شناسایی سویه‌های باکتری‌های Arthrobacter و Bordetella مولد یوریکاز و مقایسۀ میزان فعالیت آنزیمی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

2 دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

10.22108/bjm.2020.119988.1235

چکیده

مقدمه: یوریکاز (اورات‌اکسیداز)، آنزیم دارویی متعلق به خانوادۀ اکسیدوردوکتازهاست که اکسیداسیون اوریک‌اسید به آلانتوئین، دی‌اکسید‌کربن و پراکسیدهیدروژن را کاتالیز و نقشی حیاتی در مسیر متابولیک پورین ایفا می‌کند.امروزه، آنزیم یوریکاز باکتریایی مدنظر پژوهشگران قرار گرفته است.
مواد و روش‏‏ها: فضولات پرندگان به‌علت داشتن مقادیر زیاد اوریک‌‌اسید، مکان مناسبی برای رشد باکتری‌های یوریکوتلیک هستند. خاک‌های آلوده از شهر کرمان جمع‌آوری و سویه‌های باکتریایی جداسازی شدند. تجزیۀ اوریک‌اسید با تلقیح باکتری‌ها روی محیط جامد حاوی اوریک‌اسید (تنها منبع کربن و نیتروژن) انجام شد. غربال‌گری با بررسی ظهور هالۀ شفاف در اطراف کلنی‌ها که شاخصی از تجزیۀ اوریک‌اسید بود، انجام شد. فعالیت یوریکازی به روش فسفوتنگستیک‌اسید بررسی شد. شناسایی مولکولی سویه‌ها با استفاده از توالی ژن 16S rDNAو رسم درخت فیلوژنی انجام شد.
نتایج: در مطالعۀ حاضر، دو گونۀ باکتریایی مولد آنزیم یوریکاز بر اساس میزان قطر هالۀ شفاف روی محیط آگار حاوی اوریک‌اسید از خاک‌های آلوده به فضولات پرندگان جداسازی و بر اساس توالی ژن 16S rDNAبا عنوان Arthrobacter sp.KBUBو Bordetella sp.KMU3شناسایی شدند. تولید یوریکاز در زمان‌های مختلف انکوباسیون انجام شد و نتایج، بیشترین میزان فعالیت یوریکازی را حدود 25 و 15 واحددر‌میلی‌لیتر به‌ترتیب برای دو سویۀ Arthrobacter sp.KBUBو Bordetella sp.KMU3نشان دادند.
بحث و نتیجه‏گیری: توانایی هر دو سویه در تولید یوریکاز با استفاده از محیط جامد و مایع تأیید شد و سویۀ Arthrobacter sp. KBUB توانایی زیادی برای تولید یوریکاز نشان داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identifying Uricase-Producing Arthrobacter and Bordetella Bacterial Strains and Comparing the Enzyme Activity

نویسندگان [English]

  • Mojtaba Shaban 1
  • Arastoo Badoei-dalfard 2
1 Department of biology, faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Faculty of science, shahid bahonar university of kerman
چکیده [English]

Introduction: Uricase (urate oxidase) is a therapeutic enzyme that belongs to the class of oxidoreductases and catalyzes the oxidation of uric acid to allantoin, carbon dioxide, and hydrogen peroxide and also plays a vital role in the purine metabolic pathway. Nowadays, bacterial uricase enzyme has received special attention from researchers.
Materials and methods: Poultry soils are great places for the growth of uricotelic bacteria due to having high sources of uric acid. Poultry soils were collected from Kerman city and bacterial strains were isolated. The decomposition of uric acid was performed by inoculating bacteria on a solid medium containing uric acid as the only source of carbon and nitrogen. The screening was performed by monitoring the appearance of clear zones around the colonies of bacteria indicating the decomposition of uric acid. Uricase activity was investigated by the Phosphotungstic acid method. The molecular identification of strains was performed using 16S rDNA gene sequence and drawing the phylogenetic tree.
Results: In this study, two bacterial species capable of producing uricase enzyme were isolated from a poultry source and screened based on the size of the clear zone using a uric acid agar plate. Arthrobacter sp.KBUBand Bordetella sp.KMU3 strains were identified based on the 16S rDNA gene sequences. The production of uricase was performed during different incubation periods and the results showed that the maximum uricolytic activity of 25 and 15 U/mL was achieved by Arthrobacter sp.KBUBand Bordetella sp.KMU3, respectively.
Discussion and conclusion: The capability of both these strains to produce uricase was confirmed using solid and liquid media. Arthrobacter sp.KBUB has shown a high ability to produce uricase, which can be used as a therapeutic enzyme and biosensor construction to measure uric acid.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bacterial uricase
  • Screening
  • Production
  • Molecular identification
  • Arthrobacter
  • Bordetella

مقدمه.

اوریک‌اسید (C5H4N4O3)، ترکیبی هتروسیکل با وزن مولکولی 168 دالتون و حلالیت اندک در آب (60 میلی‌گرم‌در‌لیتر) است (1 و 2). به‌طور‌کلی، اوریک‌اسید به‌شکل اورات وجود دارد که نمک اوریک‌اسید است. عمده ساخت اوریک‌اسید در کبد انجام می‌شود و سرعت ساخته‌شدن اوریک‌اسید در کبد و میزان دفع آن از طریق کلیه‏ها تعیین‌کنندۀ غلظت اوریک‌اسید در خون است. اوریک‌اسید محصول انتهایی کاتابولیسم پورین در پریمات‏ها، پرندگان و برخی دیگر از حیوانات است و در اثر آنزیم گزانتین‏اکسیداز[1] از متابولیت‏های حدواسطی همچون هیپوگزانتین و گزانتین تشکیل می‏شود. در بیشتر پستانداران و بسیاری از مهره‌داران دیگر، اوریک‌اسید در اثر عمل یوریکاز یا اورات‌اکسیداز به آلانتوئین تبدیل می‏شود که ترکیبی محلول در آب است و‏ از طریق کلیه‏ها دفع می‌شود (3 و 4). آنزیم زانتین‌اکسیدوردوکتاز مسئول تولید اوریک‌اسید است (5). انسان‏ها نمی‏توانند اوریک‌اسید را به ترکیبات دارای حلالیت بیشتر تبدیل کنند؛ زیرا آنزیم یوریکاز را ندارند و به عبارتی، ژن یوریکاز در انسان به‏واسطۀ دو جهش در کدون‏های پایان خاموش می‏شود (5). زمانی ‏که غلظت اوریک‌اسید بیش از 8/6 گرم‌بر‌دسی‌لیتر باشد، بلور‏های اوریک‌اسید به‌شکل اورات‌مونوسدیم تشکیل می‏شوند (6 و 7). معمولاً دفع اوریک‌اسید به‌طور روزانه و از طریق کلیه‏ها انجام می‌شود. غلظت اوریک‌اسید را می‏توان در سرم، پلاسما و ادرار سنجید. هایپراوریسمیا[2]، عامل کلیدی در ایجاد نقرس[3]، نارسایی کلیوی، افزایش فشار خون، دیابت‏ها و چاقی است که درنتیجۀ افزایش تولید اوریک‌اسید، اختلال در دفع کلیوی اوریک‌اسید یا هر دوی این عوامل رخ می‏دهد. هایپراوریسمیا در بزرگسالان با غلظت اوریک‌اسید بیش از 7 میلی‌گرم‌بردسی‌لیتر در مردان و 6 میلی‌گرم‌بردسی‌لیتر در زنان تعریف می‏شود. در افراد سالم، اوریک‌اسید در ادرار دفع می‏شود؛ باوجوداین، دفع اوریک‌اسید ممکن است به‌علت بیماری‏های کلیوی مختل و به هایپراوریسمیا منجر شود (8). علاوه‌بر مشکلات ناشی از دفع اوریک‌اسید به‌علت نارسایی کلیوی، هایپراوریسمیا ممکن است درنتیجۀ افزایش تولید اوریک‌اسید رخ دهد (8). اوریک‌اسید مانند ویتامین C جزو مواد آنتی‏اکسیدان محسوب می‏شود و می‏توان گفت حدود نیمی از ظرفیت مواد آنتی‏اکسیدانی پلاسما در انسان ناشی از اوریک‌اسید است (9 و 10). اوریک‌اسید عمدتاً در غذاهای حیوانی مانند گوشت قرمز و همچنین حبوبات وجود دارد و بنابراین در افراد دارای رژیم غذایی عمدتاً گیاهی، سطح اوریک‌اسید سرم پایین است..

تعیین اوریک‌اسید در سرم نقش مهمی را در آزمایشگاه تشخیص طبی ایفا می‌کند. تاکنون روش‌های تحلیلی مختلفی مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، الکتروفورز مویینه (CE)، کمی‌لومینسانس (CL)، الکتروشیمی و ... برای تعیین اوریک‌اسید در نمونه‌های زیستی پیشنهاد شده‌اند. به‌طورکلی، روش‌های کروماتوگرافی مانند HPLC و CE کمک بسیاری به تشخیص اوریک‌اسید می‌کنند، اما به پیش‌پردازش نمونه‌های پیچیده و ابزار گران قیمت نیاز دارند. الکتروشیمی و CL، روش‌های تحلیلی قدرتمندی برای تعیین اوریک‌اسید در نمونه‌های واقعی با مزایای محدودۀ تشخیصی کم و دقت زیاد هستند؛ بنابراین، لازم است روش ساده و مؤثری برای تعیین حساسیت و انتخابی‌بودن اوریک‌اسید در مایع‌های زیستی به‌منظور ارزیابی سلامت و تشخیص بیماری‌ها استفاده شود (5). تغییر رنگ حاصل از واکنش سنجش اوریک‌اسید را می‌توان به روش‌های فتومتریک و اسپکتروفتومتری با طول موج 650 تا 700 نانومتر ارزیابی کرد (11)؛ محدودیت این روش، کدورت پیش‌بینی‌نشدۀ ناشی از حضور پروتئین‌ها و رسوب اوریک‌اسید طی پیدایش رنگ است. مقدار اوریک‌اسید با استفاده از ستون فاز معکوس HPLC از طریق جذب UV یا MS در طول موج 293 نانومتر نیز تعیین می‌شود (11)؛ محدودیت این روش، نیاز به دست‌ورزی نمونه‌ها و همچنین استفاده از روش‌های زمان‌بر کروماتوگرافی و هزینۀ‌ زیاد است (12). در سال 1941، نخستین روش برای تعیین اوریک‌اسید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و اندازه‌گیری جذب آن در 293 نانومتر به کار گرفته شد؛ ترکیباتی که در این روش تداخل می‌کنند، عبارتند از: گوانین، گزانتین و به‌طور‌کلی، آنالوگ‌های ساختاری اوریک‌اسید و آمینواسید.

بیشتر روش‌های رایج برای تشخیص اوریک‌اسید در سرم بر پایۀ استفاده از آنزیم یوریکاز هستند (13). آلانتوئین در آب پنج تا ده برابر محلول‌تر از اوریک‌اسید است (14). آنزیم یوریکاز در کاهش تجمع اورات سمی استفاده می‌شود. استفاده از بیوسنسور[4]های آمپرومتریک جدید مبتنی بر کوپلینگ دو آنزیم یوریکاز و پراکسیداز برای اندازه‏گیری ویژۀ اوریک‌اسید پیشنهاد شده‌اند (15 و 16). در روش کوپلینگ، دو آنزیم یوریکاز و پراکسیداز برای تعیین اوریک‌اسید استفاده می‌شوند؛ در این روش، اوریک‌اسید اکسید و به آلانتوئین، H2O2 و CO2 تبدیل می‏شود و سپس H2O2 تولیدشده در حضور آنزیم پراکسیداز، ماده‌ای رنگی ایجاد می‏کند که می‌توان آن را به روش رنگ‏سنجی و در طول موج معین اندازه‏گیری کرد. توسعۀ بیوسنسورها در پیشرفت تجزیه‌و‌تحلیل ترکیبات فعال زیستی امیدوارکننده است؛ به‌طوری‌که طی دو دهۀ گذشته، بیوسنسورها از آزمایشگاه‌ها ظاهر شدند و به‌علت داشتن مزیت‌هایی ازجمله روش اندازه‌گیری ساده، زمان پاسخ کوتاه، حساسیت و قدرت انتخاب زیاد توانستند به ابزارهای تشخیصی متداول برای تجزیه‌وتحلیل بسیاری از متابولیت‌ها تبدیل شوند (17). روش‌های مانیتورینگ کلاسیک اغلب آهسته‏تر هستند و از تجهیزات گران‌قیمت استفاده می‏کنند که این امر سبب می‌شود برای کنترل زمان واقعی مناسب نباشند و باعث جذاب‌ترشدن حسگر بیوسنسور شوند (18 و 19). بیوسنسور جدیدی مبتنی بر کوپلینگ دو آنزیم گزارش شده که از جفت‌شدگی دو آنزیم اورات‌اکسیداز و پراکسیداز تشکیل شده است و با داشتن حساسیت زیاد، زمان سنجش کوتاه و اختصاصیت زیاد، قابلیت زیادی برای سنجش اوریک‌اسید دارد. اندازه‌گیری‌ها با استفاده از منحنی‌های استاندارد انجام می‏شوند که با تعیین میزان اکسیژن مصرفی مربوط به غلظت اوریک‌اسید در واکنش‌های آنزیمی به دست می‏آیند.

یوریکاز در پستانداران، حشرات، گیاهان، قارچ‌ها، مخمرها و باکتری‌ها یافت می‌شود (20-22). تهیۀ یوریکاز از انواع منابع میکروبی مانند قارچ‌ها، مخمرها و باکتری‌ها به‌علت ساده‌بودن کار با آنها و مقرون‌به‌صرفه‌بودن کشت و نگهداری آنها گزارش شده است. نکتۀ مهم در تشخیص و درمان با یوریکاز، ضروری‌بودن غربال‌گری منابع جدید برای تولید یوریکاز است؛ منابعی که اقتصادی و دارای ویژگی‌های سودمند باشند (21 و 22). امروزه، گزارش شده است باکتری‌های Pseudomonas aeruginosa، Micrococcus، Brevibacterium، Escherichia coli، Proteus vulgaris، Streptomyces albosriseolusوKlebsiellaو Serratia توانایی تولید یوریکاز را دارند (23 و 24). مخمرها ازجمله Candida tropicalis به‌طور کارآمدی یوریکاز را با اضافه‌کردن اوریک‌اسید به محیط‌کشت رشد فراهم می‌کنند. مطالعه‌ها نشان داده‌اند چندین قارچ ازجمله Deuteromycotina، Zygomycotina، Ascomycotina، Basidiomycotina و Mastigomycotina توانایی تولید یوریکاز را دارند (25 و 26). شاخص‌های گوناگون ازجمله اسیدیته، دما و کوفاکتورها[5] برای فعالیت بهینۀ انواع یوریکازها ضروری هستند. یوریکاز میکروبی به‌عنوان عامل کلینیکی برای تعیین غلظت اوریک‌اسید سرم و خون، به‌عنوان بیوسنسور[6] اوریک‌اسید در شکل تثبیت‌شده[7]‌، به‌عنوان پروتئین دارویی راسبوریکاز[8] برای درمان هایپراوریسمیا[9] و همچنین به‌عنوان عامل رنگ‌کنندۀ مو کاربرد دارد (25-27). هدف پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتری‌های مولد یوریکاز از فضولات پرندگان است.

مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری: نمونه‌های مدنظر از کودهای بومی موجود در فروشگاه‌های پرنده‌فروشی شهر کرمان انتخاب شدند. نمونه‌های انتخاب‌شده برای انتقال به آزمایشگاه از 10 سانتی‌متری ژرفای کودها برداشته و درون فالکون‌های استریل ریخته شدند.

.جداسازی سویه‌های باکتریایی تولیدکنندۀ یوریکاز: به‌منظور جداسازی باکتری‌های مدنظر از سایر باکتری‌ها و میکروب‌های موجود در محیط نمونه‌های انتخاب‌شده، 5 گرم از نمونه‌های انتخاب‌شده در محیط مایع اختصاصی اتوکلاو‌شدۀ حاوی 5/0 گرم اوریک‌اسید، 2/0 گرم دی‌پتاسیم‌فسفات، 05/0 گرم پتاسیم‌دی‌فسفات، 01/0 گرم منیزیم‌سولفات هفت‌آبه، 01/0 گرم نمک خوراکی و 01/0 گرم کلسیم‌کلراید در 100 میلی‌لیتر آب مقطر به‌منظور رشد باکتری‌های مدنظر حل و برای یک هفته در 37 درجۀ سانتی‌گراد با دور چرخش 130 دوردردقیقه انکوبه شدند؛ پس‌از یک هفته، 1 میلی‌لیتر از محیط به محیط اختصاصی جدید تلقیح و برای یک هفته در شرایط یادشده انکوبه شد. این فرایند چهار بار دیگر تکرار شد (23-27).

جداسازی بهترین سویۀ مولد یوریکاز:به‌منظور جداسازی بهترین سویۀ مولد یوریکاز، مقدار 100 میکرولیتر از محیط مایع اختصاصی حاوی باکتری‌های مدنظر روی محیط جامد اختصاصی اتوکلاوشدۀ حاوی مواد محیط اختصاصی مایع به همراه 2 گرم آگار در 100 میلی‌لیتر آب مقطر با اسیدیتۀ 5/7 به شیوۀ کشت چمنی روی پلیت‌های استریل کشت داده شد و پس‌از 24 ساعت انکوبه‌شدن در 37 درجۀ سانتی‌گراد، کلنی‌ها رشد کردند و دارای هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید شدند. پلیت‌ها برای آزمایش‌های بعدی در یخچال نگهداری شدند.

بررسی رشد و ایجاد هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید:در این فرایند، کلنی‌هایی که رشد بیشتری در کشت چمنی داشتند، با لوپ استریل برداشته و به‌شکل دایره‌وار روی پلیت‌های جامد اختصاصی اتوکلاو‌شده کشت شدند. سرعت رشد کلنی‌ها و سرعت تولید یوریکاز بررسی شد و بهترین باکتری‌ها ازنظر رشد و تولید یوریکاز برای اطمینان از تک‌سویه‌بودن کشت شدند؛ سپس کلنی‌هایی که رشد بیشتر و ایجاد هالۀ بزرگ‌تری داشتند، با لوپ استریل به شیوۀ کشت خطی روی محیط‌کشت جامد اختصاصی، کشت چهار مرحله داده شدند تا کلنی‌های خالص به دست آیند؛ درنتیجه، اطمینان حاصل شد که هر کلنی غربال‌شده معرف یک سویۀ باکتریایی است.

غربال‌گری سویه‌های دارای بیشترین تولید یوریکاز:در این فرایند، کلنی‌های خالص‌شده برای غربال‌گری بهترین سویۀ تولیدکنندۀ یوریکاز با لوپ استریل به‌شکل دایره‌وار در محیط جامد اختصاصی کشت شدند و سرعت تولید یوریکاز و رشد تک‌کلنی برای یافتن بهترین سویۀ تولیدکنندۀ یوریکاز بررسی شد.

تهیۀ عصارۀ آنزیمی: به‌منظور تهیۀ عصارۀ سلولی، ابتدا سویۀ مدنظر در محیط مایع اختصاصی تلقیح و به‌مدت سه روز در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد و دور چرخش 130 دوردردقیقه انکوبه شد. پس‌از پایان سه روز، محیط‌کشت در فالکون‌های استریل ریخته شد و فالکون‌ها در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 20 دقیقه با دور چرخش 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند؛ سپس سوپ رویی تقریباً دور ریخته شد و رسوب‌های باکتریایی دو بار با بافر فسفات شسته و در 10 میلی‌لیتر بافر حل شدند. فالکون در بشر پر از یخ به دستگاه سونیکاتور پروب‌دار رسانده شد و به‌شکل 30 ثانیه پالس به 30 ثانیه استراحت برای 20 بار پالس داده شد و دوباره فالکون مدنظر با شرایط یادشده سانتریفیوژ و محلول رویی (عصارۀ سلولی) برداشت شد. پس‌از انجام این فرایند، عصارۀ سلولی برای آزمایش‌های بعدی در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.

سنجش فعالیت یوریکاز: سنجش فعالیت یوریکاز به دو شیوۀ استفاده از کیت تشخیص اوریک‌اسید و روش معمولی انجام شد (23-25).

در روش استفاده از کیت، اساس واکنش به این شکل است که اوریک‌اسید، فسفوتنگستن را در محیط قلیایی احیا و به آبی تنگستن تبدیل می‌کند؛ شدت رنگ با مقدار اوریک‌اسید نسبت مستقیم دارد. مقدار 50 میکرولیتر آنزیم حل‌شده در 200 میکرولیتر بافر تریس درون میکروتیوب آزمایش ریخته و 100 میکرولیتر اوریک‌اسید (پیش‌ماده) به آن اضافه شد؛ سپس 2 میلی‌لیتر معرف اول به آن اضافه و پس از مخلوط‌کردن، 500 میکرولیتر معرف دوم اضافه و مخلوط شد. پس‌از 10 دقیقه نگهداری در بنماری 37 درجۀ سانتی‌گراد، جذب در طول موج 640 نانومتر خوانده شد. به‌منظور کنترل آزمایش، جذب میکروتیوب شاهد هم خوانده شد. میکروتیوب شاهد تمام شرایط میکروتیوب آزمایش را داشت، ولی به‌جای حجم آنزیم، بافر به آن اضافه شده بود.

در روش معمولی، مقدار 50 میکرولیتر آنزیم حل‌شده در 200 میکرولیتر بافر تریس درون میکروتیوب آزمایش ریخته و 100 میکرولیتر اوریک‌اسید (پیش‌ماده) به آن اضافه شد و پس‌از انکوبه‌شدن به‌مدت 1 ساعت در دمای 35 درجۀ سانتی‌گراد، جذب در طول موج 293 نانومتر خوانده شد. به‌منظور کنترل آزمایش، جذب میکروتیوب شاهد نیز خوانده شد. میکروتیوب شاهد تمام شرایط میکروتیوب آزمایش را داشت، ولی به‌جای حجم آنزیم، بافر به آن اضافه شده بود.

 

شناسایی مولکولی.

استخراج DNA ژنومی از سویه‌های انتخاب‌شدۀ نهایی:به‌منظور استخراج DNA ژنومی، ابتدا سویه‌های انتخاب‌شده در محیط نوترینت‌آگار کشت تازۀ 24 ساعته در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد داده شدند و سپس DNA ژنومی استخراج شد. به‌منظور اطمینان‌یافتن از درستی استخراج، 3 میکرولیتر محلول حاوی DNA احتمالی به همراه شناساگر روی چاهک‌های ژل آگارز بارگذاری و خالص‌بودن DNA هسته‌ای و مقدار DNA استخراج‌شده ارزیابی شد. ژن 16S rDNA در DNA ژنومی باکتری‌ها تقریباً به‌طور حفاظت‌شده وجود دارد؛ بنابراین با توالی‌یابی‌کردن این ژن در سویۀ مدنظر و هم‌ردیف‌کردن آن با ژن‌های 16S rDNAموجود در بانک ژن می‌توان سویۀ مدنظر را شناسایی کرد؛ در این روش، هر DNA برای تکثیرشدن در حجم 25 میکرولیتر آماده می‌شود. آغازگر رفت با توالی 5ʹ-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ و آغازگر برگشت با توالی 5ʹ-GGC/T TACCTTGTTACGACTT-3ʹ اضافه و مخلوط شد.

تعیین توالی و رسم درخت فیلوژنی: محصولات PCR برای تعیین توالی به شرکت پیش‌گام فرستاده شدند و توالی ژن‌های 16S rDNAآنها تعیین شد. این سویه‌های توالی‌یابی‌شده به شیوۀ BLAST با توالی‌های ثبت‌شده در سایت NCBI مقایسه و نزدیک‌ترین سویه‌ها به سویه‌های مدنظر بر اساس میزان شباهت توالی 16S rDNA تعیین شدند؛ در مرحلۀ بعد، هشت توالی از توالی‌های سویه‌های دارای درصد شباهت زیاد و یک توالی با درصد شباهت کم (Out Group) به سویه‌های مدنظر در نرم‌افزار MEGA 6 وارد شدند و درخت فیلوژنی آنها ترسیم شد.

 

نتایج و بحث

مکان‌های نمونه‌برداری در سطح شهر کرمان: نمونه‌برداری از پرنده‌فروشی‌‌های سطح شهر کرمان با مختصات جغرافیایی 30˚17ʹ14.8ʺN57˚05ʹ07.8ʺE انجام شد (شکل 1).

انتخاب کلنی‌های برتر: به‌منظور بررسی میزان تولید یوریکاز، باکتری‌هایی انتخاب شدند که قطر هالۀ تجزیۀ یوریکاز بیشتری روی محیط جامد اختصاصی داشتند. میزان فعالیت کلنی‌های مدنظر در شکل 2 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 1- انواع مناطق نمونه‌برداری

 

شکل 2- میزان فعالیت کلنی‌ها در محیط جامد اختصاصی

 


بررسی سرعت رشد کلنی و سرعت تولید یوریکاز:به این منظور، کلنی‌های مناسب در محیط‌های اختصاصی کشت و میزان تولید یوریکاز و میزان رشد سویه‌ها با اندازه‌گیری قطر هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید و قطر کلنی بررسی شدند. در شکل 3، میزان کمّی رشد و تولید هاله به‌واسطۀ یوریکاز در دو سویۀ برگزیده بررسی شده است. در شکل 3، میزان رشد و تولید یوریکاز بهترین سویه‌ها نشان داده شده است. نتایج نشان دادند سویۀ KBUB بیشترین مقدار تولید یوریکاز را دارد و این سویه 96 ساعت پس‌از تلقیح دارای بیشترین مقدار تولید آنزیم می‌شود (شکل 4).

 

 

شکل 3- بررسی میزان رشد و تولید هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید در چهار سویۀ برگزیده

 

 

شکل 4- بررسی میزان رشد و تولید هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید در باکتری KBUB طی زمان


بررسی میزان درون‌سلولی و برون‌سلولی‌بودن فعالیت آنزیم: به‌منظور تعیین فعالیت درون‌سلولی و برون‌سلولی آنزیم، پس‌از 24 ساعت کشت در محیط مایع اختصاصی، محیط سانتریفیوژ و محلول رویی به‌شکل آنزیم برون‌سلولی سنجیده شد. رسوب باکتریایی با بافر تریس سونیکیت شد تا لیز شود و محلول حاصل از لیز باکتریایی به‌شکل آنزیم درون‌سلولی بررسی شد. در شکل 5، میزان فعالیت آنزیم درون‌سلولی و برون‌سلولی نشان داده شده است. نتایج نشان دادند آنزیم یوریکازی که باکتری KBUB تولید می‌کند به میزان 25 واحددر میلی‌لیتر درون‌سلولی و 15 واحددر میلی‌لیتر برون‌سلولی است.

 

 

شکل 5- میزان تولید برون‌سلولی و درون‌سلولی آنزیم یوریکاز سویه‌ها

 

شناسایی مولکولی

استخراج DNA ژنومی و بارگذاری روی ژل آگارز: استخراج DNA ژنومی سویه‌های KBUB و KMU3 با سه‌فازی‌کردن محیط به روش استفاده از فنل و کلروفرم انجام شد. به‌منظور اطمینان‌یافتن از درستی فرایند استخراج، DNAهای ژنومی استخراج‌شده به همراه شناساگر با پهنای باند 100 تا 3000 کیلوباز روی ژل آگارز بارگذاری شدند و میزان خالص‌بودن DNAهای ژنومی استخراج‌شده با دستگاه الکتروفورز بررسی شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): پس‌از مشاهده‌شدن باند DNA ژنومی استخراج‌شده، فرایند PCR برای تکثیر ژن 16S rDNA روی نمونه‌های استخراج‌شده انجام شد. به‌منظور بررسی نتایج PCR، محصولات آن روی ژل آگارز بارگذاری شدند. در شکل 6، نتایج PCR دیده می‌شوند. نتایج نشان دادند محصولات PCR اندازه‌ای حدود 1600 جفت باز دارند.

 

3

  2

       1

 

 

 

 

 

 

1600bp

شکل 6- باندهای محصولات PCR ژن 16S rDNA روی ژل آگارز؛ 1. شناساگر، 2. KBUB، 3. KMU3

 

تعیین توالی ژن 16S rDNA محصولات PCR و رسم درخت فیلوژنی: محصولات فرایند PCR مشاهده‌شده روی ژل آگارز برای تعیین توالی به شرکت پیشگامان ژن فرستاده شدند. پس‌از تعیین توالی، توالی‌های مدنظر با سایر ژن‌های موجود در سایت NCBI هم‌ردیف شدند؛ درنتیجه، جنس و گونۀ سویه‌های مدنظر مشخص شد. پس‌از هم‌ردیفی و مقایسه با سایر توالی‌های ثبت‌شده در بانک ژنی NCBI، توالی‌های مدنظر در نرم‌افزار MEGA6 قرار گرفتند و درخت فیلوژنی رسم شد. در شکل 7، درخت فیلوژنی سویه‌های KBUB و KMU3 مشاهده می‌شود.

 

 

 

شکل 7- درخت فیلوژنی باکتری‌های Arthrobacter sp. KBUB و Bordetella sp. KMU3 بر اساس شباهت توالی ژن 16S rDNA. درخت فیلوژنی به روش neighbor joining و با نرم‌افزار MEGA5 رسم شده است.

 


بحث و نتیجه‌گیری

آنزیم یوریکاز در بسیاری از گونه‌ها (میکروب‌ها تا پستانداران) وجود دارد؛ ولی به‌علت جهش در ژن یوریکاز، پریمات‌ها یوریکاز فعال ندارند (6). پژوهشگران بسیاری منابع گوناگون یوریکاز را برای یافتن آنزیم جدید و بهتر به‌منظور نیازهای تشخیصی و درمانی پیشنهاد کرده‌اند؛ علاوه‌براین، توجه به استفاده از آنزیم در فرایندهای صنعتی، تحلیلی و پزشکی افزایش یافته است (6). در پژوهش حاضر، فضولات پرنده‌فروشی‌های سطح شهر کرمان به‌منظور غربال‌گری باکتری‌های مولد یوریکاز نمونه‌برداری شدند. به‌منظور غربال‌گری باکتری‌‌های مولد یوریکاز در نمونه‌های انتخاب‌شده از محیط اختصاصی استفاده شد. باتوجه‌به قطر هاله‌های ایجادشده از طریق باکتری‌های مولد یوریکاز، دو سویه با کدهای KBUB و KMU3 انتخاب شدند که بیشترین تولید یوریکاز را داشتند. در بهترین سویۀ تولیدکنندۀ یوریکاز، قطر هاله در محیط اختصاصی پس‌از 24 ساعت حدود 39 میلی‌متر تعیین شد. پس‌از سنجش فعالیت آنزیمی، مشخص شد آنزیم سویۀ KBUB بیشتر درون‌سلولی است(25 واحددر میلی‌لیتر). به‌منظور شناسایی دقیق سویه‌ها، توالی ژن 16S rDNA آنها تعیین و پس‌از هم‌ردیفی توالی‌های آنها با سایت NCBI مشخص شد سویه‌های به‌دست‌آمده با کدهای KBUBو KMU3 بیشترین شباهت ژنتیکی را به‌ترتیب با  Bordetella trematum وArthrobacter creatinolyticus دارند. در پژوهش Ghosh و Sarkar در سال 2014، باکتری مصرف‌کنندۀ اوریک‌اسید از خاک مرغ‌سانان به دست آمد و پس‌از بررسی توالی 16S rDNA، این باکتری تولیدکنندۀ یوریکاز برون‌سلولی با فعالیت 8 واحددرمیلی‌گرم با عنوان Comamonas sp BT UA شناسایی شد؛ قطر هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید از طریق این باکتری در محیط‌کشت Nutrient agar-uric acid (NA-UA) برابر 25 میلی‌متر طی 24 ساعت بود (7). در سال 2014، Nanda و همکاران سه گونه باکتری را از منابع مرغ‌سانی جداسازی کردند که توانایی تولید یوریکاز برون‌سلولی داشتند و بهترین باکتری تولیدکنندۀ یوریکاز که بیشترین فعالیت (15 واحددر میلی‌لیتر) را داشت، بر اساس توالی 16S rDNA با ‌عنوان DL3 Bacillus cereus در نظر گرفته شد (25). در پژوهش Khade و همکاران در سال 2016، دو باکتری Pseudomonas aeruginosa Ph3 و Pseudomonas aeruginosa 5Y2تولیدکنندۀ یوریکاز برون‌سلولی با فعالیت به‌ترتیب 42/13 و 77/17 واحددر میلی‌لیتر شناسایی کردند. قطر هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید از طریق 5Y2 و Ph3 در محیط‌کشت Nutrient agar-uric acid (NA-UA) به‌ترتیب برابر 25 و 17 میلی‌متر طی 24 ساعت بود (28). در پژوهش Azab و همکاران در سال 2005، هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید در باکتری‌های P. vulgaris 1753، P. vulgaris B-317-C، S. graminofacience و S. albidoflavus اندازه‌گیری شد؛ قطر هالۀ تجزیۀ اوریک‌اسید از طریق باکتری‌های یادشده در انواع محیط‌های کشت به‌ترتیب برابر 14، 18، 4 و 6 میلی‌متر طی 24 ساعت بود (29). باتوجه‌به داده‌های یادشده مشخص می‌شود میکروب‌ها منابع خوبی برای تولید آنزیم یوریکاز هستند و در محیط‌هایی که اوریک‌اسید به‌طور طبیعی وجود دارد (فضولات پرندگان)، باکتری‌های تولیدکنندۀ یوریکاز یافت می‌شوند. با‌توجه‌به قطر هاله در محیط جامد و میزان فعالیت آنزیمی در محیط مایع، سویۀ KBUB قابلیت زیادی در تولید یوریکاز دارد؛ درنتیجه، سویۀ یادشده می‌تواند برای تولید انبوه این آنزیم مهم استفاده شود.

(1) Ghiuță I., Cristea D., Croitoru C., Kost J., Wenkert R., Vyrides I., Anayiotos A., Munteanu D. Characterization and antimicrobial activity of silver nanoparticles, biosynthesized using Bacillus species. Applied Surface Science 2018; 438: 66-73.
(2) Kumar CG., Mamidyala SK. Extracellular synthesis of silver nanoparticles using culture supernatant of Pseudomonas aeruginosa. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2011; 84(2): 462-466.
(3) Muthukkumarasamy S., Sharadha A., Vignesh S., Dhanabalan K., Gurunathan K. Extracellular synthesis of polygonal silver nanoparticles using extract of Escherichia coli ATCC 25922 and its antibacterial activities. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures 2012; 7: 1419-1426.
(4) Saifuddin N., Wong CW., Yasumira AA. Rapid biosynthesis of silver nanoparticles using culture supernatant of bacteria with microwave irradiation. Journal of Chemistry 2009; 6(1): 61-70.
 
(5) Rai T., Panda D. An extracellular enzyme synthesizes narrow-sized silver nanoparticles in both water and methanol. Chemical Physics Letters 2015; 623: 108-1012.
(6) Ravichandran R., Hemaasri S., Cameotra SS., Jayaprakash NS. Purification and characterization of an extracellular uricase from a new isolate of Sphingobacterium thalpophilum (VITPCB5). Protein Expression and Purification 2015; 114: 136-142.
(7) Ghosh T., Sarkar P. Isolation of a novel uric-acid-degrading microbe Comamonas sp. BT UA and rapid biosensing of uric acid from extracted uricase enzyme. Journal of Biosciences 2014; 39(5): 805-819.
(8) Klaus T., Joerger R., Olsson E., Granqvist CG. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated. Proceedings of the National Academy of Sciences 1999; 96(24): 13611-13614.
(9) Wei X., Luo M., Li W., Yang L., Liang X., Xu L., Kong P., Liu H. Synthesis of silver nanoparticles by solar irradiation of cell-free Bacillus amyloliquefaciens extracts and AgNO3. Bioresource Technology 2012; 103(1): 273-278.
(10) Oves M., Khan MS., Zaidi A., Ahmed AS., Ahmed F., Ahmad E., Sherwani A., Owais M., Azam A. Antibacterial and cytotoxic efficacy of extracellular silver nanoparticles biofabricated from chromium reducing novel OS4 strain of Stenotrophomonas maltophilia. PloS one 2013; 8(3): e59140.
(11) Cavaco-Paulo A., Gubitz G. Textile processing with enzymes. 1st ed. Netherlands: Elsevier; 2003.
(12) Tavčer PF. Biotechnology in textiles–an opportunity of saving water. In: Einschlag FSG., editor. Waste Water-Treatment and Reutilization. London, UK: InTech; 2011: 387-404.
(13) Mojsov K. Microbial alpha-amylases and their industrial applications: a review. International Journal of Management, IT and Engineering (IJMIE) 2012; 2(10): 583-609.
(14) Kamerlin SC., Warshel A. At the dawn of the 21st century: Is dynamics the missing link for understanding enzyme catalysis? Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2010; 78(6): 1339-1375.
(15) Álvarez-Lario B., Macarrón-Vicente J. Uric acid and evolution. Rheumatology 2010; 49(11): 2010-2015.
(16) Cammalleri L., Malaguarnera M. Rasburicase represents a new tool for hyperuricemia in tumor lysis syndrome and in gout. International Journal of Medical Sciences 2007; 4(2): 83-87.
(17) Zhang H., Li Q., Lu Y., Sun D., Lin X., Deng X., He N., Zheng S. Biosorption and bioreduction of diamine silver complex by Corynebacterium. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2005; 80(3): 285-290.
(18) Parikh RY., Ramanathan R., Coloe PJ., Bhargava SK., Patole MS., Shouche YS., Bansal V. Genus-wide physicochemical evidence of extracellular crystalline silver nanoparticles biosynthesis by Morganella spp. PLoS One 2011; 6(6): e21401.
(19) Wadhwani SA., Shedbalkar UU., Singh R., Karve MS., Chopade BA. Novel polyhedral gold nanoparticles: green synthesis, optimization and characterization by environmental isolate of Acinetobacter sp. SW30. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2014; 30(10): 2723-2731.
(20) Wallrath LL., Friedman TB. Species differences in the temporal pattern of Drosophila urate oxidase gene expression are attributed to trans-acting regulatory changes. Proceedings of the National Academy of Sciences 1991; 88(13): 5489-5493.
(21) Yamamoto K., Kojima Y., Kikuchi T., Shigyo T., Sugihara K., Takashio M., Emi S. Nucleotide sequence of the uricase gene from Bacillus sp. TB-90. The Journal of Biochemistry 1996; 119(1): 80-84.
(22) Montalbini P., Redondo J., Caballero JL., Cárdenas J., Pineda M. Uricase from leaves: Its purification and characterization from three different higher plants. Planta 1997; 202(3): 277-283.
(23) Tanaka A., Yamamura M., Kawamoto S., Fukui S. Production of uricase by Candida tropicalis using n-alkane as a substrate. Applied and Environmental Microbiology 1977; 34(4): 342-346.
(24) Mahmoud M., El Dein N., El-Fallal A. Screening of some fungi for uricolytic activity. Qatar University Science Journal 1996; 16(1): 71-76.
(25) Nanda P., Jagadeesh Babu PE. Isolation, screening and production studies of uricase producing bacteria from poultry sources. Preparative Biochemistry and Biotechnology 2014; 44(8): 811-821.
(26) Amirthanathan A., Vijayakumar S. Purification and optimization of uricase enzyme produced by Pseudomonas aeruginosa. Journal of Experimental Sciences 2011; 2(11): 5-8.
(27) Lotfy WA. Production of a thermostable uricase by a novel Bacillus thermocatenulatus strain. Bioresource Technology 2008; 99(4): 699-702.
(28) Khade S., Srivastava SK., Tripathi AD. Production of clinically efficient uricase enzyme induced from different strains of Pseudomonas aeruginosa under submerged fermentations and their kinetic properties. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2016; 8: 139-145.
(29) Azab EA., Ali MM., Fareed MF. Studies on uricase induction in certain bacteria. Egyptian Journal of Biology 2005; 7(1) 44-54.