دانشگاه اصفهان زیست شناسی میکروبی 3060-7647 5 18 2016 08 22 Cloning of affecting pyruvate decarboxylase gene in the production bioethanol of agricultural waste in the E.coli bacteria همسانه‌سازی ژن پیروات دکربوکسیلاز مؤثر در تولید بیواتانول در باکتری اشرشیا کلای 11 28 20380 10.22108/bjm.2016.20380 FA معصومه زینالی کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران بهمن حسینی دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران سدابه جهانبخش دانشیار اصلاح نباتات ، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران محمود رضا زاد باری دانشیار صنایع غذایی، دانشگاه ارومیه، ایران میثم طباطبایی استادیار بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج، ایران Journal Article 2016 10 04 Introduction: Ethanol made by a biomass is one of the useful strategies in terms of economic and environmental and as a clean and safe energy to replace fossil fuels considered and examined. <br /> <br />Materials and methods: In this study, key enzyme in the production of ethanol (Pyruvate decarboxylase) from Zymomonas mobilis bacteria was isolated and cloned at E. coli bacteria by freeze and thaw method. For gene cloning, we used specific primers of pdc and PCR reaction and then pdc gene isolated and pET 28a plasmid double digested with (Sal I and Xho I) enzymes. Digestion Products were ligated by T4 DNA ligase in 16 °C for 16 hours. <br /> <br />Results: Results of bacteria culture showed that a few colonies containing pET 28a plasmid could grow. Result of colony pcr of pdc gene with specific primers revealed 1700 bp bands in 1% agarose gel electrophoresis. The results of PCR with T7 promotor forward primer and pdc revers primer have proved the accurate direction of integration of pdc gene into plasmid and revealed 1885 bp band. Double digestion of recombinant plasmid with SalI and XhoI enzymes revealed same bands. Finally, RT showed the expected band of 1700 bp that implies the desired gene expression in the samples. <br /> <br />Discussion and conclusion: Due to the increased production of ethanol via pyruvate decarboxylase gene cloning in expression plasmids with a strong promoter upstream of the cloning site can conclude that, pyruvate decarboxylase cloning as a key gene would be useful and according to beneficial properties of E. coli bacteria, transfering the gene to bacteria appears to be reasonable. مقدمه: اتانول ساخته‌شده از زیست‌توده یکی از راهبردهای بی‌نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می‌تواند به‌عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت‌های فسیلی شود‏. ‏‏<br /> <br /> مواد و روش‏ ‏ها: در این پژوهش کلیدی‌ترین آنزیم مؤثر در مسیر تولید اتانول زیستی (پیروات دکربوکسیلاز) از زایموموناس موبیلیس انتخاب و در اشرشیا کلای به‌روش ذوب-انجماد همسانه‌سازی شد. برای همسانه‌سازی ژن مدِنظر از آغازگرهای اختصاصی ژن پیروات دکربوکسیلاز و واکنش پی‌سی‌آر استفاده شد. سپس ژن پیروات دکربوکسیلاز و پلاسمید pET 28a را آنزیم‌های محدودکننده Sal I و Xho I برش دادند؛ محصولاتی که آنزیم لیگاز برش دادند در دمای ۱۶ درجه سانتی‌گراد و در مدت ۱۶ ساعت به همدیگر متصل شدند. ‏‏<br /> <br /> نتایج: کشت باکتری‌ها در محیط کشت LB انتخابی نشان داد که تنها کلونی‌های حاوی پلاسمید pET 28a قادر به رشد هستند. نتایج کلونی پی‌سی‌آر با آغازگرهای اختصاصی باندهایی در اندازه تقریبی ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد. نتایج مربوط به پی‌سی‌آر پلاسمیدهای نوترکیب توسط آغازگر رفت راه‌انداز T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز، جهت صحیح درج ژن در داخل پلاسمید را ثابت کرد و باندی به‌اندازه ۱۸۸۵ جفت باز را نشان داد و نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدpET 28a pdc  نوترکیب توسط آنزیم‌های Sal I و Xho I باندهای مشابهی را آشکار کرد. درنهایت واکنش RT باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد که حاکی از بیان ژن مورد نظر در این نمونه‌ها بود. ‏<br /> <br /> بحث و نتیجه‏ گیری: از مهم‌ترین مشکلات در بیوسنتز اتانول، محدودیت عملکرد آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول از مواد اولیه نظیر ضایعات کشاورزی است؛ این آنزیم‌ها در تبدیل مواد اولیه پلی‌مری به مواد اولیه با ساختار ساده و قابل تخمیر نقش اساسی دارند. به نظر می‌رسد افزایش بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز تحت کنترل پروموتور قوی T7 منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد شد‏. ‏‏ https://bjm.ui.ac.ir/article_20380_5ff676a727830c635a147ce6f5125499.pdf