دانشگاه اصفهان زیست شناسی میکروبی 3060-7647 5 20 2017 01 20 Application of Rotatable Central Composite Design for Optimization of Extracellular Alkaline Protease Production from newly isolated Bacillus pseudofirmus MSB4 کاربرد طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر به منظور بهینه سازی تولید آنزیم آلکالین پروتئاز خارج سلولی توسط سویه جداسازی شده جدید باسیلوس پسودوفیرموس MSB4 17 31 21143 10.22108/bjm.2017.21143 FA ماتیا سادات برهانی دانشجوی دکترای میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران زهرا اعتمادی فر دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران عیسی جرجانی استادیار ژنتیک، دانشگاه گنبد کاووس، گلستان، ایران 0000-0001-7681-1799 Journal Article 2016 05 29 <strong>Introduction</strong><strong>:</strong> Microbial extracellularalkaline proteases are one of the most important industrial enzymes with a wide range of applications in various industries. In the present study, the production of an alkaline protease by <em>Bacillus pseudofirmus</em> MSB4 was evaluated using response surface methodology (RSM). <br /><strong>Materials and method</strong><strong>s:</strong> Four significant independent variables were selected, based on the results of one-factor-at-a-time (OFAT) approach (xylose concentration, beef extract concentration, pH and temperature), for rotatable central composite design (RCCD) to analyze the response pattern and to establish a model. The design consisted of total 30 runs, at five levels for each factor, with four replications of the center points. In addition, the presence of extracellular alkaline protease genes was evaluated by using PCR. <br /><strong>Results</strong><strong>:</strong> Maximum protease production (185.397 U/ml), 2.2 times higher than that of OFAT method and 3.7 times higher than the unoptimized conditions, was obtained by using 3% w/v beef extract, at pH 9 and 37ºC according to the results of RCCD. Furthermore, the genes <em>sub I, II</em> and <em>apr</em> with the expected size (319, 486 and 194 bp, respectively) corresponding to the extracellular alkaline serine protease and metalloprotease were detected in MSB4 by using PCR. <br /><strong>Discussion and conclusion</strong><strong>: </strong>The experimental data well fitted the model (Adj R²: 0.9982) and the established quadratic model has a great ability to predict responses for new observations (Pred R²: 0.9967). The results showed that the OFAT and RSM strategies were a useful screening and optimization method for enhancing protease production of MSB4, respectively. <strong>مقدمه:</strong> پروتئازهای قلیایی خارج سلولی با منشا میکروبی، یکی از مهم‌ترین آنزیم‌های صنعتی بوده که کاربردهای فراوان در صنایع مختلف دارند. در این مطالعه، تولید پروتئاز قلیایی باکتری <em>باسیلوس پسودوفیرموس</em> MSB4 با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ افزایش یافت.<br /> <strong>مواد و روش</strong><strong>‏‏</strong><strong>ها:</strong> چهار متغیر مستقل موثر، بر اساس نتایج به دست آمده از روش تک عاملی (غلظت زایلوز، غلظت عصاره گوشت، pH و دمای انکوباسیون)، به منظور تجزیه و تحلیل الگوی پاسخ و ساخت مدل با استفاده از روش طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر انتخاب شدند. طراحی آزمایش، شامل 30 آزمایش دارای 4 تکرار در نقطه مرکزی می شد و هر متغیر در 5 سطح مختلف بررسی شد. به علاوه حضور ژن‌های پروتئازهای قلیایی خارج سلولی در سویه MSB4 با استفاده از PCR ارزیابی شد.<br /> <strong>نتایج:</strong> حداکثر مقدار تولید آنزیم (U/ml 397/185) که حدود 2/2 برابر بیشتر از روش تک عاملی و 7/3 برابر بیشتر از شرایط غیر بهینه است، بر طبق نتایج طرح مرکب مرکزی چرخش پذیر با استفاده از 3 درصد عصاره گوشت، اسیدیته 9 و دمای 37 درجه سانتی‌گراد به دست آمد. همچنین ژن های sub I, II و apr با سایز مورد انتظار (به ترتیب با 319، 486 و 194 زوج باز)  مسؤول متالوپروتئاز و سرین پروتئاز قلیایی خارج سلولی در سویه MSB4 با استفاده از PCR تشخیص داده شدند.<br /> <strong>بحث و نتیجه</strong><strong>‏</strong><strong>گیری:</strong> نتایج آزمایشگاهی به خوبی با مدل به دست آمده سازگاری دارند (9982/0 Adj R²:) و این مدل توانایی زیادی برای پیش بینی متغیر پاسخ برای مشاهدات جدید خواهد داشت (9967/0Pred R²: ). نتایج این مطالعه نشان داد که روش تک عاملی و سطح پاسخ به ترتیب روش مفیدی برای غربال‌گری و بهینه‌سازی تولید پروتئاز در سویه MSB4 بودند https://bjm.ui.ac.ir/article_21143_85caeaeb9a1dc8d5fb6730cc7166ded3.pdf