مطالعه تجزیه نفت خام با کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی و تولید متانوئیک اسید و بیوسورفکتانت توسط جدایه سودوموناس

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

3 استادیار گروه علوم پایه، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

10.22108/bjm.2020.120421.1252

چکیده

مقدمه: استفاده از بیوسورفکتانت‌ها به‌دلیل مزایایی نظیر سمیت پایین، تخریب پذیری زیستی و مؤثر بودن آن‌ها در محدوده وسیعی از pH و دما افزایش چشمگیری داشته است. زیست پالایی استراتژی کاهش یا حذف ترکیبات نفتی با استفاده از میکروارگانیسم‌هایی است که توانایی تجزیه هیدروکربن‌های نفتی را با استفاده از تولید بیوسورفکتانت‌ها دارند. هدف از این تحقیق بررسی تولید بیوسورفکتانت و زیست پالایی نفت خام توسط باکتری جداسازی شده از لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان بوده است.
مواد و روش‌ها: تشخیص تولید بیوسورفکتانت از روش‌های کمی و کیفی غربالگری مانند همولیز در محیط کشت آگار خوندار، روش‌های پراکنش نفت و فروپاشی روغن، سنجش فعالیت امولسیون‌کنندگی و کشش سطحی انجام شد. باکتری با آزمون‌های بیوشیمیایی و تعین توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. باقی‌مانده هیدروکربن‌های نفتی با استفاده از تجزیه و تحلیل به روش کروماتوگرافی گازی (GC-MS) آنالیز شد.
نتایج: ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺑﺮرﺳﻲﻣﺎﻫﻴﺖ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ، ﺑا استفاده از روش‌های ﻛﺮوﻣاﺗﻮﮔﺮاﻓﻲﻻﻳﻪ ﻧﺎزک و طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز، ﻣﺸﺨﺺ کرد ﻛﻪ بیوسورفکتانت مورد نظر ازﻧﻮع رامنوﻟﻴﭙﻴﺪی است. جدایه باکتریایی مورد نظر سودوموناس شناسایی شد. در این پژوهش، باکتری سودوموناس جداسازی شده از لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان، قادر به تولید بیوسورفکتانت رامنوﻟﻴﭙﻴﺪی بود و کشش سطحی را تا 27 میلی‌نیوتن بر متر کاهش داد. تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی گازی حذف 45/80 درصد هیدروکربن‌های نفتی را طی 20 روز توسط این جدایه نشان داد. متانوئیک اسید به ‌مقدار 23 درصد از ترکیبات قابل توجه تولیدی بود.
بحث و نتیجه‌گیری: نتایج مطالعه نشان داد که جدایه BA3 توانایی تولید بیشترین بیوسورفکتانت و همچنین تجزیه نفت خام را دارا بود. بنابراین این سویه پس از تأیید غیربیماری‌زا بودن، قابل استفاده در زیست پالایی، تجزیه نفت‌خام و رفع آلودگی‌های به‌وجود آمده در محیط زیست، توسط صنعت نفت است. همچنین متانوئیک اسید تولید شده به‌عنوان ماده آنتی-باکتریال در غذای دام‌ کاربرد دارد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of Crude Oil Degradation by Gas Chromatography-Mass Spectrometry and Methanoic Acid and Biosurfactant Production by Pseudomonas sp.

نویسندگان [English]

  • Somayeh Kazemzadeh 1
  • Nafiseh-Sadat Naghavy 2
  • Zarrindokht Emami-Karvani 2
  • Masoud Fouladgar 3
1 Department of Microbiology, Faculty of biological Sciences, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
2 Department of Microbiology, Faculty of biological Sciences, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
3 Department of Basic Sciences, Faculty of biological Sciences, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Due to the advantages of biosurfactants such as low environmental toxicity, biological degradation, and effectiveness in wide ranges of pH and temperature, the industrial production of them has been significantly increased. Bioremediation is the strategy of reducing or eliminating petroleum compounds using microorganisms that are capable of decomposing petroleum hydrocarbons by producing biosurfactants. The purpose of this study was to investigate the biosurfactant production and bioremediation of crude oil by the isolated bacterium from Isfahan Oil Recovery plant activated sludge.
Material and Methods: Quantitative and qualitative methods of screening such as hemolysis in blood agar medium, oil distribution, oil degradation, oil emulsification and surface tension reduction measurements were used for detection of biosurfactant production. Residual petroleum hydrocarbons were analyzed using gas chromatography (GC-MS) analysis. The bacterium was identified by biochemical tests and 16S rRNA sequencing.
Results: The results from analysis of the composition by thin layer chromatography and Fiore infrared analysis showed that the produced biosurfactant had rhamnolipid content. The isolated bacterium was identified Pseudomonas Sp. The Pseudomonas sp. that was isolated from activated sludge of the oil refinery plant in Isfahan was able to produce rhamnolipid biosurfactant and decreased the surface tension of crude oil down to 27 mN/m. Gas chromatography analysis showed the removal of 80.45% of petroleum hydrocarbons within 20 days by the isolate. Methanoic acid accounts for 23% of the remarkable produced compounds.
Discussion and conclusion: The results of this study showed that the BA3 isolate was capable of producing the most biosurfactant and also the decomposition of crude oil hydrocarbons. Therefore it has the ability to be used in bioremediation, crude oil decomposition and elimination of the environmental pollutions from oil industries. Also the produced methanoic acid can be used as an antibacterial substance in animal feed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rhamnolipid biosurfactant
  • Pseudomonas
  • Crude oil bioremediation
  • Methanoic acid

مقدمه.

امروزه، آلودگیﻫای زیست‌محیطی با پساب‌های صنعتی و لجن فعال مقادیر زیادی از آلایندهﻫای صنعتی را در محیط‌زیست آزاد می‌کنند (1)؛ بخشی از این آلاینده‌ها در اثر فعالیت ریزموجوداتی که در آب و خاک وجود دارند یا در اثر عوامل فیزیکی حذف می‌شوند، اما بخش عمدۀ آنها در محیط‌زیست تجمع می‌یابند که برای سلامتی انسان مضر است (2). آلاینده‌ها در خاک نفوذ می‌کنند و چنانچه پاک‌سازی نشوند، سبب آلودگی آب‌های زیرزمینی می‌شوند (3). روش‌های پاک‌سازی فیزیکی و شیمیایی ازنظر اقتصادی آسان نیستند، ولی استفاده از ریزموجودات ﺑﻮﻣﯽ ﻫﺮ ﻣﻨﻄﻘﻪ در پالایش زیستی نفت خام از طریق تولید بیوسورفکتانت‌ها، روشی مقرون‌به‌صرفه ازنظر اقتصادی است (2). بیوسورفکتانت‌ها، مولکول‌های دوگانه‌ آب‌دوست و آب‌گریزی‌اند ﮐﻪ اﻣﮑﺎن ﺗﺸﮑﯿﻞ ﻣﯿﺴﻞ در حدفاصل دو ﻓﺎز ﺑﺎ ﻗﻄﺒﯿﺖ ﻣﺘﻔﺎوت را دارند. وﯾﮋﮔﯽ سمیت کم و تجزیه‌پذیری زیاد بیوسورفکتانت‌ها سبب می‌شود اعمال ﮐﺎﻫﺶ کشش ﺳﻄﺤﯽ و ﺑﯿﻦ‌ﺳﻄﺤﯽ ﻣﺎﯾﻌﺎت و درنتیجه، ﺗﺸﮑﯿﻞ ﻣﯿﮑﺮواﻣﻮﻟﺴﯿﻮن را بدون آسیب‌رساندن به محیط‌زیست انجام دهند. باکتری‌ها نفت امولسیون‌شده را تجزیه و به مواد ساده‌تر تبدیل می‌کنند. پالایش زیستی نفت خام از طریق بیوسورفکتانتی که باکتری‌ها تولید می‌کند، روشی مقرون‌به‌صرفه در صنعت است (4).

 

مواد و روش‌ها‌.

نمونه‌گیری: به‌‌منظور جداسازی باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت و تجزیه‌کنندۀ نفت خام، نمونه‌‌برداری از سطح 5 تا 20 سانتی‌متری حوضچۀ لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان (طول جغرافیایی 32 درجه و 78 دقیقه و عرض جغرافیایی 51 درجه و50 دقیقه) انجام شد و نمونه‌ها در ظرف‌های دردار استریل و در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد به آزمایشگاه منتقل شدند. اسیدیتۀ نمونه‌ها با دستگاه Eco20COND، HACH، آمریکا در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد برابر 06/8 و هدایت الکتریکی آنها برابر 1522 میکروموس‌بر‌سانتی‌متر اندازه‌گیری شد.

.غنی‌سازی، جداسازی و خالص‌سازی باکتری‌ها: محیط‌کشت حداقل پایۀ نمکی (MSM[1]) شامل 2 گرم MgSO4 7H2O، 2 گرم (NH4)2SO4، 001/0 گرم FeSO47H2O، 01/0 گرمCaCl2 2H2O ، 5/1 گرم KH2PO4، 5/1 گرم Na2HPO4 12H2O حاوی 1 درصد نفت ‌خام پالایشگاه نفت اصفهان با چگالی 8607 گرم بر سانتی‌مترمکعب (تنها منبع کربن و انرژی) در اسیدیتۀ برابر 7 در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر به‌‌منظور غنی‌سازی و جداسازی باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت و تجزیه‌کنندۀ نفت خام به‌ کار برده شد. مقدار 10 میلی‌لیتر لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان به محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت خام اضافه شد و به‌منظور غنی‌سازی به‌مدت 7 روز در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد (120 دوردردقیقه) گرمخانه‌گذاری شد. غنی‌سازی پنج مرتبه و به فواصل زمانی یک هفته و سپس، خالص‌سازی روی محیط‌کشت MSM آگار انجام شد (4).

.غربال‌گری جدایه‌های مولد بیوسورفکتانت: آزمون‌های همولیز خون، پراکنش نفت، فروپاشی روغن، فعالیت امولسیون‌کنندگی (آمیزندگی) و اندازه‌گیری کشش سطحی به‌منظور غربال‌گری جدایه‌ها به‌ترتیب زیر برای تمام جدایه‌ها اجرا شدند: به‌‌منظور تولید بیوسورفکتانت، جدایه‌های غربال‌شده طبق استاندارد نیم مک‌فارلند به محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت‌خام (اسیدیتۀ 7) تلقیح و به‌‌مدت 7 روز در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد (120 دوردردقیقه) گرمخانه‌گذاری شدند. محیط‌کشت به‌‌مدت 15 دقیقه در 8500 دور‌در‌دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی برای تولید بیوسورفکتانت جدا شد (5 و 6). به‌منظور انجام آزمون همولیز خون و بررسی فعالیت همولیتیکی جدایه‌ها، کلنی هر جدایه به‌طور مجزا در محیط‌کشت آگار خون‌دار (5 درصد حجم/حجم خون دفیبرینۀ گوسفندی) کشت داده شد و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. (7). به‌منظور انجام آزمون پراکنش نفت، 30 میلی‌لیتر آب‌ مقطر درون پلیت ریخته و سپس 20 میکرولیتر نفت ‌خام به مرکز پلیت افزوده شد و 10 میکرولیتر محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ روی لایۀ نفتی در سطح پلیت اضافه شد و میزان پراکنش سطح نفت در پلیت بررسی شد؛ محیط‌کشتMSM  استریل حاوی نفت خام برای شاهد منفی در نظر گرفته شد (6). به‌‌منظور انجام آزمون فروپاشی روغن، 10 میکرولیتر محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ به چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای استریل حاوی 100 میکرولیتر پارافین اضافه شد و توئین 80 برای شاهد مثبت و محیط‌کشت MSM استریل حاوی نفت خام برای شاهد منفی در نظر گرفته شد. چنانچه قطرۀ کروی در سطح پارافین تشکیل می‌شد، امتیاز منفی به چاهک داده می‌شد و اگر قطرۀ اضافه‌شده به ته چاهک منتقل یا از حالت کروی خارج می‌شد، امتیاز مثبت برای نمونۀ مدنظر در نظر گرفته می‌شد (7). به‌منظور انجام آزمون فعالیت امولسیون‌کنندگی، ابتدا زیست‌تودۀ باکتریایی به کمک سانتریفیوژ با سرعت 8500 دوردر‌دقیقه به‌مدت 15 دقیقه از محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت خام حذف شد و سپس، 2 میلی‌لیتر محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ ‌همراه با 2 میلی‌لیتر نفت‌ خام در لوله‌های جداگانه ریخته شد. هر لوله 2 دقیقه به‌شدت ورتکس شد و سپس به‌مدت 24 ساعت به‌طور ساکن در دمای محیط قرار داده شد؛ ارتفاع ناحیۀ امولسیون‌شده در هر لوله اندازه‌گیری و نسبت ارتفاع ناحیۀ امولسیون‌شده به ارتفاع کل مایع درون لولۀ آزمایش، شاخص امولسیون‌کنندگی برای هر جدایه در نظر گرفته شد. محیط‌کشت MSM استریل برای شاهد منفی در نظر گرفته شد (7).

E24= ×100

به‌‌منظور اندازه‌گیری کشش سطحی به روش ورقۀ فلزی، 50 میلی‌لیتر مایع رویی به‌‌دست‌آمده از سانتریفیوژ روی دستگاه تنسیومتر (KRUSS Model: K20 Easu Dyne) گذاشته شد؛ پس‌از برخورد ورقۀ فلزی دستگاه به سطح مایع در پلیت دستگاه، میانگین کشش سطحی طی 10 ثانیه سنجش متوالی با دستگاه گزارش شد؛ توئین 80 برای شاهد مثبت و محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت ‌خام بدون ریزموجود برای شاهد منفی در نظر گرفته شد. میانگین کشش سطحی نمایش‌داده‌شده روی صفحۀ دستگاه با نمونه‌های شاهد مثبت و منفی مقایسه شد و نمونه‌های نزدیک به شاهد مثبت انتخاب شدند (8).

ترسیم منحنی رشد جدایه: جدایۀ مدنظر در محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت (تنها منبع کربن و انرژی) کشت و در دمای محیط (120 دوردردقیقه) هوادهی شد. دانسیتۀ نوری محیط در زمان صفر و در فواصل زمانی دوساعته تا 96 ساعت و سپس در فواصل زمانی شش‌ساعته طی 25 روز رشد نمایی جدایه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر خوانده شد (9).

استخراج بیوسورفکتانت: جدایۀ انتخابی بر اساس استاندارد نیم مک‌فارلند به محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت تلقیح و به‌طور جداگانه به‌مدت 5، 7، 10، 15 و 20 روز در دمای ‏‏30 درجۀ سانتی‌گراد (120 دوردر‌دقیقه) گرمخانه‌گذاری شد. آزمون پراکنش نفت طی روزهای رشد یادشده، معیاری ساده و مهم برای بررسی بیشترین بیوسورفکتانت تولیدشده از جدایۀ منتخب در نظر گرفته و انجام شد؛ سپس به‌منظور استخراج بیوسورفکتانت، جدایۀ منتخب به‌مدت 7 روز در محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت و در دمای ‏‏30 درجۀ سانتی‌گراد (120 دوردردقیقه) گرمخانه‌گذاری شد؛ پس‌از‌آن، سلول‌های باکتری با‏‏ سانتریفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در 8500 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد حذف شدند و مایع رویی جمع‌آوری شد. میزان اسیدیتۀ مایع با کلریدریک‌اسید 1 مولار برابر با 2 تنظیم و به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد؛ سپس به حجم برابر، حلال‌های کلروفرم و متانول (‏‏به نسبت ‏‏1:2) ‏‏اضافه شدند و طی سه مرتبه شستشو با حلال‌های یادشده، فاز آبی دور ریخته و فاز آلی جدا شد. حلال‌ها در آون و دمای 45 درجۀ سانتی‌گراد تبخیر شدند و فراوردۀ نهایی به رنگ قهوه‌ای تیره و قوام چرب با ‌عنوان بیوسورفکتانت خام و فعال به ‏دست آمد. بیوسورفکتانت خشک به‏دست‌آمده وزن شد (8).

کروماتوگرافی لایۀ نازک[2](TLC): این روش برای تعیین ماهیت بیوسورفکتانت تولیدشده استفاده شد. مقدار 500 میلی‌گرم بیوسورفکتانت استخراج‌شده از جدایۀ انتخابی در 500 میلی‌لیتر حلال کلروفرم حل و سپس، 10 میکرولیتر آن روی کاغذهای سیلیکاژل استاندارد (silica gel 60F254 plates) بارگذاری شد. سیستم حلال‌های ‌به‌کار‌رفته شامل (کلروفرم/متانول/آب) به نسبت (v/v65/15/2) بود. معرف نین‎هیدرین (5/0 گرم در 100 میلی‌لیتر استون بدون آب) برای پیدایش بخش لیپیدی و معرف آنترون (1 گرم در 5 میلی‌لیتر سولفوریک‌اسید و 95 میلی‌لیتر اتانول) برای پیدایش بخش قندی به‌‏طور جداگانه روی کروماتوگرام به‌ کار برده شدند (9).

طیف‌سنجی تبدیل فوریۀ مادون قرمز[3](FT-IR): شناسایی ماهیت بیوسورفکتانت جدایۀ منتخب با دستگاه طیف‌سنجی تبدیل فوریۀ مادون قرمز انجام شد. بیوسورفکتانت استخراج‌شده ‌همراه با پودر پتاسیم‌بروماید خشک و خالص در دستگاه Bruker FT-IR spectrometer with KBr disks, Dresden, Germany با امواج تنظیم‌شده در cm-14000-450 قرار داده شد (10).

سنجش میزان حذف نفت به روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی: هیدروکربن‌های نفتی باقیمانده پس‌از بررسی حذف نفت خام طی 5، 10، 15 و 20 روز رشد جدایۀ منتخب در 10 میلی‌لیتر محیط‌کشت MSM حاوی 1 درصد نفت خام (120 دوردردقیقه) نگهداری‌شده در دمای محیط سنجیده شدند؛ سپس بهترین زمان برای حذف نفت خام طی 20 روز رشد جدایۀ منتخب در نظر گرفته شد. هیدروکربن‌های نفتی باقیمانده در محیط‌کشت با هگزان نرمال استخراج شدند و میزان جذب نوری آنها پس‌از سانتریفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در 8500 دوردردقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر دوشعاعی مرئی- فرابنفش UV2600))TCC 240A) در طول موج 420 نانومتر تعیین و غلظت کل محتوای هیدروکربنی جدایه‌ها با نمونۀ شاهد مقایسه شد (4).

سنجش حذف نفت به روش کروماتوگرافی گازی اسپکترومتر جرمی[4](GC-MS): به‌منظور تأیید میزان حذف نفت به کمک جدایۀ برتر در مرحلۀ پیش، هیدروکربن‌های باقیمانده در محیط‌‌کشت با نمونۀ شاهد در دستگاه Agilent Technologies 5975 inert MSD with triple-Axis Detector Biosystem-USA سنجیده و مقایسه شدند. هپتامتیل‌نونان (مرک- آلمان) به مقدار 79 میکروگرم‌درمیلی‌لیتر برای استاندارد درونی در دستگاه کروماتوگرافی گازی با ویژگی‌های ستون DP-5MS به طول60 متر و قطر داخلی 25/0 میلی‌متر با گاز حامل هلیوم و سرعت 1 میلی‌متر‌در‌دقیقه به کار گرفته شد. برنامۀ دمایی دستگاه به شرح زیر اجرا شد: دمای آغاز 50 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه در نظر گرفته شد؛ سپس دما با سرعت 10 درجه در هر دقیقه تا 280 درجۀ سانتی‌گراد افزایش یافت و 2 میکرولیتر از نمونه در دمای 260 درجۀ سانتی‌گراد به دستگاه تزریق شد (4 و 11).

شناسایی اولیه و مولکولی جدایه: به‌‌منظور شناسایی اولیۀ جدایۀ مدنظر، ویژگی‌های ماکروسکوپی و میکروسکوپی بررسی و آزمون‌های بیوشیمیایی انجام شدند. به‌‌منظور شناسایی مولکولی جدایۀ مدنظر، DNA به ‌روش جوشاندن استخراج شد (11) و واکنش زنجیره‌‌ای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگرهای عمومی R1492 و F27 با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز Ta (سیناژن، ایران) انجام شد (12).

 

نتایج.

.خالص‌سازی و غربالگری باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت: تعداد 7 جدایۀ باکتریایی متفاوت خالص‌سازی شدند. نتایج غربال‌گری سویه‌های مولد بیوسورفکتانت برای آزمون‌های همولیز خون، پراکنش نفت، فروپاشی روغن، فعالیت امولسیون‌کنندگی (آمیزندگی) و اندازه‌گیری کشش سطحی در جدول 1 مشاهده می‌شوند. باتوجه‌به نتایج، جدایۀ BA3 بهترین سویۀ مولد بیوسورفکتانت شناسایی شد. 48 ساعت پس از کشت در آزمون همولیز خون، همولیز نوع بتا در اطراف کلنی جدایۀ BA3 مشاهده شد (شکل 1، A) و قطر هالۀ همولیز پس‌از دو روز گرماگذاری به 5/0 سانتی‌متر رسید. در آزمون پراکنش نفت، افزودن محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ سبب ایجاد ناحیۀ شفاف در سطح لایۀ نفتی در پلیت شد (شکل 1، B) و قطر ناحیۀ شفافی که جدایۀ BA3 ایجاد‌ کرد، برابر با 5/5 سانتی‌متر اندازه‌گیری شد. در آزمون فروپاشی روغن، شاهد منفی در سطح پارافین قرار گرفت و شاهد مثبت به ته چاهک سقوط کرد؛ مشابه این حالت برای برخی از جدایه‌های باکتریایی مشاهده شد. در آزمون فعالیت امولسیون‌کنندگی، ناحیۀ امولسیون‌شده به‌واسطۀ جدایۀ BA3 (شکل 1، C) به ‌مقدار 5/40 درصد و پایدارتر از سایر جدایه‌ها مشاهده شد. در آزمون اندازه‌گیری کشش سطحی بر اساس نتایج دستگاه تنسیومتر، بیشترین کاهش کشش سطحی برای جدایۀ BA3 به مقدار 27 میلی‌نیوتن‌بر‌متر گزارش شد..

 

 

جدول 1- نتایج غربال‌گری ثانویه به‌منظور بررسی تولید بیوسورفکتانت توسط 7 جدایۀ باکتریایی

آزمون                                            جدایه

BA1

BA2

BA3

BA4

BA5

BA6

BA7

شاهد

قطر همولیز خون (سانتی‌متر)

g

g

Β (5/0سانتی‌متر)

Α (5/0سانتی‌متر)

g

g

g

g

پراکنش نفت (سانتی‌متر)

0

8/0

5/5

4/1

1/1

8/2

5/0

-

فروپاشی روغن

+

-

+

+

-

+

-

-

امولسیون‌کنندگی نفت خام (درصد)

10

2

5/40

12

-

26

21

-

کشش سطحی(میلی‌نیوتن‌بر‌متر)

4/38

37

27

8/37

29

8/30

39

44

-. نتیجۀ منفی، +. نتیجۀ مثبت

 

 

شکل 1- برخی ویژگی‌های بیوسورفکتانت جدایۀ BA3؛ A. همولیز بتا، B. پراکنش نفت، C. فعالیت امولسیون‌کنندگی

 

ترسیم منحنی رشد جدایۀ برتر مولد بیوسورفکتانت (BA3): پس‌از 25 روز، جدایۀ BA3 از فاز نمایی رشد خارج و وارد فاز سکون شد (شکل 2).

 

 

شکل 2- منحنی رشد جدایۀ BA3

 

استخراج بیوسورفکتانت از جدایۀ برتر مولد بیوسورفکتانت (BA3): بیوسورفکتانت استخراج‌شده در شکل 3 مشاهده می‌شود و وزن خشک آن برای جدایۀ BA3 برابر با 12 گرم‌درلیتر اندازه‌گیری شد.

 

 

شکل 3- بیوسورفکتانت استخراج‌شده از جدایۀ BA3

نتایج کروماتوگرافی لایۀ نازک (TLC): نتایج بررسی ماهیت بیوسورفکتانت تولید‌شده به‌واسطۀ جدایۀ BA3 در این آزمون نشان‌دهندۀ لکۀ قهوه‌ای‌رنگ در اثر اسپری با معرف نین‌هیدرین و لکۀ زرد‌رنگ در اثر اسپری با معرف آنترون بود. نتایج نشان دادند بیوسورفکتانت استخراج‌شده حاوی ترکیبات لیپیدی و کربوهیدراتی است (شکل 4).

 

باند حاصل از استخراج بیوسورفکتانت

 

 

باند حاصل از استخراج بیوسورفکتانت

شکل 4- بیوسورفکتانت جدایۀ BA3 بارگذاری‌شده روی کاغذ کروماتوگرافی لایۀ نازک

 

نتایج طیف‌سنجی تبدیل فوریۀ مادون قرمز (FT-IR): تفسیر ارتعاش‌های کششی و خمشی در محدودۀ cm-1 4000-450 بیوسورفکتانت جدایۀ BA3 (شکل 5) به ‌این‌ ترتیب بود که باند پهن و کششی در cm-13511 به گروه عاملی O-H و ارتعاش‌های گروه هیدروکسیل آزاد مربوط بود. مقدارهای جذب در طول موج‌های cm-12992 و cm-12922 به‌ترتیب نشان‌‌دهندۀ ارتعاش‌های کششی (-CH) مربوط به گروه‌های عاملی CH2 و CH3 زنجیرۀ آلیفاتیک بودند. جذب‌های موجود در طول موج‌های cm-11656 و cm-11155 به‌ترتیب وجود گروه‌های (-C=O) و ((-C-O-C- را اثبات کردند؛ همین‌طور جذب‌ در ناحیۀ cm-11712 نشان‌دهندۀ باند غیر‌‌اشباع (-C=C-) مربوط به گروه کربونیل بود.

 

 

شکل 5- نتایج آزمون FT-IR بیوسورفکتانت جدایۀ BA3

 


.سنجش میزان حذف نفت به روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی: مقایسۀ غلظت کل محتوای هیدروکربنی جدایه‌ها نشان می‌دهد جدایۀ BA3 توانایی بیشترین درصد حذف نفت خام را بین جدایه‌ها دارد (جدول 2).

 

جدول 2- مقایسۀ بازده زیست‌پالایی نفت خام به‌واسطۀ جدایه‌ها

نمونه‌ها

حذف نفت خام (درصد) پس‌از 20 روز رشد جدایه‌ها در طول موج 420 نانومتر

BA1

30/45 درصد

BA2

48/50 درصد

BA3

45/80 درصد

BA4

20/48 درصد

BA5

30/74 درصد

BA6

21/70 درصد

BA7

79/41 درصد

 

.سنجش میزان حذف نفت به روش کروماتوگرافی گازی (GC-MS): نتایج سنجش هیدروکربن‌های باقیمانده در محیط‌کشت MSM با دستگاه GC-MS برای جدایۀ BA3 در مقایسه با شاهد در جدول 3 و شکل 6 مشاهده می‌شوند. همان‌طور که در طیف جرمی جدایۀ BA3 مشاهده می‌شود (شکل 6)، ارتفاع و سطح زیر اکثر پیک‌ها نسبت به نمونۀ شاهد کاهش یافته است که نشان‌دهندۀ حذف ترکیبات هیدروکربنی نفت خام به‌واسطۀ جدایۀ مدنظر است. ترکیباتی که در جدول 3 با حرف R نمایش داده شده‌اند، نسبت به نمونۀ شاهد کاهش یافته‌اند؛ ترکیباتی که با حرف P مشخص شده‌اند، تولیدی‌اند؛ ترکیباتی که با حرف U نمایش داده شده‌اند، در محیط‌کشت کاهش نیافته‌اند یا حذف نشده‌اند و باقی مانده‌اند؛ ترکیباتی که با حرف L مشخص شده‌اند، کاهش کمتری را نسبت به نمونۀ شاهد نشان داده‌اند. نتایج تجزیه‌و‌تحلیل با دستگاه طیف‌سنجی جرمی نشان می‌دهند یکی از ترکیبات ارزشمند تولیدشده به‌واسطۀ جدایۀ BA3 جداسازی‌شده از لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان، متانوئیک‌اسید به مقدار 23 درصد است.

شناسایی جدایۀ BA3: نتایج شناسایی اولیۀ جدایۀ BA3 در جدول 4 نشان داده شده‌اند.

نسبت جذب DNA استخراج‌شده در طول موج 280/260 نانومتر برابر با عدد 86/1 بود که نشان‌‌دهندۀ درصد خلوص زیاد DNA است. تکثیر DNA استخراج‌شده از جدایۀ BA3 با استفاده از آغازگرهای عمومی R1492 و F27 سبب تشکیل محصول PCR با اندازه باند برابر با 1500 جفت باز روی ژل آگارز 5/1 درصد شد (شکل 7).

 

 

جدول 3- بازده زیست‌پالایی نفت خام به‌واسطۀ جدایه BA3در مقایسه با شاهد

Peak number

Change of Compounds

RetentionTime

Relative Abundance (control) (%)

Biodegradation Efficiency(BA3 Strain) (%)

Chemical Formula

Molecular Weight(g/mol)

1

Butane, 2-iodo-2-methyl

R

14/094

4

90

C5H11

197/9905

 

2

Tridecane

R

14/312

8

98

C13H28

184/37

 

3

Nonahexacontanoic acid

R

14/561

3

93

C69H138O2

999/861

 

4

Decane

R

14/722

3

98

C20H42

282/547

 

5

Tetradecane

R

15/013

9

97/5

C17H36O

256/4671

 

6

Oxalic acid

P

15/112

0

10

C13H24O4

244/321

 

7

Hydroxy ethyl quinolin

R

15/485

11

71

C20H42

282/5475

 

8

Pentadecane

R

15/732

53

60

C15H30

210/405

 

9

Dodecane, 1-fluoro

P

15/845

0

20

C12H25F

188/33

 

10

Sulfurous acid, butyl tridecyl

P

16/512

0

28

C17H36O3s

320/532

 

11

Naphthalene, 1,6,7-trimethyl

R

16/211

15.5

83

C16H34

226/448

 

12

Dodecane, 2-methyl-8-propyl-

R

16/549

32

96

C17H36

240/48

 

13

Pentadecane, 2,6,10-trimethyl

P

17/502

0

24

C18H38

254/502

 

14

Pentacosane

R

17/913

38

77

C25H52

352/69

 

15

Heptadecane

L

18/131

95

12

C20H42

282/5475

 

16

Heneicosane

R

18/987

70

89

C24H50

338/65

 

17

Methanoic acid

P

20/027

0

23

HCOOH

40/025

 

18

Tricosane

R

20/113

53

60

C26H54

366/718

 

19

Heneicosane

U

22/233

70

0

C24H50

338/65

 

L= Less reduced, U= Un-removed, P= Product, R= Reduced

 

 

 

شکل 6- مقایسۀ تجزیه‌وتحلیل هیدروکربن‌های باقیمانده در محیط‌کشت MSM با دستگاه GC-MS برای جدایه BA3 در مقایسه با شاهد

 

 

جدول 4- نتایج شناسایی اولیۀ جدایۀ BA3

ریخت‌شناسی، رنگ‌آمیزی گرم

باسیل، گرم منفی

اکسیداز

+

کاتالاز

+

رشد در ائوزین‌متیلن‌بلو

+

رشد در مک‌کانکی‌آگار

کلنی درشت، لاکتوز منفی

رنگ‌آمیزی کپسول

+

TSI

K/K، گاز منفی، H2S منفی

IMViC

اندول منفی،MR منفی، VPمنفی، سیترات مثبت

اوره‌آز

+

احیای نیترات

+

لیپاز، لستیناز

+، +

 

 

شکل 7- الکتروفورز محصول PCR جدایۀ BA3 با آغازگرهای عمومی R1492 وF27 و مشاهدۀ باند 1500 جفت بازی

 

توالی به‌دست‌آمده از تکثیر ژن در برنامۀ BLAST با توالی‌های موجود انطباق داده شد و ارزیابی مولکولی باکتری جداسازی‌شده، جنس سودوموناس[v] را تأیید کرد. نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند سودوموناس توانایی تولید بیشترین بیوسورفکتانت و تجزیۀ هیدروکربن‌های نفت خام را دارد.

 

بحث و نتیجه‌گیری

جنس سودوموناس یکی از مهم‌ترین جنس‌های خانوادۀ سودوموناداسه[vi] محسوب می‌شود. باکتری‌های موجود در این جنس همگی میله‌ای‌شکل، مستقیم یا کمی منحنی، گرم منفی غیراسید‌فست و بدون اسپورند. این باکتری‌ها با یک یا تعدادی فلاژل قطبی حرکت می‌کنند و در خاک، آب، پساب‌های صنعتی و مواد آلی درحال فساد یافت می‌شوند (11). در پژوهش‌های مختلف، این باکتری یکی از تولیدکنندگان بیوسورفکتانت محسوب شده است. بیوسورفکتانت‌ها میسل تشکیل می‌دهند و میسل‌ها به‌علت داشتن قابلیت زیاد در افزایش حلالیت مواد کم‌محلول در آب، اهمیت ویژه‌ای دارند (13-15). بیوسورفکتانت‌ها بر اساس ساختار شیمیایی و منشأ میکروبی به پنج گروه اصلی تقسیم می‌شوند که بیوسورفکتانت‌های سبک عبارتند از: گلیکولیپید، رامنولیپید، لیپوپپتید و فسفولیپیدها و بیوسورفکتانت‌های سنگین دو دستۀ پلیمری و ذره‌ای دارند. گلیکولیپیدها عمده‌ترین بیوسورفکتانت‌هایی‌اند که تولید شده‌اند (16). به‌طور‌کلی بیوسورفکتانت‌ها توانایی کاهش کشش سطحی و کشش بین‌سطحی یا قدرت امولسیون‌کنندگی، پتانسیل کاربرد در زمینه‌های مختلف ازجمله صنایع شیمیایی، نفت، پتروشیمی، شوینده‌ها، محصولات آرایشی، رنگ‌سازی، فرایند حذف فلزات سنگین، حذف هیدروکربن‌های نفتی و سایر حوزه‌های زیست‌فناوری را دارند (14 و 15). در مطالعه‌هایی که با هدف جداسازی باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت از منابع محیطی انجام شده‌اند، فعالیت همولیتیک معیاری برای جداسازی اولیۀ سویه‌های مولد بیوسورفکتانت در نظر گرفته و بررسی شده است (16 و 17)؛ به‌طوری‌که در مطالعۀ مشابهی که خواجوی[vii] و همکاران در سال 2016 برای جداسازی باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت انجام دادند، بررسی فعالیت همولیتیک برای جداسازی اولیۀ ریزموجودات استفاده شد (8). ازآنجاکه کاهش کشش سطحی محیط رشد مهم‌ترین و اصلی‌ترین معیار برای اثبات تولید بیوسورفکتانت محسوب می‌شود، پس‌از غربال‌گری اولیه در پژوهش حاضر، تعدادی از جدایه‌های باکتریایی انتخاب شدند و این آزمایش برای بررسی و تأیید توان این جدایه‌ها در تولید بیوسورفکتانت و سپس تجزیۀ هیدروکرین‌های موجود در نفت خام استفاده شد. پارتیپان[viii] و همکاران (2017) مطالعه‌های مشابهی را در این زمینه برای جداسازی باکتری‌های مولد بیوسورفکتانت انجام داده‌اند (1). پژوهشگران دیگر نیز وجود بیوسورفکتانت رامنولیپیدی را در باکتری سودوموناس گزارش کرده‌اند؛ برای نمونه، رحمان[ix] و همکاران طی پژوهشی که در سال2010 انجام دادند، تولید بیوسورفکتانت رامنولیپیدی به‌واسطۀ سودوموناس را گزارش کردند (11)؛ همچنین در مطالعه‌ای که تن‌زاده[x] و همکاران در سال 2018 انجام دادند، جدایه‌های بومی باسیلوس سرئوس[xi]، استافیلوکوکوس همولیتیکوس[xii] و سودوموناس آئروژینوزا[xiii] بیوسورفکتانت را تولید کردند و نشان داده شد تولید این نوع ترکیبات فعال سطحی ارتباط مستقیمی با جذب و تجزیۀ مواد هیدروکربنی نفت خام موجود در مناطق آلوده دارد و درنتیجه سبب پالایش زیستی نفت خام از این مناطق می‌شود. جدایۀ بومی J12 در مطالعۀ یادشده، سودوموناس آئروژینوزا شناسایی شد و تجزیه‌و‌تحلیل با دستگاه کروماتوگرافی گازی برای سنجش حذف هیدروکربن‌های نفت خام، مقدار حذف 42 درصد طی 7 روز رشد را برای این جدایۀ بومی نشان داد (18). در پژوهش حاضر مشخص شد تولید بیوسورفکتانت رامنولیپیدی به مقدار 12 گرم‌درلیتر به‌واسطۀ جدایۀ بومی BA3 ارتباط مستقیمی با تجزیۀ مواد هیدروکربنی نفت خام به مقدار 45/80 درصد طی 20 روز رشد در محیط‌کشت حداقل پایۀ نمکی دارد و باعث پالایش زیستی مقدار درخور توجهی نفت خام می‌شود. در پژوهش دیگری که حاجی محمدی[xiv] و همکاران در سال 2017 انجام دادند، مقدار بیوسورفکتانت رامنولیپیدی تولیدشده از باکتری سودوموناس آئروژینوزا ATCC28793 برابر 2 گرم‌درلیتر گزارش شد و نتایج این پژوهش نشان دادند بیوسورفکتانت رامنولیپیدی سبب سبک‌سازی نفت خام سنگین به میزان درخور توجهی می‌شود (19)؛ به‌این‌ترتیب، مقایسۀ گزارش‌های یادشده با نتایج پژوهش حاضر نشان می‌دهد باکتری سودوموناس مولد مقدار درخور توجهی بیوسورفکتانت رامنولیپیدی در حضور نفت خام (تنها منبع کربن و انرژی) است. باتوجه‌به نتایج پژوهش حاضر و مقایسۀ آن با نتایج سایر پژوهشگران، باکتری سودوموناس سویه BA3 جداسازی‌شده از لجن فعال پالایشگاه نفت اصفهان مولد بیوسورفکتانت رامنولیپیدی مفید و ارزشمند است (7 و 10)؛ از سوی دیگر، تولید تجاری این نوع بیوسورفکتانت با استفاده از کمترین نمک‌های معدنی و منابع ارزان‌قیمت دیگر امکان‌پذیر و ازنظر اقتصادی بسیار مقرون‌به‌صرفه‌تر از سورفکتانت‌های گران‌قیمت شیمیایی است (16)؛ همچنین این بیوسورفکتانت به‌علت منشأ زیستی، زیست‌تخریب‌پذیر است و رهاشدن آن در محیط، آلودگی زیست‌محیطی ایجاد نمی‌کند. تجزیه‌و‌تحلیل با دستگاه کروماتوگرافی گازی برای سنجش ترکیبات نفت خام باقیمانده در محیط‌کشت حداقل پایۀ نمکی طی 20 روز رشد سودوموناس سویۀ BA3، مقدار 45/80 درصد حذف ترکیبات نفتی را نشان می‌دهد؛ ازاین‌رو، ارتباط مستقیمی بین پالایش زیستی آلودگی‌های نفت خام و تولید بیوسورفکتانت رامنولیپیدی به کمک این ریزموجودات بومی در مناطق آلوده به نفت وجود دارد و تولید تجاری بیوسورفکتانت رامنولیپیدی و استفاده از آن در صنایع مختلف به‌ویژه در صنعت نفت به‌منظور پالایش زیستی پیشنهاد می‌شود. متانوئیک‌اسید تولید‌شده در اثر تجزیۀ زیستی نفت به کمک سودوموناس سویۀ BA3، ساده‌ترین عضو گروه کربوکسیلیک‌اسیدهاست که در نیش حشراتی مانند مورچه و زنبور یافت می‌شود؛ این ترکیب بیشتر به‌شکل مادۀ نگهدارنده و ضدمیکروبی در غذای دام‌ها استفاده می‌شود. پاشیدن مقداری از این اسید روی علف تازه‌خشک‌شده از پوسیدگی آن جلوگیری و تا حد زیادی مواد مغذی آن را حفظ می‌کند. متانوئیک‌اسید برای جلوگیری از فساد غذای زمستانی دام‌ها در دامداری‌های بزرگ استفاده می‌شود (20).

سپاسگزاری

نویسندگان مقالۀ حاضر از معاونت محترم پژوهشی و کارکنان آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان برای دراختیار‌گذاشتن امکانات دستگاهی سپاسگزاری می‌کنند.

References

(1) Parthipan P., Preetham E., Machuca LL., Rahman PK., Murugan K., Rajasekar A. Biosurfactant and degradative enzymes mediated crude oil degradation by bacterium Bacillus subtilis A1. Frontiers in Microbiology 2017; 8(193): 1-14.

(2) Liu W., Luo Y., Teng Y., Li Z., Ma LQ. Bioremediation of oily sludge-contaminated soil by stimulating indigenous microbes. Environmental Geochemistry and Health 2010; 32: 23-29.

(3) Umar ZD., Aziz NA., Zulkifli SZ., Mustafa M. Rapid biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using effective Cronobacter sakazakii MM045 (KT933253). MethodsX 2017; 20(4): 104-117.

(4) Hassanshahian M., Emtiazi G., Cappello S. Isolation and characterization of crude-oil-degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Marine Pollution Bulletin 2012; 64(1): 7-12.

(5) Pi Y., Chen B., Bao M., Fan F., Cai Q., Ze L., et al. Microbial degradation of four crude oil by biosurfactant producing strain Rhodococcus sp. Bioresource Technology 2017; 232: 263-269.

(6) Karlapudi AP., Venkateswarulu T., Tammineedi J., Kanumuri L., Ravuru BK., Ramu Dirisala V., et al. Role of biosurfactants in bioremediation of oil pollution-a review. Petroleum 2018; 4(3): 241-249.

(7) Larik I., Qazi M., Phulpoto A., Haleem A., Ahmed S., Kanhar N. Stenotrophomonas maltophilia strain 5DMD: An efficient biosurfactant-producing bacterium for biodegradation of diesel oil and used engine oil. International Journal of Environmental Science and Technology 2019; 16(1): 259-268.

(8) Kajavi SS., Moezi A., Enayati ZN. Investigation of biosurfactant production by Bacillus pomilis 1529 and Bacillus subtilis WPI. Biological Journal of Microoganisms 2016; 5(17): 97-110.

(9) Anandaraj B., Thivakaran P. Isolation and production of biosurfactant producing organism from oil spilled soil. Journal Bioscience and Technology 2010; 1(3): 120-126.

(10) Joy S., Rahman PK., Sharma S. Biosurfactant production and concomitant hydrocarbon degradation potentials of bacteria isolated from extreme and hydrocarbon contaminated environments. Chemical Engineering Journal 2017; 317: 232-241.

 

(11) Rahman PK., Pasirayi G., Auger V., Ali Z. Production of rhamnolipid biosurfactants by Pseudomonas aeruginosa DS10‐129 in a microfluidic bioreactor. Biotechnology and Applied Biochemistry 2010; 55(1): 45-52.

(12) Wang Z., Fingas M., Blenkinsopp S., Sergy G., Landriault M., Sigouin L., et al. Comparison of oil composition changes due to biodegradation and physical weathering in different oils. Journal of Chromatography A 1998; 809(1-2): 89-107.

(13) Adeniji A., Okoh O., Okoh A. Analytical methods for the determination of the distribution of total petroleum hydrocarbons in the water and sediment of aquatic systems: A review. Journal of Chemistry 2017; 1-13.

(14) Banat IM., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti MG., Fracchia L., et al. Microbial biosurfactants production, applications and future potential. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 87(2): 427-444.

(15) Sekhon Randhawa KK., Rahman PK. Rhamnolipid biosurfactantspast, present, and future scenario of global market. Frontiers in Microbiology 2014; 5: 454-458.

(16) Ahmad Z., Arshad M., Asghar Hn., Sheikh MA., Crowley DE. Isolation, screening and functional characterization of biosurfactant producing bacteria isolated from crude oil contaminated site. International Journal of Agriculture and Biology 2016; 18(3): 542-548.

(17) Joshi SJ., Al-Wahaibi YM., Al-Bahry SN., Elshafie AE., Al-Bemani AS., Al-Bahri A., et al. Production, characterization, and application of Bacillus licheniformis W16 biosurfactant in enhancing oil recovery. Frontiers in Microbiology 2016; 7: 1853-1860.

(18) Tanzadeh J., Faezi Ghasemi M., Anvari M., Issazadeh KH. Biosurfactant production and biological removal of bulk oil using native strains isolated from the southern shore lines of Caspian Sea. Journal of Biological Microorganisms 2018; 7(27): 113-128.

(19) Hoseini M., Amani H., Hajimohamadi R. Upgrading of heavy crude oil using rhamnolipid biosurfactant produced from Pseudomonas Aeroginosa ATCC28793. Petroleum Research 2017; 27(94): 112-122.

(20) Hajati H. Application of organic acids in poultry nutrition. International Journal of Avian and Wildlife Biology 2018; 3(4): 324-329.