دانشگاه اصفهان زیست شناسی میکروبی 3060-7647 4 16 2016 02 20 Gene sequencing, cloning, and expression of the recombinant L- Asparaginase of Pseudomonas aeruginosa SN4 strain in Escherichia coli تعیین توالی ژن، کلونینگ و بیان آل- آسپاراژیناز نوترکیب از سودوموناس آیروجینوزا سویه SN4 در اشریشیاکلی 11 20 19612 FA ارسطو بدویی دلفارد دانشیار بیوشیمی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران زهرا کرمی استادیار بیوشیمی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران نرجس رمضانی پور کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران Journal Article 2016 06 14 Introduction: L- asparaginase is in an excessive demand in medical applications and in food treating industries, the request for this therapeutic enzyme is growing several folds every year. <br /> <br />Materials and methods: In this study, a L- asparaginase gene from Pseudomonas aeruginosa strain SN4 was sequenced and cloned in E. coli. Primers were designed based on L- asparaginase from P. aeruginosa DSM 50071, which show high similarity to SN4 strain, according to 16S rRNA sequence. The L- asparaginase gene was exposed to restriction digestion with NdeI and XhoI enzymes and then ligated into pET21a plasmid. The ligated sample was transformed into competent E. coli (DE3) pLysS DH5a cells, according to CaCl2 method. The transformed E. coli cells were grown into LB agar plate containing 100 µg/ml ampicillin, IPTG (1 mM). <br /> <br />Results: Recombinant L- asparaginase from E. coli BL21 induced after 9 h of incubation and showed high L- asparaginase activity about 93.4 IU/ml. Recombinant L- asparaginase sequencing and alignments showed that the presumed amino acid sequence composed of 350 amino acid residues showed high similarity with P. aeruginosa L- asparaginases about 99%. The results also indicated that SN4 L- asparaginase has the catalytic residues and conserve region similar to other L- asparaginases. <br /> <br />Discussion and conclusion: This is the first report on cloning and expression of P. aeruginosa L- asparaginases in Escherichia coli. These results indicated a potent source of L- asparaginase for in vitro and in vivio anticancer consideration.  مقدمه: ال- آسپاراژیناز جایگاه با ارزشی از جنبه کاربردهای پزشکی و صنایع غذایی دارد. تقاضا برای این آنزیم دارویی هرساله چندین برابر می‏شود.<br /> <br /> مواد و روش‏‏ها: در این پژوهش، یک آسپاراژیناز از سودوموناس ایروجینوزا سویه SN4، تعیین توالی و در اشریشیاکلی کلون شد. پرایمر‏ها بر اساس آل- آسپاراژیناز از سودوموناس ایروجینوزا سویه DSM50071 طراحی شدند که بر اساس توالی ژن 16S rRNA شباهت بالایی را نسبت به سویه SN4 نشان می‏داد. ژن آسپاراژیناز در معرض هضم آنزیمی توسط آنزیم‏های برشی NdeI و XhoI قرار گرفت و سپس، به داخل پلاسمید pET21a الحاق شد. محصول الحاق به درون سلول‏های مستعد E. coli (DE3) pLysS DH5a با روش CaCl2 ترانسفورم شد. سلول‏های<br /> E. coli ترانسفورم شده در محیط LB آگار حاوی 100 میکروگرم/ میلی‏لیتر آمپیسیلین و IPTG (1mM) رشد داده شدند.<br /> <br /> نتایج: ال-‏آسپاراژیناز نوترکیب در باکتری BL21 E. coli پس از 9 ساعت انکوباسیون، به میزان بالایی القا شد و فعالیت آسپاراژینازی بالایی به میزان 4/93 واحد در میلی‏لیتر را نشان داد. ال- آسپاراژیناز نوترکیب تعیین توالی شد و نتایج همردیفی نشان داد که توالی پیشنهادی اسید آمینه‏ایی آن از 350 اسید آمینه تشکیل شده که شباهت بالایی با<br /> ال- آسپاراژیناز‏های سایر سودوموناس ایروجینوز‏ها در حدود 99 درصد را نشان می‏دهد. نتایج نشان می‏دهد که<br /> آل- آسپاراژیناز SN4، باقی‏مانده‏های کاتالیزی و نواحی حفظ شده مشابه با سایر آسپاراژینازها را داراست.<br /> <br /> بحث و نتیجه‏ گیری: پژوهش حاضر نخستین گزارش در مورد کلونینگ و بیان آل- آسپاراژیناز نوترکیب از سودوموناس آایروجینوزا در اشریشیاکلی است که منبع بالقوه‏ایی از ال- آسپاراژیناز را برای بررسی اثر ضدسرطانی آن هم در شرایط آزمایشگاه و هم در موجود زنده فراهم می‏کند.  https://bjm.ui.ac.ir/article_19612_f22b9df52e46ca6e0ff6ad1a8d6e1f1f.pdf