تولید هیدروژن زیستی توسط میکروارگانیسم‌ها و آنزیم‌های خارج سلولی: انرژی پاک

مقدمه
نیاز روزافزون به انرژی و همزمان با آن کاهش منابع سوخت‌های فسیلی، دولت‌ها را مجبور به یافتن جایگزین‌هایی برای این نوع سوخت‌های متداول کرده است. انرژی‌های تجدید‌پذیری همچون انرژی‌های زیستی می‌توانند از جنبه‌های مختلف ازجمله تأمین امنیت انرژی، تجدیدپذیری و تولید پایدار و حفظ سلامت محیط زیست درخور توجه قرار بگیرند و جایگزین سوخت‌های فسیلی شوند؛ ازجمله انرژی‌های زیستی می‌توان به اتانول زیستی، بیوگاز، دیزل زیستی و هیدروژن زیستی اشاره کرد (1-5و46). اتانول زیستی از منابع ارزان قیمت زیادی تولید می‌شود (1و2). هیدروژن زیستی همان هیدروژنی است که در اثر فرایندهای زیستی به وجود می‌آید و یکی از پاک‌ترین منابع انرژی مطرح در جهان است. هیدروژن زیستی دانسیته انرژی بالایی دارد و در صورت احتراق تنها بخار آب تولید می‌کند؛ بنابراین، برخلاف سایر سوخت‌های متداول آثار سوء محیط زیستی ندارد. همچنین بسیاری از مواد زائد (زباله‌های جامد و صنعتی، لجن فاضلاب شهری، پسماندهای حاصل از صنایع دام و طیور و ...) قابلیت تبدیل‌شدن به هیدروژن زیستی را دارند که این نیز می‌تواند در از بین بردن بسیاری از آلودگی‌های زیست‌محیطی کمک‌کننده باشد. به همین دلیل است که توجه روزافزونی در زمینة تولید هیدروژن به وجود آمده است (شکل 1)؛ با وجود این، مشکلات و محدودیت‌هایی در استفاده از این سوخت در مقیاس صنعتی وجود دارد. در این مقاله، فرایندهای اصلی دخیل در تولید هیدروژن زیستی، میکروارگانیسم‌ها و آنزیم‌های دخیل در تولید هیدروژن زیستی، منابع مورد استفاده، محدودیت‌ها و چشم‌انداز این سوخت زیستی با استفاده از جدیدترین مقالات در این زمینه مرور خواهد شد.

.فرایندها و میکروارگانیسم‌های دخیل در تولید هیدروژن زیستی: هیدروژن می‌تواند با استفاده از روش‌های غیر‌زیستی ازجمله الکترولیز آب یا استفاده از سوخت‌های فسیلی با اکسیداسیون جزئی هیدروکربن یا فرایند گازی‌سازی تولید شود؛ اما این روشها علاوه بر ایجاد گازهای گلخانه‌ای و آلودگی‌های زیست‌محیطی، ازنظر اقتصادی نیز مقرون‌به‌صرفه نیستند. تولید هیدروژن توسط فرایندهای زیستی به چند صورت انجام می‌شوند (شکل 2):
 
 
شکل 1- الف) میزان انتشارات در زمینة هیدروژن زیستی در سال. از این تعد اد 70 درصد مقالات تحقیقاتی، 5/11 درصد مقالات کنفرانسی و 10 درصد مقالات مروری هستند. ب) کشورهای پیشرو در انتشار مقالات در این زمینه. (نمودارها براساس اطلاعات موجود در پایگاه داده اسکوپوس  رسم شده‌اند)

 
1- بیوفتولیز (مستقیم و غیرمستقیم)، 2- تبدیل میکروبی آب – گاز، 3- تخمیر نوری، 4- تخمیر تاریکی و 5- الکترولیز میکروبی. از بین این موارد، فرایندهای بیوفتولیز و تخمیر نوری وابسته به نور هستند. فتولیز مستقیم و غیرمستقیم، هیدروژن خالص‌تری را نسبت به فرایندهای تخمیر در تاریکی و تخمیر در روشنایی تولید می‌کنند و هیدروژن زیستی تولید‌شده در این دو فرایند اخیر علاوه بر هیدروژن و دی‌اکسیدکربن، محتوی گازهای دیگری ازجمله متان، مونوکسیدکربن، سولفید هیدروژن، آمونیاک با مقادیر کمتری نیز هستند که انجام پروسه‌های خالص‌سازی گسترده‌تری را می‌طلبد. فرایندهای نیازمند به نور در فتوبیوراکتورها  و فرایندهای تخمیری در تاریکی در فرمانتورها  انجام می‌شوند. مکانیسم کلی هرکدام از این روش‌ها عبارت‌اند از:
 

فتولیز مستقیم    
2H2O + انرژی نورانی                                                                            2H2 + O2

H+ + e- + ATP                                                                                             H2 + ADP + Pi

فتولیز غیرمستقیم    
6CO2+6H2O+ انرژی نورانی                                                           C6H12O6+6O2

C6H12O6 + 6H2O                                                                               12H2 + 6CO2

تخمیر نوری    

C6H12O6 + 12H2 + انرژی نورانی                                                             12H2 + 6CO2

تخمیر تاریکی    
2CO2 + 4H2 + 2CH3COOH C6H12O6 + 2H2O                                                        

الکترولیز    

C6H12O6 + 2H2O                                              4H2 + 2CO2 + 2CH3COOH

تبدیل میکروبی آب- گاز    

CO + H2O                                                  H2 + CO2                      

 
باکتری‌های مختلفی که می‌توانند در تولید هیدروژن زیستی شرکت کنند، به‌طور خلاصه در شکل 2 آورده شده‌اند.
 

شکل 2- انواع میکروارگانیسم‌های دخیل در تولید هیدروژن زیستی

 
بیوفتولیز : بیوفتولیز با دو روش بیوفتولیز مستقیم و بیوفتولیز غیرمستقیم و با استفاده از نور خورشید انجام می‌شود. اما کارایی این فرایند در تولید هیدروژن پایین است. حجم کم تولید هیدروژن و حساسیت آنزیم‌های دخیل در تولید هیدروژن زیستی در این روش از مشکلاتی است که برای استفاده از این دسته از فرایندها در مقیاس صنعتی وجود دارد. هیدروژنازها می‌توانند الکترون‌ها را از منابع متابولیکی متفاوتی دریافت کنند (7). 
تولید مستقیم هیدروژن از آب با استفاده از انرژی نور خورشید و به‌واسطة سیستم‌های زیستی، بیوفتولیز مستقیم  نامیده می‌شود. در خلال فاز نوری، یک زنجیره انتقال الکترون به وجود می‌آید و ابتدا فتوسیستم II و سیتوکروم‌ها و سپس فتوسیستم I در این پروسه دخیل‌اند. در فتوسیستم II با شکست مولکول آب، اکسیژن و الکترون‌ها تولید می‌شوند که در شرایط نوری می‌توانند به فردوکسین برسند و برای تثبیت کربن استفاده شوند. در شرایط بی‌هوازی، نبود اکسیژن محیط مناسبی برای بیان هیدروژنازها به وجود می‌آورد و شروع به دریافت الکترون‌ها‌ی فتوسنتزی می‌کند که این فرایند بیوفتولیز مستقیم نام دارد. به عبارت دیگر، این الکترون‌ها در خلال فتوسیستمI  این زنجیره انتقال الکترون را ترک می‌کنند و به گیرندة نهایی فردوکسین (Fd) می‌رسند. در شرایط بی‌هوازی، فردوکسین قادر به تحویل این الکترون‌ها به آنزیم دهیدروژناز است که این آنزیم می‌تواند با احیای یون هیدروژن تولید گاز هیدروژن کند. جلبک تک‌سلولی کلامیدوموناس رینهاردی با مکانیسم فتولیز مستقیم، با کارایی 22 درصد قادر به تبدیل انرژی نورانی به هیدروژن مولکولی در شرایطی است که فشار اکسیژن پایین (زیر 1/0 درصد) و شدت نور کم حکم‌فرما است. یکی از محدودیتهای این روش تولید اکسیژن (محصول جانبی فتوسیستم II) است که اثر ممانعتی قوی بر بیان ژن، پایداری mRNA و کاتالیز آنزیمی دارد. استراتژی‌های مختلفی برای غلبه به محدودیتهای این روش در مسیر تولید کارآمد هیدروژن زیستی انجام گرفته است؛ ازجمله افزایش تحمل اکسیژن در هیدروژنازها با مهندسی ژنتیک، کنترل سطح اکسیژن در رنج مدنظر برای نیتروژنازها و هیدروژنازها با مهار به وجود آمدن اکسیژن و به خدمت گرفتن پروتئینهای متصل‌شونده به اکسیژن. گرسنگی منیزیم یا سولفور می‌تواند باعث غیرفعال‌سازی فتوسیستم  IIو درنتیجه کاهش تولید اکسیژن و افزایش تولید هیدروژن شود. 
بیوفتولیز غیرمستقیم  در دو مرحلة متوالی تولید کربوهیدرات‌ها با فتوسنتز و به دنبال آن، تخمیر کربوهیدرات برای تولید هیدروژن انجام می‌شود. بدین ترتیب، در بیوفتولیز غیر‌مستقیم، الکترون‌های لازم برای تولید هیدروژن از منبع متابولیکی متفاوتی، برای مثال از شکسته‌شدن کربوهیدرات‌های کمپلکس ذخیره‌شده مانند نشاسته تأمین می‌شوند که درنهایت به فردوکسین می‌رسند و سپس در اختیار هیدروژناز قرار خواهند گرفت. این دو مرحله که یکی به تولید اکسیژن و دیگری به تولید هیدروژن منجر می‌شود، در بخش‌های مختلف سلول میکروبی و نیز در زمانهای مجزا انجام می‌شوند؛ بنابراین، این نوع فرایند می‌تواند راه‌حل طبیعی برای فائق‌آمدن بر یکی از محدودیتهای مهم در بیوفتولیز مستقیم باشد و از مهار هیدروژنازهای آهن‌دار با اکسیژن ممانعت کند. بیوفتولیز غیرمستقیم در جلبک‌ها و سیانوباکترهایی مانند آنابنا ، کالوتریکس ، اسپیرولینا  و سینکوکوکوس  و نیز باکتری ژئوباکتر  مطالعه شده است (8 و9).
تبدیل میکروبی آب - گاز : برخی از میکرارگانیسمهای مزوفیل و ترموفیل که کربوکسیدوتروف‌های هیدروژنیک  نامیده میشوند، ازجمله برخی باکتری‌های فتوهتروتروف متعلق به خانوادة رودواسپیریلاسه، از منوکسیدکربن به‌عنوان تنها منبع کربن در تاریکی استفاده می‌کنند و همراه با تولید انرژی قادر به تولید هیدروژن نیز هستند. انواعی از متالوآنزیمهای [NiFe]-هیدروژنازی در این فرایند دخیل‌اند. در این فرایند، مونوکسیدکربن توسط آنزیم [NiFe]-کربن منوکسید دهیدروژناز به دی‌اکسیدکربن اکسید می‌شود و آنزیم دیگر [NiFe]-هیدروژنازی دو پروتون را به‌واسطة الکترون‌های رها‌شده به یک مولکول هیدروژن احیا می‌کند. به عبارت دیگر، این فرایند بین میکروارگانیسم‌های ترموفیل و گرمادوست بیشتر انجام می‌شود که یک دلیل آن می‌تواند اثر تسهیل‌کنندة دما بر افزایش سرعت انتشار گاز باشد (6). باکتری‌های بسیاری شناسایی شده‌اند که قادر به پیشبرد این واکنش‌اند، شامل گونه‌های رودوباکتر ، رودواسپیریلوم رابرم ، روبریویواکس ژلاتینوسوس ، گونه‌های سیتروباکتر ، رودوسودوموناس پالوستریس  و باکتریهای گرمادوست ترمینوکولا کربوکسیدیفیلا ، ترموانائروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس ، کالدانائروباکتر سابترانئوس پسیفیکوس  و کربوکسیدوسلا پرتیناکس ، آرکی به شدت بی‌هوازی متانوسارسینا بارکری  و آرکیهای گرمادوست ترموکوکوس انورینئوس  و کالدری‌هابیتانس ماریتیموس . در میان اینها باکتریهای غیرگوگردی ارغوانی فتوسنتتیک مانند رودواسپیریلوم رابروم  و روبریویواکس ژلاتینوسوس به‌دلیل داشتن راندمان خوب در برداشت مونوکسیدکربن و راندمان بالا در تولید هیدروژن زیستی بسیار شایان توجه‌اند. روبریویواکس ژلاتینوسوس در شرایط تاریکی می‌تواند 100 درصد مونوکسیدکربن را مصرف و به هیدروژن تبدیل کند. باوجود پتانسیل این روش برای تولید هیدروژن زیستی، محدودیتهای زیاد باعث شده است فقط در سطح آزمایشگاهی انجام گیرد و استفادة آن در مقیاس صنعتی منوط به حل مشکلات و محدودیتهاست. در این سیستمها مونوکسیدکربن ماده اولیه است و این ماده برای همه سلولها سمی است؛ به همین دلیل در طراحی بسیاری از فرایندها فاز هوازی رشد و تولید تودة زیستی را از فاز بی‌هوازی تولید هیدروژن زیستی متمایز کرده‌اند. از پارامترهای مهم در این فرایند سرعت همزنی، غلظت مونوکسیدکربن ورودی، انتقال گاز در مایع و ... است (10-12).
تخمیر نوری : در این فرایند انواع مختلف سوبستراهای آلی و ترکیبات احیا‌شده مانند اسیدهای آلی (مالیک اسید، لاکتیک اسید، سوکسینیک اسید، استیک اسید، پروپیونیک اسید و بوتیریک اسید) در شرایط بی‌هوازی و روشنایی اکسید می‌شوند و دی‌اکسید‌کربن و هیدروژن تولید می‌کنند. نیتروژناز، آنزیم کلیدی این فرایند است که در شرایط نبود نیتروژن می‌تواند باعث تولید هیدروژن با استفاده از انرژی نورانی و ترکیبات احیا‌شده به‌عنوان دهندة الکترون و فردوکسین به‌عنوان ناقل الکترون باشد. راندمان این نوع فرایند با توجه به نوع منبع کربن می‌تواند بین 4 مول هیدروژن به‌ازای هر مول سوبسترا تا 12 مول هیدروژن باشد. باکتریهای فتوسنتزکنندة گوگردی سبز و ارغوانی، باکتریهای غیرگوگردی و برخی گونه‌های جلبکهای سبز قادر به انجام این دسته از فرایندها هستند؛ برای مثال، می‌توان به رودوباکتر کپسولاتوس ، رودوباکتر اسفروئیدس ، رودویولوم پالوستریس  و رودوسودوموناس سولفیدوفیلوم  اشاره کرد. از میکروارگانیسمهای فتوسنتتیک می‌توان به تنهایی یا با کشت همزمان باکتریهای فتوسنتتیک و تخمیرکننده استفاده کرد. در صورت استفاده از باکتریهای فتوسنتزکننده به تنهایی محدودیتهایی ازجمله سرعت پایین تولید هیدروژن زیستی، ممانعت سوبسترا و نیاز به نور زیاد وجود دارد؛ اما در صورتی که از سیستمهای مخلوط با کشت همزمان باکتریهای مولد هیدروژن در نور و تاریکی استفاده شود، اسیدهای آلی توسط مولدین هیدروژن تاریکی، تولید و به‌طور همزمان توسط مولدین هیدروژن در روشنایی مصرف می‌شوند؛ بنابراین، مهار سوبسترا از بین می‌رود و می‌توان به مقادیر بالاتری از هیدروژن دست یافت. برای کاهش قیمت تولید سوخت، می‌توان از منابع کربن ارزان قیمت یا مواد زائد سایر صنایع ازجمله خروجی تخمیر تاریکی استفاده کرد (13 و 14).
تخمیر تاریکی : از میان همه فرایندهای اشاره‌شده، این فرایند به‌دلیل سادگی عملکرد، راندمان بالا، انعطاف‌پذیری در کشت، تحقق همزمان تولید هیدروژن و مصرف ضایعات آلی و نیازنداشتن به نور امیدبخش‌تر بوده و توجهات زیادی را به خود جلب کرده است. در این فرایند سوبستراهای آلی مختلف در شرایط بی‌هوازی و تاریکی توسط باکتریهای بی‌هوازی اختیاری یا مطلق به هیدروژن تبدیل می‌شوند و انرژی مورد نیاز در این فرایند به‌جای نور خورشید از اکسیداسیون سوبستراهای آلی تأمین می‌شود. در این فرایند محصولات متابولیکی متنوعی تولید می‌شوند که مقدار و ترکیب آن با توجه به نوع میکروارگانیسم و شرایط فرایند متفاوت است. کربوهیدراتها منبع کربن ترجیحی برای فرایند تخمیر هستند. روشهای زیادی برای افزایش مؤثر تولید هیدروژن در این دسته از فرایندها بررسی شده است؛ ازجمله پیش‌تیمار سوبسترا با اسید / باز، اولتراسونیک و هیدرولیز آنزیمی، استفاده از تخمیر همزمان، مهندسی ژنتیک و افزودن مواد شیمیایی (ازجمله فلزات و اکسیدهای فلزی، نانوذرات و سایر فاکتورهای دارای اثرات سینرژیستی). افزودنیهای فلزی مانند سولفات آهن  می‌تواند به‌طور مؤثری تولید هیدروژن زیستی را افزایش دهد؛ برای مثال، انتروباکتر، اشرشیا کلای و کلستریدیوم، نمونه‌ای از باکتری‌هایی هستند که می‌توان در کشت‌های خالص برای تولید هیدروژن به کار برد. کلستریدیوم ترموسلوم  دارای سیستم آنزیمی سلولوزومی است و درنتیجه می‌تواند از سلولز به‌عنوان ماده اولیه تولید هیدروژن استفاده کند. کلستریدیوم استوبوتیلیکوم  یکی دیگر از گونه‌های مهم است که با تخمیر بوتیراتی، بازده هیدروژن تولیدی به میزان 5/3 میلی‌مول بر گرم دارد. کلستریدیوم زایلانولایتیکوم ، کلستریدیوم پاپیروسولونس ، کلستریدیوم بیجرینکی ، دسولفوویبریو دسولفوریکانس ، اتانولیژننز هاربیننس  و گونه‌های رومینوکوکوس  ازجمله دیگر باکتریهای دخیل در تولید هیدروژن زیستی‌اند (15). در جدول 1 به‌طور خلاصه مقایسة فرایند‌های تخمیر در تاریکی و روشنایی ذکر شده است.
 

جدول 1- مقایسة فرایندهای تخمیر در تاریکی و تخمیر نوری برای تولید هیدروژن زیستی
رفرنس    تخمیر نوری    تخمیر تاریکی
(16)
استفاده از سوبستراهای محدودی مانند قندهای ساده (ساکارز و گلوکز) بوتیریک اسید - استیک اسید به‌عنوان اسیدهای آلی    استفاده از کربوهیدرات‌های آلی گسترده و پیچیده
(16)
باکتریهای غیرگوگردی ارغوانی عمده‌ترین میکروارگانیسم‌های مورد استفاده    گونه‌های کلستریدیوم و انتروباکترو باسیلوس به‌طور عمده استفاده می‌شوند
(16)
انرژی مصرفی بیشتر    انرژی مصرفی کمتر
(16)
نیتروژناز آنزیم کلیدی برای تولید هیدروژن    هیدروژناز آنزیم کلیدی برای تولید هیدروژن
(16)
زمان انجام فرایند بیشتر از دو هفته    زمان انجام فرایند بسیار سریع و کمتر از یک هفته
(16)
حساس‌بودن باکتریهای غیر‌گوگردی ارغوانی به اکسیژن و نیتروژن
حساس‌بودن میکروارگانیسم‌های تخمیری تاریکی فقط به اکسیژن
(16)
محدودة pH 8/6– 5/7    محدودة pH 5/5 – 5/6
(17)
پرهزینه و نیازمند راکتورهای زیستی بسیار گران (حساسیت بالا به اکسیژن)    هزینه‌بر، به‌دلیل فرایند‌های تغییر سوبستراهای پلیمری به مونومر
(17)
طراحیه پیچیده ی راکتور های زیستی    بهره‌برداری سخت از سوبستراهای تخمیری
(15)
کارایی و استفادة کم سیستم نیتروژنازی
میزان تولید هیدروژن پایین    تغییرات ناقص سوبسترا
میزان تولید هیدروژن بالا

 
الکترولیز میکروبی : این تکنولوژی بسیار شبیه به پیلهای سوختی میکروبی است و پتانسیل زیادی برای تیمار فاضلاب و آبهای زائد دارد. این سیستم از یک آند و یک کاتد تشکیل شده است که با یک غشای تبادل یونی از یکدیگر جدا شده‌اند. میکروارگانیسم‌ها در آند سوبستراهای آلی را اکسید می‌کنند و الکترون‌ها‌ی تولیدشده به‌ترتیب ازطریق یک مدار خارجی و پروتون‌های تولیدشده با عبور از یک غشای تبادل یونی به کاتد می‌رسند. در این سیستم یک منبع انرژی الکتریکی خارجی نیز وجود دارد تا تأمین‌کنندة انرژی لازم برای احیای پروتونها و تولید هیدروژن مولکولی در کاتد باشد؛ زیرا این واکنش ازنظر ترمودینامیکی به‌صورت خودبه‌خودی انجام نمی‌شود (شکل 3). با توجه به نوع سوبسترا کارایی تولید هیدروژن متفاوت خواهد بود. میکروارگانیسمهای مختلفی ازجمله آرکی‌ها، سیانوباکترها و برخی باکتریها ازجمله گونه‌های دسولفیتوباکتریوم  و دهالوکوکوئیدس  و میکروارگانیسمهای متانوژن و همواستوژن قابلیت استفاده در این فرایند را دارند (18و19).
 

 
شکل 3- شکل شماتیک MEC

 
آنزیم‌های مؤثر بر تولید هیدروژن زیستی: آنزیم‌های دخیل در تولید هیدروژن زیستی، آنزیم‌های نیتروژناز و انواع هیدروژنازها هستند که با توجه به شرایط استفاده‌شده در تولید هیدروژن زیستی، نوع و فعالیت این آنزیم‌ها متفاوت خواهد بود. نیتروژناز آنزیمی است که در تثبیت نیتروژن گازی و تبدیل آن به آمونیاک در آرکی‌ها و باکتری‌های تثبیت‌کنندة نیتروژن دخیل است و در حین انجام این فرایند گاز هیدروژن نیز به‌عنوان یک محصول جانبی تولید می‌شود. نیتروژنازها تنها خانوادة آنزیم‌هایی‌اند که می‌توانند واکنش تثبیت نیتروژن را کاتالیز کنند. تثبیت نیتروژن برای همه اشکال زندگی ضروری است‌؛ زیرا نیتروژن برای بیوسنتز مولکول‌ها (نوکلئوتیدها و اسیدهای آمینه) ضروری است. نیتروژنازها در ساختار خود کوفاکتورهای در‌بردارندة فلزاتی همچون گوگرد، آهن و مولیبدن دارند که این کوفاکتورها در تبدیل نیتروژن به آمونیاک یا انتقال الکترون شرکت دارند. براساس نوع کوفاکتور فلزی در جایگاه فعال به سه دسته FeMo - نیتروژناز، FeV - نیتروژنازها و FeFe - نیتروژنازها تقسیم می‌شوند. FeFe - نیتروژنازهای یافت‌شده در باکتری‌های فتوتروف و سیانوباکترها، مسئول تبدیل نیتروژن اتمسفری به آمونیوم (به‌عنوان منبع نیتروژن برای رشد میکروبی) هستند. در نبود نیتروژن مولکولی، نیتروژنازها می‌توانند تولید هیدروژن مولکولی را با احیای پروتون با استفاده از فردوکسین به‌عنوان دهندة الکترون کاتالیز کنند. تراوش پروتون در صورت نبودن نیتروژن در شرایط تاریکی، به‌واسطة نیتروژناز سیانوباکتر به تبدیل آن به هیدروژن منجر می‌شود. نیتروژنازها به اکسیژن حساس‌اند؛ بنابراین، در شرایط بی‌هوازی و در تخمیر نوری در انواع باکتری‌ها و آرکی‌ها در تولید هیدروژن زیستی دخیل‌اند. در سیانوباکترها به‌عنوان میکروارگانیسم‌های اتوتروف مولد اکسیژن در خلال فتوسنتز، سلول‌های تغییریافتة خاصی با عنوان هتروسیست، نیتروژناز‌ها را در خود جای می‌دهند که به‌واسطة دیواره‌های ضخیم و افزایش میزان تنفس، شرایط مطلوب ازنظر میزان اکسیژن را برای آنزیم فراهم می‌کنند؛ در عین حال، ترکیباتی ازجمله آمونیاک نیز می‌تواند زیان‌بار و از عوامل بازدارنده برای این سیستم آنزیمی در فرایند به شمار آیند (3). 
هیدروژنازها - متالوآنزیم‌های تولیدکنندة هیدروژن- از فلزات مختلفی ازجمله آهن و نیکل برای کاتالیز تبدیل هیدروژن استفاده می‌کنند و بیشتر نسبت به مونوکسید‌کربن و سولفید هیدروژن مقاوم‌اند. این آنزیم‌ها به‌طور عمده در باکتری‌ها و آرکی‌ها وجود دارند و در میکروارگانیسم‌های یوکاریوتی نیز یافت می‌شوند. با توجه به نوع مراکز فلزی که در جایگاه فعال آنها حضور دارد، نسبت به اکسیژن حساسیت نشان می‌دهند. هیدروژنازهای [FeFe] که به‌طور فعال قادر به تولید هیدروژن مولکولی‌اند، به اکسیژن حساس‌اند و خیلی سریع و به‌طور برگشت‌ناپذیر در حضور اکسیژن غیر‌فعال می‌شوند. این دسته از هیدروژنازها در باکتری‌های شدیداً بی‌هوازی ازجمله کلستریدیوم‌ها، مانند کلستریدیوم پاستورانیوم، قارچ‌ها و برخی از جلبک‌های سبز تک‌سلولی مانند کلامیدوموناس رینهاردی  وجود دارند. هیدروژنازهای [NiFe] کمتر به اکسیژن حساس‌اند و بیشتر آنها به‌صورت برگشت‌پذیر در برابر اکسیژن مهار می‌شوند و می‌توانند دوباره فعال شوند. این دسته در تعداد بیشتری از میکروارگانیسم‌ها ازجمله بسیاری از باکتری‌ها و همچنین در آرکی‌ها یافت می‌شوند. هیدروژنازهای [NiFe] به‌طور عمده در میکروارگانیسم‌های مصرف‌کنندة هیدروژن یافت می‌شوند (4-6). هیدروژناز رالستونیا اروپا کاندید مناسبی برای تولید هیدروژن است؛ چون به اکسیژن مولکولی مقاوم است. هیدروژنازها برای نخستین‌بار در دهه 1930 کشف شدند. از آن زمان، شایان توجه بسیاری از محققان ازجمله شیمی‌دانان معدنی قرار گرفتهاند و انواع شبیهسازهای هیدروژناز را سنتز کردند که مقاوم به اکسیژن باشند. درک مکانیسم کاتالیزوری هیدروژناز ممکن است به دانشمندان در طراحی منابع انرژی زیستی پاک مانند جلبک‌های تولیدکنندة هیدروژن کمک کند. در جدول 2 واکنش‌های مختلف تولید هیدروژن وجود دارند که با واسطه‌ها و کوآنزیم‌های مختلفی مانند رودوکسین، فرودوکسین، نیکوتین‌آمید و کینون، هیدروژن تولید می‌کنند. آنزیم‌های هیدروژنازی و نیتروژنازی می‌توانند به‌صورت تکی یا همزمان در سلول برخی از میکروارگانیسم‌ها وجود داشته باشند. 
 

جدول 2– طبقه‌بندی بیوشیمیایی دهیدروژنازها
واکنش    آنزیم هیدروژناز
H2 + NAD+ ⇌ H+ + NADH    Hydrogen dehydrogenase
(hydrogen:NAD+ oxidoreductase)
H2 + NADP+ ⇌ H+ + NADPH
    Hydrogen dehydrogenase (NADP)
(hydrogen:NADPH+ oxidoreductase)
H2 +2 ferricytochrome c3 ⇌ 2H+ + 2 ferrocytochrome c3    Cytochrome-c3 hydrogenase
(hydrogen: ferricytochrome-c3 oxidoreductase)
H2 + menaquinone ⇌ menaquinol    Hydrogen:quinone oxidoreductase
H2 + 2oxidized ferredoxin ⇌ 2H+ +2 reduced ferredoxin    Ferredoxin hydrogenase
(hydrogen:ferredoxin oxidoreductase)
H2 + oxidized coenzyme F420 ⇌ reduced coenzyme F420    Coenzyme F420 hydrogenase
(hydrogen:coenzyme F420 oxidoreductase)
H2 + A ⇌ AH2    Hydrogenase (acceptor)
(hydrogen:acceptor oxidoreductase)
H2 + 5,10-methenyltetrahydromethanopterin ⇌ H+ + 5,10 methylenetetrahydromethanopterin    Methenyltetrahydromethanopterin hydrogenase (hydrogen:5,10-methenyltetrahydromethanopterin oxidoreductase)
H2 + 2-(2,3-dihydropentaprenyloxy) phenazine ⇌ 2-dihydropentaprenyloxyphenazine    Methanosarcina-phenazine hydrogenase [hydrogen:2-(2,3-dihydropentaprenyloxy) phenazine oxidoreductase]
https://enzyme.expasy.org

 
.سوبستراهای استفاده‌شده در تولید هیدروژن زیستی: برای تولید این سوخت زیستی از طیف وسیعی از سوبستراها و زائدات، با توجه به شیوة انجام واکنش استفاده می‌شود. امروزه افزایش جمعیت موجب شده است گسترش و انباشته‌شدن ضایعات و پسماند‌ها یکی از مشکلات عمدة جوامع شهری باشد؛ اما به‌کارگیری این پسماندها برای تولید هیدروژن، راهی برای کاهش این مواد زائد انباشته‌شده محسوب می‌شود که می‌تواند در عین حال باعث تولید ماده‌ای با ارزش افزودة بالا شود. همچنین، بسیاری از این منابع به‌دلیل داشتن مواد مغذی فراوان ازجمله لیپید‌ها، مواد معدنی و ویتامین‌ها می‌توانند جزء بهترین سوبستراها برای استفاده در تولید هیدروژن زیستی باشند (17). یکی از در دسترس‌ترین سوبستراها در تولید هیدروژن، توده‌های زیستی لیگنوسلولزی است که به دلایل مختلف ازجمله فراوانی، تجدید‌پذیری و در دسترس بودن برای تولید هیدروژن بسیار درخور توجه قرار گرفته‌اند (20). زائدات حاصل از جنگل‌ها، کشاورزی و نیز کود‌های حیوانی غنی از این منابع لیگنوسلولزی هستند. این توده‌های لیگنوسلولزی از سه بخش اصلی سلولز (40 درصد)، همی‌سلولز (25 درصد) و لیگنین (20 درصد) تشکیل شده‌اند (15 درصد باقی‌مانده نیز اجزای بسیار کوچکی از ترکیبات غیرآلی هستند)؛ برای مثال، محصولات گیاهی کتان و کنف که بخشی از ساختار‌های مستحکم برای سلول گیاهی‌اند، منابع غنی از سلولز می‌توانند باشند (21)؛ اما برای به‌کارگیری هرکدام از این اجزا نیاز به انجام واکنش‌های تجزیه برای ایجاد واحد‌های مونومری است که می‌توان به روش‌های فیزیکی (هیدروترمولیز - فشار ناشی از بخار)، شیمیایی (اسید و باز) و زیستی اشاره کرد. نکتة مهم در استفاده از این سوبستراهای لیگنوسلولزی، این است که ترکیبات لیگنینی می‌توانند موجب محدودیت برای عملکرد آنزیمها و درنتیجه، به کاهش بازده هیدروژن تولیدی منجر شوند. به همین دلیل، سلولز نسبت به همی‌سلولز و لیگنین برای تولید هیدروژن به‌طور گسترده‌تر استفاده می‌شود (20). نشاسته نیز یکی دیگر از پلیمرهای با وزن مولکولی بالاست که در حالت پلیمری قادر به گذشتن از غشای سلولی نیست؛ بنابراین، باید ابتدا به واحدهای سازندة خود تجزیه شود که این امر با استفاده از آنزیمها و روش‌های تجزیه‌ای گسترده‌ای مانند روش‌های فیزیکی، گرمایی، زیستی یا ترکیبی از این روش‌ها امکان‌پذیر است. پسماند‌های کارخانجات سیب‌زمینی، کود‌های گاوی و لجنها، ترکیبات غنی از نشاسته‌اند (16). پسماندهای کشاورزی ازجمله محصولات گیاهی که در بازار‌های مختلف به‌صورت غیر‌قابل عرضه‌اند، با داشتن پلیمرهای ساده و پیچیده از کربوهیدرات‌ها، به‌عنوان سوبسترا برای تولید هیدروژن استفاده می‌شوند. همچنین، پسماند‌های جانوری و کود‌ها غنی از میکروارگانیسمهای تولید‌کنندة هیدروژن‌اند و به‌دلیل تجدید‌پذیری و غنی‌بودن از مواد مغذی، سوبستراهای با ‌ارزشی به شمار می‌آیند. فاضلابهای مختلف خانگی و صنعتی می‌توانند برای تولید انرژی زیستی استفاده شوند و موجب بازیابی انرژی شوند (45). پسماند‌های کارخانجات صنعت شراب و آبجوسازی، فرآوری شکر، ملاس و ...، از دیگر منابع غنی از سوبستراهای مورد نیاز برای تولید هیدروژن‌اند (17). در جدول‌های 3 و 4 به‌طور خلاصه انواع سوبسترا‌ها و میکروارگانیسم‌های درگیر در فرایند‌های تخمیر نوری و تاریکی آورده شده‌اند.
راهکارهای افزایش تولید هیدروژن زیستی و تولید آنزیمی: تغییرات اولیه روی سوبستراهای مصرفی برای تولید هیدروژن زیستی و افزودن برخی مواد حین انجام واکنش می‌توانند در افزایش راندمان تولید مؤثر باشند؛ برای مثال، در فرایند تخمیر نوری حضور ترکیبات نیتروژنی مانند آلبومین، گلوتامات و همچنین عصارة مخمر در غلظت‌های مناسب باعث افزایش تولید می‌شوند. در بعضی از فرایند‌های تولیدی هیدروژن محصولات جانبی فراوانی ایجاد می‌شوند که موجب مختل‌کردن فرایند و کاهش سرعت در تولید می‌شوند؛ برای مثال، در تخمیر تاریکی اسید‌های گوناگونی مانند بوتیریک اسید تولید می‌شود؛ اما استفاده از ترکیباتی مانند فلز‌ها (پالادیوم ، نیکل ، نقره ، آهن  و ...)، یون‌های فلزی (منیزیم ، سدیم ، نیکل ، آهن  و ...) و اکسید‌های فلزی (اکسید زیرکونیوم ، اکسید کبالت ، اکسید آهن 3  و مگنتیت ) می‌توانند تا حدودی در افزایش تولید هیدروژن مؤثر واقع شوند (20).
کشت همزمان می‌تواند یکی از راهکارهای افزایش تولید هیدروژن باشد. یکی از معروف‌ترین باکتری‌های بنفش غیر‌گوگردی، رودوباکتر اسفروئیدس  است که به‌دلیل قابلیت استفاده از انواع مختلف بسترها و فعالیت زیاد، میتواند در تولید هیدروژن در شرایط بی‌هوازی نقش داشته باشد. به‌طور کلی، برای افزایش سرعت و عملکرد تولید هیدروژن، بیشتر با باکتری‌های دیگر همچون کلستریدیوم، لاکتوباسیلوس دلبروکی و انتروباکتر کشت داده می‌شود. کشت توأم این باکتری با هالوباکتریوم سالیناروم  تولید هیدروژن را توسط رودوباکتر افزایش میدهد. هالوباکتر یک آرکی شیمیو‌ارگانوترف است؛ اما در فشار کم اکسیژن قادر است از سیستم نوری فتورودوپسین، برای تولید انرژی، پروتون آزاد کند. سیستم غشایی این آرکی قادر به جذب نور و تولید پمپ پروتونی است. این سیستم غشایی در هالوباکتر سالیناروم به تغییرات pH و حرارت محیط، مقاوم و منبع بسیار مناسبی برای فعالیت آنزیم دی‌نیتروژناز و هیدروژناز است تا بتواند پروتون آزادشده توسط رنگدانة هالوباکتر را به هیدروژن تبدیل کند (21). سلولهای هالوباکتر به راحتی در آب مقطر لیز می‌شوند و غشا آزاد می‌شود. غشای آزاد‌شده در حضور نور، پمپ پروتون ایجاد می‌کند و توسط نیتروژناز رودوباکتر هیدروژن تولید می‌شود. از 80 نانومول رودوپسین می‌توان 217 میلی‌لیتر هیدروژن در ساعت توسط رودوباکتر تولید کرد. یک مثال دیگر از کشت همزمان این است که هنگام استفاده از نشاسته به‌عنوان سوبسترا در محیط کشت، ترکیب دو باکتری باسیلوس سرئوس  ATCC14579 و برووندیموناس ناجانجسامنسیس  سویة BIO-TAS2-2 موجب افزایش تولید هیدروژن از 52 درصد به 62 درصد می‌شود (42 و 43). از کشت جلبک و باکتریهای مولد هیدروژن و غیرمولد هیدروژن به‌صورت همزمان استفاده شده است و پتنت‌هایی در این زمینه نیز ثبت شده‌اند. کشت همزمان جلبک کلامیدوموناس و باکتری‌های غیرمولد هیدروژن مانند گونه‌های سودوموناس ، برادی‌ریزوبیوم جاپونیکوم ، اشرشیا کلای ، باسیلوس سابتیلیس ، گونه‌های استنوتروفوموناس  و رالستونیا یوتروفا  در محیط تریس - استات - فسفات  استفاده شده است که ازنظر میزان گوگرد در شرایط کمبود قرار دارد و نتایج نشان‌دهندة افزایش چشمگیری در میزان، سرعت و مدت زمان تولید هیدروژن زیستی توسط جلبک کلامیدوموناس بوده است. بهترین نتایج در این مورد، مربوط به کشت همزمان کلامیدوموناس و باکتری‌های سودوموناس فلورسنس  و برادی‌ریزوبیوم جاپونیکوم  است که باعث افزایش تولید هیدروژن زیستی تا 30 برابر در مقایسه با استفاده از جلبک کلامیدوموناس به تنهایی بوده است. دربارة اثر سینرژیستی جلبک کلامیدوموناس و باکتریهای مولد هیدروژن زیستی مانند رودواسپیریلوم رابروم  و گونه‌های رودوسودوموناس  نیز تحقیقاتی صورت گرفته است (44).
یکی دیگر از روشهایی که دانشمندان برای افزایش تولید هیدروژن زیستی به کار می‌برند، کپسوله‌کردن باکتری‌های مولد هیدروژن در ماتریکس‌های مختلف ازجمله ماتریکس‌های سیلیکایی است؛ بدین ترتیب، از هیدروژنازهای حساس به اکسیژن حتی در شرایط هوازی می‌توان استفاده کرد. در تخمیر تاریکی، تکنولوژیهای تثبیت سلول میکروبی روی حاملهای مختلف ازجمله آلژینات، کربن فعال و کامپوزیتهای مختلف بررسی شدند که باعث تولید پایدار هیدروژن در مدت زمانهای بیشتر شده‌اند. هنگام استفاده از سلول‌های تثبیت‌شدة جلبکهایی مانند تتراسپورا ، با اضافه‌کردن پلیمری مانند کلسیم آلژینات می‌توان ظرفیت تولید هیدروژن را افزایش داد. مکانیسم عملکرد این پلیمر به این صورت است که با کنترل‌ تولید اکسیژن حین فرایند، از سیستم آنزیمی هیدروژنازی این جلبک محافظت می‌کند که مسئول تولید هیدروژن است؛ درنتیجه، عملکرد آنزیم به‌دلیل حساسیت به اکسیژن مختل نمی‌شود (29). تثبیت آنزیم‌ها در شرایط خاص، برای تولید انبوه این گاز از اهمیت خاصی برخوردار است؛ برای مثال، هیدروژناز و غشای سلولی هالوباکتر سالیناروم در شرایط هوازی فعال‌اند؛ اما نیتروژن رودوکتاز شرایط بی‌هوازی را برای عملکرد خود نیاز دارد.
 
جدول 3- انواع سوبستراهای استفاده‌شده در سیستم تخمیری تاریکی در راکتورهای ناپیوسته
رفرنس    سوبسترا    بازده هیدروژن    باکتری
ضایعات نشاسته‌ای
(16)
سیب‌زمینی    7.21 mmol H2 g-1
COD    C.butyricum NRRL-B-1024 & E.aerogenes NRRL-B-115
(22)
ذرت    1.59 L H2 L-1
محیط کشت    C.acetobutylicum DSM 792
(16)
گندم    2.34 mol H2 mol-1 گلوکز    Biohydroghenbacterium R3
(23)
گندم    1.09 mol H2 mol-1 گلوکز    Enterobacter aerogenes NCIMB10102
(24)
گندم    1.96 mol H2 mol-1
گلوکز    لجن
(22)
سیب‌زمینی    0.29 mol H2 mol-1
هگزوز    E. coli HD701
(22)
سیب‌زمینی شیرین    2.7 mol H2 mol-1
گلوکز    C.butyricum IFO13949 & Enterobacter aerogenes HO-39
ضایعات لیگنوسلولزی
(16)
تفالة سیب    1.89 ml H2 g-1    Clostridium roseum ATCC17797
(16)
پوست نارگیل    0.279 mol H2 mol-1
قند احیاشده    Enterobacter aerogenes NBRC13534
(22)
کاه برنج هیدرولیزشده    1.53 mol H2 mol-1
گلوکز    Bacillus cereus (KR809374)
(22)
کاه برنج    2.7 mmol H2 g-1
کاه برنج    Thermotoga neapolitana
(16)
پوست سورگم (نوعی گیاه)    1.05   mol H2 mol-1 ه قند احیا‌شده    Colostridium beijerinckii KCTC-178
سلولز
(20)
سلولز    176 ml / g    Cellulomonas sp
(20)
سلولز    4.79 mmol    Cellulomonas uda
(25)
سلولز    1.91 mmol    Cellulomunas biazotea NCIM-2550
(25)
سلولز    4.20 ml /g    میکروفلور‌های کود گاو
(25)
سلولز    122 ml / g    Trichoderma viride
(20)
سلولز    521 ml / g    Enterobacter SPP.
(20)
سلولز    43.8 mmol    Thermoanaerobacterium sp strain F6
(20)
سلولز    2.20 mmol    Hyperthermophilic eubacterium & Thermotoga neapolitana
(25)
سلولز    2.0mol    Clostridium butyricum & Ruminococcus albus
(20)
سلولز    8.10mmol    Clostridium acetobutylicum X9 & Ethanoigenes harbinense B49
(20)
سلولز    1387ml/L    C.thermocellum & C.thermopalmarium
(20)
سلولز    44.0mmol    Sellulomonas fimi & Rhodopseudomonas palustris
(20)
سلولز    10.4mmol    C.acetobutylicum X9 & Ethanoigenens harbinense B2
قند ساده
(16)
گلوکز    1.9 mol H2 mol-1 گلوکز    Enterobacter cloacae DH-89
(16)
گلوکز    2.2 mol H2 mol -1 گلوکز    C.pasteurianum CH5
(26)
گلوکز    1.74 mol H2 mol-1 گلوکز    .acetobutylicum NCIM 2337 & Enterobacter cloacae 811101
جدول 4- تولید هیدروژن با ترکیب‌کردن فرایندهای تخمیر در تاریکی و نور با استفاده از نشاسته به‌عنوان سوبسترا
سویة باکتریایی در تخمیر نوری    سویة باکتریایی در تخمیر تاریکی    بازده هیدروژن    سوبسترا    رفرنس
Rhodobacter sphaeroides O.U.001    C.acetobutylicum DSM792    2.62 mol H2 mol-1 هگزوز    ذرت    (22)
Rhodopseudomonas palustris GCA009    C.butyricumNRRL-B-1024 & E.aerogenes NRRL-B-115    8.3 mmol H2 g-1 COD    سیب‌زمینی    (16)
Rhodobacter sphaeroides M-19    C.butyricum IFO13949 & Enterobacter aerogenes HO-39    7.2 mol H2 mol-1 گلوکز    سیب‌زمینی شیرین    (16)
Rhodobacter sphaeroides-RV    C.beijerinkii DSMZ-791    90 ml g-1 نشاسته    گندم    (27)
R.sphaeroides & R.palustiris    لجن    63.9 ml g-1 نشاسته    گندم    (16)
Rhodobacter sphaeroides N7    C.butyricum    6.1 mol H2 mol-1 گلوکز    نشاسته    (16)استفاده از سیستمهای آنزیمی، از روشهای نوین در تولید هیدروژن زیستی است. کمپلکس‌های آنزیمی که بر سطوح جامد چسبیده شده‌اند، با استفاده از الکترون‌های فعال‌شده با نور می‌توانند تولید هیدروژن کنند. همچنین، مسیرهای متابولیکی سنتزی که به آنها آنزیم‌های خالص‌شده اضافه شده است، با راندمان بالا قندها را به هیدروژن و دی‌اکسید‌کربن می‌توانند تبدیل کنند. برای انجام این تکنولوژی‌ها باید مقادیر کافی از آنزیم خالص در اختیار باشد و بدین منظور دانشمندان با استفاده از مهندسی ژنتیک و روشهای موتاسیون توانستند به آنزیم‌های هیدروژنازی با کارایی بالاتر برسند که مقاومت بیشتری در برابر اکسیژن دارند و آنزیم‌های مزبور را در سیستم‌های میکروبی بسیار متنوع به میزان زیاد به‌صورت پروتئین‌های هترولوگ یا غیرهترولوگ تولید کرده‌اند. از این آنزیم‌ها در آزمایشگاه برای تولید هیدروژن می‌توان استفاده کرد. در این رابطه، غشاها و هیدروژل‌هایی معرفی شده‌اند که قادرند از آنزیم‌ها در برابر شرایط محیطی ازجمله اکسیژن محافظت کنند. همچنین، هیدروژنازها می‌توانند در داخل لیپوزوم‌ها به همراه آنزیم‌ها و کوفاکتورهای لازم جای داده و به‌عنوان بیوراکتورهایی برای تولید هیدروژن از گلوکز استفاده شوند؛ برای مثال، اشرشیا کلای نوترکیب‌شده با هیدروژناز رودوباکتر اسفروئیدس قادر به تولید 200 برابری هیدروژن نسبت به سلولهای اولیه در شرایط بی‌هوازی تاریکی بوده است. همچنین، بیان هیدروژنازهای مقاوم به اکسیژن در ارگانیسمهای فتوسنز‌کننده می‌تواند در افزایش تولید هیدروژن زیستی مؤثر باشد ‌‌که با تغییر ژنتیکی در آنزیم‌های آن میکروارگانیسم انجام می‌شود یا با بیان آنزیم‌های تحمل‌کنندة اکسیژنی که از باکتریهای دیگر به دست آمده است. دانشمندان با ترکیب آنزیمهای مسیر پنتوز‌فسفات با هیدروژناز و کپسوله‌کردن آنها در ماتریکس‌های خاص توانسته‌اند کارایی تولید هیدروژن را بالا ببرند. هیدروژناز به‌دست‌آمده از پیروکوکوس فوریوس  در شرایط آزمایشگاهی و خارج از سلول زنده به همراه گلوکز دهیدروژناز برای تولید هیدروژن از گلوکز به کار رفته است. این دو آنزیم از کوفاکتور NADP+ استفاده می‌کنند و هیدروژناز خالص‌شده از پیروکوکوس فوریوس همراه آنزیم‌های پنتوزفسفات قادر است 6/11 مول هیدروژن به‌ازای هر مولکول گلوکز فسفات تولید کند. باکتری ترموتوگا ماریتیما  یک یوباکتر هایپرترموفیل بی‌هوازی گرمادوست است که عصارة سلولی آن همه آنزیم‌ها و کوفاکتورهای لازم برای تولید هیدروژن را دارد (5 و 30-32). 
محدودیت‌های تولید هیدروژن زیستی: باوجود مزایای عمده‌ای که تولید هیدروژن به‌عنوان سوخت زیستی دارد، برای تولید آن ممکن است مشکلاتی وجود داشته باشد؛ برای مثال، هنگامی که از پلیمر‌هایی مانند سلولز به‌عنوان سوبسترا استفاده می‌شود، برای تجزیة آن به واحد‌های مونومری، روشهایی مانند هیدرولیز آنزیمی نیاز است که این مرحله می‌تواند یکی از پردردسرترین و پرهزینه‌ترین مرحله‌ها باشد (33). در روشهای مهندسی و طراحی راکتورهای مناسب برای تخمیر نوری، مشکلاتی برای تأمین نور مناسب فرایند وجود دارد. همچنین، بهره‌برداری و استفاده از هیدروژن به‌صورت خالص و ذخیره‌سازی آن مشکل‌ساز است و برای عرضه‌کردن هیدروژن به‌عنوان سوخت در حمل‌ونقل، محدودیتهایی وجود دارد (17). در تولید هیدروژن با استفاده از روش الکترولیز، هزینة تولید به مانعی مهم برای تجاری‌سازی فناوری مبدل شده است. یکی از موارد، وجود الکترودهای مناسب در این زمینه است که به‌تازگی با استفاده از کامپوزیت‌های مبتنی بر پلیمرهای زیستی مانند نانوسلولز باکتریایی حل شده است (34). نانوسلولز باکتریایی باوجود خواص منحصربه‌فردی که در این رابطه دارد، می‌تواند در مقیاس بالا با تخمیر میکروبی از منابع ارزان قیمت تهیه شود (35). 
.خالص‌سازی و ذخیره‌سازی هیدروژن زیستی: سیستم‌های فتولیز مستقیم و غیرمستقیم، گاز هیدروژن خالص تولید می‌کنند؛ اما روش‌های تخمیری مجموعه‌ای از گازها را تولید می‌کنند که حاوی هیدروژن نیز هستند که محتوای هیدروژنی در آنها اغلب کمتر از 50 درصد است. برای داشتن هیدروژن زیستی با خلوص بالا باید انواع دیگر گازها ازجمله دی‌اکسیدکربن، متان، مونوکسید‌کربن حذف شوند. روشهای بسیاری برای خالص‌سازی این گاز از مخلوط گازهای دیگر وجود دارد و خالص‌سازی هیدروژن زیستی نیز از چالشهای خیلی مهم برای پژوهشگران زیستی است. راههای مختلفی برای این امر پیشنهاد میشوند که عبارت‌اند از 1- خالص‌سازی در دمای سرد که حدوداً 98 درصد کارایی دارد؛ اما قبل از خالص‌سازی با این روش گاز سولفید و دی‌اکسید‌کربن باید خارج شوند. 2- غشاهای نانو که این روش گران است و غشاهای مختلف ازجمله پلی‌سولفونات و پلانینیوم استفاده میشوند؛ اما درصد کارایی آن کمتر از 85 درصد است و این تکنولوژی فعلاً در مقیاس کوچک استفاده میشود. هلیوم و دی‌اکسید‌کربن با این غشا از گاز هیدروژن جدا میشوند. 3- ایجاد هیبرید با فلز که در این روش کارایی کم است و گازهای نیتروژن، مونواکسید‌کربن و سولفور نیز با فلز واکنش میدهند. 4- ایجاد چمبرهای الکترولیت که یون هیدروژن را از پلیمرهای غشایی جامد عبور میدهند. این روش میتواند 99 درصد هیدروژن خالص جمع‌آوری کند؛ اما حضور سولفور، الکترولیت را تخریب میکند. 5- ایجاد کاتالیزورهای واکنشی با هیدروژن برای خروج اکسیژن که در این روش فلزات باعث تخریب کاتالیزور میشوند. 6- استفاده از غشاهای پالادیم برای جذب هیدروژن که قادر است هیدروژن را با درصد بالا و خلوص بسیار زیاد جذب کند؛ در این نوع غشا اسیدهای چرب و سولفور مخرب‌اند (36 و 37). 
سیستم‌های ذخیره‌سازی مطمئن با ایمنی بالا و مقرون‌به‌صرفه، یکی دیگر از چالش‌هایی‌اند که در استفاده از هیدروژن زیستی در مقیاس صنعتی وجود دارند. ذخیرة هیدروژن می‌تواند براساس ذخیره‌سازی فیزیکی (به‌صورت گاز فشرده یا هیدروژن مایع) یا بر پایة مواد و روش‌های شیمیایی (جذب شیمیایی) انجام شود که هرکدام محدودیت‌هایی را ایجاد می‌کنند که برای حل آنها تحقیقات بیشتر در این زمینه نیاز است (38). ترکیبات میان سطحی گرافیت  (GICs) می‌توانند در ذخیره‌سازی هیدروژن استفاده شوند و به راحتی از سلولز باکتریایی قابل تولید هستند (39).
آنالیز و سنجش هیدروژن زیستی: آنالیز و سنجش گاز هیدروژن از چالشهای مهم پژوهشگران است. برای حل‌کردن چنین مشکلی باید گازهای حاصل از واکنشهای میکروبی در داخل چمبری درب تفلونی جمع‌آوری شوند و گاز هیدروژن با سوزن مخصوص کروماتوگرافی گازی نمونه‌گیری و به دستگاه جی‌سی برای آنالیز تزریق شود؛ البته دتکتورهای دستی برای آنالیز سریع این گاز نیز وجود دارند که در جدول 5 آورده شده‌اند. امروزه روش‌های سریعی برای سنجش گاز هیدروژن توسط تکنولوژی نانوپارتیکلهای پلاتنیوم طراحی شده‌اند (40).

جدول 5- انواع دتکتورهای هیدروژن
دتکتور    
Gasman    1
China cpo1    2
Honeywell    4
Oc-904A    5
آیندة تولید هیدروژن: طبیعت تجدید‌ناپذیر انرژی فسیلی و آلودگی محیط زیست ناشی از استفاده از آن‌، ایجاد انرژی تجدیدپذیر پاک و کارآمد را بسیار ضروری می‌کند. با استفاده از زیست‌تودة میکروجلبک به‌عنوان منابع انرژی جایگزین مواد اولیه مانند هیدروژن زیستی و متان را می‌توان ازطریق تخمیر و فتوسنتز تولید کرد. برخلاف انرژی خورشیدی که دارای معایب چگالی انرژی پایین، بی‌ثباتی و مشکل در ذخیره‌سازی است‌، هیدروژن زیستی و بیوگاز یکی از جدیدترین منابع انرژی ایدئال در زمان حاضر هستند. با توجه به اینکه ریزجلبکها زیست‌توده‌های تجدیدپذیر و مقرون‌به‌صرفه هستند و توسعة فناوری‌های مربوط به آنها با سهولت انجام می‌شود، استفاده از آنها می‌تواند چشم‌اندازهای جذابی در زمینه‌های کاربردی مربوطه ایجاد کند. نکاتی که در آینده برای مقابله با چالش‌های تولید هیدروژن زیستی لازم‌اند، عبارت‌اند از 1- امکان استفاده از زباله و تبدیل آن به هیدروژن، 2- ساخت سویههای نوترکیب تولید‌کنندة هیدروژن بالا و مقاوم به نور، 3- ایجاد مقاومت در میکرو‌جلبک به هیدروژن و دی‌اکسید بالا، 4- ساخت میکروجلبک‌های تولید‌کنندة هیدروژن در تاریکی، 5- توسعة تکنولوژی خالص‌سازی ارزان هیدروزن زیستی و 6- استفاده از آنزیمهای نوترکیب با کارایی بیشتر در تولید هیدروژن زیستی (41).