دانشگاه اصفهان زیست شناسی میکروبی 3060-7647 7 26 2018 06 22 Cloning and bioinformatics analyses of the coding DNA sequence (CDS) of Delta 6 Desaturase gene from Mortierella alpina (CBS 754.68) همسانه‌سازی و بررسی بیوانفورماتیکی توالی رمزگردان (CDS) ژن دلتا 6 دسچوراز از قارچ مورتیرلا آلپینا سویه CBS 754.68 87 99 22282 10.22108/bjm.2017.101401.1023 FA عصمت اشعارقدیم کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه صنعتی شاهرود، شاهرود، ایران شاهرخ قرنجیک استادیار ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک، دانشگاه صنعتی شاهرود، شاهرود، ایران Journal Article 2016 12 30 Introduction: Membrane-bound desaturases and related enzymes play a pivotal role in the biosynthesis of unsaturated fatty acids. Delta6 desaturase is a key enzyme in the biosynthesis of the unsaturated fatty acids. Mortierella alpina is an oleaginous fungus with active Delta 6 desaturase which hasbeengreatly considered recently. Materials and methods: In order to isolate and clone Δ6D gene from Mortierella alpina, after extraction of total RNA and synthesis cDNA, PCR amplification has been done using gene specific primers. The amplified fragment was cloned into the pBlueScriptSK+ containing seed specific promoter napin. Then the recombinant plasmid was transformed into E.coli DH5a by freezing and thawing method. The confirmed gene construct was cloned into the binary vector pBI121 and transformed into Agrobacterium LBA4404 in order to transform canola plants. Bioinformatics characterization of target gene was investigated by servers TMHMM, ProtParam and Psipred. Results: Correctness of cloning was confirmed by PCR with specific primers, enzymatic digestion and sequencing. The proliferation of a fragment with 830 bp using internal primer of napin promoter and Delta6 desaturase primer confirmed insertion of the gene along with napin promoter. Nucleotide sequencing results showed that cloned CDS includes 1374 nucleotides that will translate to a protein with 448 amino acids. Using bioinformatics analysis, presence of cytochrome b5 domain, three His-box, secondary and spatial structures, transmembrane and conserved domains were confirmed. Discussion and conclusion: Based on the results of BLAST analysis using nucleotide and protein sequences, and also presence of functional domains in the protein, it can be predicted that cloned CDS will show proper enzyme activity after transformation into plants. Confirming these results requires expression analysis of the gene in appropriate plant system and studying its function in the enzyme level. مقدمه: دسچورازهای غشایی و آنزیم‌های وابسته به آنها نقشی اساسی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع ایفا می‌کنند. دلتا 6 دسچوراز، آنزیمی کلیدی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع است. قارچ مورتیرلا آلپینا، گونه‌ای روغنی و دارای دلتا 6 دسچوراز فعال است و در سال‌های اخیر مورد توجه پژوهشگران قرارگرفته است. مواد و روش‏‏ها: پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از قارچ مورتیرلا آلپینا سویه CBS 754.68، ژن دلتا 6 دسچوراز توسط آغازگرهای اختصاصی حاوی توالی کوزاک تکثیر و قطعه تکثیرشده در ناقل همسانه‌سازی pBlueScriptSK+ حاوی پروموتور اختصاصی بذر ناپین درج شد. پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش شیمیایی به باکتری اشریشیا کلی سویه DH5α ترانسفورم شد. سازه حاصل در ناقل دوگانه pBI121 همسانه‌سازی و برای انتقال به گیاه، به آگروباکتریوم سویه LBA4404 ترانسفورم شد. ویژگی‌های بیوانفورماتیکی ژن موردنظر با سرورهای TMHMM، ProtParam و Psipred بررسی شد. نتایج: درستی همسانه‌سازی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز توسط آغازگرهای اختصاصی، هضم آنزیمی و توالی‌یابی تأیید شد. تکثیر قطعه 830 جفت نوکلئوتیدی با استفاده از آغازگر داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز، الحاق ژن در امتداد پروموتور ناپین را تأیید کرد. نتایج توالی‌یابی نوکلئوتیدی نشان دادند که توالی نوکلئوتیدی این ژن، 1374 جفت باز است و پروتئینی با 457 آمینواسید را رمز می‌کند. وجود دمین سیتوکروم b5، سه موتیف جعبه هیستیدین، دمین‌های تراغشایی و حفاظت‌شده از طریق بررسی بیوانفورماتیک تأیید شدند. بحث و نتیجه‏گیری: با استناد به نتایج بلاست پروتئینی و تأیید حضور دمین‌های کارکردی، پیش‌بینی می‌شود که توالی همسانه‌سازی‌شده از این قارچ دارای فعالیت آنزیمی مدنظر است. تأیید این نتایج به بررسی بیان این ژن در سیستم گیاهی مناسب و بررسی کارکرد آن در سطح آنزیمی نیازمند است.

https://bjm.ui.ac.ir/article_22282_0a1188920ef1f8a97e349da18bd7c7ab.pdf