دانشگاه اصفهان زیست شناسی میکروبی 3060-7647 4 14 2015 08 23 Production of recombinant human growth hormone in Eschericia coli strain Origami and comparing freeze/ thaw and sonication methods for proteins extraction تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سویه اوریگامی اشریشیاکلی و مقایسه میزان استخراج آن با دو روش اولتراسونیک و انجماد و ذوب 141 152 19577 FA مرضیه سواری کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران سیدحمید زرکش اصفهانی دانشیار ایمونولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران Journal Article 2016 06 14 <strong>Introduction</strong>:Human growth hormone (hGH) is a single-chain polypeptide derived from pituitary gland that participates in a wide range of biological functions and has therapeutic applications. The hormone consists of 191 amino acid residues (22kD) which folds into a four-helix bundle structure with two disulfide bridges. Due to the complication of internal cell protein extraction, several methods have been established for this purpose that most of them need special instruments. Thus, in the preliminary studies, scientists need a quick and simple method for cell disruption and protein extraction. The aim of the present study was production of hGH in <em>E.coli</em> and comparison between the freeze/thaw and Sonication method for protein extraction from cells. <strong>Materials and methods:</strong> The competent cells of <em>E. coli</em> Origami (DE3) were transformed using plasmid containing human growth hormone gene and then cultured in LB medium. After IPTG induction, the hGH was extracted using various methods including bacterial lysing, freeze/thaw and sonication methods and then extracted protein was assessed using ELISA, Bradford, dot blot and Western blotting. <strong>Results:</strong> According to our findings, bacterial transformation showed high efficiency of transformation. Furthermore, the results of dot blot and Western blot showed production of recombinant hGH at high levels. Protein extraction measurement using ELISA and Bradford methods indicated that the proportion of the extracted protein in the slow freeze/thaw method was higher than the fast freeze/thaw method and was almost equal to sonication method. <strong>Discussion and conclusion:</strong> The extracted protein levels in both of the slow freeze/ thaw and ultrasonic methods was equal, which introduces the slow freeze/thaw method as an excellent substitution for ultrasonic method when special instruments are not available. <strong>مقدمه</strong>: هورمون رشد انسانی یک پروتئین تک‏رشته است که دارای 191 اسید‏آمینه و وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون است. به علت فعالیت‏های زیستی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده‏ایی در پزشکی و بیوتکنولوژیست. از اواخر سال 1970 استفاده از بیان ژن برای تولید پروتئین‏های نوترکیب صنعتی تبدیل به یک صنعت چند میلیارد دلاری شده است. از طرفی مشکلاتی که در استخراج پروتئین درون‏سلولی وجود دارد باعث شده است که چندین روش برای این کار ارایه شود که در بسیاری از این روش‏ها نیاز به تجهیزات خاص است. اما در بیشتر مطالعات، پژوهشگران نیاز به یک روش سریع و ارزان قیمت برای تخریب سلول دارند. هدف این پژوهش، تولید هورمون رشد انسانی توترکیب و مقایسه میزان استخراج آن با روش انجماد و ذوب و روش اولتراسونیک در سویه اوریگامی ‏<em>اشریشیاکلی</em> است‏‏. ‏‏‏ <strong>مواد و روش‏‏ها:</strong> سلول‏ها‏ی مستعد سویه اوریگامی <em>‏اشریشیاکلی </em>با وکتور حاوی ژن هورمون رشد انسانی ترانسفورم شده و با کشت در محیط LB و القا با IPTG هورمون رشد انسانی نوترکیب تولید و با دو روش انجماد و ذوب و اولتراسونیک، استخراج و سپس این پروتئین با استفاده از روش‏ها‏ی الایزا، برادفورد، دات‏بلات و وسترن‏بلات بررسی شد. ‏‏‏ <strong>نتایج:</strong> عمل ترانسفورم کردن باکتری با کارایی بالایی انجام گرفت و نتایج حاصل از دات‏بلات و وسترن‏بلات نشان داد که پروتئین هورمون رشد انسانی نوترکیب به خوبی تولید شد. با استخراج پروتئین با روش‏ها‏ی انجماد و ذوب و اولتراسونیک و بررسی نتایج حاصل از روش‏های الایزا و برادفورد مشخص شد که میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته بیشتر از انجماد و ذوب سریع و کمابیش هم اندازه پروتئین استخراج شده در روش اولتراسونیک است. ‏‏‏ <strong>بحث و نتیجه‏گیری:</strong> برابر بودن میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته و روش اولتراسونیک نشان دهنده این است که روش انجماد و ذوب آهسته، در مواردی که امکان استفاده از تجهیزات خاص و گران‏قیمت مثل اولتراسونیک وجود ندارد، جایگزین مناسبی برای این روش است.  https://bjm.ui.ac.ir/article_19577_13baa9fd8b6794eb06c6d87460b1915d.pdf