نویسندگان
1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران
4 دانشیار بیوشیمی، دانشگاه تهران، ایران
5 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Halophiles, especially haloarchaea are one of the most important groups of extremophiles. Halophilic hydrolases have been studied worldwide and have been considered for biotechnology and industrial technologies. This study is the first report in amylopullulanase production in halophilic microorganisms.
Materials and methods: A halophilic archaeon, Halorubrum sp. strain Ha25, produced extracellular halophilic organic solvent-tolerant amylopullulanase. The enzyme was purified using ethanol precipitation and anion exchange chromatography method. Molecular mass of purified enzyme was determined by SDS–PAGE method. After purification, the enzyme was characterized. To study the effects of organic solvents in the stability of the enzyme, the enzyme solution was incubated in the presence of various organic compounds and then, residual enzyme activity was measured. Mode of action of the enzyme was determined by thin-layer chromatography.
Results: Molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 140 kDa by SDS–PAGE method. Optimum temperature for amylolitic and pullulytic activities was 50 °C. Optimum pH for amylolitic activity was 7.0 and for pullulytic activity was 7.5. This enzyme was active over a wide range of concentrations (0-4.5 M) of NaCl. The effect of organic solvents on the amylolitic and pullulytic activities showed that this enzyme was more stable in the presence of non-polar organic solvents than polar solvents. The enzyme solely hydrolyzed pullulan and soluble starch to glucose.
Discussion and conclusion: Halorubrum sp. strain Ha25 produces thermophilic and extremely halophilic amylopullulanase. The catalytic function under multi extreme condition of high temperature, high salinity, and low water activity might possess biotechnological and commercial values such as treatment waste solutions with starch residues, high salt content and solvents.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
هالوآرکیها در راسته Halobacterialesو خانوادهیHalobacteriaceae قرار داشته و نمکدوستهای افراطی[1] هستند که برای رشد به حداقل 5/1 مولار از نمک NaCl نیاز دارند (2). نمکدوستها، میکروارگانیسمهای افراطیدوستی هستند که قابلیت بقاء و رشد در محیطی با میزان شوری بالا را داشته و منبعی برای آنزیمهای نمکدوست هستند (3). بسیاری از فرآیندهای صنعتی در شرایط فیزیکی و شیمیایی سختی انجام میشوند که برای عملکرد بسیاری از آنزیمهای معمول، مناسب نیست. از اینرو، یافتن آنزیمهای افراطیدوستی[2] که بتوانند در شرایطی مانند شوری و دمای بالا فعالیت داشته باشند، بسیار ارزشمند است. در سالهای اخیر توجه به آنزیمهای تولید شده توسط میکروارگانیسمهای افراطیدوست که توانایی فعالیت در شرایط سخت را دارند، افزیش یافته است (4). آنزیمهای نمکدوست جدا شده از آرکیهای نمکدوست میتوانند دارای کاربردهای متعددی در صنایع باشند زیرا در غلظت بالای نمک، دمای بالا و آب فعال کم دارای فعالیت هستند (5). پروتئینهای آرکیهای نمکدوست در مقایسه با پروتئینهای معمولی به واسطهی تعداد کمتر اسیدهایآمینه آبگریز و اسیدهایآمینهای با بار منفی که در سطح خود دارند، میتوانند در غلظت بالای نمک که در داخل و خارج سلول با آن روبرو هستند پایدار باشند (6).
آنزیمهای خانواده α-آمیلاز دارای فعالیتهای زیستفنآوری متعددی هستند و در صنایع مواد شوینده، کاغذ، مواد غذایی و دارویی کاربرد دارند (7). پولولانازها (پولولان-6 گلوکانوهیدرولاز)، انواعی از آنزیمهای شاخه شکن بوده و به خانوادهی آنزیمی
α-آمیلاز متعلق هستند. این آنزیمها بسته به توانایی و یا عدم توانایی هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α در نشاسته، آمیلوپکتین و الیگوساکاریدهای مربوطه به دو نوع I و II (آمیلوپولولاناز) تقسیم میشوند. نوع I بر خلاف نوع II قادر به هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α نیست. هر دو نوع آنزیم I و II قادر به شکست پیوندهای گلیکوزیدی (6,1) -α در پولولان بوده و مالتوتریوز را به عنوان محصول تولید میکنند. پولولان هیدرولاز نوع I (نئوپولولاناز) و پولولان هیدرولاز نوع II (ایزوپولولاناز)، توانایی هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α را در پولولان داشته و پنوز و ایزوپنوز را تولید میکند (8). پولولان هیدرولاز نوع III توانایی هیدرولیز پیوندهای گلیکوزیدی (4,1) -α و (6,1) -α را در پولولان داشته و مالتوتریوز، پنوز و مالتوز را به عنوان محصول تولید میکند (9).
در این پژوهش، آنزیم آمیلوپولاناز از آرکی نمکدوست Halorubrum سویه Ha25 تخلیص شده و وزن مولکولی آن تعیین شد. سپس ویژگیهای کینتیکی آن نظیرVmax و Km و همچنین شرایط بهینه فعالیت آنزیم بررسی شد. محصولات حاصل از عملکرد آنزیم روی سوبستراهای نشاسته و پولولان نیز به کمک روش کروماتوگرافی لایه نازک تعیین شد. این مطالعه، اولین گزارش در خالصسازی آنزیم آمیلوپولولاناز نمکدوست از یک میکروارگانیسم نمکدوست است.
مواد و روشها
سویه آرکیایی و شرایط کشت
آرکی نمکدوست سویه Ha25 از دریاچه نمک آران بیدگل در ایران جدا شد. بررسیهای بیوشیمیایی، فنوتیپی و ریختشناسی به همراه تعیین توالی ژن
S rRNA16 و بررسی شباهت توالی
S rRNA16 این سویه با سایرتوالیهای ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server، نشان داد که این سویه به جنس Halorubrumمتعلق بوده و بیشترین شباهت را به گونهHalorubrum chaoviator Halo-GT (AM048786) دارد (1 و 10). تولید آنزیم پولولاناز سویه Ha25 در شرایط هوازی، دمای 40 درجه سانتیگراد، در انکوباتور شیکردار با حرکت دورانی 200 دور در دقیقه و در محیط کشت دارای (w/v) 23 درصد نمک تام (NaCl 4/18 درصد، MgSO4.7H2O 7/2 درصد، MgCl2.6H2O 3/2 درصد، KCl54/0 درصد، CaCl2.2H2O058/0 درصد)، 2 درصد مالتوز، 5/0 درصد پپتون گوشت، 5/0 درصد عصارهی گوشت و (v/v) 04/0 درصد محلول عناصر کممصرف، (11) با اسیدیته 2/7-4/7، بعد از گذشت سه روز به بیشترین میزان خود رسید. مایع رویی این محیط کشت برای خالص سازی آنزیم استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیمی و تعیین غلظت پروتئین
برای تعیین فعالیت پولولیتیکی و آمیلولیتیکی، از محلول پولولان 5/0 درصد و نشاستهی محلول یک درصد در بافر Tris-HClبا غلظت 50 میلی مولار، محتوی 20 میلی مولار CaCl2 با اسیدیته 0/8 تا 5/7 (بافر A) به عنوان سوبسترا استفاده شد. به این صورت که میزان 50 میکرو لیتر از محلول آنزیمی با 450 میکرولیتر از محلول سوبسترا مخلوط شده و به مدت یک ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. بعد از گرماگذاری، میزان قندهای احیاء کننده با کمک معرف دینیتروسالیسیلیک اسید تعیین شد (12). به این ترتیب که میزان 500 میکرو لیتر از معرف دینیتروسالیسیلیک اسید به مخلوط واکنش آنزیمی اضافه شد و در آب جوش به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. بر حسب تعریف یک واحد آنزیم مقدار آنزیمی است که موجب هیدرولیز یک میکرومول سوبسترا در یک دقیقه در یک میلیلیتر محلول آنزیمی شود.
غلظت پروتئین نمونهها با روش برادفورد تعیین شد. از آلبومین سرم گاوی به عنوان استاندارد استفاده شد (13). غلظت پروتئین بخشهای خارج شده از ستون، از طریق تعیین جذب نمونهها در طول موج 280 نانومتر تعیین شد.
خالص سازی آنزیم
تمام مراحل خالص سازی آنزیم در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شدند. مایع رویی کشت سه روزه آرکی از طریق سانتریفیوژ محیط کشت به مدت 20 دقیقه با دور x g 9000، از سلولها و سایر مواد جامد جدا شد. یک حجم اتانول سرد مطلق منفی20 درجه سانتیگراد) به تدریج به مایع رویی محیط کشت در حال هم زدن، اضافه شد. رسوب پروتئینی حاصل به کمک سانتریفیوژ به مدت 20 دقیقه با دور x g 10000 جدا شد و در کمترین میزان بافر A حل شده و ترکیبات نامحلول از طریق سانتریفیوژ مجدد به مدت 20 دقیقه با دور x g 10000 جدا شدند. سپس این محلول علیه بافر A به مدت 15 ساعت دیالیز شد. این محلول حاصل روی ستون گروماتوگرافی تعویض آنیونی
Q-Sepharose (آمرشام بیوساینس[3]، ابعاد ستون: 15 سانتیمتر در یک سانتیمتر) که از قبل با بافر A به تعادل رسیده بود، قرار گرفت. ستون با همین بافر شستشو داده شد تا جایی که غلظت پروتئینهای بخشهای خارج شده از ستون به صفر رسید. سپس پروتئینهای متصل به ستون از طریق یک شیب غلظت خطی از غلظت صفر تا یک مولار نمک سدیم کلراید در بافر A، با شدت جریان یک میلیلیتر در دقیقه از آن خارج شدند. بخشهایی از ستون که دارای فعالیت آمیلوپولولانازی بودند، جمعآوری شده و برای مطالعات بیشتر بررسی شدند. جرم مولکولی و میزان خلوص آنزیم از طریق
SDS-PAGE و با روش لاملی[4] تعیین شد (14). به منظور حذف نمکها از مایع رویی محیط کشت برای انجام SDS-PAGE، نمونه به کمک سنتریکون تغلیظ شد و سپس با بافر A به حجم اولیه رسانده شد و این عمل چندین بار تکرار شد تا نمکها از مایع رویی محیط کشت حذف شوند.
بررسی اثر دما، اسیدیته و غلظت نمک سدیم کلرایدروی فعالیت آنزیم
اثر اسیدیته روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در محدوده بین 5/4 تا 0/10 تعیین شد. برای این منظور از بافر مخلوط با غلظت 50 میلی مولار
(0/5-5/4، سدیم استات؛ 5/7-0/6، سدیم فسفات؛ 0/9-0/8، Tris-HCl؛ 0/12-5/9، Glycine-NaOH) و شرایط استاندارد تعیین فعالیت آنزیمی که در بالا به آن اشاره شد انجام شد. نیمرخ دمایی و دمای بهینهی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی، از طریق تعیین فعالیت آنزیمی با گرماگذاری مخلوط واکنش آنزیمی در محدوده دمایی بین 35 تا 70 درجه سانتیگراد، با فواصل دمایی 5 درجه سانتیگراد تعیین شد. مخلوط واکنشهای آنزیمی به مدت یک ساعت در دماهای ذکر شده گرماگذاری شدند و بعد از این مدت معرف دینیتروسالیسیلیک اسید به آنها اضافه شد و سپس به مدت 10 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. برای تعیین غلظت بهینه نمک سدیم کلراید برای فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم، سنجش فعالیت آنزیمی در شرایطی انجام شد که مخلوط واکنش دارای صفر تا 5/4 مولار نمک بود.
تعیین پایداری دمایی و مقاومت آنزیم نسبت به حلالهای آلی
به منظور تعیین پایداری دمایی آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد، نمونهی آنزیمی به مدت 35 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سنجش باقیمانده فعالیت آنزیمی نمونه آنزیمی تیمار شده در دمای 70 درجه سانتیگراد، در فاصله زمانی بین 5 تا 35 دقیقه و هر 5 دقیقه یک بار، در شرایط استاندارد سنجش آنزیمی انجام شد. فعالیت نمونه آنزیمی که تیمار دمایی نشده بود، 100 درصد در نظر گرفته شد.
به منظور تعیین پایداری آنزیم در حضور حلالهای آلی، نمونهی آنزیمی در حضور غلظت (v/v) 20 و 50 درصد حلالهای آلی مختلف نظیر دی متیل سولفوکساید[5]، n-بوتانول، دی متیل فرمامید[6]، اتانول، 2-پروپانول، استون و کلروفرم به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار با دمای 20 درجه سانتیگراد و با حرکت دورانی 150 دور در دقیقه قرار گرفت (31). باقی مانده فعالیت آنزیمی هر روز سنجش شد. فعالیت نمونه آنزیمی که در مجاورت حلال قرار نگرفته بود، به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. سپس نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیمی تعیین شد.
تعیین ویژگیهای کینتیکیVmax و Kmآنزیم
ویژگیهای کینتیکی آنزیم، توسط گرماگذاری نمونه آنزیمی با غلظتهای مختلف نشاستهی محلول و پولولان در بافر A به عنوان سوبسترا در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه تعیین شد. مقادیرVmax و Kmآنزیم از طریق رسم منحنی لاین ویور برک[7] به دست آمد.
کروماتوگرافی لایهی نازک
نمونه آنزیمی در حضور پولولان 5/0 درصد و نشاسته محلول یک درصد در بافر A به عنوان سوبسترا و در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت دو ساعت گرماگذاری شد. فعالیت آنزیمی با قرار دادن مخلوط واکنش در دمای حدود 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه، متوقف شد. نمونههای حاصل از عملکرد آنزیم به شکل یک لکه روی کاغذ کروماتوگرافی قرار گرفتند و بعد از خشک شدن لکهها، این کاغذ در تانک محتوی سیستم حلالی n-بوتانول، متانول و آب ((v/v) 4:2:1) برای جدا کردن محصولات قندی تولید شده، قرار گرفت. وقتی حلال به بالای کاغذ رسید، کاغذ از تانک خارج شده و پس از خشک شدن، برای آشکار شدن لکهها سولفوریک اسید و متانول ((v/v) 1:1) روی سطح کاغذ پاشیده شده و به مدت 5 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت (14). قندهای گلوکز (G1)، مالتوز (G2)، مالتوتریوز (G3)، مالتوتترائوز (G4)، مالتوپنتائوز (G5)، مالتوهگزائوز (G6)، مالتوهپتائوز (G7) و قند پنوز نیز به عنوان شاهد در کنار نمونهها قرار گرفتند.
نتایج
خالص سازی و تعیین ویژگیهای آنزیم
آنزیم خارج سلولی آمیلوپولولاناز از محیط کشت سه روزهی آرکی با روش رسوبدهی پروتئینها به کمک حلال آلی اتانول و استفاده از ستون تعویض آنیونی تخلیص شد. نمونه پروتئینی حاصل از رسوبدهی با اتانول بر روی ستون Q-Sepharose قرار گرفت و بعد از شستشوی ستون با گرادیان خطی از نمک سدیم کلراید، آنزیم در غلظت 38/0 مولار از این نمک از ستون خارج شد. سه بخش دارای فعالیت از ستون به دست آمد (شکل 1). خلاصهای از مراحل مختلف خالص سازی در جدول 1 نشان داده شدهاند. جرم مولکولی آنزیم آمیلوپولولاناز با کمک SDS-PAGE به میزان 140 کیلودالتون تعیین شد (شکل 2).
جدول 1- خلاصهای از مراحل مختلف خالصسازی آنزیم آمیلوپولولاناز از مایع رویی محیط کشت سویه Ha25
مراحل خالصسازی |
بازده ( درصد) |
خالصسازی (برابر) |
فعالیت ویژه (واحد آنزیمی بر میلیگرم) |
پروتئین کل (میلیگرم) |
فعالیت کل (واحد آنزیمی) |
آنزیم خام |
100 |
1 |
5/4 |
100 |
450 |
50 درصد اتانول (v/v) |
31 |
2 |
9 |
5/15 |
140 |
Q-Sepharose |
5/3 |
2/3 |
5/14 |
1/1 |
16 |
شکل 1- کروماتوگرافی تعویض آنیونی به کمک ستون Q-Sepharose
شکل 2- تحلیل الکتروفورتیک آنزیم خالص شده. در این شکل، پروتئینهای موجود در هر مرحلهی خالص سازی نشان داده شدهاند. ردیف 1: شاهد جرم مولکولی ردیف 2: کروماتوگرافی تعویض آنیونی ردیف 3: رسوب اتانولی ردیف 4: مایع رویی محیط کشت
اثر عوامل مختلف بر روی فعالیت آنزیم در شکل 3 نشان داده شدهاند. آنزیم هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی خود را در محدودهی وسیع اسیدیته از 5/4 تا 0/10 حفظ کرد. اسیدیته بهینه برای فعالیت آمیلولیتیکی 0/7 و برای فعالیت پولولیتیکی به میزان 5/7 تعیین شد. فعالیت نسبی آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در اسیدیته 5/4 به ترتیب 23 و 31 درصد و در اسیدیته 0/10 به ترتیب 44 و 30 درصد تعیین شد (شکل 3 الف). نیمرخ دمایی آنزیم در شکل 3 ب نشان داده شده است. هر دو فعالیت آنزیمی در دمای 50 درجه سانتیگراد بیشینه است. در دمای 35 درجه سانتیگراد، فعالیت نسبی پولولیتیکی و آمیلولیتیکی آنزیم، به ترتیب 55 درصد و 40 درصد تعیین شد. در دمای 70 درجه سانتیگراد، هر دو فعالیت آنزیمی تنها 32 درصد از بیشترین میزان فعالیت خود را نشان میدهند. بیشینهی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی به ترتیب در غلظت 0/2 و 5/3 مولار از نمک سدیم کلراید تعیین شدند. در غلظت 5/4 مولار از این نمک، 44 درصد و 31 درصد از فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم باقی ماند، در حالی که در غلظت صفر مولار از نمک سدیم کلراید، به ترتیب 36 درصد و 7 درصد از فعالیت بیشینهی آنزیمی دیده شد (شکل 3 پ).
الف |
ب |
پ |
شکل 3- اثر اسیدیته (الف)، دما (ب) و غلظتهای مختلف نمک سدیم کلراید (پ) بر روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز. فعالیت آنزیمی مطابق با شرایط استاندارد اشاره شده در متن انجام شده است. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی به عنوان 100 درصد در نظر گرفته شده است. فعالیتهای آنزیمی به شکل فعالیت نسبی ± انحراف معیار گزارش شدهاند.
ویژگیهای کینتیکی آنزیم از طریق سنجش استاندارد فعالیت آنزیمی و در حضور پولولان و نشاسته محلول به عنوان سوبسترا انجام شد. میزان Km و Vmaxبه کمک نمودار لاین ویوربرک تعیین شدند (شکل 4). میزان Kmبرای سوبسترای نشاسته محلول 8/1 میلیگرم بر میلیلیتر و برای سوبسترای پولولان 8/4 میلیگرم بر میلیلیتر تعیین شد. میزان Vmaxبرای سوبسترای نشاسته محلول 25 میکرومول بر دقیقه و برای سوبسترای پولولان 7/10 میکرومول بر دقیقه تعیین شد.
نحوهی عملکرد آنزیم بر روی سوبسترای نشاسته محلول و پولولان
محصول عملکرد آنزیم بر روی دو سوبسترای نشاسته محلول و پولولان در شکل 5 نشان داده شدهاند. از آنجا که آنزیم خالص شده به شکل یک باند دارای هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی روی
SDS-PAGE دیده شد و به دلیل اینکه تنها محصول تولید شده توسط آنزیم حاصل از عملکرد بر روی هر دو سوبسترا تنها گلوکز بود، نوع آنزیم آمیلوپولولاناز تعیین شد (16).
شکل 5- الگوی عملکرد آنزیم آمیلوپولولاناز بر روی سوبستراهای نشاسته محلول و پولولان. ردیف 1: محصول عملکرد آنزیم روی سوبسترای نشاسته محلول ردیف 2: محصول عملکرد آنزیم روی سوبسترای پولولان ردیف 3: استاندارد قندی (قند یک کربنه تا هفت کربنه) ردیف 4: قند پنوز (محصول اصلی عملکرد آنزیم نئوپولولاناز)
شکل 4- منحنی لاین ویوربرک فعالیت آنزیمی با استفاده از نشاسته محلول و پولولان به عنوان سوبسترا. فعالیت آنزیمی مطابق با شرایط استاندارد تعیین شده است.
پایداری دمایی آنزیم و مقاومت به حلالهای آلی
به منظور تعیین پایداری دمایی آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد، نمونه آنزیمی به مدت 35 دقیقه در این دما قرار گرفت. بعد از طی این زمان گرماگذاری، باقی مانده فعالیت آنزیمی سنجیده شد و مشخص شد فعالیت پولولیتیکی و فعالیت آمیلولیتیکی به ترتیب 36 درصد 39 درصد از فعالیت اولیه خود را نشان میدهند. پایداری دمایی آنزیم در شکل 6 نشان داده شده است.
شکل 6- پایداری حرارتی آنزیم آمیلوپولولاناز در دمای 70 درجه سانتیگراد. فعالیت آنزیمی بدون تیمار حرارتی به عنوان 100 درصد در نظر گرفته شد. فعالیتهای نسبی به شکل ± انحراف معیار نشان داده شدهاند.
به منظور بررسی اثر حلالهای آلی بر روی پایداری آنزیم، هفت حلال آلی با ارزش log POWبین 97/1 تا 376/1- با غلظتهای (v/v) 20 و 50 درصد با نمونه آنزیمی مخلوط شدند. فعالیت آنزیمی به مدت هفت روز سنجش شد. نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در جدول 2 نشان داده شده است. همانطور که در جدول دیده میشود، نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی در دمای 20 درجه سانتیگراد و در عدم حضور حلالهای آلی 250 ساعت و نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی 165 ساعت است. در غلظت 20 درصد حلالهای آلی قابل اختلاط با آب، نیمه عمر آنزیم کوتاهتر از حلالهای آلی غیر قابل اختلاط با آب است. این موضوع در مورد حلال پروپانول و استون دیده نشد، به طوری که آنزیم در حضور غلظت 20 درصد از حلال پروپانول کمترین نیمه عمر و در حضور حلال استون بیشترین نیمه عمر را دارا بود. در حضور غلظت 50 درصد این حلالها، همان الگوی مشاهده شده در مورد غلظت 20 درصد دیده شد.
جدول 2- اثر حلالهای آلی بر روی فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز
غلظت حلال (20 درصد) |
غلظت حلال (50 درصد) |
Log Pow |
حلال آلی |
||
نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی(ساعت) |
نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی(ساعت) |
نیمه عمر فعالیت پولولیتیکی(ساعت) |
نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی (ساعت) |
||
165 |
250 |
165 |
250 |
- |
- |
150 |
230 |
160 |
240 |
97/1 |
کلروفرم |
125 |
215 |
140 |
220 |
88/0 |
n- بوتانول |
33 |
53 |
16 |
40 |
074/0 |
پروپانول |
65 |
101 |
72 |
82 |
- 038/0 |
DMF |
155 |
155 |
160 |
280 |
-208/0 |
استون |
57 |
99 |
50 |
54 |
-22/0 |
اتانول |
46 |
41 |
44 |
36 |
-1/39 |
DMSO |
بحث و نتیجهگیری
در این مطالعه برای اولین بار یک آنزیم آمیلوپولولاناز نمکدوست و مقاوم به حلال گزارش شده است. بررسیهای بیوشیمیایی، فنوتیپی و تعیین توالی ژن S rRNA16 نشان دادند که سویه Ha25 به جنس Halorubrum متعلق است. آنزیم تولید شده در محیط کشت مایع، به کمک رسوبدهی اتانولی و ستون تعویض آنیونی خالص شد. جرم مولکولی آنزیم آمیلوپولولاناز با کمک SDS-PAGE به میزان تقریبی 140 کیلودالتون تعیین شد. جرم مولکولی این آنزیم مشابه با جرم مولکولی آمیلوپولولاناز جدا شده از Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum(150 کیلو دالتون)، Thermoanaerobacter ethanolicus 39 E (140 کیلو دالتون)، siculi Thermococcus (131 کیلو دالتون) است (15، 17، 18 و 19). دمای بهینه برای فعالیت آنزیم آمیلوپولولاناز سویه Ha25 (50 درجه سانتیگراد) مشابه با دمای مشاهده شده برای فعالیت آنزیمهای α-آمیلاز نمکدوست جدا شده از Haloarcula hispanicaوHaloferax mediterranei است (20 و 21). در بسیاری از موارد دمای بهینه آنزیمهای آمیلوپولولاناز بیشتر از 50 درجه سانتیگراد بوده است. برای مثال دمای بهینه آمیلوپولولاناز جدا شده از Pyrococcus furiosus (105 درجه سانتیگراد)، Closteridium thermosulfurogenes SVM17 (70 درجهسانتیگراد) وGeobacillus stearothermophilus (65 درجهسانتیگراد) بوده است (22، 23 و 24). هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم آمیلوپولولاناز در محدودهی وسیعی از اسیدیته حفظ میشوند، مشابه با آنچه که در مورد α-آمیلازهای نمکدوست جدا شده از
Bacillus cereus Ms6،Halomonas meridianaو Marinobacter sp. EMB دیده شده است (25، 26 و 27). در حالی که اسیدیته بهینهای که برای فعالیت این آمیلوپولولاناز تعیین شده است بیشتر از مقادیر گزارش شده برای پولولاناز جدا شده از
(5 pH) Desulforucoccus mucosus،
(6 pH) Fervidobacterium pennavorans Ven5، (6 pH) P. woeseiو آمیلوپولولاناز جدا شده از
(5 pH) Thermoanaerobacter strain B6A بوده است (28، 29 و 30).
هر دو فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در محدوده غلظت NaCl بین صفر تا 5/4 مولار دیده شده و فعالیت بهینه آنها به ترتیب در غلظت 2 و 5/3 مولار از نمک تعیین شد. این تحمل بالای نمک در آمیلازهای نمکدوست جدا شده از
Hfx. mediterranei،Har. hispanica،Nesterenkonia sp. strain F و Chromohalobacter sp. TVSP 101 نیز دیده شده است (20، 21، 31 و 32).
آمیلازهایی که دارای این تحمل بالای نمک هستند، میتوانند در تصفیه پسآبهای آلوده به ترکیبات نشاستهای و دارای نمک بالا به کار بروند (31). با توجه به اینکه که بسیاری از آنزیمها عملکرد خود را در حضور حلالهای آلی از دست میدهند، دستیابی به آنزیمهایی که به حلالهای آلی مقاومت دارند بسیار ارزشمند بوده و دارای کاربردهای متعددی در صنایع است. عوامل متعددی نظیر تغییر ساختار فضایی آنزیم، از دست رفتن انعطافپذیری و کاهش آب فعال اطراف آنزیم در از دست رفتن فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی نقش دارند. آنزیمهایی که به شکل طبیعی دارای مقاومت به حلالهای آلی هستند میتوانند دارای کاربردهای متعددی در جهت عملکرد در محیطهای واجد این حلالها باشند، زیرا در این صورت نیازی به استفاده از روشهای مهندسی پروتئین در جهت ایجاد پایداری آنزیمهای معمولی نیست (33). بررسی نیمه عمر فعالیت آمیلولیتیکی و پولولیتیکی آنزیم در حضور غلظت 20 و 50 درصد حلالهای آلی نشان داد که پایداری آنزیم در حضور حلالهای آلی غیر قابل اختلاط با آب بیشتر از حلالهایی است که قابل اختلاط با آب هستند. در این مورد دو استثنا دیده شد، به این صورت که آنزیم در حضور حلال پروپانول کمترین و در حضور حلال استون بیشترین نیمه عمر را دارا بود. این نتایج نشان میدهند که پایداری آنزیم وابسته به قطبیت حلال مورد بررسی است، به این صورت که با افزایش قطبیت حلال میزان پایداری آنزیم کاهش پیدا میکند و برعکس. پایداری α-آمیلازهای نمکدوست جدا شده از Nesterenkonia sp. strain F، Haloarcula sp. strain S-1 وThalassobacillus sp. strain DF-E4 نیز همانند آنچه که در این مطالعه دیده شد بسته به قطبیت حلال مورد بررسی دارد (31، 34 و 35).
آنالیز محصولات قندی تولید شده حاصل از عملکرد آنزیم روی سوبستراهای نشاسته محلول و پولولان نشان داد که آنزیم تنها قند گلوکز را ایجاد میکند. این موضوع نشان میدهد که آنزیم قادر به شکست پیوندهای گلیکوزیدی (4,1) -α و (6,1) -α بوده و به این ترتیب نوع آنزیم، به احتمال زیاد آمیلوپولولاناز است. زیرا این آنزیم برخلاف سایر اعضای خانواده پولولانازها پنوز و ایزوپنوز را تولید نکرده و از طرفی قابلیت هیدرولیز پیوند گلیکوزیدی (4,1) -α را دارد. به منظور بررسی تولید احتمالی مقادیر بسیارکم از مالتوتریوز توسط این آنزیم که در روش کروماتوگرافی لایه نازک مشخص نشده است، ولی از مشخصات آنزیم آمیلوپولولاناز است لازم است که از روش حساسی نظیر HPLC استفاده کرد.
نتایج تحقیق حاضر نشان میدهند که HalorubrumسویهHa25یک منبع تولید آنزیم آمیلوپولولاناز گرمادوست و نمکدوستافراطی است. تولید این آنزیم در شرایط سختی مانند دمای بالا، غظت نمک زیاد و آب فعال کم انجام شده و از این رو میتواند در چنین شرایطی که در صنایع بسیار دیده میشود، کاربرد داشته باشد.