بهینه‌سازی محیط‌کشت سویۀ سیانوباکتریوم Fischerella sp. SH.A برای بیشترین تولید اگزوپلی‌ساکارید با فعالیت ضدباکتریایی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران مرکز، تهران، ایران

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

10.22108/bjm.2020.120846.1261

چکیده

مقدمه: در بین ریزموجودات فتوسنتزکننده، سیانوباکتریومsp.  Fischerella منبع نویدبخشی برای جستجوی پلی‌ساکاریدهای با ساختمان جدید است. اگزوپلی‌ساکاریدها مانند مرزی در برابر عوامل ضدمیکروبی عمل می‌کنند؛ به ‌همین‌ علت، امروزه در صنعت به سیانوباکتری‌ها با عنوان عوامل غلیظ‌کننده یا شناورکننده، جاذب فلزات سنگین یا در زمینۀ پلی‌ساکاریدهای سولفاته به‌شکل مواد بیواکتیو بسیار توجه شده است که خود مزیتی در مقایسه با دیگر پلی‌ساکاریدهای جداشده از گیاهان و ریزجلبک‌های دیگر به حساب می‌آید. عوامل بسیاری بر رشد و تجمع متابولیت‌ها در کشت‌های سلولی تأثیر دارند؛ باوجوداین، دانش کافی در زمینۀ عوامل مؤثر بر بیشترین بیوسنتز اگزوپلی‌ساکاریدها و فعالیت ضدباکتریایی وجود ندارد. در مطالعۀ حاضر، به‌منظور انتخاب بهترین شرایط کشت برای کاربرد صنعتی اگزوپلی‌ساکاریدها به بررسی تأثیر هم‌زمان برخی از عوامل فیزیکی، محیطی و غذایی بر تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای تولیدشده از Fischerella sp. SH.A پرداخته شد.
مواد و روش‏‏ها: در مطالعۀ حاضر با هدف بررسی عوامل اصلی مؤثر بر بیوسنتز اگزوپلی‌ساکاریدها و فعالیت ضدباکتریایی، سیانوباکتریوم Fischerella sp. SH.A از آب‌های شیرین استان گلستان جداسازی و پس‌از شناسایی ریخت‌شناختی و مولکولی، همبستگی‌های احتمالی بین نوع تنش و میزان تولید پلی‌ساکارید و فعالیت ضدباکتریایی سنجیده شد.
نتایج: نتایج نشان دادند میزان اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده و فعالیت ضدباکتریایی بسیار به شرایط کشت و شدت روشنایی وابسته است؛ علاوه‌براین، تولید اگزوپلی‌ساکارید در شرایط غیردیازوتروفیک با غلظت نیترات 500 میلی‌مولار و روشنایی 50 یا 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه همبستگی دارد.
بحث و نتیجه‏گیری: ازآنجاکه اگزوپلی‌ساکاریدهای سیانوباکتریایی از دیدگاه زیست‌فناوری جالب توجه هستند، توجه به بسیاری از عوامل دیگر برای بیشترین تولید اگزوپلی‌ساکارید در این جنس اهمیت زیادی دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimizing the Cultivation Conditions of Fischerella sp. SH.A Cyanobacterium for Maximizing Polysaccharide Production with Antibacterial Activity

نویسندگان [English]

  • Shadab Abbaspour 1
  • Bahareh Nowruzi 2
  • S. M. M Hamdi 1
1 Department of Biology, Faculty of science, Central Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran ‎
2 Department of Biology, Faculty of science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran‎
چکیده [English]

Introduction: Among the photosynthetic microorganisms, cyanobacteria belonging to the genus Fischerella appear particularly promising for new polysaccharides producing strains. Extracellular polysaccharides (EPS) serve as a boundary to the immediate environment and play a protective role against antimicrobial agents. That iswhy cyanobacteria are so popular in the industry today as thickeners or floating agents, heavy metal absorbers, or in the case of sulfate polysaccharides as bioactive substances. This is an advantage over other polysaccharides extracted from plants or other macroalgae. There are many factors  affecting cell growth and metabolite accumulation in cell cultures. However, there is insufficient knowledge about the factors affecting maximal EPS biosynthesis and antibacterial activity. In this regard, in this paper, the effect of some physical, environmental, and nutritional factors on the simultaneous production of exopolysaccharide by Fischerella sp. SH.A was investigated in order to select the best cultivation conditions for the industrial application of exopolysaccharides.
Materials and methods: In this study, the cyanobacterium isolated from the fresh water of Golestan province was undertaken with the aim of investigating the key factors regulating EPS biosynthesis and antibacterial activity. After the morphological and molecular identification, the possible correlations between the type of stress and the amount of polysaccharides production were also investigated.
Results: The obtained results indicated that EPS production and antibacterial activity were highly dependent on the culture conditions and light intensity. Furthermore, the production of exopolysaccharides in non-diastrophic conditions was highly correlated with the concentration of nitrate up to 500 mM and the illumination of 50 or 150 microeinsteins per second per square meter.
Discussion and conclusion: Since cyanobacterial extracellular polysaccharides are interesting from the biotechnological point of view, considering some other parameters are of crucial importance for the maximization of EPS production in this genus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cyanobacteria
  • Extracellular Polysaccharide
  • Fischerella sp. SH.A
  • Optimization

مقدمه

غشای خارجی و لیپو‌پلی‌ساکاریدی دیوارة سیانوباکتری‌ها با باکتری‌های گرم منفی مشابه است؛ لایۀ ضخیم پپتیدوگلیکانی دارد و با باکتری‌های گرم مثبت مشابه است. از دهۀ گذشته، بهره‌برداری صنعتی از سیانوباکتری‌ها سود بیشتری نسبت به دیگر پلی‌ساکاریدهای جداشده از گیاهان یا درشت‌جلبک‌های دریایی به همراه داشته است؛ درنتیجه، پژوهش‌های وسیعی در زمینۀ سویه‌های سیانوباکتری‌های دارای ظرفیت ترشح مواد موسیلاژی به‌منظور یافتن پلی‌ساکاریدهای جدید انجام شده‌اند؛ باوجوداین، فقدان اطلاعات در زمینۀ ژن‌های رمزگذاری‌کنندۀ پروتئین‌های درگیر در مسیرهای بیوسنتزی اگزوپلی‌ساکاریدها و عوامل کنترل‌کنندۀ این مراحل، پتانسیل کاربرد زیست‌فناوری آنها را به‌شدت محدود کرده است (1 و 2). تفاوت در محتوای سولفوری و ترکیب مونوساکاریدی گزارش‌شده برای غلاف و پلی‌ساکاریدهای محلول برخی از سیانوباکتری‌ها به‌شدت از فرضیۀ مسیرهای بیوسنتزی مختلف پشتیبانی می‌کند؛ باوجوداین، مطالعه‌های بیشتر برای روشن‌شدن این مسیرها در سیانوباکتری‌ها ضروری‌اند (3 و 4).

از آغاز دهۀ 1950، سیانوباکتری‌های بسیاری با قابلیت سنتز و آزادسازی پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی[1] به محیط معرفی شدند؛ به‌طوری‌که تاکنون، حدود 70 سویه با قابلیت تولید پلی‌ساکاریدهای محلول معرفی شده‌اند. تمام مطالعه‌های انجام‌شده در زمینۀ سویه‌های تولید‌کنندۀ پلی‌ساکاریدهای محلول به زیربخش‌های کروکوکالس[2]، اسیلاتوریالس[3] و نوستوکالس[4] مربوط می‌شوند. طی رشد سلول در کشت مایع، بخش‌هایی از مواد پلی‌ساکاریدی شامل کپسول و لعاب[5] به درون آب آزاد می‌‌شوند و غلظت محیط را افزایش می‌دهند. پلی‌ساکاریدهای محلول به‌آسانی از کشت‌های مایع بازیافت می‌شوند و بسیاری از ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی آنها برای کاربردهای صنعتی مناسب‌اند؛ این موضوع سبب شده است سیانوباکتری‌ها به جذاب‌ترین منبع برای تولید پلیمرهای جدید تبدیل شوند (4-8).

اطلاعات دردسترس از ترکیب مونوساکاریدی اگزوپلی‌ساکاریدهای سیانوباکتری‌ها به حضور مولکول‌‌هایی مانند یک یا دو یورونیک‌اسید[6] اشاره می‌کنند که به‌ندرت در ترکیب اگزوپلی‌ساکاریدهای تولید‌شده از سایر گروه‌های میکروبی یافت می‌شود. حضور گروه‌های سولفات، گروه‌های پیرووات و اسیدهای اورونیک سبب خاصیت آنیونی اگزوپلی‌ساکاریدها و بار منفی ماکرومولکول‌ها می‌شود. در نمونه‌های محدودی، حضور انواع دیگر مونوساکاریدها (برای نمونه، قندهای متیل و قندهای آمینو مانند N- استیل‌گلوکز‌آمین[7]، 2 و 3-O متیل‌رامنوز[8]، 3-O متیل‌رامنوز[9]، 4-O متیل‌رامنوز[10] و 3-O متیل‌گلوکز[11])گزارش شده است؛ این ویژگی با پلیمرهایی که باکتری‌ها یا ریز/درشت جلبک‌های دیگر سنتز می‌کنند و کمتر از چهار مونومر مختلف دارند، مغایرت دارد (9 و 10). در میان مونوساکاریدهای اگزوپلی‌ساکارید سیانوباکتری‌ها، گلوکز سهم بیشتری ازنظر غلظت دارد؛ اگرچه تاکنون پلیمرهایی با قندهای دیگر مانند گزیلوز، آرابینوز، گالاکتوز و فروکتوز در غلظت‌های بیشتر از گلوکز نیز گزارش شده‌اند (11 و 12). ترکیب شیمیایی، نوع و میزان اگزوپلی‌ساکاریدهای تولیدی یک سویۀ سیانوباکتری جزو ویژگی‌های پایدار و به‌طور عمده وابسته به گونه و شرایط کشت است؛ هرچند ترکیب قندی اگزوپلی‌ساکارید تولیدی یک سویۀ معین ممکن است ازنظر کمّی و کیفی با سن کشت نیز مرتبط باشد (13 و 14). طی دهۀ گذشته، مطالعه‌های بسیاری برای فهم ژنتیکی و بیوشیمیایی بیوسنتز اگزوپلی‌ساکاریدها در باکتری‌ها انجام شده‌اند؛ اما اطلاعات دردسترس دربارۀ سیانوباکتری‌ها در زمینۀ یادشده بسیار محدود است (15).

سازوکارهای درگیر در سنتز مستقیم اگزوپلی‌ساکاریدها در باکتری‌ها بسیار محافظت‌‌شده هستند و از چهار مرحلۀ مختلف شامل فعال‌سازی مونوساکاریدها و تبدیل آنها به نوکلئوتیدهای قندی در سیتوپلاسم، تجمع واحدهای تکراری با اضافه‌شدن پشت‌سر‌هم قندها به درون ناقل لیپید به کمک گلیکوزیل‌ترانسفرازها در غشای پلاسمایی، پلیمریزاسیون واحدهای تکراری در سطح پری‌پلاسمی غشای پلاسمایی و صادر‌شدن پلیمر به سطح سلول تشکیل شده‌اند (16-19).

توانایی سنتز لایۀ پلی‌ساکاریدی خارج‌سلولی یکی از سازوکارهای حفاظتی سیانوباکتری‌ها برای زنده‌ماندن در زیستگاه‌های سخت است که از سلول‌ها در شرایط محیطی نامطلوب محافظت می‌کند (20 و 21). توانایی سلول‌های باکتریایی در سنتز مواد خارج‌سلولی با طبیعت پلی‌ساکاریدی به‌طور مستقیم با محدودیت‌های محیطی مرتبط است که ریزموجود با آن مواجه است (22)؛ به‌طوری‌که تغییرات شرایط به‌ویژه تغییر محیط‌کشت سیانوباکتری‌ها با میزان تولید اگزوپلی‌ساکارید و ترکیبات ضدباکتریایی آنها ارتباط مستقیم دارد (22-24).

تکامل کاربردهای زیست‌فناوری اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها به شناسایی عوامل مؤثر بر افزایش سنتز اگزوپلی‌ساکاریدها بستگی دارد. ازآنجاکه منابع مختلف نیتروژنه، اسیدیته، میزان رقیق‌سازی، فاز رشد، حضور و غیاب منیزیم، کلسیم، پتاسیم و فلزهای سنگین، همچنین اضافه‌کردن گلی‌اکسیلات، استات، والرات، گلوکز، سیترات و EDTA، تابش، چرخۀ روشنایی، دما، شوری، جریان هوا، مرحلۀ رشد، سن کشت و غلظت سولفور، فسفر و پتاسیم تأثیر متفاوتی بر تولید اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها دارند، مشکل بتوان نتیجه گرفت تفاوت‌های گزارش‌شده در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها از تفاوت‌های فیزیولوژیکی گونه‌ها ناشی می‌شود یا با تفاوت در شرایط کشت آزمایشگاهی به‌کاررفته مرتبط است (13، 25 و 26).

طی چند سال گذشته، جداسازی چندین متابولیت متنوع و جدید با فعالیت‌های داروشناختی (ضدسرطانی، آنتی‌بیوتیکی، ضدویروسی، ضدقارچی) و همچنین ترکیبات بازدارندۀ پروتئازی و نظایر آن از سیانوباکتری‌ها و تشخیص آنها، اهمیت استفاده از این موجودات به‌شکل موجودات باارزش در صنایع داروسازی را آشکارتر کرده است (27-31)؛ ازاین‌رو، بررسی میزان اگزوپلی‌ساکاریدهای تولید‌شده و همچنین مساعدکردن محیط، گام مهمی در معرفی سویه‌های سیانوباکتریایی بالقوه ازنظر دارویی به شمار می‌آید. باتوجه‌به مطالب یادشده، بررسی پتانسیل سیانوباکتری با ‌عنوان موجود دارای قابلیت تولید پلی‌ساکاریدهای مفید و تعیین بهترین شرایط تولید مواد خارج‌سلولی از اهداف مقالۀ حاضر است و در این راستا، تأثیر برخی از مهم‌ترین عوامل تأثیر‌گذار بر تولید پلی‌ساکارید خارج‌سلولی و ضدباکتریایی بررسی می‌شود.

 

مواد و روش‌ها

کشت و شناسایی ریخت‌شناختی سویۀ سیانوباکتریوم آب شیرین:ابتدا سویۀ سیانوباکتریوم آب شیرین جمع‌آوری‌شده از استان گلستان (39º 40’ 26” N, 41º 26’ 34” E) از مجموعه کشت سیانوباکتری‌های دانشگاه آزاد، واحد علوم و تحقیقات Cyanobacteria Culture Collection (CCC) واقع در هرباریوم البرز تهیه و کشت داده شد. به‌منظور خالص‌سازی نمونه، چندین بار کشت‌های متوالی انجام شدند و درنهایت، کشت نمونه‌های خالص‌شده در محیط‌کشت جامد BG110 انجام شد و نمونه‌ها به‌مدت 30 روز در اتاقک رشدی با دمای 2±28 درجۀ سانتی‌گراد و روشنایی ممتد فلورسنت با شدت 300 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه[12] نگهداری شدند (32).

شناسایی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناختی نمونه با میکروسکوپ نوری مجهز به میکرومتر مدرج و با مراجعه به کلیدهای شناسایی (33) انجام شد. چندین شاخص شامل طول و قطر سلول‌های رویشی، حضور هتروسیست[13] و آکینت[14]، ریخت‌شناسی سلول انتهایی، فاصلۀ بین هتروسیست‌ها و فاصلۀ نزدیک‌ترین آکینت، حضور یا غیاب هتروسیست‌های انتهایی، شکل رشته‌ها و تجمع در کلنی‌ها طی مطالعه‌های ریخت‌شناختیبررسی شدند (34).


شناسایی مولکولیسویۀ سیانوباکتریوم آب شیرین

استخراج DNA ژنومیک: کشت‌های ده‌روزه برای استخراج DNA استفاده شدند؛ به این منظور، ابتدا باید از خلوص کشت‌ها اطمینان یافت و ازاین‌رو، آزمایش نمونه‌های آکزنیک با تلقیح در محیط‌کشت R2A (R2A LAB163) انجام شد؛ سپس ظرف‌های پتری تلقیح‌شده به‌مدت 5 تا 7 روز در دمای 22 درجۀ سانتی‌گراد یا به‌مدت 3 روز در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس‌از رشد، حضور یا غیاب کلنی در اطراف هر نقطه بررسی شد و چنانچه کلنی باکتریایی در اطراف نقطه‌ای ایجاد شده بود، کشت‌های متوالی انجام شدند تا از خلوص نمونه اطمینان حاصل شود (35).

استخراج DNA با استفاده از کیت E.Z.N.A. SP Plant DNA kit  (Omega Bio-tek, Inc., Norcross, GA, USA) انجام و DNA با اسپکتروفوتومتر NanoDrop ND-1000  (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) کیفیت‌سنجی شد (28).

تکثیر ژن 16S rRNA به کمک PCR: تکثیر ژن 16S rRNAبا استفاده از آغازگر رفت[15] و آغازگر برگشت[16] انجام (جدول 1) و اندازۀ محصولات در مقایسه با DNA نشانگر (λ/HinfIII + φx/HaeIII; Finnzymes) سنجیده شد. محصولات PCR با استفاده از کیت Geneclean Turbo (Qbiogene/MP Biomedicals, Solon, OH, USA) خالص شدند (28).

 

 

جدول 1- آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی 16S rRNA استفاده‌شده در مطالعۀ حاضر (28)

Target gene/sequence

Sequence 5´      3´

16S rRNA

pA (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')

B23S (5'-CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT-3')

 


توالی‌یابی، تجزیه‌وتحلیل و ثبت ژن: سویۀ مطالعه‌شده به‌منظور توالی‌یابی به شرکت میکروسینس سوئیس ارسال شد.بررسی‌های Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) ژن 16S rRNA برای شناسایی شباهت توالی با توالی‌های مشابه در بانک اطلاعات ژنی NCBI انجام شدند (36). عملیات ثبت ژن با نرم‌افزار bankit موجود در سایت http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank انجام شد. به‌منظور دریافت کد دسترسی[17]، توالی‌های نوکلئوتیدی توالی‌یابی‌شدۀ دو سویه در پایگاه داده‌های (DDBJ)[18] ثبت شدند و به آنها رمز یا شماره‌ای تعلق گرفت که مخصوص آن توالی بود.

طراحی بهترین شرایط کشت برای بیشترین تولید اگزوپلی‌ساکارید:مهم‌ترین عوامل تأثیر‌گذار بر تولید پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی سیانوباکتری‌ها انتخاب شدند (37 و 38) و سپس با هدف تولید بیشترین میزان پلی‌ساکارید (متابولیت ثانویۀ ارزشمند)، برهم‌کنش چندین عامل اکوفیزیولوژیکی در دو شرایط تغذیه‌ای فتوتروف و میکسوتروف ارزیابی شد تا درنهایت، بهینه‌ترین شرایط کشت برای رشد سیانوباکتریوم آب شیرین به‌منظور تولید پلی‌ساکارید پیشنهاد شود.

الف- برای کشت‌های فتوتروفیک از محیط‌کشت BG-110 در شرایط دیازوتروف و بدون منابع نیتروژنه استفاده شد.

ب- برای تهیۀ محیط‌کشت میکسوتروفیک از غلظت‌های مختلف گلوکز (2 و 5 گرم‌برلیتر) و سوکروز (2 و 5 گرم‌برلیتر) استفاده شد.

ج- محیط‌کشت BG-110 با غلظت‌های متفاوت فسفات (10، 20 و 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) برای کشت‌های غیردیازوتروفیک استفاده شد (39).

د- محیط‌کشت BG-110 با غلظت‌های متفاوت نیترات (100، 250 و 500 میلی‌مولار) (منبع نیتروژن) برای کشت‌های غیردیازوتروفیک به کار رفت (40 و 41).

محیط‌کشت‌های آماده‌شده طبق آزمون‌های طراحی‌شده (الف تا د) در دو شدت روشنایی مختلف ۵۰ و ۱۵۰ میکروانشتین در مترمربع در ثانیه قرار گرفتند؛ به‌طوری‌که سمتی از اتاقک کشت، میانگین شدت روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه و سمت دیگر اتاقک کشت، میانگین شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه را دریافت می‌کرد (42).

.جداسازی پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی(EPS): استخراج پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولیبه روش تغییریافتۀ Ozturk و همکاران (43) انجام شد. کشت‌های سی‌روزه برای جداسازی پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولیاستفاده شدند. سلول‌ها در دمای اتاق و با سانتریفیوژ به‌مدت 10 دقیقه در 10700 دوردردقیقه جدا شدند و رسوب با مقدار مناسبی آب مقطر به‌مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجۀ سانتی‌گراد جوشانده شد. محلول به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری و دوباره در تری‌کلرواستیک‌اسید 5 درصد حل شد و سپس به‌مدت 2 ساعت در 100 درجۀ سانتی‌گراد جوشانده شد؛ محلول حاصل پس‌از سردشدن به‌مدت 30 دقیقه در 10700 دوردردقیقه سانتریفیوژ و سپس بخش رویی شامل پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولیجدا و هم‌حجم آن، اتانول اضافه شد. مخلوط در 4 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت یک شب قرار گرفت و دوباره به‌مدت 30 دقیقه در 10700 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل دو بار با اتانول 96 درصد شسته و به‌مدت 30 دقیقه در 10700 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب نهایی در 1 میلی‌لیتر آب دوبارتقطیر حل و در منفی 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.

 

بررسی آثار ضدباکتریایی به روش انتشار: در این روش از دیسک‌های کاغذی آغشته به عصارۀ سیانوباکتریایی حل‌شده در متانول (بازدارندۀءرشد باکتری‌ها) استفاده و نتیجه به‌شکل هالۀ رشدنکردن ظاهر شد. به‌منظور مناسب‌کردن محیط‌کشت برای بیشترین تولید اگزوپلی‌ساکارید، ابتدا سویۀ مدنظر در محیط‌کشت عمومی سیانوباکتری‌ها بدون منابع نیتروژنه کشت داده شد و سپس به بررسی قدرت ممانعت‌کنندگی سویه در برابر باکتری‌های گرم مثبت Staphylococcus aureus (PTCC 1112)، Bacillus cereus (PTCC 1015) و باکتری‌های گرم منفی Escherichia coli (PTCC 1047) و Enterobacter sp. 638پرداخته شد. به‌منظور آماده‌کردن عصاره‌های سیانوباکتریایی از فاز ایستایی رشد (روز 15) استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که زیست‌تودۀ حاصل به کمک کاردک پلاستیکی از سطح هر ظرف پتری جمع‌آوری و به‌مدت 1 ساعت در گرمخانۀ 60 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. مقدار 500 میلی‌گرم از زیست‌تودۀ خشک‌شده در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد درون چند میکروتیوب تقسیم (هرکدام 100 میلی‌گرم) و 300 میلی‌گرم دانۀ شیشه‌ای 5/0 میلی‌متری (disruptor beads, Scientific Industries) و 1 میلی‌لیتر حلال به هرکدام اضافه شد؛ سپس ورتکس به‌مدت 30 دقیقه انجام شد تا دیوارۀ اسکلتی سیانوباکتری‌ها کاملاً از بین برود. مخلوط به‌مدت 5 دقیقه در 10000 دوردرددقیقه سانتریفیوژ و سپس بخش رویی برای بررسی ویژگی‌های ضدباکتریایی در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد (44).

به‌منظور کشت 24 ساعتۀ باکتری‌ها از محیط‌کشت مولر‌هینتون‌آگار استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که 34 گرم پودر مولرهینتون‌آگار و 5/0 میکروگرم متیلن‌بلو در 1 لیتر آب مقطر حل شد (به کمک هم‌زن مغناطیسی و روی هیتر). متیلن‌بلو کمک می‌کند پس‌از جامدشدن محیط و قرارگرفتن دیسک‌های کاغذی، قطر منطقۀ بازدارندگی(IZ) [19] با وضوح بیشتری مشاهده و اندازه‌گیری شود. پیش‌از آغاز آزمایش، باکتری‌ها آماده شدند؛ به‌این‌ترتیب کهباکتری‌ها در محیط مولر‌هینتون‌آگار به‌مدت 24 ساعت در 35 درجۀ سانتی‌گراد رشد داده شدند. کلنی‌های رشدیافتۀ باکتری‌ها به 2 میلی‌لیتر محلول نمکی )‌کلریدسدیم 145/0 مولار) منتقل شدند تا سوسپانسیون تشکیل شود؛ سپس کدورت هر سوسپانسیون با استاندارد 5/0 مک‌فارلند[20] تنظیم شد. به‌منظور تهیۀ لولۀ 5/0 مک‌فارلند، 175/1 درصد کلریدباریم به 95/9 میلی‌لیتر سولفوریک‌اسید 1 درصد اضافه شد؛ کدورت ایجادشده تقریباً معادل 108×5/1 کلنی در هر میلی‌لیتر باکتری بود. پس‌از آماده‌سازی محیط‌کشت باکتری‌ها و تلقیح هر ظرف پتری با سوسپانسیون باکتریایی با کدورت تنظیم‌شده، هر دیسک با 100 میکرولیتر عصارۀ سیانوباکتریایی تلقیح شد. ظرف‌های پتری با پارافیلم بسته و به‌مدت 24 ساعت در گرمخانه‌ای با دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند. قطر مناطق بازدارندۀ رشد شامل قطر دیسک کاغذی با خط‌کش اندازه‌گیری و به میلی‌متر گزارش شد (31 و 45). پس‌از یافتن هالۀ ممانعت از رشد باکتری آزمایش‌شده، سویۀ بررسی‌شده با غلظت‌های مختلف گلوکز و سوکروز (2 و 5 گرم‌بر‌لیتر)، فسفات (10، 20 و 30 میلی گرم‌بر‌لیتر) و نیترات (100، 250 و 500 میلی‌مولار) کشت شد و ویژگی‌های ضدباکتریایی سنجیده شدند.

جداسازی مواد بیواکتیو با TLC[21]:به‌منظور جداسازی مادۀ بیواکتیو دارای ویژگی‌های ضدباکتریایی، محیط‌کشتی که بیشترین قطر هالۀ رشدنکردن را داشت، انتخاب و آزمون TLC انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که زیست‌تودۀ سیانوباکتریایی (10 گرم وزن تر) رسوب‌گیری و با آب مقطر شسته و لیوفیلیزه شد. مقدار 1 گرم از زیست‌تودۀ به‌دست‌آمده دو بار با 100 میلی‌لیتر متانول شسته و سپس به‌مدت 30 دقیقه در 20000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی به‌دست‌آمده تا زمانی که خشک شود، تبخیر و باقیمانده دوباره در متانول (5 میلی‌لیتر) حل شد. به‌منظور استخراج به روش TLC (Mercksilicagel-60) از حلال تتراکلریدکربن: متانول (1:9 حجمی- حجمی) استفاده شد، سپس باندهای حاصل از هم جدا و در حلال متانولی حل شدند و دوباره آزمون آنتی‌بیوگرام برای هریک از باندها انجام شد (45).

تجزیه‌وتحلیل آماری: تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌های هر آزمایش با نرم‌افزار SPSS (نسخۀ 16) و Excel انجام شد. تمام داده‌ها، نتایج سه تکرار بودند. تفاوت معنادار بین عوامل اندازه‌گیری‌شده به کمک آنالیز واریانسیک‌طرفهبا حدود اطمینان 95 درصد و مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون توکی[22] بررسی شد. نتایج مقایسه‌ها به‌شکل نمودار با برنامۀ Excel رسم شدند.

 

نتایج

نتایج تجزیه‌وتحلیل توالی نوکلئوتیدی حاصل از ژن 16S rRNA: سویۀ مطالعه‌شده به میزان 95 درصد با سویۀ Fischerella sp. HKAR-5 شباهت نشان داد. سویۀ مطالعه‌شده با نام Fischerella sp. SH.A و کد دسترسی MN817980 در بانک ژن ثبت شد.

اثر غلظت‌های متفاوت نیترات، فسفات، گلوکز و سوکروز بر میزان اگزوپلی‌ساکارید تولید‌شده: نتایج تحلیل آماری SPSS و آزمون توکی نشان دادند استفاده از نیترات با غلظت 500 میلی‌مولار و شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه با اختلاف معناداری دارای بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید نسبت به سایر غلظت‌هاست؛ پس‌ازآن، غلظت نیترات 250 میلی‌مولار دارای بیشترین مقدار اگزوپلی‌ساکارید گزارش شد. نتایج نشان دادند استفاده از غلظت نیترات 100 میلی‌مولار با اختلاف معناداری دارای کمترین میزان تولید اگزوپلی‌ساکارید است. نتایج نشان دادند در شرایط غیردیازوتروفی، سویۀ Fischerella sp. SH.A بیشترین انرژی خود را صرف تولید اگزوپلی‌ساکاریدها می‌کند. به نظر می‌رسد دردسترس‌بودن نیترات، مهم‌ترین عامل مؤثر بر تولید اگزو‌پلی‌ساکارید، تراکم سلولی و وزن خشک ‌پلی‌ساکارید خارج‌سلولی در Fischerella sp. SH.A است؛ همچنین مقدار پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی به‌شدت تحت‌تأثیر میزان روشنایی دریافت‌شده قرار دارد؛ به‌طوری‌که این میزان در کشت‌های رشد‌یافته در غلظت نیترات 500 میلی‌مولار با روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه تقریباً 3 برابر کشت‌های رشد‌یافته در همان غلظت نیترات با شدت روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه و 8 برابر کشت‌های رشد‌یافته در شرایط شاهد با همان شدت روشنایی گزارش شد (شکل 1) و تفاوت معناداری بین کشت‌های دیازوتروف و غیردیازوتروف وجود داشت. میزان پلی‌ساکاریدهای کشت‌های رشد‌یافته در غلظت نیترات 500 میلی‌مولار با شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه برابر 300 میلی‌گرم بود و میزان پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در کشت‌های رشد‌یافته در غلظت نیترات 500 میلی‌مولار با روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به 87 میلی‌گرم رسید و تقریباً 8 برابر پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در کشت‌های دیازوتروف با شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه و 5/4 برابر کشت‌های دیازوتروف با شدت روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه بود؛ همچنین میزان اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده در غلظت نیترات 500 میلی‌مولار با روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه 5/1 برابر و در روشنایی 50 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه 7/1 برابر غلظت نیترات 250 میلی‌مولار بود. در کشت‌های با غلظت‌های مختلف نیترات، روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه با تولید درمجموع 542 میلی‌گرم اگزوپلی‌ساکارید، شرایط برتر شناخته شد (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- مقایسۀ میزان تولید اگزوپلی‌ساکاریدها (ستون‌های مشکی‌رنگ) در شرایط تغذیه‌ای با غلظت‌های مختلف (100، 250 و 500 میلی‌مولار) نیترات با شرایط دیازوتروفیک (شاهد) در شدت روشنایی 150 و 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه؛ تحلیل‌های آماری با آزمون‌ توکی، اختلاف معناداری (05/0P<) را بین غلظت‌های مختلف نیترات و شاهد نشان می‌دهند. اعداد هر نمودار، میانگین سه تکرار هستند و حرف‌های متفاوت در هر ستون نشان می‌دهند تفاوت معناداری بین میزان اگزوپلی‌ساکارید در غلظت‌های مختلف نیترات وجود دارد.

 

 

در کشت‌های میکسوتروف نیز سنتز پلی‌ساکاریدهای کل تحت‌تأثیر شدت روشنایی و حضور غلظت 2 گرم‌بر‌لیتر گلوکز یا غلظت 5 گرم‌بر‌لیتر سوکروز بود. بیشترین مقدار پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در سویۀ Fischerella sp. SH.A و در حضور گلوکز با غلظت 2 و 5 گرم‌بر‌لیتر و روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به‌ترتیب برابر 5/45 و 5/1 میلی‌گرم گزارش شد؛ درحالی‌که مقادیر کمتر در روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به‌ترتیب برابر 29 و 46/0 میلی‌گرم به دست آمدند (شکل 2). مقدار پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در حضور سوکروز با غلظت 2 و 5 گرم‌بر‌لیتر و روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به‌ترتیب 20 و 41 میلی‌گرم گزارش شد؛ درحالی‌که مقادیر کمتر در روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به‌ترتیب 4 و 5/32 میلی‌گرم به دست آمدند (شکل 2).

میزان پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در حضور گلوکز با غلظت 5 گرم‌بر‌لیتر بسیار کم بود؛ به‌طوری‌که این میزان تقریباً 41 برابر کمتر از میزان پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در کشت‌های رشد‌یافته در غلظت گلوکز 2 گرم‌بر‌لیتر و 31 برابر کمتر از پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در کشت‌های دیازوتروف گزارش شد. نتایج نشان دادند غلظت 5 گرم‌بر‌لیتر گلوکز اثر ممانعت‌کنندگی روی میزان کل اگزوپلی‌ساکاریدها دارد؛ همچنین بررسی‌ها مشخص کردند تفاوت معناداری بین تولید اگزو‌پلی‌ساکارید در غلظت 5 گرم‌بر‌لیتر تحت‌تأ‌ثیر شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه و 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه وجود ندارد و برعکس، تأثیر افزایندۀ غلظت 2 گرم‌بر‌لیتر گلوکز و 5 گرم‌بر‌لیتر سوکروز در تولید بیشتر اگزوپلی‌ساکارید استنتاج می‌شود (شکل 2).

 

 

 

شکل 2- مقایسۀ میزان تولید اگزوپلی‌ساکاریدها (ستون‌های مشکی‌رنگ) در شرایط تغذیه‌ای با غلظت‌های مختلف (2 و 5 گرم‌بر‌لیتر) گلوکز و سوکروز در شدت‌های روشنایی 150 و 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه؛ تحلیل‌های آماری با آزمون توکی، اختلاف معناداری را بین غلظت‌های مختلف گلوکز و سوکروز با شاهد در سطح اطمینان (05/0P<) نشان می‌دهند. اعداد هر نمودار، میانگین سه تکرار هستند و حرف‌های متفاوت در هر ستون نشان می‌دهند تفاوت معناداری در میزان اگزوپلی‌ساکارید در غلظت‌های متفاوت گلوکز و سوکروز وجود دارد.

 

 

 

میزان اگزوپلی‌ساکارید کل تولید‌شده در غلظت فسفات 10، 20 و 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر در شدت روشنایی 150 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه به‌ترتیب برابر 8/45، 8/40 و 5/18 میلی‌گرم و میزان اگزوپلی‌ساکارید کل در روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه به‌ترتیب برابر 21، 8/17 و 8/16 میلی‌گرم گزارش شد. نتایج نشان دادند میزان تولید اگزو‌پلی‌ساکارید در غلظت فسفات 10 و 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر در شرایط روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه تقریباً 2 برابر این میزان در شرایط روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه است؛ علاوه‌براین، نتایج نشان دادند غلظت فسفات 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر در هر دو شدت روشنایی، شرایط برتر نسبت به غلظت فسفات 20 و 30 میلی‌‌گرم‌بر‌لیتر است (شکل 3). مقدار اگزوپلی‌ساکارید در سلول‌های سویۀ Fischerella sp. SH.A کشت‌شده تحت‌تأثیر غلظت 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر فسفات در روشنایی 150 و 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه 1 تا 2/1 برابر بیشتر از سلول‌های کشت‌شده در شرایط شاهد با همین شدت روشنایی گزارش شد؛ در شدت روشنایی 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه، غلظت‌های مختلف فسفات اختلاف معناداری در تولید اگزوپلی‌ساکارید کل ایجاد نکردند (شکل 3).

درکل، نتایج بررسی میزان تولید پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در روز سی‌ام کشت نشان دادند میزان نیترات و شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه، مهم‌ترین عوامل در افزایش تولید اگزو‌پلی‌ساکاریدها هستند (شکل 4).

 

 

 

 

شکل 3- مقایسۀ تأثیر غلظت‌های مختلف (10، 20 و 30 میلی‌گرم‌برلیتر) فسفات و شدت روشنایی 150 و 50 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه با شاهد بر میزان تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای کل خارج‌سلولی؛ تحلیل‌های آماری با آزمون توکی، اختلاف معناداری را بین غلظت‌های مختلف فسفات و شاهد در سطح اطمینان (05/0P<) نشان می‌دهند. اعداد هر نمودار، میانگین سه تکرار هستند و حرف‌های متفاوت در هر ستون نشان می‌دهند تفاوت معناداری در میزان اگزوپلی‌ساکارید در غلظت‌های متفاوت فسفات وجود دارد.

 

شکل 4- مقایسۀ تأثیر غلظت‌های مختلف نیترات، فسفات، گلوکز و سوکروز در شدت روشنایی 150 و 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه با شرایط دیازوتروفیک (شاهد) بر میزان تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای کل خارج‌سلولی به کمک تحلیل‌های آماری و آزمون توکی در سطح اطمینان (05/0P<). اعداد هر نمودار، میانگین سه تکرار هستند و حرف‌های متفاوت در هر ستون نشان می‌دهند تفاوت معناداری در میزان اگزوپلی‌ساکارید در غلظت‌های متفاوت نیترات وجود دارد.

 


.نتایج بررسی ریخت‌شناختی Fischerella sp. SH.A در تیمارهای مختلف: به‌طور خلاصه، نتایج بررسی ریخت‌شناختی سویۀ مطالعه‌شده در غلظت‌های مختلف گلوکز نشان دادند در نور کم، سویۀ مطالعه‌شده انشعابات بیشتری را تولید می‌کند و در کشت‌های رشد‌کرده با غلظت‌های 2 و 5 گرم‌برلیتر سوکروز، ریسه‌های بدون انشعاب بیشتر دیده می‌شوند؛ به‌طوری‌که انشعابات معمولاً کوتاه هستند. بررسی ریخت‌شناختی کشت‌های رشد‌کرده در نیترات نشان داد غلظت 500 میلی‌مولار از تشکیل انشعاب ممانعت می‌کند و در غلظت 250 میلی‌مولار نیز انشعابات بسیار کم و سوزنی‌شکل هستند. در کشت‌های رشدکرده در غلظت‌های متفاوت فسفات، ریسه‌ها تمایلی به تشکیل انشعاب نداشتند و تنها در غلظت‌های 10 و 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر، انشعابات کوتاهی تولید شدند. در سایر نمونه‌ها، تعداد زیادی آکینت در محور اصلی و پشت‌سر‌هم وجود داشتند (شکل 5). جزئیات بیشتر این بررسی‌ها در جدول 2 بیان شده است.

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

شکل 5- A. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار گلوکز در غلظت 5 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، B. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار گلوکز در غلظت 5 میلی گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، C. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار گلوکز در غلظت 2 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، D. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار گلوکز در غلظت 2 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، E. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار سوکروز در غلظت 5 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، F. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار سوکروز در غلظت 5 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در متر‌‌مربع در ثانیه (400X)، G. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار سوکروز در غلظت 2 میلی‌گرم‌برلیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، H. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار سوکروز در غلظت 2 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه (400X)، I. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 500 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، J. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 500 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)، K. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 100 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ L. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 100 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)Y؛ M. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 250 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ N. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار نیترات در غلظت 250 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ O. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار بدون نیترات با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ P. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار بدون نیترات  با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ Q. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ R. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 10 میلی‌گرم‌برلیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه (400X)؛ S. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه (400X)؛ T. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه (400X)؛ U. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه (400X)؛ V. ریخت‌شناسی ریسه‌ها در تیمار فسفات در غلظت 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه(400X)

 

جدول 2- شرح ریخت‌شناسی سویۀ مطالعه‌شده در تیمارهای مختلف

نوع تیمار

شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

ریخت‌شناسی کلنی‌ها روی پلیت

ریخت‌شناسی سلول‌ها زیر میکروسکوپ نوری

ریخت‌شناسی کلنی‌ها روی پلیت

ریخت‌شناسی سلول‌ها زیر میکروسکوپ نوری

گلوکز 2 گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز چمنی تیره، کروی و مجزا دیده می‌شوند.

انشعابات به‌ندرت وجود دارند و نسبتاً کوتاه هستند. برخی از ریسه‌ها بدون دیوارۀ عرضی هستند. سلول‌های بدون انشعاب بلند فراوان هستند. آکینت‌های کروی پررنگ جدا‌شده به‌‌فراوانی دیده می‌شوند، هتروسیست‌های مستطیلی بزرگ در محور اصلی دیده می‌شوند، سلول‌های رویشی در محور اصلی استوانه‌ای شکل هستند.

کلنی‌ها به رنگ سبز چمنی در اندازه‌های کوچک هستند و به‌طور پراکنده، گاهی جدا و گاهی به‌هم‌چسبیده دیده می‌شوند.

انشعابات طویل بدون دیوارۀ عرضی و دارای آکینت‌های درشت و کروی هستند.

گلوکز 5 گرم بر لیتر

کلنی‌های سبز پررنگ و بسیار متراکم دیده می‌شوند.

انشعابات کوتاه و دارای دیوارۀ عرضی هستند. آکینت‌های سبز چمنی و درحال تقسیم و تولید ریسه‌هایی با چهار تا پنج سلول و سلول‌های محور اصلی استوانه‌ای شکل دیده می‌شوند.

کلنی‌ها به رنگ سبز چمنی با تراکم کلنی‌های کم دیده می‌شوند.

تمام محور اصلی دارای انشعابات است؛ انشعابات بلند، کوتاه و فراوان هستند. سلول‌های انشعابات دیوارۀ عرضی دارند. آکینت‌های درحال تقسیم به‌شکل منفرد یا پشت‌سر‌هم در ریسه قرار گرفته‌اند. سلول‌های محور اصلی مربع تا مستطیلی‌شکل هستند.

سوکروز 2 گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز لجنی مایل به قهوه ای، بیشتر کروی‌شکل و به‌طورتوده‌ای و چسبیده به سطح محیط‌کشت دیده می‌شوند.

دو ردیفی‌شدن سلول‌ها در محور اصلی درنتیجۀ تقسیم‌های آکینت دیده می‌شود، عرض سلول‌ها دو برابر طول در محور اصلی است، انشعابات به‌ندرت دیده می‌شوند و کوتاه هستند، هتروسیست های مستطیلی حضور دارند.

کلنی‌ها به رنگ سبز تیره هستند. تراکم در سطح پلیت بسیار زیاد است و تمام سطح پلیت را پوشانده اند و در برخی نواحی به‌شکل توده تجمع یافته‌اند.

عرض سلو‌ل‌ها دو برابر طول آنهاست. انشعابات بسیار به‌ندرت دیده می‌شوند. آکینت‌ها پشت‌سر‌هم در طول ریسه قرار دارند.

سوکروز 5 گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز لجنی و تقریباً کروی‌شکل دیده می‌شوند، تراکم آنها زیاد است و به‌‌شکل کلنی‌های مجزا در کنار هم رشد کرده‌اند.

انشعابات کم و کوتاه هستند. در محور اصلی، آکینت‌های درحال تقسیم وجود دارد.

کلنی‌های سبز لجنی مایل به قهوه‌ای به‌طور متراکم و کنار هم و چسبیده به سطح پلیت مشاهده می‌شوند.

ریسه‌ها کوتاه به همراه آکینت‌های درحال تقسیم فراوان هستند و انشعابات بسیار به‌ندرت دیده می‌شوند.

نیترات 100 میلی مولار

کلنی‌ها به رنگ سبز روشن و به‌شکل لایۀ نازکی روی سطح محیط‌کشت گسترش یافته‌اند.

ریسه‌های بی‌رنگ و منشعب، آکینت‌های درحال تقسیم دیده می‌شوند.

کلنی‌ها به رنگ سبز روشن هستند، در سطح پلیت گسترش یافته‌اند و در برخی نواحی به‌شکل توده‌های متراکم و تیره‌تر دیده می‌شوند.

ریسه‌ها بدون انشعاب، دارای تعداد زیادی آکینت در محور اصلی و درحال تقسیم هستند.

نیترات 250 میلی مولار

کلنی‌های بسیار کوچکی وجود دارند و به رنگ سبز روشن دیده می‌شوند.

تعداد زیادی آکینت‌های درحال تقسیم در محور اصلی و همچنین در انشعابات دیده می‌شوند، انشعابات کوتاه هستند.

کلنی‌های بسیار کوچکی وجود دارند و به رنگ سبز روشن تا تیره دیده می‌شوند.

انشعابات سوزنی، بی‌رنگ و بسیار کوتاه هستند. سلول‌ها در محور اصلی در دو ردیف قرار گرفته‌اند. سلول‌های انشعابات بدون دیوارۀ عرضی هستند. آکینت‌های جدا‌شده فراوان هستند. سلول‌های محور اصلی بیضوی‌شکل هستند.

نیترات 500 میلی مولار

کلنی‌ها به رنگ سبز دیده می‌شوند و در سطح پلیت به‌شکل لایه‌ای یکنواخت پراکنده هستند و در مرکز محیط‌کشت به‌شکل توده‌های متراکم و تیره‌تر تجمع یافته‌اند.

ریسه‌ها بدون انشعاب، تمام سلول‌های محور اصلی دارای تعداد زیادی آکینت به‌شکل پیوسته و جداشده و درحال تقسیم هستند.

کلنی‌ها به رنگ سبز چمنی روشن به‌شکل لایۀ نازکی سطح پلیت را پوشش داده‌اند

شکل سلول‌ها، تقسیم آکینت‌ها و فقدان انشعاب مانند در معرض بودن با شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه است.

بدون نیتروژن

کلنی‌های سبز متراکم پر‌رنگ و لجنی دیده می‌شوند.

تعداد زیادی انشعابات کوتاه، حضور آکینت‌های درحال تقسیم در محور اصلی و همچنین انشعابات دیده می‌شود.

کلنی‌های جداگانه با تراکم نسبتاً کم و به رنگ سبز لجنی دیده می‌شوند.

ریسه‌های بلند دارند. سلول‌ها دیوارۀ عرضی دارند. آکینت‌ها تنها در انشعابات دیده می‌شوند.

فسفات 10 میلی گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز تیره، مجزا از هم و پراکنده هستند

ریسه‌ها کوتاه هستند. سلول‌های محور اصلی نکریدیوم دارند. آمادۀ تقسیم سلولی هستند. انشعابات بزرگ و دارای دیوارۀ عرضی هستند. آکینت‌های بزرگ در انشعابات وجود دارند. انشعابات در دوطرف (یکی به‌سمت بالا و دیگری به‌سمت پایین) هستند. غلاف بسیار ضخیم دارند و در نمونه‌هایی بدون سلول هستند.

کلنی‌ها به رنگ سبز تیره هستند و تراکم کم است.

سلول‌های محور اصلی پیچ و تاب خورده‌اند و به‌شکل مارپیچی هستند. ریسه‌ها انشعاب ندارند. سلول‌های تک در زمینه مشاهده می‌شوند. سلول‌های دارای آکینت به رنگ سبز تیره دیده می‌شوند.

فسفات 20 میلی گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز تیره، بی‌شکل و به‌هم چسبیده هستند و تراکم زیاد است.

ریسه‌ها بزرگ و به دو رنگ زرد و سبز دیده می‌شوند. سلول‌های محور اصلی باریک و بدون انشعاب هستند. سلول‌ها در ردیف اصلی دوتایی شده‌اند.

آکینت‌ها زیاد هستند. دسته‌های 8 تا 14 تایی از سلول‌هایی مشاهده می‌شوند که پر از آکینت هستند.

کلنی‌ها به‌طور مجزا و پراکنده در سطح پلیت هستند. تراکم بسیار کم است.

ریسه‌ها انشعاب دارند. سلول‌ها دارای آکینت و درحال تقسیم بسیار دیده می‌شوند.

فسفات 30 میلی گرم بر لیتر

کلنی‌ها به رنگ سبز چمنی هستند. تراکم نسبتاً کم است و در برخی نواحی به‌شکل توده تجمع یافته‌اند.

سلول‌های بسیار ضخیم و پررنگ مشاهده می‌شوند. هتروسیست‌های مستطیلی وجود دارند. انشعابات بسیار کوتاه هستند. دو ردیفی‌شدن سلو‌ل‌ها به همراه تقسیم آکینت‌ها دیده می‌شود.

کلنی‌ها به رنگ سبز و قهوه‌ای و به‌طور مجزا هستند. تراکم کم است.

ریسه‌ها بلند هستند. دو‌ردیفی‌شدن سلول‌ها در برخی نواحی مشاهده می‌شود. سلول‌ها دیوارۀ عرضی دارند.

 


نتایج فعالیت ضدباکتریایی در کشت‌های شاهد و تیمار: نتایج بررسی فعالیت ضدباکتریایی، تحلیل آماری و آزمون توکی در برابر باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی نشان دادند سویۀ مطالعه‌شده دارای بیشترین قطر ممانعت در برابر باکتری Staphylococcus aureusاست؛ به‌همین‌علت، بررسی فعالیت ضدباکتریایی تنها در برابر این باکتری در کشت‌های تیمار انجام شد. نتایج نشان دادند همبستگی مثبتی میان میزان اگزوپلی‌ساکاریدها در تیمارهای مختلف و فعالیت ضدباکتریایی وجود دارد؛ به‌این‌ترتیب که تیمارهای با غلظت 500 و 250 میلی‌مولار نیترات، 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر فسفات، 5 و 2 گرم‌بر‌لیتر گلوکز با اختلاف معناداری (P<0.05) بیشترین میزان قطر ممانعت‌کنندگی را داشتند؛ همچنین نتایج نشان دادند در همۀ نمونه‌ها، نور حداکثر با شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه دارای بیشترین میزان ممانعت‌کنندگی است (شکل 6 و جدول 3).

نتایج جداسازی مواد بیواکتیو با TLC:نتایج آزمون TLC روی زیست‌تودۀ حاصل از کشت سویۀ مطالعه‌شده در محیط‌کشت ۵۰۰ میلی‌مولار نیترات، پنج باند مجزا را نشان دادند؛ از پنج باند حاصل، چهار باند در برابر باکتری Staphylococcus aureus مؤثر بودند که نشان‌دهندۀ حضور مادۀ مؤثر ضدباکتریایی در چهار باند حاصل است (شکل 7).

 

 

3

2

1

     

6

5

4

     

شکل 6- وجود هاله در تیمارهای مختلف گلوکز، سوکروز، فسفات و نیترات؛ 1. کشت شاهد، 2. 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر فسفات، 3. 250 میلی‌مولار نیترات، 4. 2 ‌گرم‌برلیتر گلوکز، 5. 5 گرم‌برلیتر سوکروز، 6. 500 میلی‌مولار نیترات

 

جدول 3- میزان فعالیت ضدباکتریایی سویۀ مطالعه‌شده در کشت‌های مختلف؛ قطر منطقۀ بازدارندگی بر حسب میلی‌متر و به‌‌شکل میانگین±انحراف معیار نشان داده شده است.

قطر منطقۀ بازدارندگی (میلیمتر)

کشت‌های مختلف به‌کار‌رفته

5/9 ±28/0

بدون نیتروژن با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/8±1/0

بدون نیتروژن با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/7±1/0

نیترات در غلظت 100 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

9/6±2/0

نیترات در غلظت 100 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

8/7±4/0

نیترات در غلظت 250 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

9/11±21/0

نیترات در غلظت 250 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/8±3/0

نیترات در غلظت 500 میلی‌مولار با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

3/12± 6/0

نیترات در غلظت 500 میلی‌مولار با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/6±3/0

فسفات در غلظت 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

04/11±1/0

فسفات در غلظت 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/7±2/0

فسفات در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

5/11±12/0

فسفات در غلظت 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

5/8±2/0

فسفات در غلظت 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

1/8±4/0

فسفات در غلظت 30 میلی‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/7±1/0

گلوکز در غلظت 2 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

1/10±02/0

گلوکز در غلظت 2 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/7±1/0

گلوکز در غلظت 5 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/8±1/0

گلوکز در غلظت 5 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

9/6±3/0

سوکروز در غلظت 2 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

8/7±4/0

سوکروز در غلظت 2 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

7/6±3/0

سوکروز در غلظت 5 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 50 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

9/8±04/0

سوکروز در غلظت 5 ‌گرم‌بر‌لیتر با شدت نوری 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه

 

B

A

1

3

4

5

2

1

2

3

4

5

شکل 7- A. باندهای حاصل از آزمون TLC، B. انجام آزمون آنتی‌بیوگرام برای بررسی اثر ترکیب بیواکتیو موجود در هر باند به‌شکل مجزا


بحث

سنتز پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی در ریزموجودات و به‌ویژه سیانوباکتری‌ها، نقش عمده‌ای در محافظت از سلول در برابر بسیاری از تنش‌های موجود در زیستگاه‌های مختلف دارد. پژوهش Otero و Vincenzini در سال 2004 نشان داد تکامل کاربردهای زیست‌فناوری اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها به شناسایی عوامل مؤثر بر افزایش سنتز اگزوپلی‌ساکاریدها وابسته است. ازآنجاکه عوامل مختلف تأثیر متفاوتی روی تولید اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها دارند، مشکل بتوان نتیجه گرفت تفاوت‌های گزارش‌شده در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها از تفاوت‌های فیزیولوژیک بین گونه‌ها ناشی می‌شود یا به تفاوت در شرایط کشت آزمایشگاهی به‌کاررفته مربوط است؛ درنتیجه، به‌منظور فهم کامل پتانسیل سیانوباکتری تولید‌کنندۀ پلی‌ساکاریدهای مفید، تعیین بهترین شرایط تولید مواد خارج‌سلولی اهمیت بسزایی دارد. در پژوهش حاضر، تلاش شد به بررسی تأثیر برخی از مهم‌ترین عوامل تأثیرگذار بر تولید پلی‌ساکاریدها پرداخته شود و نتیجه‌گیری کلی از آزمایش‌ها نشان داد همبستگی مثبتی بین میزان نیترات محیط‌کشت و تولید اگزوپلی‌ساکاریدها در کشت‌های سویۀ Fischerella sp. SH.A رشدیافته در روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه وجود دارد (25).

Guedes‌ در سال 2011 بیان کرد گونه‌های Nostocمنابع درخور توجهی برای تولید پلی‌ساکارید هستند. درحقیقت، اهمیت این مواد خارج‌سلولی ازنظر پتانسیل کاربرد صنعتی به حدی زیاد است که موجب استخراج پلی‌ساکاریدها از گیاهان و ریز‌جلبک‌ها طی سالیان متمادی شده است (46)؛ این امر سبب شده است استخراج پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی از سیانوباکتریوم آب شیرین در مقیاس آزمایشگاهی انجام شود تا گامی در راستای کاربرد هرچه بیشتر این متابولیت ثانویۀ باارزش در صنایع دارویی، غذایی و شیمیایی برداشته شود. در پژوهش‌های Tiwari و همکاران (2015)، تولید اگزوپلی‌ساکارید منعقدکنندۀ زیستی از 40 سویۀ سیانوباکتریایی طی رشد فتواتوتروفیک آنها بررسی شد و بیشترین مقدار EPS را Nostoc sp. BTA97 و Anabaena sp. BTA990 تولید کردند و بیشترین تولید EPS در غیاب منبع نیتروژن ترکیبی رخ داد (47). نتایج آزمایش‌های یادشده نشان دادند گونه‌های Anabaena sp. BTA990 و Nostoc sp. BTA97 گزینه‌های خوبی برای تولید تجاری EPS هستند؛ این در حالیست که در مقالۀ حاضر، بیشترین تولید EPS در حضور منبع نیتروژن رخ داد. مقایسۀ نتایج Tiwari و یافته‌های پژوهش حاضر نشان داد تولید EPS به نوع سویه وابسته است.

Singh در سال 2015 روی یک سویۀ سیانوباکتری مطالعه و از روش‌های مختلف مانند ویژگی‌های مربوط به فنوتیپ، توالی‌یابی ژن‌های 16S rRNA، rbcl، psbA، nifD و pc-IGS و فیلوژنی مولکولی استفاده و ثابت کرد سویۀ NE-PS، گونۀ‌ جدیدی از جنس Nostoc است (48). در مطالعۀ حاضر نیز باتوجه‌به ویژگی‌های ریخت‌شناختی و توالی‌یابی ژن 16S rRNAو نتایج تحلیل درخت فیلوژنتیک نشان داده شد سویۀ Fischerella sp. SH.A مطالعه‌شده بیشترین قرابت فیلوژنتیک را با سویه‌های Fischerella sp. HKAR-13 و Fischerella sp. HKAR-14 دارد. سویۀ مطالعه‌شده کلاد جداگانه‌ای تشکیل داد که نشان‌دهندۀ جدیدبودن این سویه است. Huang و همکاران در سال 2009 تأکید کردند اگرچه مراحل خالص‌سازی بسیار طولانی و وقت‌گیر هستند، اهمیت فراوانی در ادامۀ پژوهش‌ها دارند؛ زیرا اولاً برای بررسی‌های مولکولی به کشت خالص نمونه‌ها نیاز است و ثانیاً در مرحلۀ تشخیص نوع متابولیت ثانویۀ موجود در هر سویه، وجود کشت‌هایی متشکل از تنها یک نمونه دارای اهمیت زیادی است تا بتوان ترکیب فعال زیستی تولیدشده را به آن سویۀ خاص نسبت داد (49)؛ ازاین‌رو، در مقالۀ حاضر با ایجاد کشت‌های متوالی و چندین بار آزمایش، سویۀ Fischerella sp. SH.A جداسازی و خالص‌سازی و بهترین شرایط کشت برای رشد سویۀ مطالعه‌شده فراهم شد. Katoh در سال 2003 بیان کرد سیانوباکتری‌ها دارای راهبردهای متفاوتی برای زندگی در شرایط تغذیه‌ای مختلف هستند و از عمده‌ترین راهبردها می‌توان به تغییر شکل زندگی از اتوتروف به هتروتروف اشاره کرد. میکسوتروفی، سیستمی از رشد است که کربن آلی و کربن‌دی‌اکسید به‌طور هم‌زمان با متابولیسم فتوسنتزی و تنفسی تغذیه می‌شوند. زمانی که ریزجلبک کربن بیشتری را تثبیت می‌کند، تولید کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و لیپیدها افزایش می‌یابد (50). بررسی نتایج پژوهش حاضر نشان داد سویۀ Fischerella sp. SH.A شدت روشنایی 150 میکروانشتین در مترمربع در ثانیه را به‌شکل منبع انرژی به دام می‌اندازد و از گلوکز، سوکروز، نیترات و فسفات به‌شکل منابع غذایی در رشد استفاده می‌کند. در پژوهش حاضر با هدف بیشینه‌سازی تولید فراورده‌های طبیعی، سعی شد تا با ترکیب الگوی رشد اتوتروف با سیستم متابولیک هتروتروف که میکسوتروف نامیده می‌شود، توانایی سویۀ Fischerella sp. SH.A در دو محیط فتوتروف و میکسوتروف در‌رابطه‌با تولید پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی سنجیده شود. نتایج بررسی‌ها نشان دادند نیترات بهترین پیش‌ماده برای تولید ترکیبات پلی‌ساکاریدی در مقایسه با سایر پیش‌ماده‌هاست و درحقیقت، یکی از دلایل آن اینست که احتمالاً سویۀ Fischerella sp. SH.A از نیتروژن محیط برای تثبیت چرخۀ ازت استفاده و انرژی خود را صرف تولید بیشتر پلی‌ساکارید خارج‌سلولی می‌کند.

بررسی‌های بسیاری در زمینۀ قابلیت سیانوباکتری‌های تولید‌کنندۀ پلی‌ساکارید برای غلبه بر تنش خشکی در بیابان یا محیط‌های شور انجام شده‌اند و نتایج نشان داده‌اند پیوندهای هیدورژنی برقرارشده بین پلی‌ساکاریدها، پروتئین‌ها، لیپیدها و DNA، پوسته‌های آبی را شکل می‌دهند که برای مقابله با تنش خشکی بسیار سودمند است (51). اگزوپلی‌ساکاریدها با داشتن ویژگی‌های آبدوستی[xxiii] و آبگریزی[xxiv] و به‌دام‌انداختن و تجمع آب و ایجاد لایۀ ژلاتینی در اطراف سلول‌ها، غشای سلولی را در طول دورۀ خشکی پایدار نگه می‌دارند. مهم‌ترین عمل کپسول پلی‌ساکاریدی، ایجاد سدی بین سلول باکتری و محیط اطراف آن است؛ به‌علاوه، نقش محافظتی این لایۀ پلی‌ساکاریدی در برابر دهیدریشن، فاگوسیتوزیس و حتی لیزشدن در اثر ویروس‌ها یا ایجاد توانایی چسبیدن به بستر و جلوگیری از شسته‌شدن در زیستگاه‌های طبیعی در اثر آب روان، ویژگی‌های ضدباکتریایی یا جلوگیری از شکار به‌وسیلۀ تک‌یاخته‌های آغازی را نباید نادیده گرفت (52 و 53). طی تنش خشکی، جدا از جایگزینی آب از‌دست‌رفته، سیانوباکتری‌ها می‌توانند به‌سرعت فعالیت‌های متابولیکی خود را باز یابند و سلول را محافظت کنند (54). پژوهش‌های Hill و همکاران (55) روی Nostoc commune با پراکندگی وسیع در زیستگاه‌های مختلف (از مناطق گرمسیری تا مناطق قطبی) نشان دادند گلیکان ترشح‌شده از این موجود، مخزنی برای حفظ آب فراهم می‌کند که به‌شکل بافر بین سلول و اتمسفر عمل می‌کند. عملکرد یادشده، سازوکار کلیدی این سیانوباکتریوم برای تحمل دهیدریشن است؛ درحقیقت، پلی‌ساکاریدها به همراه ترهالوز و سوکروز به‌شکل سد دفاعی سلول‌های N. commune را در برابر خشکی هوا محفوظ نگه می‌دارند. بررسی‌ها نشان داده‌اند این گونه با تشکیل غلاف، کپسول و لایۀ لعابی چسبناک می‌تواند در برابر آثار مضر تابش‌های UV مقابله کند (56).

بررسی‌ها نشان داده‌اند تابش UV سنتز پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی، رنگدانۀ جذب‌کنندۀ UV (سایتونمین[xxv])، ترکیبات آمینواسیدی مایکوسپورین‌مانند[xxvi] (MMAs) و سوپراکسیددیسموتازها شامل آهن فعال را در N. commune القا و با تشکیل ماتریکس خارج‌سلولی، سدی را در برابر نفوذ تابش‌های مضر UV فراهم می‌کند (57-59). بررسی آزادسازی پلی‌ساکاریدها از سویه‌های سیانوباکتریایی جداشده از تپه‌های شنی در بیابان نشان داد وجود پلیمرهای پلی‌ساکاریدی نقش مهمی را در محافظت از رطوبت در بیابان طی ماه‌ها و در جایی که شبنم صبحگاهی تنها منبع آب به‌طور گاه و بی‌گاه است، بازی می‌کند؛ درحقیقت، این پلیمرها مانند ترکیب بافری عمل می‌کنند و علاوه‌بر حفظ آب، آزادسازی آرام آب را سبب می‌شوند. به‌تازگی گزارشی دربارۀ اکولوژی جنس Nostocنشان داده است تراکم موسیلاژ احاطه‌کنندۀ تریکوم‌های تعداد فراوانی از سویه‌های Nostocدر مقایسه با دیگر ریزجلبک‌هایی که کپسول ندارند، آنها را از خطر خورده‌شدن رهایی می‌بخشد (60). خاصیت آبگریزی اگزوپلی‌ساکاریدها که به‌علت حضور گروه‌های استیل دارای پیوند استری (تا 12 درصد وزن خشک EPS)، بخش‌های پپتیدی و قندهایی همچون فوکوز و رامنوز است، به ویژگی امولسیفیه‌کنندگی پلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها در پوسته‌های میکروبی بیابان منجر می‌شود؛ به‌طوری‌که در آن، پلی‌ساکاریدها با متصل‌کردن ذره‌های شن سبب حفاظت از جوامع میکروبی پوسته در برابر شسته‌شدن در اثر جریان آب می‌شوند.

بررسی‌های اخیر نشان داده‌اند غلاف سیانوباکتری‌ها می‌تواند سلول‌ها را از آثار خسارت‌بار معدنی‌سازی محافظت ‌کند؛ درحقیقت، بررسی‌های نفوذپذیری غلاف Calothrix sp. نشان داده‌اند این سیانوباکتری به ذره‌های دارای کمتر از 11 نانومتر قطر نفوذناپذیر است و بنابراین از معدنی‌شدن زیستی ترکیبات حساس دیوارۀ سلول جلوگیری می‌کند (61). پژوهش‌های انجام‌شده در زمینۀ سویه‌ای از Nostoc sp. نشان داده‌اند پوشش لعابی احاطه‌کنندۀ تریکوم‌ها سبب پراکندگی آسان‌تر ریسه‌ها به درون محیط مایع می‌شود و به‌این‌ترتیب، دسترسی ریسه‌ها را به منابع نوری و مواد غذایی تسهیل می‌کند؛ درحقیقت، ترشح مواد لزج اگزوپلی‌ساکاریدی با تولید نیروی دافعۀ ضروری برای حرکت، نقش مهمی را در حرکت و سرخوردن سیانوباکتری‌ها بازی می‌کند (62)؛ برای نمونه، سیانوباکتری Microcystis flosaquae C3-40 در زیستگاه‌های قلیایی زندگی می‌کند و کپسول این سیانوباکتری با تجمع یون‌های ضروری مانند آهن و منگنز که نسبتاً در آب‌های قلیایی غیرمحلول هستند، نقش مهمی را در تغذیه و رشد سیانوباکتری بر عهده دارد. در زمینۀ سیانوباکتری‌هایی که در همزیستی با گیاهان عالی زندگی می‌کنند، نقش اگزوپلی‌ساکاریدها به‌شکل عامل چسبناک برای اتصالAnabaenaبه سطح و ایجاد حفره در گیاه میزبانAzollaبسیار ضروری است (63 و 64). طبیعت آنیونی پلی‌ساکاریدهای سیانوباکتریایی از تماس مستقیم سلول‌ها با فلزات سنگین سمی که ممکن است در محیط وجود داشته باشند، جلوگیری می‌کند (65 و 66). در پژوهشی، پژوهشگران روش‌هایی را برای تعیین مقدار فلزاتی که روی جلبک‌ها جذب سطحی شده‌اند و فلزاتی که به درون سلول‌ها وارد شده‌اند، ارائه کردند؛ نتایج نشان دادند بیش از 80 درصد مقدار اولیۀ فلزات در سطح سلول‌ها جذب می‌شوند (67 و 68). در پژوهش دیگری در زمینۀ جلبک‌های دریایی نیز پژوهشگران نشان دادند جلبک‌های دریایی باتوجه‌به ظرفیت اتصال زیادی که برای یون‌های فلزی دارند، هدف مطالعه‌های بسیاری قرارگرفته‌اند. مهم‌ترین اجزای دیوارة سلولی جلبک‌های دریایی شامل سلولز (اسکلت سلولی)، آلژینات‌ها و فوکوئیدان‌های[xxvii] تشکیل‌دهندۀ ماتریکس بی‌شکل و موسیلاژ داخل‌سلولی هستند. فوکوئیدان‌ها، پلی‌ساکاریدهای سولفاته‌ای هستند که انواعی از جلبک‌های قهوه‌ای آنها را تولید می‌کنند. آلژینات‌ها، نمک‌‌های آمونیومی یا قلیایی آلژینیک‌اسید هستند که از واحدهای –D مانورونیک‌اسید [xxviii]، L– گلورونیک‌اسید[xxix] و باقیمانده‌های L- گلورونیک‌اسید تشکیل شده‌اند. گروه‌های کربوکسیل هریک از این واحدها نقش اصلی را در اتصال یون‌‌های فلزی به آلژینات‌ها ایفا می‌کنند و ازآنجاکه محتوای آلژیناتی جلبک‌های قهوه‌ای 10 تا 40 درصد وزن خشک آنها را تشکیل می‌دهد، پتانسیل بالقوه‌ای برای جذب یون‌های فلزی فراهم می‌کند (69).

جلبک‌های قهوه‌ای دارای 5 تا 10 درصد پلی‌ساکاریدهای گوگردداری به نام فوکوئیدان هستند که پلی‌ساکارید شاخه‌دار سولفاته است و ساختمان آن از واحدهای L- فوکوز تشکیل شده است که با اتصالات آلفا 1-2 به یکدیگر متصل شده‌اند. جذب کاتیون‌های سه‌ظرفیتی عمدتاً به وجود پلی‌ساکاریدهای سولفات‌دار بستگی دارد. در پژوهش دیگری به بررسی دو سویۀ جهش‌یافته و وحشی پرداخته و نشان داده شد محیط‌کشت سویۀ جهش‌یافته باوجود نداشتن غلاف، دو برابر بیشتر از سویۀ وحشی توانایی حذف یون مس را دارد (3). نتایج نشان دادند ظرفیت بیشتر حذف مس در محیط‌کشت سویۀ جهش‌یافته از آزادسازی مقدار زیاد ترکیبات پلی‌ساکارید ناشی می‌شود. در پژوهش دیگری به بررسی ترکیبات شیمیایی پلی‌ساکارید محلول[xxx] تولیدشده از سویۀ وحشی و سویۀ جهش‌یافته پرداخته و مشخص شد این ترکیب از 11 نوع مونومر یکسان تشکیل شده است. قند اسیدی حدود 35 درصد در سویۀ جهش‌یافته بیشتر است که تمایل زیاد برای یون‌های مثبت مس را نشان می‌دهد؛ در‌حالی‌که قندهای دئوکسی‌فوکوز و رامنوز حدود 28 درصد در پلی‌ساکارید محلول تولیدی در سویۀ وحشی وجود دارند و زیادبودن میزان آبگریزی و کاهش حلالیت برای یون مس را نشان می‌دهد.

باتوجه‌به اهمیت پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی ازنظر پتانسیل کاربرد صنعتی برای تثبیت تجاری مواد شیمیایی ناپایدار در کشاورزی، غذا، مواد دارویی، ترکیبات بیوشیمیایی و به‌ویژه ثبات کیفیت مواد و درنظرگرفتن این نکته که چنین پژوهش‌هایی در کشور کاملاً مقدماتی هستند، انجام این دسته پژوهش‌ها به گسترش استفاده از این مواد پلیمری باارزش ازنظر صنعتی منجر می‌شود.

 

نتیجه‌گیری

گونه‌های سیانوباکتری‌ها به‌شکل منابع درخور توجهبرای تولید پلی‌ساکارید در کشت‌های سوسپانسیون مایع و کلنی‌های خشک‌شده همواره مدنظر قرار داشته‌اند؛ درحقیقت، اهمیت این مواد خارج‌سلولی ازنظر پتانسیل کاربرد صنعتی برای تثبیت تجاری مواد شیمیایی ناپایدار در کشاورزی، غذا، مواد دارویی، ترکیبات بیوشیمیایی و به‌ویژه ثبات کیفیت مواد به حدی زیاد است که موجب استخراج پلی‌ساکاریدها از گیاهان و ریزجلبک‌ها طی سالیان متمادی شده است.

در طول چند سال گذشته، جداسازی و تشخیص چندین متابولیت متنوع و جدید با فعالیت‌های داروشناختی جدید (ضدسرطانی، آنتی‌بیوتیکی، ضد‌ویروسی، ضد‌قارچی) و همچنین ترکیبات بازدارندۀ پروتئازی و نظایر آن از سیانوباکتری‌ها، اهمیت استفاده از آنها به‌شکل موجودات باارزش در صنایع داروسازی را آشکارتر کرده است؛ ازاین‌رو، بررسی میزان اگزوپلی‌ساکاریدهای تولیدشده و همچنین مساعدکردن محیط، گام مهمی در معرفی سویه‌های سیانوباکتریایی بالقوه ازنظر دارویی است؛ همچنین خلاقیت و استفاده از محیط‌کشت جامد در بررسی حاضر سبب بیشترین بهره‌وری از ترکیبات فعال ضدباکتریایی شد. گفتنی است اگرچه بررسی‌ها و پژوهش‌های بسیاری در زمینۀ اثر بازدارندگی ترکیبات ضدباکتریایی سیانوباکتری‌ها انجام شده‌اند، تاکنون هیچ اطلاعاتی دربارۀ فعالیت ضدباکتریایی و ارتباط آن با میزان اگزوپلی‌ساکاریدهای تولید‌شده در محیط‌کشت‌های تیمار‌شده با غلظت‌های مختلف نمک‌ها و شدت‌های روشنایی 50 و 150 میکروانشتین در متر‌مربع در ثانیه در دسترس نیست و درحقیقت، پژوهش انجام‌شده در این زمینه جزو نخستین بررسی‌های انجام‌شده در ایران است و نتایج می‌توانند ایدۀ جدیدی برای گسترش داروهای ضدباکتریایی در صنایع داروسازی باشند. در بررسی حاضر، افزایش غلظت نیترات در محیط‌کشت و شدت روشنایی سبب افزایش میزان پلی‌ساکارید خارج سلولی شد؛ به‌همین‌علت، جداسازی و شناسایی اگزوپلی‌ساکاریدهای موجود در  Fischerella sp. SH.A اهمیت بسیاری دارد و انجام پژوهش‌های بیشتر برای شناخت این سویه بسیار ضروری به نظر می‌رسد.

 

سپاسگزاری

تمام فعالیت‌های انجام‌شده در پژوهش حاضر با حمایت‌های شخصی خانوادۀ دانشجو و گروه تخصصی استادان انجام شده است.

(1) Li P., Harding SE., Liu Z. Cyanobacterial exopolysaccharides: Their nature and potential biotechnological applications. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2001; 18(1): 375-404.
(2) Su J., Jia S., Chen X., Yu H. Morphology, cell growth, and polysaccharide production of Nostoc flagelliforme in liquid suspension culture at different agitation rates. Journal of Applied Phycology 2008; 20(3): 213-217.
(3) Suresh Kumar A., Mody K., Jha B. Bacterial exopolysaccharides–a perception. Journal of Basic Microbiology 2007; 47(2): 103-117.
(4) Singh S., Verma E., Tiwari B., Mishra AK. Exopolysaccharide production in Anabaena sp. PCC 7120 under different CaCl 2 regimes. Physiology and Molecular Biology of Plants 2016; 22(4): 557-566.
(5) Tiwari ON., Khangembam R., Shamjetshabam M., Sharma AS., Oinam G., Brand JJ. Characterization and optimization of Bioflocculant exopolysaccharide production by Cyanobacteria Nostoc sp. BTA97 and Anabaena sp. BTA990 in culture conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology 2015; 176(7): 1950-1963.
(6) Wu X., Li R., Zhao Y., Liu Y. Separation of polysaccharides from Spirulina platensis by HSCCC with ethanol-ammonium sulfate ATPS and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers 2017; 173: 465-472.
(7) Gao L., Pan X., Zhang D., Mu S., Lee DJ., Halik U. Extracellular polymeric substances buffer against the biocidal effect of H2O2 on the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Water Research 2015; 69: 51-58.
(8) Bhunia B., Uday US., Oinam G., Mondal A., Bandyopadhyay TK., Tiwari ON. Characterization, genetic regulation and production of cyanobacterial exopolysaccharides and its applicability for heavy metal removal. Carbohydrate Polymers 2018; 179: 228-243.
(9) Parikh A., Madamwar D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology 2006; 97(15): 1822-1827.
(10)           Arora M., Kaushik A., Rani N., Kaushik CP. Effect of cyanobacterial exopolysaccharides on salt stress alleviation and seed germination. Journal of Environmental Biology 2010; 31(5): 701-704.
(11)           Bender J., Phillips P. Microbial mats for multiple applications in aquaculture and bioremediation. Bioresource Technology 2004; 94(3): 229-238.
(12)           Brüll LP., Huang Z., Thomas‐Oates JE., Paulsen BS., Cohen EH., Michaelsen TE. Studies of polysaccharides from three edible species of Nostoc (cyanobacteria) with different colony morphologies: structural characterization and effect on the complement system of polysaccharides from Nostoc commune. Journal of Phycology 2000; 36(5): 871-881.
(13)           Trabelsi L., Houda M’sakni N., Ben Ouada H., Bacha H., Roudesli S. Partial characterization of extracellular polysaccharides produced by Cyanobacterium Arthrospira platensis. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2009; 14: 27-31.
(14)           Pereira S., Zille A., Micheletti E., Moradas-Ferreira P., De Philippis R., Tamagnini P. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews 2009; 33(5): 917-941.
(15)           Chug R., Mathur S. Extracellular polymeric substances from cyanobacteria: Characteristics, isolation and biotechnological applications-A. International Journal of Engineering, Science and Technology 2013; 3: 49-53.
(16)           Delattre C., Pierre G., Laroche C., Michaud P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances 2016; 34(7): 1159-1179.
(17)           Rossi F., De Philippis R. Role of cyanobacterial exopolysaccharides in phototrophic biofilms and in complex microbial mats. Life 2015; 5(2): 1218-1238.
(18)           De Philippis R., Ena A., Paperi R., Sili C., Vincenzini M. Assessment of the potential of Nostoc strains from the Pasteur Culture Collection for the production of polysaccharides of applied interest. Journal of Applied Phycology 2000; 12(3-5): 401-407.
(19)           De Philippis R., Faraloni C., Margheri MC., Sili C., Herdman M., Vincenzini M. Morphological and biochemical characterization of the exocellular investments of polysaccharide-producing Nostoc strains from the Pasteur Culture Collection. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2000; 16(7): 655-661.
(20)           Pereira SB., Mota R., Santos CL., De Philippis R., Tamagnini P. Assembly and export of extracellular polymeric substances (EPS) in cyanobacteria: a phylogenomic approach. InAdvances in Botanical Research 2013; 65: 235-279.
(21)           Tamaru Y., Takani Y., Yoshida T., Sakamoto T. Crucial role of extracellular polysaccharides in desiccation and freezing tolerance in the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71(11): 7327-7333.
(22)           Volk RB., Venzke K., Blaschek W. Structural investigation of a polysaccharide released by the cyanobacterium Nostoc insulare. Journal of Applied Phycology 2007; 19(3): 255.
(23)           Pereira S., Micheletti E., Zille A., Santos A., Moradas-Ferreira P., Tamagnini P., et al. Using extracellular polymeric substances (EPS)-producing cyanobacteria for the bioremediation of heavy metals: do cations compete for the EPS functional groups and also accumulate inside the cell? Microbiology 2011; 157(2): 451-458.
(24)           Wiegand C., Pflugmacher S. Ecotoxicological effects of selected cyanobacterial secondary metabolites a short review. Toxicology and Applied Pharmacology 2005; 203(3): 201-218.
(25)           Otero A., Vincenzini M. Nostoc (Cyanophyceae) goes nude: Extracellular polysacharides  serve as a sink for reducing power under unbalanced C/N metabolism 1. Journal of Phycology 2004; 40(1): 74-81.
(26)           Richert L., Golubic S., Le Guédès R., Ratiskol J., Payri C., Guezennec J. Characterization of exopolysaccharides produced by cyanobacteria isolated from Polynesian microbial mats. Current Microbiology 2005; 51(6): 379-384.
(27)           Nowruzi B., Blanco S., Nejadsattari T. Chemical and molecular evidences for the poisoning of a duck by anatoxin-a, nodularin and cryptophycin at the coast of lake shoormast (Mazandaran province, Iran). International Journal on Algae 2018; 20(4): 359-376.
(28)           Nowruzi B., Blanco S. In silico identification and evolutionary analysis of candidate genes involved in the biosynthesis methylproline genes in cyanobacteria strains of Iran. Phytochemistry Letters 2019; 29: 199-211.
(29)           Nowruzi B., Wahlsten M., Jokela J. A report on finding a new peptide aldehyde from cyanobacterium Nostoc sp. Bahar M by LC-MS and Marfey’s analysis. Iranian Journal of Biotechnology 2019; 17(2): e1853.
(30)           Hosseini N., Akhavan A., Nowruzi B. Detection and relation of polyketide synthase (PKSs) genes with antimicrobial activity in terrestrial cyanobacteria of Lavasan. Iranian Journal of Medical Microbiology 2019; 12(6): 419-431.
(31)           Nowruzi B., Akhavan Sepahi A., Soltani Savoji Gh. Genetic analysis of nonribosomal peptide synthesis genes (NRPSs) in natural ‎product biosynthesis of the cyanobacterial strains of Lavasan lake. Biological Joutnal of Microorganisms 2019; 30: 27-54.
(32)           Andersen RA. Algal culturing techniques. 1st ed. Cambridge: Academic Press; 2005.
(33)           Komárek J., Kaštovský J., Mareš J., Johansen JR. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia 2014; 86(4): 295-335.
(34)           Briones-Nagata MP., Martinez-Goss MR., Hori K. A comparison of the morpho-cytology and chemical composition of the two forms of the cyanobacterium, Nostoc commune Vauch., from the Philippines and Japan. Journal of Applied Phycology 2007; 19(6): 675-683.
(35)           Berg K. Heterotrophic bacteria associated with cyanobacteria in recreational and drinking water [Dissertation]. Helsinki: University of Helsinki; 2009.
(36)           Nowruzi B., Khavari-Nejad RA., Sivonen K., Kazemi B., Najafi F., Nejadsattari T. Identification and toxigenic potential of a Nostoc sp. Algae 2012; 27(4): 303-313.
(37)           Nowruzi B., Khavari-Nejad RA., Sivonen K., Kazemi B., Najafi F., Nejadsattari T. Optimization of cultivation conditions to maximize extracellular investments of two Nostoc strains. Algological Studies 2013; 142(1): 63-76.
(38)           Stuart RK., Mayali X., Boaro AA., Zemla A., Everroad RC., Nilson D., et al. Light regimes shape utilization of extracellular organic C and N in a cyanobacterial biofilm. MBio 2016; 7(3): e00650-16.
(39)           Otero A., Vincenzini M. Extracellular polysaccharide synthesis by Nostoc strains as affected by N source and light intensity. Journal of Biotechnology 2003; 102(2): 143-152.
(40)           Yu H., Jia S., Dai Y. Accumulation of exopolysaccharides in liquid suspension culture of Nostoc flagelliforme cells. Applied Biochemistry and Biotechnology 2010; 160(2): 552-560.
(41)           Vonshak A., Cheung SM., Chen F. Mixotrophic growth modifies the response of Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanobacteria) cells to light. Journal of Phycology 2000; 36(4): 675-679.
(42)           Alcorta J., Vergara-Barros P., Antonaru LA., Alcamán-Arias ME., Nürnberg DJ., Díez B. Fischerella thermalis: A model organism to study thermophilic diazotrophy, photosynthesis and multicellularity in cyanobacteria. Extremophiles 2019; 23: 635-647.
(43)           Ozturk S., Aslim B. Modification of exopolysaccharide composition and production by three cyanobacterial isolates under salt stress. Environmental Science and Pollution Research 2010; 17(3): 595-602.
(44)           Mashjoor S., Yousefzadi M., Esmaeili MA., Rafiee R. Cytotoxicity and antimicrobial activity of marine macro algae (Dictyotaceae and Ulvaceae) from the Persian Gulf. Cytotechnology 2016; 68(5): 1717-1726.
(45)           Dussault D., Vu KD., Vansach T., Horgen FD., Lacroix M. Antimicrobial effects of marine algal extracts and cyanobacterial pure compounds against five foodborne pathogens. Food Chemistry 2016; 199: 114-118.
(46)           Guedes AC., Amaro HM., Malcata FX. Microalgae as sources of high added‐value compounds- A brief review of recent work. Biotechnology Progress 2011; 27(3): 597-613.
(47)           Tiwari ON., Khangembam R., Shamjetshabam M., Sharma AS., Oinam G., Brand JJ. Characterization and optimization of Bioflocculant exopolysaccharide production by Cyanobacteria Nostoc sp. BTA97 and Anabaena sp. BTA990 in culture conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology 2015; 176(7): 1950-1963.
(48)           Singh P., Singh SS., Aboal M., Mishra AK. Decoding cyanobacterial phylogeny and molecular evolution using an evonumeric approach. Protoplasma 2015; 252(2): 519-535.
(49)           Huang J., Graham N., Templeton MR., Zhang Y., Collins C., Nieuwenhuijsen M. A comparison of the role of two blue–green algae in THM and HAA formation. Water Research 2009; 43(12): 3009-3018.
(50)           Katoh H., Shiga Y., Nakahira Y., Ohmori M. Isolation and characterization of a drought-tolerant cyanobacterium, Nostoc sp. HK-01. Microbes and Environments 2003; 18(2): 82-88.
(51)           Giner-Lamia J., Pereira SB., Bovea-Marco M., Futschik ME., Tamagnini P., Oliveira P. Extracellular proteins: Novel key components of metal resistance in cyanobacteria? Frontiers in Microbiology 2016; 7: 878.
(52)           Liu XJ., Chen F. Potential uses of cyanobacterial polysaccharides in the food industry. In: Pometto A., Shetty K., Paliyath G., Levin RE., editors. Food Biotechnology. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press; 2005: 473-490.
(53)           Liu L., Jokela J., Wahlsten M., Nowruzi B., Permi P., Zhang YZ., et al. Nostosins, trypsin inhibitors isolated from the terrestrial cyanobacterium Nostoc sp. strain FSN. Journal of Natural Products 2014; 77(8): 1784-1790.
(54)           Gupta P., Diwan B. Bacterial exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies. Biotechnology Reports 2017; 13: 58-71.
(55)           Hill DR., Keenan TW., Helm RF., Potts M., Crowe LM., Crowe JH. Extracellular polysaccharide of Nostoc commune (Cyanobacteria) inhibits fusion of membrane vesicles during desiccation. Journal of Applied Phycology 1997; 9(3): 237-248.
(56)                       Helm RF., Huang Z., Edwards D., Leeson H., Peery W., Potts M. Structural characterization of the released polysaccharide of desiccation-tolerant Nostoc communeDRH-1. Journal of Bacteriology 2000; 182(4): 974-982.
(57)           Ploutno A., Carmeli S. Prenostodione, a novel UV-absorbing metabolite from a natural bloom of the cyanobacterium Nostoc species. Journal of Natural Products 2001; 64(4): 544-545.
(58)           Nowruzi B., Haghighat S., Fahimi H., Mohammadi E. Nostoc cyanobacteria species: a new and rich source of novel bioactive compounds with pharmaceutical potential. Journal of Pharmaceutical Health Services Research 2018; 9(1): 5-12.
(59)           Sharma M., Kaushik A., Bala K., Kamra A. Sequestration of chromium by exopolysaccharides of Nostoc and Gloeocapsa from dilute aqueous solutions. Journal of Hazardous Materials 2008; 157(2-3): 315-318.
(60)           Hu C., Liu Y., Paulsen BS., Petersen D., Klaveness D. Extracellular carbohydrate polymers from five desert soil algae with different cohesion in the stabilization of fine sand grain. Carbohydrate Polymers 2003; 54(1): 33-42.
(61)           Klock JH., Wieland A., Seifert R., Michaelis W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology 2007; 152(5): 1077-1085.
(62)           De Philippis R., Faraloni C., Margheri MC., Sili C., Herdman M., Vincenzini M. Morphological and biochemical characterization of the exocellular investments of polysaccharide-producing Nostoc strains from the Pasteur Culture Collection. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2000; 16(7): 655-661.
(63)           De Philippis R., Sili C., Paperi R., Vincenzini M. Exopolysaccharide-producing cyanobacteria and their possible exploitation: a review. Journal of Applied Phycology 2001; 13(4): 293-299.
(64)           Freire-Nordi CS., Vieira AA., Nascimento OR. The metal binding capacity of Anabaena spiroides extracellular polysaccharide: an EPR study. Process Biochemistry 2005; 40(6): 2215-2224.
(65)           Micheletti E., Colica G., Viti C., Tamagnini P., De Philippis R. Selectivity in the heavy metal removal by exopolysaccharide‐producing cyanobacteria. Journal of Applied Microbiology 2008; 105(1): 88-94.
(66)           Singh N., Asthana RK., Singh SP. Characterization of an exopolysaccharide mutant of Nostoc spongiaeforme: Zn2+-sorption and uptake. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2003; 19(8): 851-857.
(67)           De Philippis R., Paperi R., Sili C., Vincenzini M. Assessment of the metal removal capability of two capsulated cyanobacteria, Cyanospira capsulata and Nostoc PCC7936. Journal of Applied Phycology 2003; 15(2-3): 155-161.
(68)           Pereira S., Micheletti E., Zille A., Santos A., Moradas-Ferreira P., Tamagnini P., et al. Using extracellular polymeric substances (EPS)-producing cyanobacteria for the bioremediation of heavy metals: do cations compete for the EPS functional groups and also accumulate inside the cell? Microbiology 2011; 157(2): 451-458.
(69)           Nie ZY., Xia JL., Levert JM. Fractionation and characterization of polysaccharides from cyanobacterium Spirulina (Arthrospira) maxima in nitrogen-limited batch culture. Journal of Central South University of Technology 2002; 9(2): 81-86.