تاثیر دیواره سلولی و عصاره سیتوپلاسمی باکتری لاکتوباسیلوس روتری بر تحریک تولید سایتوکاین های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم، کشاورزی و فناوری های نوین، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران

2 عضو هیئت علمی

3 بخش ایمونولوژی، مرکز تحقیقات میکروب شناسی بالینی استاد البرزی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران.

10.22108/bjm.2019.118287.1219

چکیده

مقدمه: لاکتوباسیلو‌س ها به عنوان میکروارگانیسم‌های زنده‌ای شناخته شده‌اند که در معده، ترشحات صفراوی و پانکراس وجود دارند. به سلول‌های اپیتلیال متصل می‌شوند و در روده انسان کلونیزه می‌گردند. بسیاری از پروبیوتیک‌ها به گروه بزرگی از باکتری‌ها به نام باکتری‌های اسید لاکتیک تعلق دارند. با توجه به خواص تنظیم کنندگی سیستم ایمنی پروبیوتیکها و اثر تنظیمی آنها بر عملکردهای سیستم ایمنی هدف این مطالعه ارزیابی اثر دیواره سلولی و عصاره سیتوپلاسمی باکتری لاکتوباسیلوس روتری بر تحریک تولید سایتوکاین های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما می باشد.
مواد و روشها: به این منظور20 نمونه محصولات لبنی سنتی و پاستوریزه جمع‌آوری شد. شناسایی مولکولی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی انجام شد. DNA باکتری‌ها جداسازی و شناسایی گونه‌های باکتری‌ها با تعیین توالی ژنتیکی محصول PCR صورت گرفت. سپس خون هپارینه انسانی تهیه و سلول‌هایی تک هسته‌ای خون محیطی جداسازی شد. میزان تحریک سیستم ایمنی، سایتوکاین‌های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما با روش الایزا اندازه‌گیری شدند.
نتایج: از 20 نمونه محصولات لبنی، 7 ایزوله لاکتوباسیلوس روتری جداسازی و شناسایی شد. سیستم ایمنی در جهت تولید اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما در حضور دیواره سلولی و عصاره سلولی سیتوپلاسمی باکتری لاکتوباسیلوس روتری تحریک نشد.
بحث و نتیجه گیری: سطح سایتوکاین‌های تولید شده در سلول‌های مونوکلئار انسانی بعد از تحریک سیستم ایمنی افزایش پیدا نکرد. باکتری لاکتوباسیلوس روتری در ایمونوتراپی کاربرد نخواهد داشت.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of Lactobacillus reuteri cell wall and cytoplasmic extract on stimulating of IL-4 and IFN γ cytokines production

نویسندگان [English]

  • Mohammad Hosein Soltani Kordsholi 1
  • Elham Moazamian 2
  • Mehdi Kalani 3
1 Department of Microbiology, Faculty of Science, Agriculture and modern technology, Islamic Azad University, Shiraz, Iran.
3 Department of Immunology, Medical microbiology Research Center, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran.
چکیده [English]

Introduction: Lactobacillus bacteria are known as living microorganisms in the stomach, biliary secretions and pancreas. They attach to the epithelial cells and colonize the human intestines. Many probiotics belong to a large group of bacteria called lactic acid bacteria. In according to immunomodulatory effect of probiotics and effect of these bacteria on the effectiveness of immune responses, we proposed the evaluation of Lactobacillus reuteri cell wall and cytoplasmic extract effects on stimulating of IL-4 and IFN γ cytokines production.
Material and Methods: For this purpose 20 samples of traditional dairy and pasteurized dairy products were collected. Molecular identification was performed using molecular-specific primers. Bacterial DNA was extracted and identification of bacterial species was determined by genetic sequencing of PCR product. Human heparin blood was then prepared and peripheral blood mononuclear cells were isolated. To evaluate immune stimulation, IL-4 and IFN γ cytokines produced by ELISA were measured.
Results: The results of this study showed that from 20 dairy samples, 7 isolates of Lactobacillus reuteri was identified. The immune system for the production of interleukin-4 and IFN γ in the presence of cell wall and cytoplasmic cell extracts of Lactobacillus reuteri was not stimulated.
Lactobacillus casei extract compared to other two bacteria has the greatest effect on immune stimulation and increased IL-4 production.
Discussion and conclusion: The level of cytokines produced in human monocular cells did not increase after stimulating the immune system. The Lactobacillus reuteri Bacterium will not be used in immunotherapy.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lactobacillus casei
  • Immunotherapy
  • Cytokines
  • PBMC

مقدمه.

پروبیوتیک‌ها، ریزموجودات زنده‌ای‌اند که در معده، ترشحات صفراوی و پانکراس وجود دارند، به سلول‌های اپی‌تلیال متصل و در رودۀ انسان کلونیزه می‌شوند. بسیاری از پروبیوتیک‌ها به گروه بزرگی از باکتری‌ها به نام باکتری‌های لاکتیک‌اسید تعلق دارند (1). از میان ریزموجودات پروبیوتیک، باکتری‌های لاکتیک‌اسید مهم‌ترین گروه به شمار می‌آیند و در این میان، جنس لاکتوباسیلوس متداول‌ترین ریزموجود به‌کار‌رفته در تولید محصولات پروبیوتیکی است (2). سـودآوری پژوهش‌ها در زمینـۀ بـاکتری‌هـای لاکتیک‌اسـید و نیاز تمام کشورها به این باکتری‌ها سبب شده است کشورهای درحال توسعه از مدت‌ها پیش به‌طور جدی برای شناسایی باکتری‌های لاکتیک‌اسید بومی تلاش‌ کنند (3).

پروبیوتیک‌ها از طریق تولیدات خود مانند اجزای سلولی، متابولیت‌ها و DNA بر عملکرد سیستم ایمنی میزبان اثر می‌گذارند؛ به عبارتی، اجزای پروبیوتیک‌ها به‌ویژه DNA و پپتیدوگلیکان پاسخ‌هایی را در سیستم ایمنی ذاتی به راه می‌اندازند (4).

در بین پروبیوتیک‌ها، لاکتوباسیلوس‌ها توجه بیشتری را به خود معطوف کرده‌اند. مهم‌ترین اثر پروبیوتیک‌ها، جایگزینی آنها در رودۀ کوچک است که سبب تحریک روده و پاک‌سازی آن و به‌این‌ترتیب، مانع چسبیدن بیماری‌زاها و مهار اثر سمی توکسین‌ها می‌شود. مصرف پروبیوتیک‌ها آثار مفیدی بر سلامت افراد دارد که ازجملۀ آنها عبارتند از: 1- بهبود هضم لاکتوز در افرادی که تحمل لاکتوز ندارند؛ 2- کم‌شدن کلسترول؛ 3- کمک به پیشگیری از سرطان؛ 4- تحریک سیستم ایمنی؛ 5- کنترل عفونت ادراری در خانم‌ها؛ 6- کنترل و پیشگیری عفونت‌های روده‌ای؛ 7- تعادل باکتری‌های بومی (5).

لاکتوباسیلوس روتری، باکتری گرم مثبتی است که به‌طور طبیعی در رودۀ پستانداران و پرندگان زندگی می‌کند. ابتدا در دهۀ 1980 توضیح داده شد برخی گونه‌های این باکتری پروبیوتیک هستند. از قرن نوزدهم، لاکتوباسیلوس روتری در طبقه‌بندی علمی باکتری‌های لاکتیک‌اسید ثبت شد (6). پروبیوتیک‌ها نه‌تنها محرک رشد به شمار می‌آیند، برای تحریک سیستم ایمنی بدن و پیشگیری از ابتلا به بسیاری از بیماری‌های عفونی به کار می‌روند (7).

پروبیوتیک‌ها در سطوح متعددی ازجملـه افـزایش سـطح سیتوکاین‌ها و ایمونوگلوبولین‌ها، افزایش تکثیر سلول‌های مونونوکلئـاز، فعـال‌کــردن ماکروفاژهــا، افـزایش فعالیــت سلول‌های killer Natural، تعدیل خـود‌ایمنـی و تحریـک ایمنی در برابر باکتری‌های بیماری‌زا و پروتوزوآها روی سیسـتم ایمنـی تأثیر می‌گذارند (8).

ایمنی‌درمانی یا ایمونوتراپی، روشی درمانی برای برخی بیماری‌ها ازجمله سرطان است که با تحریک یا سرکوب پاسخ سیستم ایمنی عمل می‌کند. برخی اینترلوکین‌ها، سیتوکین‌ها و کموکین‌ها در این روش درمانی به کار می‌روند. تحریک سیستم ایمنی برای درمان سرطان و برخی از انواع نقص‌های سیستم ایمنی به کار رفته و سرکوب سیستم ایمنی در درمان حساسیت ، رد پیوند اعضا و ... آزموده شده است. درمان سرطان یکی از مهم‌ترین زمینه‌های پژوهشی علوم پایه و بالینی در علوم پزشکی است. پس‌از جراحی، شیمی‌درمانی و رادیوتراپی، روش ایمونوتراپی با استفاده از سیستم ایمنی مهم‌ترین روش مکمل و تأثیرگذار در درمان سرطان است و امروزه، کارآزمایی‌های بالینی وسیعی در انواع مختلف آن درحال انجام است. بررسی پیچیدگی برخورد سیستم ایمنی با تومور لازمۀ ارائۀ راهکار درمانی مناسب برای ایمونوتراپی سرطان است (9 و 10).

هدف مطالعۀ حاضر، ارزیابی تحریک سیستم ایمنی تیپ 1 و 2 در سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی انسانی با استفاده از لاکتوباسیلوس روتری است.

 

مواد و روش‌ها.

نوع مطالعه:مطالعه به‌طور مقطعی از خرداد 1397 تا اردیبهشت 1398 انجام شد. جمع‌آوری نمونه برای جداسازی باکتری‌ها به‌طور تصادفی از محصولات لبنی انجام، شناسایی باکتری‌ها به روش مولکولی انجام و اثر باکتری‌های جداشده بر سلول‌های منوکلئار و تحریک تولید اینترلوکین 4 و اینترفرون گاما با استفاده از آزمایش الایزا ارزیابی شد.

جمع‌آوری نمونه:تعداد 20 نمونه از محصولات لبنی سنتی و پاستوریزه شامل شیر، ماست، پنیر، کشک و ... به‌طور تصادفی از استان فارس جمع‌آوری و برای جداسازی باکتری به آزمایشگاه میکروب‌شناسی منتقل شدند.

.جداسازی لاکتوباسیلوس‌ها از محصولات لبنی: تعلیق باکتریایی از نمونه‌های محصولات لبنی با استفاده از محلول پپتون فیزیولوژیکی استریل (5/8 گرم‌بر‌لیتر کلرید‌سدیم و 1 گرم‌بر‌لیتر پپتون باکتریولوژیکی) تهیه شد. ابتدا حدود 10 گرم از نمونه‌های لبنی با قاشقک استریل و 10 میلی‌لیتر از نمونه‌های شیر و دوغ به‌طور جداگانه به 100 میلی‌لیتر PPS (Physiological Peptone Solution) استریل منتقل شد. پس‌از یکنواخت‌کردن نمونه‌ها با تکان‌دادن به‌مدت نیم ساعت، 10 میلی‌لیتر از تعلیق‌های تهیه‌شده به‌طور جداگانه به 200 میلی‌لیتر محیط‌کشت MRS (Man, Rogosa and Sharp) مایع (شرکت سیگما‌- آلدریچ آمریکا) منتقل شد تا باکتری‌ها به بیشترین مقدار خود برسند و به‌مدت 24 ساعت در شرایط کم‌هوازی (شرایط اتمسفری با فشار اکسیژن کم) و دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ تمام مراحل یادشده زیر هود لامینار و شرایط استریل انجام شدند (11).

شناسایی اولیۀ باکتری‌:شناسایی باکتری‌های خالص‌شده بر اساس صفت‌های شکلی کلنی، رنگ‌آمیزی گرم، آزمون کاتالاز و اکسیداز انجام شد (12).

شناسایی مولکولی: استخراج DNA با استفاده از کیت (یکتاتجهیزآزما- ایران) و بر اساس دستورعمل آن انجام شد. به‌منظور شناسایی دقیق‌تر و تکثیر از آغازگرهای اختصاصی لاکتوباسیلوس و تکثیر ژن 16S rDNA استفاده شد (12). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad-USA) انجام شد. تمام اجزای واکنش از شرکت یکتاتجهیزآزما خریداری شدند. مخلوط واکنش شامل 25 ماکرولیتر Master Mix (شامل بافر PCR با غلظت 10 برابر، کلریدمنیزیم dNTP، آنزیم Taq DNAپلیمراز)، 3 ماکرولیتر DNA، 2 ماکرولیتر آغازگر رفت FLB190 (5′- AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG -3′)، 2 ماکرولیتر آغازگر برگشت RLB190 (5′- CGG TAT TAG CATG TTT CC -3′) با غلظت 10 پیکومول و 18 ماکرولیتر آب بود (13). به‌منظور آغاز فرایند پلیمریزاسیون در این روش، دستگاه ترموسایکلر به‌مدت 1 دقیقه روی دمای 94 درجۀ سلسیوس تنظیم و متعاقباً 35 چرخۀ PCR به‌شکل 1 دقیقه در 94 درجۀ سلسیوس، 30 ثانیه در 55 درجۀ سلسیوس و 1 دقیقه در دمای 72 درجۀ سلسیوس اجرا شد؛ درنهایت، عمل طویل‌سازی نهایی به‌مدت 4 دقیقه در 72 درجۀ سلسیوس انجام شد و سپس برای اطمینان‌یافتن از تکثیر ژن 16S rDNA، الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد حاوی بافر TBE 1X به‌مدت 60 دقیقه در ولتاژ 90 انجام شد. درنهایت، دستگاه UV Transilluminator-USA برای مشاهدۀ نتایج ژل استفاده شد (13 و 14).

توالی‌یابی: محصول نهایی واکنش PCR برای تعیین توالی به شرکت First Base مالزی ارسال شد.

.تهیۀ عصارۀ سیتوپلاسمی و دیوارۀ سلولی از لاکتوباسیلوس‌ها:مقدار 10 میلی‌لیتر محیط‌کشت MRS به‌مدت 48 تا 72 ساعت در شرایط ﺑﯽﻫﻮازی و دﻣـﺎی 30 درجۀ سلسیوس ﮐﺸـﺖ ﺷـﺪ. پس‌از رشد باکتری‌ها، ﺳـﺎﻧﺘﺮیفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در 3500 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سلسیوس انجام و رﺳـﻮب ﺣﺎﺻــﻞ دوباره ﺑـﺎ ﺑــﺎﻓﺮ فسفات 1/0 مولار (اسیدیتۀ 9/6) شستشو شد. رسوب حاصل به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای منفی 80 درجۀ سلسیوس نگهداری شد و سپس، باکتری‌ها از حالت انجماد خارج شدند و 1 میلی‌لیتر بافر لیزکننده به آنها اضافه شد. بافر لیزکننده به شرح زیر تهیه شد:

ابتدا محلولی شامل 140 میلی‌مولار NaCl، 7/2 میلی‌مولار KCL، 10 میلی‌مولار Na2HPO4، 8/1 میلی‌مولار KH2PO4 با اسیدیتۀ 3/7 تهیه و در اتوکلاو، استریل شد؛ محلول حاصل تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد. به‌منظور تهیۀ بافر، 10 درصد گلیسیرین، 2/0 میلی‌مولار لیزوزیم، 10 میلی‌مولار 2- مرکاپتواتانول و 1/0 تا 2 درصد تریتون 100- x به‌طور روزانه به محلول یادشده اضافه شد؛ در مرحلۀ بعد، عمل خردکردن باکتری‌ها در کنار یخ به‌مدت دو دقیقه و به کمک دستگاه سونیکاتور با دامنۀ 60 درصد انجام شد. به‌منظور جلوگیری از افزایش دمای محلول و پروب سونیکاتور، دستگاه به‌مدت چهار دقیقه خاموش شد؛ درنهایت، نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجۀ سلسیوس با 15000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند، محلول رویی جدا و رسوب حاصل (دیوارۀ سلولی) جدا شد؛ سپس رسوب حاصل به‌مدت یک شبانه‌روز درون دستگاه خشک‌کن انجمادی قرار داده شد تا خشک شود. به‌منظور تهیۀ غلظت‌های مختلف، مقادیر لازم وزن و به‌مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجۀ سلسیوس گرمخانه‌‌گذاری شدند تا استریل شوند. عمل رقیق‌سازی به کمک محیط‌کشت RPMI-1640 انجام شد و در شرایط استریل، رقت‌های 1000، 2000، 4000 و 8000 میکروگرم‌در‌میلی‌لیتر از رسوب تهیه شدند (15).

.جداسازی و کشت ردۀ سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی: به‌منظور جداسازی سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی از خون، 10 میلی‌لیتر خون انسانی حاوی مادۀ ضد‌انعقاد هپارین تهیه شد؛ سپس 5 میلی‌لیتر نرمال‌سالین سرد به خون اضافه و به‌آرامی مخلوط شد تا خون لیز نشود. فایکول در لولۀ سانتریفیوژ تمیز ریخته و 8 تا 10 میلی‌لیتر خون رقیق‌شده با نرمال‌سالین سرد به‌آرامی به آن افزوده شد. لولۀ حاوی فایکول و خون به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد و لایۀ حاوی سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی با پییت شارژی که بین فایکول در زیر و نرمال‌سالین در بالا قرار دارد، جدا و به لولۀ تمیز منتقل شد. سلول‌های تک‌هسته‌ای دو بار با نرمال‌سالین شسته و پس‌از آخرین شستشو به حجم 1 میلی‌لیتر رسانده شدند؛ سپس یک قطره از آن برای شمارش استفاده شد. در ادامه، سلول‌ها در محیط‌کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد آلبومین سرم گاوی، 2 میلی‌مولار ال- گلوتامین، 100 میکروگرم‌در‌میلی لیتر استرپتومایسین و 100 میکروگرم‌درمیلی‌لیتر پنی‌سیلین کشت شدند (16 و 17).

.کشت سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی و تیمار آنها با عصارۀ سیتوپلاسمی و دیوارۀ سلولی:پلیت‌های 96تایی برای کشت سلول استفاده شدند. برای هر بیمار، 3 ردیف 8 تایی چاهک در نظر گرفته و تعداد 105×1 سلول در هر چاهک اضافه شد. به‌منظور ارزیابی تحریک سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی به‌واسطۀ دیوارۀ سلولی و عصارۀ سیتوپلاسمی باکتری، مقدار 100 نانوگرم‌درمیلی‌لیتر دیوارۀ سلولی باکتریایی و 5 میکرولیتر عصارۀ باکتریایی استخراج‌شده به چاهک‌های جداگانه اضافه شد. در آزمایش حاضر، سلول‌های بدون تیمار برای شاهد منفی و لیپوپلی‌ساکارید باکتری برای شاهد مثبت استفاده شد. سلول‌ها به‌مدت 72 ساعت در گرمخانۀ 37 درجۀ سلسیوس حاوی 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت نگهداری شدند. پس‌از گذشت 72 ساعت، مایع رویی کشت جمع‌آوری، به تیوب‌های اپندورف منتقل و به‌منظور بررسی سیتوکین IL-4 و IFN-γ به روش الایزا در فریزر منفی 20 درجۀ سلسیوس ذخیره شد (18).

.جمع‌آوری محلول رویی و اندازه‌گیری اینترفرون گاما و اینترلوکین-4:در پژوهش حاضر از کیت الایزا (شرکت کارمانیا پارس ژن، ایران) استفاده شد. پلیت الایزا از کیت خارج و در محیط خشک به دمای اتاق رسانده شد. به‌منظور اندازه‌گیری اینترلوکین-4، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 5 (استاندارد (HI4S-KPG: CN) با غلظت 855 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال A1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 4 (266 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال B1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 3 ( 88 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال C1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 2 (29 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال D1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 1 (9 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال E1 و میزان 65 میکرولیتر از استاندارد صفر (HI4Sz-KPG: CN) به ویال F1 اضافه شد. میزان 60 میکرولیتر به باقی ویال‌ها نمونۀ مدنظر اضافه شد. به‌منظور اندازه‌گیری میزان تولید اینترفرون گاما، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 5 (استاندارد(IFNS-KPG: CN با غلظت 600 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال A1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 4 (200 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال B1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 3 (6/66 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال C1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 2(2/22 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال D1، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 1 ( 4/7 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال E1 و میزان 60 میکرولیتر از استاندارد صفر (HIFNSz-KPG: CN) به ویال F1 ضافه شد؛ در ادامه، نمونه‌ها به‌مدت دو ساعت روی شیکر و در دمای 37 درجۀ سلسیوس گرمخانه‌گذاری شدند. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، سه مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولیتر از آنتی‌بادی کونژوگه به تمام حفره‌ها اضافه و به‌مدت 1 ساعت در دمای اتاق روی شیکر گرمخانه‌گذاری شد. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، سه مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولیتر از محلول Avidin-HRP به تمام حفره‌ها اضافه و به‌مدت نیم ساعت در دمای اتاق و روی شیکر گرمخانه‌گذاری شد. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، پنج مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولـیتر از پیش‌ماده به تمام حفره‌ها اضافـه شد و به‌مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و روی شیکر گرمخانه‌گذاری شدند. میزان 30 میکرولیتر از محلول متوقف‌کننده به تمام حفره‌ها اضافه شد و میزان جذب نمونه‌ها در دستگاه Elisa reader و طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری شد.

تجزیه‌وتحلیل آماری:نرم‌افزارهای آماری SPSS (نسخۀ 25) و (GraphPad) Prism V5.01 برای تجزیه‌وتحلیل آماری استفاده شدند. آزمون شاخصی میانگین برای به‌دست‌آوردن Mean±SD استفاده شد.

 

نتایج

جداسازی باکتری: تعداد 16 جدایه با ویژگی‌های لاکتوباسیلوس از 20 محصول لبنی جمع‌آوری‌شده از مناطق مختلف استان فارس جداسازی شد. کلنی‌های لاکتوباسیلوس، کروی‌شکل، سفید‌رنگ، نرم، صاف، صیقلی، مات و برخی خشک و ناصاف بودند. در رنگ‌آمیزی گرم، باسیل‌های گرم مثبت، کاتالاز و اکسیداز منفی جداسازی و شناسایی مولکولی شدند (شکل 1).

 

   

شکل 1- کلنی لاکتوباسیلوس روتری (شکل سمت چپ)، رنگ‌آمیزی گرم با بزرگ‌نمایی 100× (سمت راست)

 

 

.شناسایی مولکولی لاکتوباسیلوس‌های جداسازی‌شده:پس‌از استخراج DNA، دستگاه ژل الکتروفورز برای مشاهدۀ باندهای حاصل از PCR استفاده شد. از 16 جدایۀ اکسیداز و کاتالاز منفی، 8 جدایۀ لاکتوباسیلوس با اندازۀ 190 جفت باز حاصل شد؛ نتایج در شکل 2 مشاهده می‌شوند.

 

 

190bp

 

 شناساگر  1     2       3      4       5     6       7      8   شاهد+  شاهد-

شکل 2- شناسایی مولکولی لاکتوباسیلوس‌های جداسازی‌شده؛ شناساگر 100 جفت بازی سیناژن، چاهک 1 تا 8 جدایه‌های جداسازی‌شده در پژوهش حاضر، شاهد منفی سویۀ استاندارد باکتری لاکتوباسیلوس، شاهد منفی تمام مواد واکنش PCR به‌جز DNA باکتری


تعیین توالی ژنتیکی محصولات PCR:محصول واکنش PCR تعیین توالی و BLAST شد. نتایج BLAST دارای 99 درصد تشابه با باکتری لاکتوباسیلوس روتری سویۀ LRS بودند. از 8 نمونۀ ارسالی، 7 جدایۀ لاکتوباسیلوس روتری جداسازی و شناسایی شد. جدایه‌های لاکتوباسیلوس روتری از محصولات لبنی پنیر پروبیوتیک رامک، شیر رامک، پنیر پگاه، ماست سنتی روبینا جداسازی شدند.

مقایسه میانگین اثر عصارۀ سیتوپلاسمی و رسوب باکتری لاکتوباسیلوس روتری در تولید اینترفرون گاما و اینترلوکین-4:باتوجه‌به نمودار، عصارۀ سیتوپلاسمی و رسوب این باکتری در تولید اینترفرون گاما مؤثر نبود و تفاوت معناداری در سطح 05/0با شاهد مثبت داشت (شکل 3).

 

 

شکل 3- مقایسه میانگین اثر عصارۀ سیتوپلاسمی و رسوب باکتری لاکتوباسیلوس روتری در تولید اینترفرون گاما؛ D. دیوارۀ سلولی، E. عصارۀ سیتوپلاسمی، LPS. شاهد مثبت و UT. شاهد منفی. * نشان‌دهندۀ سطح معناداری کمتر از 05/0 است.

 

نتایج مقایسه میانگین نشان دادند عصارۀ سیتوپلاسمی و رسوب اثر تقریباً یکسانی در تولید اینترلوکین 4 و تفاوت معنا‌داری در سطح 05/0 با شاهد مثبت دارند (شکل 4).

 

شکل 4- مقایسۀ اثر عصارۀ سیتوپلاسمی و رسوب باکتری لاکتوباسیلوس روتری در تولید اینترلوکین4؛ D. دیواره سلولی، E. عصاره سیتوپلاسمی، LPS. شاهد مثبت و UT. شاهد منفی. * نشان‌دهندۀ سطح معناداری کمتر از 05/0 است.

 

بحث و نتیجه‌گیری

پروبیوتیک‌ها، ریزموجودات زنده‌ای‌اند که در معده، ترشحات صفراوی و پانکراس وجود دارند، به سلول‌های اپی‌تلیال متصل و در رودۀ انسان کلونیزه می‌شوند. بسیاری از پروبیوتیک‌ها به گروه بزرگی از باکتری‌ها به نام باکتری‌های لاکتیک‌اسید تعلق دارند (19). گونه‌های مختلف باکتری‌های لاکتوباسیلوس از انواع باکتری‌های لاکتیک‌اسید هستند. طبقه‌بندی این باکتری‌ها بر اساس واکنش گرم و تولید لاکتیک‌اسید از کربوهیدات‌های تخمیرشدنی گوناگون است (19). یکی از سازوکارهای لاکتوباسیلوس‌های پروبیوتیک، تحریک فعالیت سیتوکین‌های سیستم ایمنی بدن است؛ همچنین سبب تقویت پاسخ ایمنی می‌شوند. در پژوهش حاضر، اثر عصارۀ سلولی و دیوارۀ سلولی باکتری‌ روتری بر تحریک تولید سیتوکین‌های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما از سیستم ایمنی تیپ 1 و 2 در سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی انسانی بررسی شد.

در پژوهش حاضر، گونۀ‌ شناسایی‌شده از لبنیات جمع‌آوری‌شده جداسازی شد. Ehsani و همکاران (2004) به بررسی و جداسازی لاکتوباسیلوس‌های جدا‌شده از پنیر‌های سنتی آذربایجان غربی پرداختند (20) و گونۀ لاکتوباسیلوس کازائی را به دست آوردند. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند عصارۀ سیتوپلاسمی و دیوارۀ سلولی باکتری‌ لاکتوباسیلوس روتری توانایی تحریک سیستم ایمنی برای تولید سیتوکین‌های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما را ندارد. Soltan Dallal و همکاران (2010) اثر تجویز لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر افزایش کارآمدی سیستم ایمنی را بررسی کردند (21). نتایج پژوهش یادشده نشان دادند موش‌های دریافت‌کنندۀ پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در مقایسه با موش‌های شاهد، میزان IFNγ بیشتری را در کشت سلول‌های طحالی خود دارند (005/0p<) و میزان اینترلوکین-4 که سیتوکین ایمنی هومورال و مربوط به سلول‌های Th2 است، در موش‌های گیرندۀ پروبیوتیک کمتر است (21).

Moafi و همکاران (2017) به بررسی کاربرد اینترفرون گاما در تشخیص بیماران مبتلا به سالک پرداختند و نتایج نشان دادند سطح اینترفرون گامایی که سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی تحریک‌شده با آنتی‌ژن محلول لیشمانیا یا میتوژن فیتوهماگلوتینین تولید می‌کنند، در گروه بیماران مبتلا به سالک التیام‌پذیر به‌‌شکل معنا‌داری (001/0p<) بیشتر از بیماران مبتلا به سالک التیام‌ناپذیر است (22).

Soleimany و همکاران (2018) تأثیر پاراسپورال سیتوسیدال باکتری گرم مثبت باسیلوس تورنجنسیس را بر تحریک سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی و توانایی تولید سیتوکین‌های اینترلوکین-2 و اینترلوکین-5 بررسی کردند و نتایج نشان دادند توکسین باکتری گرم مثبت باسیلوس تورنجنسیس موجب تحریک سیستم ایمنی، تولید اینترلوکین-2 و توقف تحریک تولید سیتوکین مهاری اینترلوکین-5 می‌شود (18).

نتایج پژوهش Zeuthen و همکاران (2006) نشان دادند گونه‌هایی از پروبیوتیک‌ها مانند باکتری‌های لاکتیک‌اسیدی سبب تولید IL10 و درنتیجه، مهار Th1 و به دنبال آن، مهار سیتوکین‌های التهابی می‌شوند (23).

Galdeano و همکاران (2006) عنوان کردند سازوکار‌هایی که باکتری‌های پروبیوتیک بر سیستم ایمنی تأثیر می‌گذارند، ناشناخته‌اند؛ باوجوداین، بسیاری از آنها به افزایش پاسخ‌های ایمنی یا ذاتی بدن نسبت داده می‌شوند. به‌منظور بررسی تأثیر باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس کازائی در بیان گیرنده‌های دخیل در پاسخ ایمنی ذاتی، این باکتری به‌‌شکل موازی به موش BALB/c تزریق شد. سیتوکین‌های اینترلوکین- 5، اینترلوکین- 6، رسپتورهای CD-206 و TLR-2 باتوجه‌به تیمار شاهد درمان‌نشده افزایش یافتند (24). Del Carmen و همکاران (2014) با جداسازی و انتخاب باکتری‌های لاکتیک‌اسید دارای ویژگی ضدالتهابی از نوعی استارتر ماست نشان دادند این باکتری سبب افزایش IL10 نسبت به INF α و IL10 نسبت به IL17 در بافت روده می‌شود و شدت التهاب را کاهش می‌دهد (25). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند عصارۀ سلولی و دیوارۀ سلولی لاکتوباسیلوس روتری در تولید اینترفرون گاما بسیار ضعیف و برابر با شاهد منفی‌ عمل می‌کنند؛ هرچند در تولید اینترلوکین-4 تفاوت معنا‌داری در سطح کمتر از 05/0 ندارند، اما نسبت به شاهد مثبت کاهش معنادار دارند. باتوجه‌به اهمیت لاکتوباسیلوس‌ها در تحریک تولید سیتوکین‌ها، پیشنهاد می‌شود اثر دیگر گونه‌های لاکتوباسیلوس بر سیستم ایمنی و تحریک تولید سیتوکین‌ها ارزیابی شود.

References
(1)              Herman A. Probiotics supplementation inprophylaxis and treatment of depressive and anxiety disorders- A review of current research. Psychiatria Polska 2019; 53(2): 459-473.
(2)              Sulijaya B., Takahashi N., Yamazaki K. Host modulation therapy using anti-inflammatory and antioxidant agents in periodontitis: A review to a clinical translation. Archives of Oral Biology 2019; 105: 72-80.
(3)              Perceval C., Szajewska H., Indrio F., Weizman Z., Vandenplas Y. Prophylactic use of probiotics for gastrointestinal disorders in children. Lancet Child Adolesc Health 2019; S2352-4642(19): 30182-30188.
(4)              Oelschlaeger TA. Mechanisms of probiotic actions- A review. International Journal of Medical Microbiology 2010; 300(1): 57-62.
(5)              Connolly ML., Tuohy KM., Lovegrove JA. Wholegrain oat-based cereals have prebiotic potential and low glycaemic index. British Journal of Nutrition 2012; 108(12): 2198-2206.
(8)              Pereyra BS., Lemonnier D. Induction of human cytokines by bacteria used in dairy foods. Nutrition Research 1993; 13(10): 1127-1140.
(9)              Ma W., Mao Q., Xia W., Dong G., Yu C., Jiang F. Gut microbiota shapes the efficiency of cancer therapy. Frontiers Microbiology 2019; 25(10): 1050-1059.
(10)          Baloch MN., Siddiqui R., Zafar U., Haider F., Mojgani N., Eijaz S. Persistence and safety assessment of novel probiotic strain Lactobacillus plantarum 1 strain Lp86 and Lp36 in Salmonella typhi infected mice. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 2019; 32(3): 1261-1267.
(11)          Mallesha M., Manjunatha R., Nethravathi C. Function of dopamine in presence of uric acid and ascorbic acid. Bioelectrochemistry 2011; 81: 104-108.
(12)          Xie F., Zhang F., Zhou K., Zhao Y., Zhao Q., Sun H. Isolation, identification and fermentation optimization of lactic acid bacteria for aquaculture water purification. Wei Sheng Wu Xue Bao. 2017; 57(2): 304-314.
(13)          Yadav R., Puniya AK., Shukla P. Probiotic Properties of Lactobacillus plantarum RYPR1 from an Indigenous Fermented Beverage Raabadi. Frontiers in Microbiology 2016; 7: 1683-1691.
(14)          Moazamian E., Bahador N., Azarpira N., Rasouli M. Anti-cancer Parasporin Toxins of New Bacillus thuringiensis Against Human Colon (HCT-116) and Blood (CCRF-CEM) Cancer Cell Lines. Current Microbiology 2018; 75(8): 1090-1098.
(15)          Riki M., Tukmechi A., Farokhi F. Anticancer effect of probiotics on mutant p53 protein expression in K562 cell line Yafte 2017; 18(4): 87-97.
(16)           Lenina NK., Naveenkumar A., Sozhavendan AE., Balakrishnan N., Balasubramani V., Udayasuriyan V. Characterization of parasporin gene harboring Indian isolates of Bacillus thuringiensis. Biotechnology 2014; 4(5): 545-551.
(17)          Moazamian E., Bahador N., Rasouli M., Azarpira N., Kalani M. Investigation of Cytocidal Activity of Bacillus thuringiensis Parasporal Toxin on CCRF-CEM Cell Line. Journal of Fasa University of Medical Sciences 2012; 2(4): 247-253.
(18)          Soleimany M., Moazamian E., Rasouli M. Effect of Bacillus thuringiensis parasporal toxin on stimulating of IL-2 and IL-5 cytokines production. Biological Journal of Microorganism 2018; 7(25): 101-108.
(19)          Parsaeimehr M., Misaghi A., Afshin Akhondzade A., Zahraei Salehi T., Modaresi MH., Gandomi H., Firuzbakht F., Karkudi S., Assadollah nezhad R. Effect of Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus on growth and enterotoxin production of Staphylococcus aureus. Journal Food Science and Technology 2011; 8(1); 91-97.
(20)          Ehsani A., Mahmoudi R., Hashemi M., Raeisi R. Identification of Lactobacillus Species Isolated from Traditional Cheeses of West Azerbaijan. Iranian Journal of Medical Microbiology 2014; 8(1): 38-43.
(21)          Soltan Dallal MM., Yazdi MH., Hassan ZM., Holakuyee M., Abedi Mohtasab TP., Aminharaty F., Agha Amiri S., Mahdavi M. Effect of oral administration of Lactobacillus acidophilus on the immune responses and survival of BALB/c mice bearing human breast cancer. Tehran University Medical Journal 2010; 67(11): 753-758.
(22)          Moafi M., RezvanH., SherkatR., Zarkesh-Esfahani SH., Taleban R., Asilian A. Evaluation of Interferon-gamma Application for Recognition of Patients Afflicted by Non-healing Cutaneous Leishmaniasis. Biological Journal of Microorganism 2017; 6(22): 100-111.
(23)          Zeuthen LH., Christensen HR., Frøkiær H. Lactic acid bacteria inducing a weak interleukin-12 and tumor necrosis factor alpha response in human dendritic cells inhibit strongly stimulating lactic acid bacteria but act synergistically with gram-negative bacteria. Clinical and Vaccine Immunology 2006; 13(3): 365-375.
(24)          Galdeano CM., Perdigon G. The probiotic bacterium Lactobacillus casei induces activation of the gut mucosal immune system through innate immunity. Clinical and Vaccine Immunology 2006; 13(2): 219-226
(25)          Del Carmen S., Miyoshi A., Azevedo V., Langella P., Bermudez-Humaran L., de LeBlanc AD., LeBlanc JG. Selection of anti-inflammatory lactic acid bacteria from a pool of yoghurt starter cultures. Food Science and Technology International 2014; 1(1): 429-430.