نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی صنعتی، دانشگاه ایلام، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
 Introduction: Biosurfactants are amphiphilic biological compounds produced extracellularly or as part of the cell membranes by a variety of microorganisms . Because of their use in various industries, they are of a particular importance. The aim of this study was to identify a strain of bacteria of the genus Pseudomonas aeruginosa biosurfactant producers .  Materials and methods: In this study, different samples of oil, water and soil contaminated with oil were prepared. Hemolytic activity, emulsification activity and measurement of surface tension were used and selected strains were identified by biochemical tests. The nature and effect of antibacterial biosurfactant was evaluated for strain selection .  Results: In this study, eighty eight bacterial strains were isolated. Twenty four strains were isolated from the isolated strains with hemolytic activity . Among which, 14 strains have emulsification activity more than 70% and at last four strains reached surface tension to be less than 40 mN/m. Selected strain based on biochemical tests was recognized as a Pseudomonas aeruginosa. The nature of biosurfactant was determined by TLC, and proved to be of glycolipid kind. Therefore, the produced biosurfactant of the selected strain had antibacterial activity against six bacterial infectious. Sensitive bacteria to the effects of biosurfactant extract of Pseudomonas aeruginosa83 , was Staphylococcus aureus and the most resistant bacteria to these extract, was the Proteus mirabilis. The results of MIC, MBC showed that MIC of the extract in concentration of 63 and 125 mg/ml on Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus respectively. Also, the MBC were extract in concentration of 63 and 125mg/ml on Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus respectively . Discussion and conclusion : Pseudomonas aeruginosa had high potential in reducing the surface tension and biosurfactant extracted had high antibacterial effects. Therefore, it could be said that this bacterium had a great potential for applications of biotechnology and the environment .
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
بیوسورفکتانتها ترکیبات زیستی آمفیفیلیکی تولید شده به شکل خارج سلولی یا بخشی از غشاءهای سلول بهوسیله انواع میگروارگانیسمها هستند. بیوسورفکتانتها از لحاظ تجاری به علت استفاده در صنایع مختلف از جمله صنعت نفت، پتروشیمی، غذایی، داروسازی پزشکی، آرایشی، کشاورزی، نساجی، کاغذسازی، چرمسازی و غیره از اهمیت ویژهای برخوردارند. به همین جهت میکروارگانیسمهای تولید کننده این ترکیبات به علت دارا بودن نسبت بالای سطح به حجم و ظرفیت متنوع بیوسنتتیک، کاندیدای مناسبی برای گسترش تولید بیوسورفکتانت هستند (1 و 2) . در پزشکی حرکت سوارمینگ و تشکیل بیوفیلم اعمال مهم در کلونیزاسیون سطح به وسیله باکتریها هستند و احتمال بروز عفونتها را افزایش میدهد. بیوسورفاکتانتها برای جلوگیری از چسبندگی ارگانیسمهای بیماریزا به سطوح جامد یا به محلهای عفونت، تولید شدهاند.سورفاکتین باعث کاهش میزان تشکیل بیوفیلم بهوسیله سالمونلا تیفیموریوم، سالمونلا انتریکا، اشریشیاکلی و پروتئوسمیرابیلیس در پلیوینیلکلراید و همچنین، در سوندهای مجرای وینیل میشود. به تازگی، از بیوسورفکتانت ال-فرمنتوم به منظور مهار عفونت استافیلوکوکوساورئوس و چسبندگی برای ایمپلنتهای جراحی گزارش شده است (3) . بیوسورفاکتانتها کاربردهای بسیار گستردهای در صنایع غذایی هم دارند. در حال حاضر، گروهی از این ترکیبات به‌عنوان افزودنی‌های مجاز مواد غذایی بهکار میروند. برای مثال، لسیتین و مشتقات آن، استرهای اسیدهای چرب حاوی گلیسرول، سوربیتان[1] یا اتیلنگلیکول و مشتقات اتیوکسیلات منوگلیسریدهای حاوی یک الیگوپپتید، در تمام دنیا به عنوان عوامل امولسیونهکننده در مواد غذایی استفاده میشوند (4 و 5). بیوفیلم به عنوان گروهی از باکتریهایی است که در یک سطح کلونیزه میشوند. بیوفیلم نه تنها شامل باکتریها، بلکه توصیف همه مواد خارجسلولی تولید شده در سطح و هر نوع مواد به دام افتاده در داخل ماتریکس است. مرحله اول در ایجاد بیوفیلم چسبندگی باکتریایی است که تحتتاثیر عاملهایی از جمله گونههای میکروارگانیسم، آبگریزی سطح و بارهای الکتریکی درگیر، شرایط محیطی و توانایی میکروارگانیسمها برای تولید پلیمرهای خارجسلولی که در اتصال سلولها به سطوح کمک میکند، است (6). بیوفیلم در حال حاضر در سطوح صنایعغذایی منبع مهم آلودگی است، که ممکن است به فساد مواد غذایی و انتقال بیماری منجر شود. با توجه به این واقعیت که نگه دارندههای مواد غذایی دارای سطح تحمل صفر برای پاتوژن مانند سالمونلا و همچنین، در بسیاری از کشورها برای باکتری لیستریا مونوسیتوژنز هستند، سلولهای چسبنده منفرد ممکن است به طور در خور توجهی به شکل بیوفیلم به خوبی گسترش یابند. در نتیجه کنترل چسبندگی میکروارگانیسمها به سطوح در تماس با مواد غذایی یک مرحله اساسی در فراهم آوردن ایمنی و محصولات با کیفیت به مصرفکنندگان است. از این رو، دخالت بیوسورفکتانتها در چسبندگی میکروبی و جداشدن از سطوح بررسی شده است (6). سورفاکتانت منتشرشده بهوسیله استرپتوکوکوس ترموفیلوس برای کنترل زنگ زدگی صفحات مبدل حرارتی در پاستوریزه کردن استفاده میشود که کلونیزاسیون گونههای دیگر گرما دوست استرپتوکوکها که مسئول زنگ زدگی هستند را به تاخیرمیاندازد (6). در این پژوهش، جداسازی و شناسایی سویه تولید کننده بیوسورفکتانت از جنس سودوموناس آئروژینوزا و بررسیاثراتضد باکتریایی بیوسورفکتانت تولید شده از آن بر رویرشد6 باکتری گرم مثبت و گرم منفی بااستفادهازروشانتشار در آگار به کمک دیسکبررسیومقایسهشد.
مواد و روشها
نمونه برداری
برای جداسازی باکتریهای مولد بیوسورفکتانت، نمونهها از منابع مختلف از جمله نفت خام نفتشهر کرمانشاه (چاه 25)، آب و خاکهای آلوده به نفت نواحی اطراف مخازن نفتی جمع آوری شدند. برای نمونهگیری از شیشههای در پوشدار استریل استفاده شد.
غنیسازی و کشت میکروبی
پس از انجام نمونهگیری و ارسال به آزمایشگاه 5 میلیلیتر ازنمونه آب و 5 گرم ازنمونه خاک آلوده به نفت در 95 میلیلیتر محیطنوترینت براث تقویت شده[2]در داخل ارلن مایر 250 میلیلیتر تلقیح ودر دمای 30 درجه به مدت72 ساعت شیکر (150 دور در دقیقه[3]) و گرمخانهگذاری شدند (7 و 8). محیط نوترینت براث تقویت شده استفاده شده در این تحقیق، محتوای 500 میلیلیتر نوترینت براث و 500 میلیلیتر محلول نمک معدنی[4] است. محلول نمک معدنی استفاده شده در این تحقیق، در هر لیتر آب مقطر محتوای: 2 گرم KH2PO4، 5 گرم K2HPO4، 3 گرم (NH4) 2SO4، 1/0 گرم Nacl، 01/0گرم FeSO4.7H2O، 01/0 گرم CaCl2.2H2O، 2گرم MgSO4.7H2O، 002/0 گرم MnSO4.7H2O، 25/0گرم CuSO4.5H2O، 24/0گرم ZnSO4.7H2O، 03/0 درصدگلوکز و 03/0 درصد عصاره مخمر[5]، با اسیدیته 2/7 تنظیم شد. پس از آن از این محیط از1-10 تا6-10 در فسفات بافر سالین رقتهای متوالی تهیه شد و سپس هر رقت در محیط کشت نوترینت آگار تقویت شده[6] (1.2 نوترینت براث تقویت شده همراه با 2 درصد آگار) به شکل پورپلیت[7] کشت داده شد. به منظور افزایش دادن تعداد باکتریهای مولد بیوسورفکتانت برای نمونه نفت ابتدا یک میلیلیتر نفت خام در99 میلیلیتر محیط نوترینت براث تقویت شده در داخل ارلن مایر 250 کشت داده شد و همینطور یک میلیلیتر نفت فیلتر شده نیز به همراه 99 میلیلیتر محیط نوترینت براث تقویت شده به عنوان شاهد قرار داده شد. هر دو ارلن در دمای 30 درجه به مدت 2 ساعت شیکر وگرمخانهگذاری شدند (rpm150). پس از 2 ساعت از کشت مورد نظر رقتهای متوالی تهیه شد. برای رقتسازی بجای بافر فسفات سالین از نوترینت براث تقویت شده استفاده شد و از هر رقت در محیط کشت نوترینت آگار تقویت شده به شکل پورپلیت کشت داده شد و از محیطهای گلوکز عصاره مخمر آگار[8] برای جداسازی سایر باکتریها و از محیط مکانکی آگار، ائوزین متیل بلو آگار[9] و اندو آگار برای جداسازی باکتریهای گرم منفی از گرم مثبت استفاده شد. تمام پلیتها در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند (9 و 10).
غربالگری
آزمایش همولیزخون
نخستین آزمایش غربالگری برای شناسایی و جداسازی باکتریهای تولید کننده بیوسورفکتانت آزمایش همولیز است. تک کلونیهایی که تازه از تمام کشتهای خالصی بهدست آمده بودند بر روی آگار حاوی خون بهطور خطی کشت داده شدند و به مدت 72 ساعت در دمای30 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند (7 و 11).
اندازه گیری فعالیت امولسیفیه کنندگی
در این مرحله هر کدام از کلونی جدا شده از غربالگری اولیه در لوله آزمایش محتوای 3 میلیلیتر محیط محلول نمک معدنی به مدت 48 ساعت کشت داده شد. پس از تلقیح دو کلونی در هر محیط، به میزان 10 درصد هیدروکربن (نفت خام) به لوله اضافه و پس از مخلوط کردن با دستگاه ورتکس[10] به مدت یک دقیقه، در دمای 30 درجه به مدت 3 روز گرمخانهگذاری شد. پس از گرمخانه گذاری لولهها خوب با ورتکس مخلوط و در ادامه ضخامت لایه نفت امولسیفیه شده به شکل زیر محاسبه شد (9 و11).
EC طول کل ستون مایع / طول لایه امولیسیفیه شده 100
تائید ترشح بیوسورفکتانت با اندازهگیری کشش سطحی
برای اندازهگیری کشش سطحی از دستگاه کششسنج کرواس کلات[11] استفاده شد. بدین منظور یک کلونی از کشت خالص هر یک از سویههای جدا شده از غربالگری ثانویه به محیط کشت نوترینت براث تلقیح شد، پس از آنکه جذب نوری کشت مذکور در طول موج 620 نانومتر به 9/0-8/0 آنگسترم رسید، از آن به عنوان مایع تلقیح استفاده شد. یک میلیلیتر از کشت مذکور به 100 میلیلیتر محیط محلول نمک معدنی و یک درصد نفت فیلتر شده به عنوان منبع هیدروکربن اضافه شد. مخلوط همراه با نمونه شاهد در دمای 30 درجه در 150 دور در دقیقه به مدت 3روز گرمخانهگذاری شد (9 و11).
ویژگیهای سویه انتخابی سودوموناس آئروژینوزا تولید کننده بیوسورفکتانت
ویژگیهای سویه انتخابی تولید کننده بیوسورفکتانت بواسطه آزمایشهای مختلف تعیین شده بود. این آزمایشها شامل: ویژگیهای ظاهری کلونیها، رنگ آمیزی گرم، رنگآمیزی اسپور، آزمایش کاتالاز، اکسیداز، سیترات، تریپل شوگر آیرون آگار[12]، سولفید تحرک اندول[13]، متیل رد- وجس پروسکوآر[14]، اورهآز، احیا نیترات و همچنین، الگوی مقاومت سویههای انتخابی به 16 آنتیبیوتیک جنتامایسین (10 میکروگرم بر میلیلیتر)، کلیندامایسین (2 میکروگرم بر میلیلیتر)، متیسیلین (5 میکروگرم بر میلیلیتر)، آمپیسیلین (10 میکروگرم بر میلیلیتر)، استرپتومایسین (10 میکروگرم بر میلیلیتر)، اکسیتتراسایکلین (30 میکروگرم بر میلیلیتر)، سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم بر میلیلیتر)، ونکومایسین (3 میکروگرم بر میلیلیتر)، اپی پنم (10 میکروگرم بر میلیلیتر)، اریترومایسین) 15 میکروگرم بر میلیلیتر)، باسیتراسین (04/0 میکروگرم بر میلیلیتر)، اگزاسیلین (1 میکروگرم بر میلیلیتر)، نالیدیکسیکاسید (30 میکروگرم بر میلیلیتر)، سفیپیم (30 میکروگرم بر میلیلیتر)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم بر میلیلیتر) و پنیسیلین (10 میکروگرم بر میلیلیتر) بررسی شد.
استخراج بیوسورفکتانت
به این شکل که کلونی سویه انتخابی به ارلن 1000 میلیلیتری محتوای 500 میلیلیتر محیط کشت نوترینت براث تلقیح، سپس با اضافه کردن 10 میلیلیتر n-هگزان به عنوان منبع هیدروکربن، مخلوط در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز با شیکر 150 دور در دقیقه گرمخانهگذاری شد. پس از آن سلولهای باکتری بهوسیله سانتریفیوژ در 5000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت20 دقیقه حذف و مایعرویی جمعآوری شد. اسیدیته مایع با استفاده از سولفوریک اسید 1 مولار به 2 تنظیم شد و پس از آن به حجم برابر کلروفرم و متانول (1:2) اضافه شد. سپس فاز آلی مجزا شده و حلال در آون و در دمای 60 درجه تبخیر شد. فراورده نهایی به رنگ قهوهای تیره و قوام چرب به عنوان بیوسورفکتانت خام بهدست آمد (شکل 1). بیوسورفکتانت خشک بدست آمده از هر سویه وزن شد و از آنها رقتهای متوالی شامل: 1000، 500، 250، 125 و63 میلیگرم بر میلیلیتر در 1 میلیلیترحلال دی متیل سولفوکساید[15] تهیه شد رقتهای هر بیوسورفکتات برای بررسیهای ضد باکتریایی استفاده شد (7).
شکل 1- عصاره بیوسورفکتانت خام بهدست آمده از سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی
در این مرحله پلیت استریل را گرفته و وزن پلیتها اندازهگیری شد. رسوب حاصل از استخراج بر روی پلیتها ریخته شد، سپس پلیتها در آون در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شد پس از خشککردن، پلیتها وزن شد. وزن خشک بیوسورفکتانتها بهوسیله فرمول زیر محاسبه شد (7).
وزن پلیت خالی -وزن پلیت پس از خشک کردن = وزن خشک بیوسورفکتانت
کروماتوگرافی لایه نازک
یکی از روشهای اطمینان از حضور بیوسورفکتانت در محیط، کروماتوگرافی لایه نازک است. پس از استخراج بیوسورفکتانت، 500 میلیگرم از بیوسورفکتانت خام را در 1000 میلیلیترآب دیونیزه شده مخلوط و سپس 10 میکرولیتر از آن بر روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک بارگذاری شد. سیستم حلال مورد استفاده شامل: کلروفرم/ متانول/ استیک اسید/ آب (V/V/V/V 25:15:4:1) بود. صفحه کروماتوگرافی لایه نازک آماده، در داخل تانک حاوی حلال قرار گرفت سپس صفحه کروماتوگرافی لایه نازک پس از خشک شدن زیر UV قرار داده شد تا مشاهده شود واکنش انجام شده است یا نه، اگر واکنش انجام شده کروماتوگرام را با معرفهای نین هیدرین[16] (5/0 گرم در 100 میلیلیتر استون بدون آب) برای کشف بخشهای لیپیدی به عنوان نقاط قهوهای و معرف آنترون[17] (1گرم در 5 میلیلیتر سولفوریک اسید ترکیب شده با 95 میلیلیتر اتانول) برای کشف بخشهای کربوهیدراتی به عنوان نقاط زرد اسپری مینماییم (7، 9 و12).
سویههای میکروبی
سویههای استانداردباکتریهایموردآزمایش در این تحقیق، ازگروه میکروبشناسی موسسه سرمسازی رازی کرج و کلکسیون میکروبشناسی تهران به نامهای استافیلوکوکوس اورئوس 1112 PTCC، اشریشیاکلی 1330 PTCC، سودوموناس آئروژینوزا 1074 PTCC، استافیلوکوکوس اپیدرمیس 2405 ATCC، پروتئوس میرابیلیس 2601 ATCC و سالمونلا تیفی موریوم1679 ATCC تهیه شد.
تهیه سوسپانسیون میکروبی
ازتمامسویههادرسرم فیزیولوژی سدیم کلراید 9/0 درصد سوسپانسیون میکروبی تهیه شد، به این شکل که برایهرسریآزمایشکشتتازه24 ساعتهتهیهشد.برایاینکاریکلوپازهرمیکروبدر 5 سیسی سرم فیزیولوژی فوق تلقیح شد. جذب نوری سوسپانسیون میکروبیبا دستگاه اسپکترفتومتری در طول موج 620 به 08/0 تا 0/1آنگسترم تنظیم شد، سپس از این سوسپانسیونمیکروبیبرایتلقیحدرمحیط کشتمولرهینتون آگاراستفادهشد.
بررسی خاصیت ضد باکتری بیوسورفکتانت
برای تعیین حساسیت کیفی و کمی از سوسپانسیون تهیه شده استفاده شد. در روش کیفی از انتشار در آگار[18] به شیوه کربی بائر[19] استفاده شد که طی آن از سوسپانسیونمیکروبیاستانداردشدهبهروش چمنیدرسطحمحیطکشتمولرهینتونآگار[20] کشتانجامشد.سپس برایبررسیخواصیضدباکتریایی، دیسکهایکاغذیبلانک (ساخت پادتن طب) با فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت روی آگار قرار داده شد و حدود 20 میکرولیتر از غلظتهای حاوی 1000، 500، 250، 125 و63 میلیگرم بر میلیلیتر در محلول دی متیل سولفوکساید، روی دیسکها اضافه شد. از دیسک آنتیبیوتیک جنتامایسین با غلظت10 میکروگرم بر میلیلیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سپسمحیطهایکشتحاوی باکتریهابهمدت24ساعتدردمای۳۷درجهسانتیگراد قرار داده شد. سپس با اندازهگیری قطر هالههای تشکیل شده در اطراف صفحهها، نتایج بررسی و نتایجحاصلازآنتیبیوتیک باجداول، موسسه استاندارد بالینی و آزمایشگاهی[21]مقایسهشده است برای حصول اطمینان از هر یک از غلظتهای مختلف بیوسورفکتانت و آنتی بیوتیک این آزمایشها برای هر سویه باکتریایی سه بار تکرار شد. همچنین، آزمایشهایکمیبرایتعیینحداقلغلظت مهارکننده و حداقلغلظت کشنده بیوسورفکتانتها انجام شد. به این ترتیب آزمایش حداقل غلظت مهارکننده درپلیت٩٦خانهاستریلوباروشبراث میکرودایلوشن انجام شد. ابتدا ازمولر هینتون براث (مرکآلمان) 100 میکرولیتر داخل چاهکهای مربوط به رقتهای مورد نظر میکروپلیت ریخته شد. سپس به نخستین چاهک 100 میکرولیتر عصاره بیوسورفکتانت اضافه شد و از خانه دوم وسوم به همین ترتیب تا خانه ششم رقیق شدند. در پایان به همه چاهکها 100 میکرولیتر سوسپانسیون رقیق شده (نوترینت براث) معادل لوله نیم مک فارلند اضافه شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد،کف پلیت زیر نور در آینه مشاهده شد. خانه کنترل اسانس، محیط کشت و میکروب نیز جداگانه منظور و وجود کدورت را که نشان دهنده رشد یا عدم رشد باکتری است، درجدول مخصوص یادداشت شد. طبق تعریف اولین چاهک بدون کدورت (رقیقترین)، به عنوان حداقل غلظت مهارکننده قرار داده شده است. همچنین، آزمایش حداقل غلظت کشندگی با توجه به نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی تعیین شد. از چاهکهایی که رشد باکتری در آنها به طور کامل متوقف شده بود با سوآپ استریل نمونه برداری، روی محیط کشت نوترینت آگارکشت داده و در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. پس از 24 ساعت کمترین غلظتی از عصاره بیوسورفکتانت که باکتری در آن رشد نکرده به عنوان حداقل غلظتکشندگی گزارش شدند(13).
تجزیه تحلیل آماری
بررسی خواص ضدباکتریایی در سه تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. برای تجزیه واریانس دادهها از نرم افزار SAS در سطح 1 درصد و برای مقایسه میانگین دادههااز آزمونچنددامنهدانکن در سطح 5 درصد استفاده شد.
نتایج
جداسازی، خالصسازی
در این مطالعه، از نمونهها پس از سپری شدن مراحل غنیسازی، رقت تهیه شده و بر روی محیطکشتهای اختصاصی کشت داده شدند. نمونهها از نفت خام، خاک و آب آلوده به نفت تهیه شده بودند، که بر اساس مشخصات ظاهری و صفات کلونیها، 88 سویه باکتریایی مختلف جداسازی شدند. در این روش به علت خالص بودن کشتها، میزان آلودگیهای قارچی تا حد زیادی کاهش پیدا میکند، چون تنها سویههایی که بر روی محیط کشت اختصاصی خالصسازی شدهاند، استفاده شدند.
انتخاب مناسبترین سویهها
آزمایش همولیزخون
تمام سویههای جدا شده در مرحله قبل، برای بررسی فعالیت همولیتیک بر روی محیط کشت بلادآگار کشت داده شدند. از بین 88 سویه جداسازی شده، تنها 24 سویه دارای فعالیت همولیز بتا بودند (شکل 2). در نتیجه سویههایی که دارای همولیز بتا بودند به عنوان فعالیت همولیتیک مثبت در نظرگرفته و برای مطالعات بعدی انتخاب شدند.
اندازهگیری فعالیت امولسیفیهکنندگی
نتایج حاصل از فعالیت امولسیفیهکنندگی کشت سویههای غربال شده از مرحله قبل با هیدروکربن نفت نشان داد که از میان 24 سویه حاصل از غربالگری اولیه، 14 سویه، 70 درصد یا بیشتر توانایی امولسیفیهکنندگی را داشتند. این سویهها برای مطالعات بیشتر انتخاب شدند.
اندازهگیری کشش سطحی
کشش سطحی یکی از معیارهای نشان دهنده تولید مواد فعال سطحی در محیط است. جدول 1 کشش سطحی کشت سویههای انتخابی همراه با یک درصد نفت را نشان میدهد. کشش سطحی شاهد (محیطکشت فاقد باکتری) 72 میلینیوتن برمتر بود. در این مرحله با توجه به نتایج غربالگری اول و دوم 14 سویه برای اندازهگیری کشش سطحی انتخاب شدند. همانطور که در این جدول نشان داده شده از بین 14 سویه آزمایش شده تنها سویههای 43، 47، 83 و 88 قادر به کم کردن کشش سطحی تا کمتر از40 میلینیوتن برمتر هستند (10 و19) البته هر 4 سویه به نمونه نفت متعلق بودند.
شکل 2- فعالیت همولیز بتا توسط سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی
جدول 1- کشش سطحی حاصل از 14 سویه انتخابی پس از 72 ساعت (mN/m)
|
شماره سویه |
کشش سطحی [میلینیوتن برمتر] |
|
1 |
43 |
|
5 |
42 |
|
40 |
48 |
|
41 |
47 |
|
43 |
6/38 |
|
47 |
38 |
|
53 |
40 |
|
56 |
55 |
|
77 |
53 |
|
78 |
58 |
|
80 |
62 |
|
83 |
39 |
|
87 |
57 |
|
88 |
36 |
جدول 2- ویژگیهای بیوشیمیایی سویه انتخابی تولیدکننده بیوسورفکتانت
|
ویژگیها |
سودوموناس83 |
الگوی مقاومت |
سودوموناس83 |
|
ریختشناسی سلول |
کوکوباسیل |
جنتامایسین |
- |
|
واکنش گرم |
- |
کلیندامایسین |
+ |
|
تشکیل اسپور |
- |
متیسیلین |
+ |
|
کاتالاز |
+ |
آمپیسیلین |
+ |
|
اکسیداز |
+ |
استرپتومایسین |
+ |
|
حرکت |
- |
اکسیتتراسایکلین |
- |
|
اندول |
- |
سیپروفلوکساسین |
- |
|
H2S |
- |
ونکومایسین |
+ |
|
متیل رد |
- |
اریترومایسین |
+ |
|
وجس- پروسکوآر |
- |
باسیتراسین |
+ |
|
گلوکز |
+ |
اگزاسیلین |
+ |
|
لاکتوز |
+ |
نالیدیکسیک اسید |
+ |
|
اورهآز |
+ |
سفیپنم |
- |
|
سیترات |
+ |
کلرامفنیکل |
+ |
|
احیای نیترات |
+ |
پنیسیلین |
+ |
|
پیگمان |
+ |
اپیپنم |
- |
- : نتیجه منفی، + : نتیجه مثبت
ویژگیها وشناسایی سویههای باکتری
در این مطالعه، یکی از باکتریهای تولیدکننده بیوسورفکتانت به نام سویه 83 دارای کاهش کشش سطحی زیر 40 میلینیوتن برمتر بود. براساس آزمایشهای بیوشیمیایی مطابق با جدول 2 و طبقهبندی ارائه شده در چاب هشتم کتاب برگی، سویه جدا شده تا حد امکان تعیین هویت شد. به این ترتیب سویه
83؛Pseudomonas.aeruginosa c.f.نام گذاری و برای استخراج بیوسورفکتانت انتخاب شد.
وزن خشک بیوسورفکتانت
وزن خشک بیوسورفکتانت مطابق با جدول 3 اندازهگیری و تعیین شد.
جدول 3- وزن خشک بیوسورفکتانت سویههای انتخابی (برحسب گرم)
|
سویه |
وزن پلیت |
وزن پلیت پس از خشک کردن بیوسورفکتانت |
وزن خشک بیوسورفکتانت |
|
سودوموناس آئروژینوزا83 |
98/48 |
254/49 |
274/0 |
کروماتوگرافی لایه نازک
با قرار دادن صفحه کروماتوگرام در سیستم حلال، جابجایی لکهها زیر UV بررسی شد که نمونه لکه بزرگ و مشخصی بر روی صفحه کروماتوگرام تشکیل داد و زیر UV به شکل لکه صورتی رنگ مشاهده شد. همچنین، با اسپری معرف نینهیدرین بر روی صفحه کروماتوگرام لکه لیپیدی به رنگ قهوهای در سویه انتخابی مشاهده شد. همچنین، با اسپری معرف آنترون لکه زرد در سویه سودوموناس آئروژینوزا83 دیده شد که وجود بخش کربوهیدراتی را در این سویه نشان میدهد (شکل 4).
شکل 3- صفحه کروماتوگرام
شکل 4- مشاهده لکههای عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 انتخابی
بررسی اثرات ضد باکتریایی بیوسورفکتانت
تجزیه تحلیل آماری دادههای حاصل از بیوسورفکتانت
نتایج حاصلازتجزیهواریانسدادههایمربوط (جدول 4) نشان دادند که اثر باکتری و رقتهای مختلف و همچنین، اثر متقابل بین باکتری و رقت بیوسورفکتانت مورد آزمایش در سطح یک درصد معنادار هستند.
تاًثیر رقتهای مختلف بیوسورفکتانت بر هر یک از باکتریها
تحلیل آماری دادهها نشان داد که تفاوت بین میانگینهای قطر هاله ممانعت از رشد حاصل از تاثیر رقتهای مختلف بیوسورفکتانت برای 6 باکتری مختلف در سطح پنج درصد معنادار است (جدول 4). همچنین، بررسی قطر هاله ممانعت از رشد حاصل از تاًثیر رقتهای مختلف بیوسورفکتانت بر روی هر باکتری و سپس مقایسه باکتریها با هم نشان داد که حساسترین باکتری نسبت به تاثیر عصاره بیوسورفکتانتسودوموناسآئروژینوزا 83؛ استافیلوکوکوس اورئوس و مقاومترین باکتری در برابر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83؛ پروتئوس میرابیلیس است (جدول 5).
جدول 4- نتایج تجزیه واریانس بیوسورفکتانت بدست آمده از سودوموناس آئروژینوزا83
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
باکتری |
5 |
**16/287 |
|
رقت |
5 |
**74/521 |
|
باکتری*رقت |
25 |
**35 /22 |
|
خطا |
72 |
22/0 |
|
کل |
107 |
|
|
CV درصد (ضریب تغییرات) |
87/2 |
|
** معنی دار
جدول 5- مقایسه میانگین بین باکتریها متاثر از بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83
|
سویه باکتری |
میانگین |
انحراف معیار |
|
اشریشیا کلی |
27/16 C |
57/0± |
|
استاف اورئوس |
A83/21 |
57/0± |
|
استاف اپیدرمیس |
B05/20 |
57/0± |
|
پروتئوس میرابیلیس |
F88/10 |
0± |
|
سالمونلا تیفیموریوم |
E38/14 |
57/0± |
|
سودوموناس آئروژینوزا |
D83/14 |
57/0± |
اثر بیوسورفکتانت در رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر
مقایسه میانگینهای قطر هاله ممانعت از رشد وتجزیه و تحلیل دادهها مشخص کرد که رقت1000 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناسآئروژینوزا 83بیشترین اثر بازدارندگی را بر استافیلوکوکوس اورئوس داشته که تفاوت آن با دیگر باکتریها معنیدار بود. پس از آن بیشترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 به ترتیب بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس، اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا تیفیموریوم و پروتئوس میرابیلیس وجود داشت که تفاوت آنها با هم معنیدار بود (جدول 6).
اثر بیوسورفکتانت در رقت500 میلیگرم بر میلیلیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر
تحلیل دادهها نشان داد که رقت 500 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 بیشترین اثر بازدارندگی را بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و استافیلوکوکوس اورئوس داشته که تفاوت آنها با هم معنیدار نبود، ولی تفاوت آنها با دیگر باکتریها معنیدار بود. پس از آن بیشترین اثربازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 بهترتیب بر اشریشیاکلی، سالمونلا تیفیموریوم، سودوموناس آئروژینوزا و پروتئوسمیرابیلیس داشت که تفاوت آنها نیز با هم معنیدار بود (جدول 6).
اثر بیوسورفکتانت دررقت 250 میلیگرم بر میلیلیتر برمهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر
تجزیه و تحلیل آماری دادهها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 250 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 در مورد استافیلوکوکوس اورئوس بیشتراز سایر باکتریهاست که تفاوت آن با دیگر باکتریها معنیدار بود. پس از آن بیشترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و اشریشیاکلی مشاهده شد که تفاوت آنها با هم و با سودوموناس آئروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم که اختلاف معناداری با هم نداشتند و همچنین بر پروتئوس میرابیلیس معنیدار بود (جدول 6).
اثر بیوسورفکتانت در رقت125 میلیگرم بر میلیلیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر
تجزیه وتحلیل آماری دادهها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 125 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 در مورد استافیلوکوکوس اورئوس بیشتر از سایر باکتریهاست که تفاوت آنها با دیگر باکتریها معنیدار بود. پس از آن بیشترین اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناسآئروژینوزا 83 بر استافیلوکوکوس اپیدرمیس و اشریشیاکلی مشاهده شد که تفاوت آنها با پروتئوس میرابیلیس، سودوموناسآئروژینوزاو سالمونلا تیفیموریوم که تفاوت معنیداری با هم نداشتند، معنیدار بودند (جدول 6).
اثر بیوسورفکتانت در رقت63 میلیگرم بر میلیلیتر بر مهار رشد 6 باکتری مختلف با یکدیگر
تجزیه و تحلیل آماری دادهها نشان داد اثر بازدارندگی رقت 63 میلیگرم بر میلیلیتر از عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 در مورد استافیلوکوکوس اپیدرمیس بیشتر از سایر باکتریهاست که تفاوت آنها با باکتریهای دیگر معنیدار بود. پس از آن بیشترین اثر بازدارندگی بر استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیاکلیوجود داشت که تفاوت آنها با هم و با سودوموناسآئروژینوزا و سالمونلا تیفیموریوم که با هم اختلاف معنیداری نداشتند و همچنین، پروتئوس میرابیلیس که کمترین اثر بازدارندگی را داشت معنیدار بود (جدول 6).
جدول 6- مقایسه میانگین قطر هاله ممانعت از رشد 6 باکتری مختلف تحت تأثیر رقتهای مختلف بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 وآنتی بوتیک (میلیمتر)
|
باکتری |
رقت |
میانگین |
انحراف معیار |
باکتری |
رقت |
میانگین |
انحراف معیار |
|
اشریشیاکلی |
1000 |
de 66/23 |
57/0± |
پروتئوس میرابیلیس |
1000 |
n 12 |
0± |
|
500 |
h 33/18 |
0± |
500 |
p 66/9 |
57/0± |
||
|
250 |
jk 15 |
57/0± |
250 |
p 66/9 |
57/0± |
||
|
125 |
o 66/10 |
57/0± |
125 |
q 66/8 |
57/0± |
||
|
63 |
o 66/10 |
57/0± |
63 |
r 6 |
0± |
||
|
جنتامایسین |
g 33/19 |
57/0± |
جنتامایسین |
g 33/19 |
57/0± |
||
|
استاف اورئوس |
1000 |
a 33/31 |
57/0± |
سالمونلا تیفیموریوم |
1000 |
hi 18 |
57/0± |
|
500 |
d 24 |
0± |
500 |
j66/15 |
0± |
||
|
250 |
d 24 |
0± |
250 |
mn 33/12 |
0± |
||
|
125 |
kl 33/14 |
57/0± |
125 |
q 66/8 |
0± |
||
|
63 |
n 12 |
0± |
63 |
q 66/8 |
0± |
||
|
جنتامایسین |
c 33/25 |
57/0± |
جنتامایسین |
e 23 |
57/0± |
||
|
استاف اپیدرمیس |
1000 |
b 66/29 |
57/0± |
سودوموناس آئروژینوزا |
1000 |
f 33/20 |
57/0± |
|
500 |
d 24 |
0± |
500 |
k66/14 |
57/0± |
||
|
250 |
f 33/20 |
57/0± |
250 |
m 13 |
0± |
||
|
125 |
m 13 |
0± |
125 |
q66/8 |
57/0± |
||
|
63 |
m13 |
0± |
63 |
q66/8 |
0± |
||
|
جنتامایسین |
f 33/20 |
57/0± |
جنتامایسین |
de66/23 |
57/0± |
حروفمشابهبیانکنندهعدموجوداختلافمعنیداراست
مقایسه تاًثیر ضد باکتریایی بیوسورفکتانت در رقتهای مختلف با تاثیر بازدارنده آنتیبوتیکها
تجزیه تحلیل آماری دادهها طبق جدول 7 نشان داد که در مورد باکتری اشریشیا کلی اثر بازدارنده رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83، از تمام آنتی بیوتیکهای موثر بر این باکتری کمتر ولی از آنتی بیوتیک اریترومایسین موثر بر این باکتری بیشتر است.
در مورد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس تاثیر بازدارنده رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناسآئروژینوزا 83، در برابرجنتامایسین، کلیندامایسین، آمپیسیلین، وانکومایسین، اگزاسیلین و نالیدیکسیک اسید زیاد ولی نسبت به سفیپیم که یک نوع آنتیبیوتیک حاوی حلقه بتالاکتامی و از دسته سفالوسپورینهاست اثری مشابه و نسبت به سیپروفلوکساسین، اکسیتتراسایکلین و اپیپنم کمتر موثر بودند.
در مورد باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیس، اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 نسبت به آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین موثر بر این باکتری بیشتر و نسبت به آنتی بیوتیک
اپی پنم و سفیپیم اثر مشابه ولی نسبت به اریترومایسین، کلرامفنیکل پنیسیلین موثر بر این باکتری کمتر بود (جدول6 و 7).
در مورد باکتری پروتئوس میرابیلیس اثر بازدارندگی عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 نسبت به آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین موثر بر این باکتری بیشتر و نسبت به آنتی بیوتیک اپی پنم و سفیپیم اثر مشابه ولی نسبت به اریترومایسین، کلرامفنیکل پنیسیلین موثر بر این باکتری کمتر بود.
برای باکتری سالمونلا تیفیموریوم، اثر باز دارندگی رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 از تمام آنتیبیوتیکهای موثر به جز کلیندامایسین که با رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 اثر مشابه داشت کمتر و معنیدار بود.
در مورد باکتری سودوموناس آئروژینوزا تاثیر بازدارنده رقت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره سودوموناس آئروژینوزا 83 نسبت به تمام آنتیبیوتیکها به جز اکسیتتراسایکلین که اثرات مشابهای داشت کمتر بود (جدول6 و7).
همانگونه که نتایج این پژوهش نشان داد، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 دارای خاصیت ضد باکتریایی است که این ویژگی بسته به رقت بیوسورفکتانت و جنس باکتری متفاوت است. مطابق با جداول 5 و6 بیشترین اثر بازدارندگی رقتهای مختلف عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا 83 بر روی باکتری استافیلوکوکوس اپیدرمیس وکمترین اثر برروی سالمونلا تیفیموریوم باکتری مشاهده شد.
همچنین، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83، برای باکتری اشریشیاکلی دررقت 63 میلیگرم بر میلیلیتر اثر باکتریواستاتیکی و در رقت 250 میلیگرم بر میلیلیتر اثر باکتریوسیدالی داشت. همچنین، برای باکتریهای سالمونلا تیفیموریوم و سودوموناسآئروژینوزا رقت 250 میلیگرم بر میلیلیتر اثر باکتریواستاتیکی و دررقت 500 میلیگرم بر میلیلیتر اثر باکتریوسیدالی مشاهده شد. با این حال برای باکتریهای استافیلوکوکوس اپیدرمیس دررقت 63 میلیگرم بر میلیلیتر، استافیلوکوکوس اورئوس در رقت 125 میلیگرم بر میلیلیتر و برای پروتئوس میرابیلیس دررقت1000 میلیگرم بر میلیلیتر هم اثر باکتریواستاتیکی و هم اثر باکتریوسیدالی مشاهده شد (جدول 8).
جدول 7- اثرات ضد باکتری آنتیبیوتیکها بر روی 6 باکتری مختلف (میلیمتر)
|
سویه باکتری آنتیبیوتیک |
اشریشیاکلی |
استاف اورئوس |
استاف اپیدرمیس |
پروتئوس میرابیلیس |
سالمونلا تیفیموریوم |
سودوموناس آئروژینوزا |
|
کلیندامایسین |
R 33/12 |
S 23 |
R 6 |
R 6 |
S 66/17 |
R 6 |
|
متیسیلین |
R 6 |
R 66/15 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
|
آمپیسیلین |
R 6 |
S 33/30 |
R 6 |
R 6 |
R 33/9 |
R 6 |
|
استرپتومایسین |
R 66/12 |
R 66/12 |
R 6 |
R11 |
R 33/9 |
R 33/10 |
|
اکسیتتراسایکلین |
S 25 |
S 33/32 |
R 6 |
R 6 |
S66/22 |
S 20 |
|
سیپروفلوکساسین |
S 33/35 |
S 33/35 |
S 33/28 |
S 25 |
S 33/26 |
S 33/35 |
ادامه جدول 7
|
سویه باکتری آنتیبیوتیک |
اشریشیاکلی |
استاف اورئوس |
استاف اپیدرمیس |
پروتئوس میرابیلیس |
سالمونلا تیفیموریوم |
سودوموناس آئروژینوزا |
|
وا نکومایسین |
R 6 |
S 33/20 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
|
اپیپنم |
S 35 |
S 66/33 |
S 30 |
S31 |
S 33/38 |
S 66/33 |
|
اریترومایسین |
I 15 |
R 6 |
S 66/33 |
R 6 |
R 66/12 |
R 6 |
|
باسیتراسین |
R 6 |
R 33/16 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
|
اگزاسیلین |
R 6 |
S 66/22 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
R 6 |
|
نالیدیکسیک اسید |
R 33/10 |
I 33/14 |
R 33/10 |
R 6 |
S 28 |
R 33/12 |
|
سفیپیم |
S 33/28 |
S 33/31 |
S 30 |
S 30 |
S 33/34 |
S 33/29 |
|
کلرامفنیکل |
R 13 |
R 13 |
S 33/31 |
R 12 |
S31 |
R 6 |
|
پنیسیلین |
R 6 |
R 6 |
S 33/34 |
S 66/25 |
I33/21 |
R 10 |
R: Resistant, I: Intermediate/moderatelysusceptible, S: Susceptible
جدول 8- تعیین میزان حداقل غلظت مهارکننده رشد حداقل غلظت کشنده رشد بیوسورفکتانت بر روی 6 باکتری مختلف (میلیگرم بر میلیلیتر)
|
بیوسورفکتانت |
سویه باکتری |
غلظت مهارکننده رشد |
غلظت کشنده رشد |
|
سودوموناس آئروژینوزا83 |
اشریشیا کلی |
63 |
250 |
|
استاف اورئوس |
125 |
125 |
|
|
استاف اپیدرمیس |
63 |
63 |
|
|
پروتئوس میرابیلیس |
1000 |
1000 |
|
|
سالمونلا تیفیموریوم |
250 |
500 |
|
|
سودوموناس آئروژینوزا |
250 |
500 |
بحث و نتیجهگیری
تعداد زیادی از باکتری و قارچها قادر به تجزیه زیستی آلایندههای نفتی هستند. این ارگانیسمها به طور گستردهای در مخازن نفتی و اکوسیستمهای آبی و خاکی پراکنده میباشند (14). بررسیها نشان داده است اگر چه امکان وجود باکتری با توان تجزیهکنندگی بالا در آبها و خاکهای بدون سابقه آلودگی قبلی با ترکیبات نفتی وجود دارد، ولی در اکثر پژوهشهای مشابه، به آب، خاکها و مناطقآلوده به نفت توجه میشود. چون که امکان یافتن میکروارگانیسمی با توان تجزیهکنندگی بالا در این مناطق بیشتر از مناطق غیرآلوده به ترکیبات نفتی است. در مطالعه ای که در بلغارستان توسط کانکووا و گالابووا [xxii] در سال 2002 انجام شد نیز جداسازی میکروارگانیسمها از مناطق آلوده (آبهای آلوده به پسابهای نفتی) گزارش شده است (15). اوکرنتوگبا و ازرونی[xxiii] باکتریهای تجزیهکننده نفت ازآبهای آلوده به نفت در اطراف پالایشگاه را جداسازی نمودند. (16). بولا[xxiv] در سال 2006 در نیجریه از ترکیبات ماسهای همراه با نفت سنگین که به شکل کلوخ درآمده بودند باکتریهایی جداسازی کرد که در تجزیه نفت خام بسیار موثر عمل میکردند. این باکتریها بیشتر از جنس سودوموناس بودند. از آنجایی که باکتریهای مولد بیوسورفکتانت در تجزیه نفت موثرتر عمل میکنند، از بین باکتریهای جدا شده سویههای مولد بیوسورفکتانت انتخاب شدند (17).
در مطالعاتی که با هدف جداسازی باکتریهای مولد بیوسورفکتانت از منابع محیطی انجام شده به طور معمول از بررسی فعالیت همولیتیک به عنوان معیاری برای جداسازی اولیه سویههای مولد بیوسورفکتانت استفاده شده است (11). به طوری که در مطالعاتی مشابه که طباطبایی در سال 2005 و آناندارج[xxv] در سال 2010 برای جداسازی باکتریهای مولد بیوسورفکتانت انجام دادند از فعالیت همولیتیک برای جداسازی اولیه استفاده شد (7 و10).
با توجه به بررسیهای انجام شده، راه دیگر غربالگری فعالیت امولسیونسازی است. فعالیت امولسیفیهکنندگی یک امولسیفایر به تمایل آن نسبت به سوبسترای هیدروکربنی استفاده شده برای اندازهگیری EC بستگی دارد. نتایج آزمایش امولسیونسازی (E24) به دست آمده برای سویههای غربال شده از مرحله قبل مطابق جدول 1 بود. نتایج به دست آمده در این تحقیق، از نتایج گزارش شده در مطالعات مشابه توسط بودوئر[xxvi] و همکاران در سال 2004 (4)، فرنسی[xxvii] و همکاران در سال 1991 (9) و بیکا[xxviii] وهمکارانش در سال 1999 (18)، بهتر و چشمگیرتر است. اما یکی دیگر از فعالیتهای غربالگری کشش سطحیست. از آنجایی که کاهش کششسطحی محیط رشد، مهمترین و اصلیترین معیار برای اثبات تولید بیوسورفکتانت محسوب میشود به همین دلیل در این تحقیق، پس از غربالگری اول و دوم و کاهش تعداد سویههای باکتری انتخاب شده، از این آزمایش برای بررسی و تائید توان این سویهها در تولید بیوسورفکتانت استفاده شد. مطالعات مشابهی در این زمینه توسط بنت[xxix] در سال 1991 و طباطبایی در سال 2005 برای جداسازی باکتریهای مولد بیوسورفکتانت انجام شد (10 و 19). اما یکی از قابلیتهای جالب توجه باکتریهای مولد بیوسورفکتانت، توانایی آنها در ازدیاد برداشت میکروبی نفت از مخازن نفتی است. ازدیاد برداشت میکروبی نفت یک روش سوم ازدیاد برداشت است که با وجود برخوردار بودن از قدمت وسابقه تاریخی طولانی، به تازگی مورد توجه فراوان قرار گرفته است. مکانیسمهایی که برای ازدیاد برداشت نفت بهوسیله میکروارگانیسمها پیشنهاد شدهاند بسیار پیچیده، متنوع و فراوان هستند اما بدون شک تولید بیوسورفکتانت و کمکردن کششسطحی و کاهش قدرت مویینگی یکی از دلایل اصلی افزایش تولید نفت توسط میکروارگانیسمها به شمار میرود (1 و 20).
علاوه بر این، در تحلیل عصاره حاصل از کشت سویه سودوموناس آئروژینوزا83، لکه به دست آمده بر روی صفحه کروماتوگرافی لایه نازک در اثر اسپری با معرف نانیهیدرین، تولید رنگ قهوهای، و با اسپری با معرف آنترون تولید رنگ زرد میکرد که نشان میدهد که عصاره بیوسورفکتانت سویه حاوی ترکیبات لیپیدی و کربوهیدراتی است. در مطالعهای که توسط طباطبایی و همکاران در سال 2005، آناندارج و همکاران و روسا و همکاران[xxx] در سال 2010 انجام شده، ماهیت بیوسورفکتانت که بهوسیله آنها جداسازی شده بود نیز کاملاً مشابه با نتایج حاصل از سویه سودوموناس آئروژینوزا83، گزارش شده است (7، 10 و20).
اما یکی دیگر از کاربردهای بیوسورفکتانتها فعالیت ضدمیکروبی آنهاست. هر روزه مقاومت باکتریها در برابر آنتی بیوتیکها بیشتر میشود. تحقیق در مورد کشف مواد جدید با خواص ضدمیکروبی قویتر همپای افزایش مقاومت در باکتریها رو به گسترش است و از این رو بیوسورفاکتانت یک جایگزین مناسب برای داروهای ترکیبی هستند و عوامل ضد میکروبی و عوامل موثر درمانی یا پروبیوتیک به عنوان ایمنی (بیخطر) بویژه در زمانی که مقاومت در برابر داروها در میان ارگانیسمها برای بسیاری از بیماریهای تهدیدکننده زندگی رو به افزایش است میتواند استفاده شود؛ که به عنوان یک انتخاب مناسب برای این نوع تحقیقات به شمار میروند. بیوسورفکتانتها با اثرات ضدمیکروبی بر روی طیف گستردهای از ارگانیسمها و همچنین، قابلیت مصارف غذایی آنها در برخی موارد وکمتر بودن اثرات جانبی آنها نسبت به آنتی بوتیکهای رایج میتوانند در برخی موارد جایگزین آنتی بیوتیکها شوند (21).
در راستای بررسی اثرات ضدمیکروبی بیوسورفکتانتها، اثرات ضدباکتریایی بیوسورفکتانتکه در مصارف غذایی و آرایشی و بهداشتی نیز استفاده میشود، بر روی 6 باکتری مختلف عفونتزا به ویژه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس که هم ایجاد کننده مسمومیتهای غذایی و هم یکی از باکتریهای مهم در ایجاد عفونتهاست همچنین، بر روی سودوموناس آئروژینوزا که از مقاومترین باکتریها و بیماریزاست ارزیابی شدند. به این شکل که بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83در رقتهای بالا بر رشد پروتئوس میرابیلیس، سالمونلا تیفیموریوم، سودوموناس آئروژینوزا و اشریشیا کلی اثر مهارکنندگی و کشندگی داشت که نشان دهنده اثر آنتیباکتریال قوی این بیوسورفکتانت بر روی این باکتریهاست. همچنین، عصاره بیوسورفکتانت سودوموناس آئروژینوزا83 بر روی استافیلوکوکوس اورئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیس هم اثر باکتریوسیدال و هم باکتریواستاتیک داشت که اعداد نزدیک به هم حداقل غلظت مهار کننده وحداقل غلظت کشنده نیز نشان دهنده اثر قوی باکتریوسیدال بیوسورفکتانت بر این باکتریهاست. در بررسی مطالعات مشابه، تحقیقات کمی بهویژه در ایران در مورد خواص ضد میکروبی بیوسورفکتانتها انجام شده و یا دراین مطالعات در مورد جزئیات ویژگیهای آنتی باکتریالی از جمله به نتایج هالههای عدم رشد اشاره نشده است با این حال برخی از بیوسورفکتانتهای دکاپپتیدی حلقوی جدید از گونههای سودوموناس جدا شدند، که در شرایطآزمایشگاهی فعالیت ضدمیکروبی بر علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آویوم داخل سلولی یافت شد (22). وتسا و همکاران[xxxi] در سال 2010 گزارش دادند که رامنولیپیدها جدا شده از سودوموناس دارای فعالیت ضد باکتریایی بر علیه باکتری گرم منفی؛ سودوموناس آئروژینوزا و باکتری گرم مثبت؛ استافیلوکوکوس بودند (23). همچنین، فعالیت ضدمیکروبی بر اساس مقادیر حداقل غلظت مهارکنندگی بیوسورفکتانت رامنولیپید از سودوموناس AT10 بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی، مخمر، و سویههای قارچ به دست آمده است. که با نتایج این پژوهش مشابه است (24). با این حال وجودبرخیتفاوتهادر میزاناثراتضدمیکروبیمشاهدهشدهدراینمطالعهو تحقیقاتمشابهمیتواندبهدلیلتفاوتسوبستراهایمختلف برای رشد باکتریتولیدکنندهبیوسورفکتانت،استفادهازروشهای مختلفبرایاستخراجوسایر... باشد.تفاوتدراثراتضد میکروبینشاندهنده تفاوتهای موجود در ترکیبات بیوسورفکتانتهاست.
با توجه به نتایج این تحقیق میتوان گفت که این باکتری دارای پتانسیل فراوانی برای کاربردهای بیوتکنولوژی و زیست محیطی است. بنابراین، ما میتوانیم در مورد استفاده از آن در آینده به عنوان اجزا تشکیلدهنده چندمنظوره فکرکنیم. بنابراین، با وجود پتانسیل بسیار زیاد بیوسورفاکتانتها در این زمینه، استفاده از آنها هنوز محدود است. شاید دلیل آن هزینههای تولید کمابیش بالا و همچنین، اطلاعات اندکی درمورد سمیت آنها نسبت به سیستمهای انسانی است با وجود این، تقاضای استفاده از آنها به شکل مکملهای غذایی، موادآرایشی و محصولات دارویی نشاندادن علاقه زیاد به استفاده از این محصولات میکروبی به دستآمده است.
[1]. Sorbitan
[2]. Strenghted Nutrient Broth
[3]. rpm
[4]. Mineral Salt Solution
[5]. Yeast extract
[6]. Strenghted Nutrient Agar
[7]. Pour Plate
[8]. Glucose Yeast extract Agar
[9]. EMB
[10]. Vortex
[11]. Tensiometer-Kruess Klot
[12]. Triple Sugar Iron Agar
[13]. Sulfide Indole Motility
[14]. Methyl Red- Voges Proskauer
[15]. DMSO
[16]. Ninhydrin
[17]. Anthrone
[18]. Disk diffusion
[19]. Kirby Bauer
[20]. Muller hinton agar
[21]. Clinical and Laboratory Standards Institute
[xxii]. Tonkova & Galabova
[xxiii]. Okerentugba and Ezeronye
[xxiv]. Bola
[xxv]. Anandaraj
[xxvi]. Bodour
[xxvii]. Francy
[xxviii]. Bicca
[xxix]. Banat
[xxx]. Rosa et al
)