به دنبال تشخیص به موقع یک بیمار مقاوم به دارو و درمان آن منجر شود که این مساله ازدیدگاه همهگیر شدن بیماری بسیار دارای اهمیت است. از آنجایی که روش ارائه شده در این تحقیق، هیچگونه وابستگی به کیت، دستگاه ویژه و یا مواد ویژه و اختصاصی برای آزمایشگاه عادی به دنبال ندارد و نیز هزینه برای روش، در حد یک PCR کاملا معمولی بوده و هیچگونه هزینه اضافی به آزمایشگاه تحمیل نمیکند همچنین، سرعت عمل روش قابل قبول است. بنابراین، امکان اجرای آن، به عنوان آزمایش عادی آزمایشگاهی، حتی در آزمایشگاههایی که تعداد نمونههای مورد پذیرش بالایی به شکل روزانه دارند، وجود دارد و پیشنهاد میشود که این روش جایگزین روشهای سخت و پر هزینه در آزمایشگاههای عادی و مراکز تحقیقاتی شود.
تشکر و قدردانی
این پژوهش بخشی از طرح تحقیقاتی مصوب دانشگاه علوم پزشکی اراک و همچنین، قسمتی از پایاننامه دانشجویی خانم وحیده وحیدی دانشجوی دوره کارشناسی ارشد است. بنابراین، بدینوسیله از معاونت پژوهشی این دانشگاه تشکر و قدردانی میشود.
)