نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران،
2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران
3 استادیار بیوشیمی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران
4 استادیار قارچشناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد خوراسگان، اصفهان، ایران
5 استادیار بیوفیزیک مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Diverse groups of microscopic fungi are able to degrade polymeric plant tissues such as pectin. Biodegradation of these materials are mostly applicable in food industries. Materials and Methods: In the present study, the exopectinase producing fungus was isolated from decaying tangerine and its exopectinase activity was studied in submerged fermenting condition. Also, the enzyme production of the isolated fungus was compared to the industrial fungus, Aspergillus niger PTCC 5013. The exopectinase production and activity of the extracted enzyme solution with respect to pH, temperature, activity timing and substrate concentration were scrutinized. Results: According to the morphological macroscopic and microscopic features, the isolated fungus was identified as the genus Monilia in the Moniliaceae family. The best exopectinase production was in pH 7 and the best enzyme activity achieved at 50°C, in 30 to 40 minute, 1.5% substrate and the 1:1 of the enzyme solution to the substrate solution ratio. The isolated fungus, Monilia, was fast growing and produced highly active exopectinase enzyme. In optimum condition, its exopectinase activity was 20 units higher than the fungus Aspergillus niger PTCC 5013. Discussion and Conclusion: The exopectinase enzyme was active in a wide ranges of pH and temperatures. As Monilia does not produce toxic compounds, it is proposed for pectinase production, especially in the food industries.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
خصوصیت مشخص دیواره گیاهان، سختی و تجزیهناپذیری آن است. این ساختار برای گیاه نقش استحکام و حفاظت دارد. دیواره سلولی گیاهان دارای سه لایه داخلی، دیواره سلولی اولیه و دیواره سلولی ثانویه است. ترکیب اولیه این دیواره شامل سلولز، همی سلولز، پروتئینهای محلول مختلف و پکتین است. پکتین خانواده متنوعی از پلیساکاریدهاست که بخش عمده دیواره سلولی اولیه و لایه داخلی را تشکیل میدهد (1 و 2). ساختار مولکولی پکتینهای گیاهی تا حدودی پیچیده است و از مولکولهای D– گالاکتورونیک اسید تشکیل شده است که با پیوندهای α (1→4) گلیکوزیدی به هم متصل شده اند. گروههای کربوکسیل نسبتا استری هستند و با گروههای اسیدی میتوانند تا حدی استیله باشند (3). منابع مختلفی مانند پوست ترنج، پوست لیمو، پوست پرتقال، کدوتنبل، چغندر قند، قسمت گوشتی سیب، پوست نخودفرنگی، گریپ فورت و سبوس گندم سرشار از پکتین هستند (4 و 5).
انواع آنزیمهای تجزیه کننده پکتین شامل: پکتین لیاز، پکتین، متیل استراز، اگزوپلیگالاکتوروناز (اگزوپکتیناز)، اندوپلیگالاکتوروناز (اندوپکتیناز) و رامنوگالاکتوروناز میشوند که هر کدام بر روی قسمتهای مختلف زنجیره در انواع متفاوت پکتین مؤثرند (1). پکتینازها در فرآیندهای صنعتی، نظیر: نساجی، فرآوری فیبرهای گیاهی، چای، قهوه، استخراج روغن، تیمار پسابهای صنعتی و تولید کاغذ استفاده میشوند. گستردهترین کاربرد صنعتی پکتیناز در استخراج و شفافسازی آبمیوه است (6). تولید پکتینازها بهوسیله میکروارگانیسمها در سیستمهای بستر جامد و غوطهور معمولاً تحت تأثیر ترکیبات محیط کشت، بویژه منابع کربن و نیتروژن و شرایط فیزیکی شیمیایی نظیر اسیدیته، دما و هوادهی قرار دارد. اگزوپکتیناز قطعات کوچکی را از زنجیره پکتین آزاد میکند. این آنزیم بر خلاف اندوپکتیناز، ویسکوزیته را به طور قابل توجهی کاهش نمیدهد، اما در تجزیه نهایی پکتین نقش مهمی دارد (7). هدف از مطالعه حاضر جداسازی قارچ تجزیهکننده پکتین از میوههای درحال فساد در ایران بوده است که فعالیت آن قابل مقایسه با نمونه صنعتی باشد و بتوان آن را برای استفاده در صنایع تولید غذا به طور اولیه پیشنهاد کرد. همچنین، شرایط تولید و فعالیت اگزوپکتینازی قارچ جداسازی شده در شرایط تخمیر غوطهور از نظر اسیدیته، دما، زمان فعالیت و غلظت سوبسترا بهینهسازی شود.
مواد و روشها
میکروارگانیسمها
نمونه قارچی از نارنگی در حال فساد بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار (SDA)جداسازی شد و در دمای 28 درجه سانتیگراد انکوبه شد. قارچ جداسازی شده پس از خالصسازی از طریق مقایسه خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی با کلید شناسایی، در حد جنس شناسایی شد (8). نمونه کلکسیونی قارچ PTCC5013 Aspergillus niger نیز از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه و پس از تأیید گونه، برای مقایسه فعالیت اگزوپکتینازی استفاده شد.
کشت و تولید آنزیم
از روش کشت تخمیری غوطهور در محیط کشت حاوی ترکیبات منبع کربن (10 گرم سبوس گندم و 15/0 گرم تفاله پرتقال)، 6 گرم سولفات آمونیوم ، 6 گرم دی هیدروژن پتاسیم فسفات، 6 گرم هیدروژن دی پتاسیم فسفات و 1/0 گرم منیزیم سولفات در لیتر استفاده شد. محیط کشت در دمای 120 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه استریل شد و پس از تلقیح 107×65/1 اسپور قارچ به ازای هر 100 میلیلیتر محیط کشت، تخمیر در دمای 30 درجه سانتیگراد با هم زنی 140 دور در دقیقه انجام گرفت (9).
سنجش اگزوپکتیناز
فیلتره محیط کشت به مدت 20 دقیقه در دمای 10 درجه سانتیگراد با دور 10000 در دقیقه سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت حاصل بهعنوان محلول آنزیمی با همان حجم از محلول سوبسترا حاوی 5/0 درصد پکتین در استات سدیم 2 مولار با اسیدیته 6 مخلوط شد و در 50 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه قرار گرفت. فعالیت آنزیم با استفاده از روش میلر[i] بر اساس سنجش میزان گالاکتورونیک اسید آزاد شده با استفاده از معرف دی نیتروسالیسیلیکاسید سنجش شد. جذب نوری رنگ ایجاد شده در طول موج 540 نانومتر خوانده شد و با منحنی استاندارد گالاکتورونیک اسید مقایسه شد. هر میکرومول قند آزاد شده در هر دقیقه فعالیت آنزیم بهعنوان یک واحد فعالیت در نظر گرفته شد (10). تنها سوبسترای مورد استفاده برای فعالیت آنزیم در شرایط این بررسی، پکتین بوده است و حاصل تجزیه این پلیمر با آنزیم اگزوپکتیناز، قند احیای دی گالاکتورونیکاسید است، بنابراین، میزان قند احیای آزاد شده به عنوان معیار فعالیت آنزیم در نظر گرفته شد. همه مراحل بالا به طور همزمان بر روی قارچAspergillus nigerنیز انجام شد که فعالیت بالای پکتینازی آن اثبات شده است. شایان ذکر است که پکتین از شرکت سیگما[ii] و سایر مواد مورد استفاده در پژوهش از شرکت مرک[iii] تهیه شد.
بهینهسازی تولید و فعالیت آنزیم در قارچ جداسازی شده
به محیطهای کشت با مقادیر مختلف اسیدیته، 107×65/1 اسپور قارچ به ازای هر 100 میلیلیتر محیط کشت تلقیح شد و میزان تولید آنزیم بررسی شد. برای بهینهسازی فعالیت آنزیم دماهای 35 تا 65 درجه سانتیگراد، زمان 10 تا 40 دقیقه، غلظت سوبسترای 2/0 تا 8/1 درصد و نسبت محلول آنزیمی به محلول سوبسترا به میزان 3/0 تا 5/2 بررسی شد. آزمایشها در سه تکرار انجام شد و میانگین نتایج با استفاده از نرم افزارSPSS12به دست آمد.
نتایج
میکروارگانیسم جداسازی شده
قارچ جداسازی شده بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار کلنیهای زرد رنگ با ظاهر موکوئیدی و پرزدار ایجاد کرد (شکل 1). همچنین، در بررسی میکروسکوپی به صورت میسلیومهای کوتاه دیواردار و شبه مخمری با سلولهای جوانهزن و کلامیدوکنیدیهای بیضوی و کنیدیوفورهای کوتاه مشاهده شد (شکل 2) و بر اساس مقایسه با کلید شناسایی در جنسMoniliaازخانوادهMoniliaceaeقرار گرفت.
شکل 1- مورفولوژی قارچ Monilia بر روی محیط کشت سابرود دکستروز آگار. کلنیهایی با ظاهر موکوئیدی و پرزدار از مشخصات این قارچ است. شایان ذکر است کلنی به رنگ زرد مشاهده شد.
شکل 2- مورفولوژی میکروسکوپی قارچ Monilia در رنگآمیزی با متیلن بلو، مشاهده شده با بزرگنمایی 400 برابر. میسلیومهای کوتاه دیواره دار، سلولهای جوانهزن مخمری و کلامیدوکنیدیهای بیضوی با کنیدیوفورهای کوتاه از مشخصات این قارچ است.
تولید آنزیم
فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia در روزهای اول تا ششم پس از تلقیح در مقادیر مختلف اسیدیته رشد اندازهگیری شد. بهترین تولید آنزیم در اسیدیته 7 در روز دوم کشت به دست آمد (شکل 3). این فعالیت معادل 55 واحد در دقیقه بود. در همین شرایط بیشترین تولید آنزیم در قارچ Aspergillusniger در اسیدیته 6 در روز دوم کشت و برابر با 35 واحد در دقیقه به دست آمد (شکل 4).
شکل 3- فعالیت روزانه (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز تولید شده به وسیله قارچ Monilia در روزهای مختلف و مقادیر متفاوت اسیدیته.
شکل 4- فعالیت روزانه (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز تولید شده به وسیله قارچ Aspergillusniger در روزهای مختلف و مقادیر متفاوت اسیدیته.
بهینهسازی فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia
همانطور که در نمودار شکلهای 5 و 6 مشاهده میشود، بیشترین فعالیت آنزیم در دمای 50 درجه سانتیگراد و 5/1 درصد پکتین به عنوان سوبسترا به دست آمد. همچنین، بالاترین فعالیت آنزیم بر اساس میزان آزادسازی قند د-گالاکتورونیک اسید در زمان 30 تا 40 دقیقه مشاهده شد (شکل 7).
شکل 5- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در دماهای مختلف.
شکل6- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در غلظتهای مختلف سوبسترای پکتین.
شکل 7- میزان آزادسازی قند د-گالاکتورونیک اسید (میکرومول) در زمانهای مختلف فعالیت اگزوپکتیناز قارچ Monilia بر روی سوبسترای پکتین 5/1 درصد.
در مطالعه نسبت آنزیم به سوبسترا نیز مشخص شد بیشترین فعالیت اگزوپکتینازی در نسبت 1 به 1 آنزیم به سوبسترا وجود دارد (شکل 8).
شکل8- فعالیت (واحد در دقیقه) اگزوپکتیناز قارچ Monilia در نسبتهای مختلف محلول آنزیمی به سوبسترای پکتین.
قارچ Monilia جداسازی شده در روز دوم کشت و در اسیدیته 7 فعالیت اگزوپکتینازی بالاتری (به میزان 20 واحد) نسبت به سویه شناخته شده PTCC5013 Aspergillusniger نشان داد (جدول 1).
جدول 1- مقایسه تولید اگزوپکتیناز در مقادیر مختلف اسیدیته در روز دوم به وسیله قارچهای Monilia و Aspergillusniger.
فعالیت آنزیم تولید شده به وسیله قارچ Aspergillusniger (واحد در دقیقه) |
فعالیت آنزیم تولید شده به وسیله قارچ Monilia (واحد در دقیقه) |
مقادیر مختلف اسیدیته محیط رشد |
5/6 |
2/3 |
اسیدیته 5 |
0/35 |
1/20 |
اسیدیته 6 |
0/32 |
0/55 |
اسیدیته 7 |
0/10 |
5/48 |
اسیدیته 8 |
بحث و نتیجهگیری
آنزیمهای تجزیهکننده پکتین به وسیله قارچهای مختلف تولید میشوند. در میان این قارچها توجه خاصی به جنسهای آسپرژیلوس و پنی سیلیوم شده است (11 و 12). اکافور و همکاران[iv] از دو قارچ Aspergillusniger و پنی سیلیوم پکتینازهایی را با منابع مختلف پسماند کشاورزی (پوست آناناس، پوسته پرتقال، خاک اره، پالپ نیشکر و سبوس گندم) تولید کردند. بالاترین فعالیت پکتینازی در هر دو قارچ بر روی سبوس گندم مشاهده شد و کشت غوطهور پس از 48 ساعت بهترین نتیجه را برای هر دو قارچ داشت (9).
قارچ Monilia از نظر خصوصیات میکروسکوپی بسیار مشابه Candida است، به طوری که قبلاً در این جنس قرار میگرفته است. همچنین، برخی مواقع ممکن است مشابه جنس Cladosporium به نظر برسد، اما با بررسی خصوصیات میکروسکوپی کلامیدوکنیدیها و میسلیومهای تشکیل شده، میتوان آن را به وضوح تشخیص داد. قارچ جداسازی شده در این تحقیق از طریق مقایسه با کلیدهای تشخیصی شناسایی شد (8).
گیتا و همکاران[v] در سال 2012 از پسماند پوست میوهها در محیط کشت جامد و غوطهور برای تولید آنزیمهای پکتینولیتیک پکتین استراز و پکتات لیاز از باکتریها و قارچها استفاده کردند. بهترین تولید، از باکتری جنس Bacillus و قارچ Aspergillus به دست آمد (13). در پژوهشی که در سال 2012 توسط ردی و اسریرامولا[vi] بر روی چندین قارچ صورت گرفت، سه گونه از Aspergillus شامل A.niger، A.flavus و A.japonicus و گونه Chaetomiumglobosum توانایی بالایی در تولید پکتیناز در محیط کشت غوطهور از خود نشان دادند. فعالیت آنزیم بر اساس قطر منطقه تجزیه ترکیبات پکتیکی در محیط کشت جامد اندازهگیری و مقایسه شده است. دمای بهینه فعالیت آنزیم 30 درجه سانتیگراد تعیین شده است و آنزیم در 8/6 اسیدیته بیشترین فعالیت را داشته است (14)
در مطالعه حاضر مشخص شد، این قارچ در روز دوم کشت و در اسیدیته 7 فعالیت اگزوپکتینازی بالاتری نسبت به سویه شناخته شده PTCC5013 Aspergillusniger نشان میدهد (جدول 1). اختلاف در اسیدیته بهینه فعالیت آنزیم میتواند به علت تنوع ایزوآنزیمهای تولید شده به وسیله قارچهای مختلف باشد. نکته مهم این است که قارچ جداسازی شده در این مطالعه در محدوده اسیدیته 6 تا 8 تولید آنزیم قابل قبولی را دارد و آنزیم تولید شده در دماهای 35 تا 65 درجه سانتیگراد فعالیت میکند. بنابراین، میتوان در شرایط مختلف از نظر اسیدیته و دما از آن استفاده کرد.
قارچ Monilia اخیراً از جنس کاندیدا جدا شده و به عنوان یک قارچ ساپروفیت، فعالیت پکتینازی آن شناسایی و بررسی شد (15). در مطالعه حاضر، پس از جداسازی قارچ Monilia ابتدا تولید آنزیم آن با قارچ صنعتیPTCC5013 Aspergillusniger مقایسه شد. بیشترین فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia معادل 55 واحد بر اساس میکرومول قند آزاد شده در دقیقه بود؛ که در اسیدیته 7 به دست آمد. بالاترین فعالیت آنزیم در دمای 50 درجه سانتیگراد، 5/1 درصد پکتین به عنوان سوبسترا ، مدت زمان 30 تا 40 دقیقه و نسبت یک به یک محلول آنزیمی به محلول سوبسترا مشاهده شد، در حالیکه در قارچ Aspergillusniger بالاترین میزان تولید آنزیم در اسیدیته 6 و معادل 35 واحد در دقیقه به دست آمد. بنابراین، فعالیت اگزوپکتینازی قارچ Monilia جداسازی شده از نارنگی نسبت به قارچ شناخته شده Aspergillusniger 20 واحد بالاتر بود. قارچ Monilia در محدوده وسیعی از اسیدیته قادر به تولید اگزوپکتیناز بود و آنزیم تولید شده با سرعت بالا و در محدوده وسیعی از دما فعالیت میکرد. این قارچ ترکیبات سمی نیز تولید نمیکند (8). بنابراین، به عنوان جایگزین مطلوب برای تولید آنزیم پکتیناز در کشت غوطهور، به ویژه در صنایع غذایی پیشنهاد میشود.