بررسی توکسین‌زایی قارچ‌های جدا شده از خوراک دام و طیورشهرستان خرم‎آباد

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه علوم پایه دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران

2 عضو هیات علمی، گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران

10.22108/bjm.2020.120098.1238

چکیده

مقدمه: میکوتوکسین‎ها یا سموم قارچی فرآورده‌های متابولیکی اولیه و یا ثانویه ‎می‎باشند. طیف وسیعی از انواع قارچ‎های کپکی مانند آسپرژیلوس، فوزاریوم و دیگر قارچ‏ها قادر به تولید مقادیر زیادی از میکوتوکسین‎های خطرناک در غذای انسان و دام می‎باشند.
مواد و روش‎ها: در این بررسی نمونه‏هایی از خوراک دام و طیور به آزمایشگاه منتقل و روی محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز آگار (PDA) کشت داده شد. پس از جدا سازی، خالص سازی و شناسایی، توکسین‌زایی قارچ‎ها روی بستره ذرت انجام و برای بررسی قابلیت توکسین‎زایی از محیط نارگیل آگار استفاده شد. سپس با استفاده از توکسین استاندارد روی صفحۀ TLC در تانک TLC در زیر نور ماوراء بنفش (UV) مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین ارزیابی کمی توکسین‎ها با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) انجام شد.
نتایج: نتایج نشان داد که نمونه‎ها به قارچ‏های Aspergillus flavus، A. parasiticus، A. ochraceous، A. niger، Penicilliun glabrum، Fusarium verticillioides، F. proliferatum، F. fujikuroi، F. concentricum، Rhizopus oreyzae، Absidia corymbifera، Rhizomucor sp.، Trichothecium sp. و Alternariaalternata آلوده بودند. بیشترین درصد آلودگی مریوط به قارچ‎های Rhizomucor، Absidia و Fusarium (15 و 5/27 درصد) در خوراک طیور و F. prolifratum (1/62 درصد) در خوراک دام بود. همچنین براساس TLCقارچ‌های F. prolifratum و F. verticillioides بیشترین نور را ساطع کردند در حالی که قارچ Rhizomucor کمترین نور و به طبع کمترین توکسین‌زایی را به خود اختصاص داد. براساس نتایج حاصل از HPLC جدایه‌هایF. verticillioides و A. flavusبیشترین توانایی تولید فومونیسین B1 و A. niger از بیشترین میزان افلاتوکسین G1 برخوردار بود.
بحث و نتیجه‎گیری:در مطالعه حاضر قارچ‏های آسپرژیلوس، ریزوموکور و فوزاریوم در محیط کشت نارگیل-آگار خاصیت فلورسانس از خود نشان ‎دادند. بعد از نقطه‎گذاری بر روی صفحه TLC، نقاط حاوی توکسین شدت فلورسانس بیشتری داشتند که نتایج کلی سنجش این سم با HPLC نیز همین موضوع را تائید می‌نماید.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Toxicity of fungi isolated from livestock feed and poultry in Khorramabad county

نویسندگان [English]

  • Reza Darvishnia 1
  • Mostafa Darvishnia 2
  • Mohammad Hossein Gharouni 1
1 Department of Basic Science, Faculty of Veterinary Medicine, Lorestan University, Khorramaad, Iran
2 Department Plant protection of Faculty Agriculture Lorestan University, Khorramabad, Iran
چکیده [English]

Introduction: Mycotoxins are primary or secondary metabolic products. A wide variety of mold fungi such as Aspergillus, Fusarium and other fungi are capable of producing large amounts of dangerous mycotoxins in human and animal food.
Material and method: In this study, samples of animal and poultry feed were transferred to the laboratory and cultured on potato dextrose agar (PDA) medium. After isolation, purification and identification, fungal toxicity was performed on the corn media and coconut agar medium was used for toxicity assessment. Then they were evaluated using standard toxin on the TLC plate in the TLC tank under ultraviolet (UV) light. Also, quantitative evaluation of toxins was performed using high performance liquid chromatography (HPLC).
Results:The results showed that the samples were infected with Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. ochraceous, A. niger, Penicilliun glabrum, Fusarium verticillioides, F. proliferatum, F. fujikuroi, F. concentricum, Rhizopus oreyzae, Absidia corymbifera, Rhizomucor sp., Trichothecium sp. and Alternaria alternata. Rhizomucor, Absidia and Fusarium (15 and 27.5%) were most infected in poultry and F. prolifratum (62.1%) in animal feed, respectively. Also, according to TLC, F. prolifratum and F. verticillioides emitted the highest light, while Rhizomucor received the least light and, consequently, the least toxicity. Based on HPLC results of F. verticillioides and A. flavus isolates, Fumonisin B1 and A. niger had the highest amount of aflatoxin G1.
Discussion and conclusion: In the present study, Aspergillus, Rhizomocor and Fusarium showed fluorescence in coconut-agar medium. After puncturing on the TLC plate, the toxin-containing dots had a higher fluorescence intensity, which the overall results of this toxin assay by HPLC also confirm this.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mycotoxins
  • Fungi
  • toxins
  • livestock and poultry

مقدمه

آلودگی مواد غذایی به قارچ‌ها خسارت‌های عمدۀ تولیدات غذایی را در پی دارد که با‌توجه‌به شیوۀ تهیه و نگهداری مواد غذایی، احتمال آلودگی این مواد به انواع قارچ‎ها و درنتیجه، تولید میکوتوکسین‎ها و آفلاتوکسین‌ها زیاد است (1). دانۀ ذرت ازنظر چربی، پروتئین، کربوهیدرات، نمک‌ها و برخی عناصر به‌گونه‌ای است که در دما و رطوبت مناسب محیط، بستر‌ی بسیار مطلوب برای رشد قارچ Aspergillus و تولید آفلاتوکسین‎ها محسوب می‌شود (2). پودر ماهی و کنجالۀ سویا به‌علت خردشدن و نداشتن پوستۀ محافظ، به‌آسانی در دسترس قارچ‌ها قرار می‌گیرند و قارچ‌ها به‌سهولت روی آنها رشد می‌کنند (3). طیف وسیعی از انواع قارچ‎های کپکی مانند Aspergillus‎، Penicillium، Fusarium و دیگر قارچ‎ها مقادیر درخور توجهی از میکوتوکسین‎های خطرناک را تولید می‌کنند (4). میکوتوکسین‎ها معمولاً در اجزای مادۀ خوراکی مانند ذرت، جو، گندم و بادام‌زمینی دیده می‌شوند و مشکل‌ آنها تنها در خوراک حیوان یا کاهش عملکرد دام و طیور نیست؛ آنها در گوشت، شیر و تخم‌مرغ وجود دارند و تهدیدی برای سلامت انسان محسوب می‌شوند. قارچ‎های Aspergillus، Fusariumو Penicillium اهمیت بیشتری در تولید میکوتوکسین‎های مضر دارند. میکوتوکسین مهمی که قارچ Aspergillusتولید می‌کند، آفلاتوکسین است (5). آفلاتوکسین‎های B1، B2، G1 و G2 متابولیت‌های قارچی‌اند که گونه‎های خاصی مانند Aspergillus parasiticusو Aspergillus flavusآنها را تولید می‎کنند. غلات و حبوبات در مناطق گرم و مرطوب به آفلاتوکسین و عمدتاً آفلاتوکسین B1 آلوده می‎شوند (6). آفلاتوکسین‌های M1 و M2 مشتقات مونوهیدروکسیلۀ آفلاتوکسین‌های‌ B1 و B2 هستند که در شیر انسان و حیوانات شیردۀ تغذیه‌شده با جیره‌های آلوده به آفلاتوکسین‌های B1 و B2 تشکیل و ترشح ‌می‎شوند. آفلاتوکسین‌ M1 به‌طور گسترده‌ در محصولات لبنی مانند شیرخشک، پنیر و ماست یافت می‌شود (7 و 8).

گروهی از میکوتوکسین‌ها به‌طور مستقیم یا پس‌از تغییر ساختمان شیمیایی و سیستم‎های متابولیکی با مولکول DNA واکنش می‌دهند. نتیجۀ واکنش‌ بین میکوتوکسین‌ها و DNA، ایجاد تغییرات اساسی در توالی اطلاعاتی DNA است که با بروز آثار جهش‌زایی و سرطان‌زایی همراه است. اتصال میکوتوکسین‌ها به DNA سبب مهار همانند‌سازی DNA و ممانعت از تولید RNA می‌شود (9). تمام جدایه‌های سمی A. parasiticus آفلاتوکسین‌های گروه B و G را تولید می‌کنند؛ درحالی‌که بیشتر جدایه‌های گونة A. flavus صرفاً آفلاتوکسین‌های گروه B را تولید می‌کنند. آفلاتوکسین‌های گروه G به میزان کمتری نسبت به انواع B تولید می‌شوند (10). جهش‎‏زایی و سرطان‎زایی ناشی از آفلاتوکسین در حیوانات به‌طور گسترده بررسی و در انسان نیز ارتباط آفلاتوکسین‎ها با سرطان کبد تأیید شده است (11). فومونیسین‌ که گونه‌های خاصی از قارچ Fusariumشامل F. verticillioides، F. proliferatum، F. oxysporum، F. globosum و چندین گونۀ دیگرآن را تولید می‌کنند و بیشتر در ذرت و فرآورده‌های مربوط به آن یافت می‌شود، در سال ۱۹۸۸ در جنوب آفریقا کشف شد (12) و توانایی F. verticillioides، F. proliferatumو برخی جدایه‌‌‌های F. oxysporum در تولید فومونیسین به‌ویژه فومونیسین B1 و B2 گزارش شده است (13 و 14). آلودگی خوراک دام به فومونیسین سبب بیماری و مرگ دام می‌شود و زیان‌‌های اقتصادی را به همراه دارد. بر اساس تشخیص انجمن آزمایشگاه دامپزشکی آمریکا، مقدار ۵ میکروگرم‌در‌گرم فومونیسین برای اسب‌‌‌ها مضر است. پوست برنج که گاهی دام از آن تغذیه می‎کند، حاوی غلظت بیش از ۵ میکروگرم‌در‌گرم فومونیسین است. فومونیسین‌ها نسبت به حرارت مقاومند و با پخت‌‌وپز نابود نمی‌شوند (15). در ایران، آلودگی ذرت به آفلاتوکسین‎ها در سال 1372 گزارش و در سال 1380، آلودگی بذرهای ذرت به قارچ Aspergillus برابر با 47 درصد اعلام شد؛ آلودگی دانه‎های ذرت به این قارچ در مزارع مازندران و روی دانه‌ها گزارش شده است (16 و 17). در پژوهشی، تمام نمونه‌های ذرت وارداتی و داخلی گرفته‌شده از انبارهای استان اصفهان به آفلاتوکسین نوع B1 آلوده بودند؛ در این مطالعه، بیشترین میزان آلودگی برابر با 9/9 میکروگرم‌در‌کیلوگرم اعلام شد (18). در پژوهشی، نتایج بررسی میزان تولید توکسین‎های قارچی زیرالئون و داکسی‎نیوالنول تولیدشده از قارچ Fusariumروی پیش‌ماده‌های مختلف نشان داد این قارچ بیشترین توکسین‎زایی را روی کلش برنج دارد (19). در بررسی انجام‌شده روی میزان توکسین‎زایی دو گونۀ A. flavusو Aspergillus ochraceus در شرایط محیطی مختلف مشاهده شد رشد بهینۀ Aspergillus ochraceus در دمای 31 درجة ‌سلسیوس، اسیدیتۀ 5، رطوبت بذری 27 درصد و رشد بهینۀ A. flavus در دمای 28 درجة ‌سلسیوس، اسیدیتۀ 6 و رطوبت بذری 27 درصد است و هر دو گونه قابلیت تولید آفلاتوکسین را دارند (20). نتایج مطالعه‎ای با عنوان تأثیر اسیدیته و فشار اسمزی بر تولید آفلاتوکسین در قارچ A. parasiticus نشان دادند بیشترین توکسین‌زایی و رشد به‌ترتیب در تیمارهای اسیدیتۀ 6 و 5 و در تیمار کلرورسدیم با غلظت 3 و صفر درصد است (21). آفلاتوکسین در خوراک و بذرهایی مانند برنج، بادام‎زمینی، ذرت، سویا و سایر دانه‌های ذخیره‌شده در انبار با شرایط دمایی و رطوبتی زیاد تولید می‌شود (22). نتایج پژوهشی روی قارچ A. parasiticus نشان دادند این قارچ بیشترین میزان آفلاتوکسین را در شرایط تاریکی و دمای 30 درجة سلسیوس تولید می‌کند (23) و نتایج پژوهش دیگری نشان دادند فومونیسین B در بیش از ۹۷ درصد سویه‌‌های F. moniliformeجداشده از خوراک مرغ و ۸۹ درصد نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از مناطق مختلف کاستاریکا یافت می‌شود (24). فومونیسین‌ها مهم‌ترین عامل آلودگی مواد غذایی در شرق و جنوب آفریقا به شمار می‌آیند (25) و از 95 نمونه مادۀ غذایی ارزیابی‌شده به روش TLC[1] طی سال ۱۹۹۰ در مصر، 2/44 درصد نمونه‌های ذرت، انواع برنج، انواع پنبه‌دانه و بادام‌زمینی به انواع آفلاتوکسین آلوده بودند (26). هدف پژوهش حاضر، بررسی میزان آلودگی خوراک دام و طیور به آلودگی‎های قارچی و توکسین‏زایی آنها روی خوراک دام و طیور در شهرستان خرم‏آباد است.

 

مواد و روشها

جداسازی، خالصسازی و شناسایی: به‌منظور شناسایی عوامل قارچی موجود در خوراک دام و طیور شهرستان خرم‌آباد، درمجموع 100 نمونه خوراک و اجزای آن طی سال‌های 97-96 از ده مرغ‎داری و گاو‌داری فعال واقع در بخش‌های مختلف حومۀ این شهرستان جمع‌آوری شدند. حدود 100 گرم از هر نمونه‎ درون کیسه‌های پلاستیکی تمیز ریخته شد و پس‌از انتقال به آزمایشگاه، بخش‎های مختلف نمونه‎های مواد خوراکی دام و طیور به‌طور تصادفی برداشته و روی محیط‌کشت معمولی سیب‌زمینی دکستروز آگار[2] ‌و محیط‌کشت اختصاصی تغییر‌یافتۀ ناش اسنیدر[3] کشت شدند. پس‌از رشد قارچ، زیرکشت‌هایی[4] از حاشیۀ جوان پرگنۀ (کلنی) قارچ تهیه شدند و قارچ جداسازی شد؛ سپس قارچ‎ها خالص‌سازی و با مراجعه به کلیدهای معتبر و مقاله‌های منتشرشده شناسایی شدند.

تعیین توکسینزایی اولیۀ قارچ:محیط‌کشت نارگیل ‌آگار[5] برای بررسی اولیۀ توکسین‎زایی قارچ استفاده شد. روش دیویس و همکاران[6] (1987) با تغییرات جزئی برای تهیۀ محیط‌کشت به کار برده شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا مقدار 100 گرم پودر نارگیل در 200 میلی‏لیتر آب جوش ریخته شد و پس‌از ۵ دقیقه و چند نوبت به‌هم‌زدن، زمانی که عصارة نارگیل کاملاً خارج شد، مایع حاصل از چهار لایه پارچۀ ململ عبور داده شد؛ سپس ۲۰ گرم‌در‌لیتر پودر آگار و 10 گرم‌در‌لیتر عصارۀ مخمر به آن اضافه شد و به‌‌مدت 15 دقیقه دراتوکلاوی با فشار 1/1 اتمسفر و دمای ۱۲۱ درجة سلسیوس استریل و در تشتک‌های پتری 8 سانتی‌متری ریخته شد. قارچ روی این محیط‌کشت و در دمای 25 درجة سلسیوس نگهداری شد. پس‌از سه تا چهار روز از رشد قارچ، پتری‌های حاوی پرگنۀ قارچ رشدکرده به اتاقک TLC منتقل و برای رؤیت هالة آبی‌رنگ یا سبزرنگ اطراف پرگنۀ قارچ، زیر نور UV با طول موج 245 تا 366 نانومتر بررسی شدند (27-29).

کشت قارچ روی بستر ذرت:تعدادی ارلن 500 میلی‎لیتری فراهم شدند و در هریک، 100 گرم ذرت قرار داده شد؛ سپس به‌ازای هر 100 گرم بذر ذرت، 32 میلی‎لیتر آب مقطر استریل به ارلن‌ها افزوده و در ارلن‌ها با پنبه و فویل آلومینیومی محکم‌ شد. ارلن‌ها به‌مدت 24 ساعت در همین حالت نگهداری شدند تا رطوبت کافی جذب کنند و سپس به‌مدت 15 دقیقه در اتوکلاوی با دمای 121 درجة سلسیوس و فشار 1/1 اتمسفر قرار داده شدند تا تمام عوامل میکروبی آنها از بین بروند و 24 ساعت بعد، دوباره در همین شرایط استریل شدند. پس‌از اتوکلاو دوم و سردشدن ارلن‎های حاوی بذرهای ذرت، 5 عدد قرص میسلیومی 1 سانتی‎متری به‌ازای هر 100 گرم بذر ذرت از کشت 3 تا 4 روزة قارچ در کنار شعله و زیر هود لامینار درون هرکدام از ارلن‌های حاوی ذرت مرطوب قرار داده شدند و در آنها کاملاً محکم بسته شد. ارلن‌ها تکان داده شدند تا اسپورها درون ارلن‎های حاوی بذرهای ذرت به‌طور یکنواخت پخش شوند. ارلن‌ها در اتاق تاریک قرار داده شدند و از روز سوم به بعد، روزی دو بار با احتیاط تکان داده شدند؛ این کار سبب شکسته‌شدن میسلیوم درون هر ارلن شد تا بستر را بهتر پوشش دهد. پس‌از روز هفتم، ارلن‎های حاوی بذرهای آلوده به قارچ آمادۀ استخراج و تعیین توکسین بودند.

روش تولید توکسین: بسترهایی مانند ذرت، دانۀ گندم یا ارزن یا شلتوک برنج استریل‌شده برای تولید توکسین از جدایه‎های قارچی و محیط‌کشت نارگیل آگار برای بررسی توکسین‎زابودن جدایه‎های قارچی استفاده شدند. به‌منظور تهیۀ این محیط، مقدار ۲۰۰ گرم نارگیل در یک لیتر آب جوش ریخته شد و پس‌از ۵ دقیقه و چند نوبت هم‌زدن، زمانی که عصارة نارگیل کاملاً خارج شد، مایع حاصل از چهار لایه پارچۀ ململ عبور داده شد و ۲۰ گرم آگار به آن اضافه شد. نمونه‌ به‌مدت 15 دقیقه در اتوکلاوی با فشار 1/1 اتمسفر و دمای ۱۲۱ درجة ‌سلسیوس استریل و به تشتک‌های پتری 8 سانتی‌متری منتقل و زیر نور UV با طول موج 245 تا 366 نانومتر ارزیابی شد (27).

استخراج توکسین: به‌منظور استخراج توکسین‌های قارچی، ابتدا محتویات ارلن‌های حاوی بذرهای آلوده به قارچ به‌مدت 24 ساعت در دمای 70 درجۀ سلسیوس قرار داده شدند؛ سپس بذرهای ذرت آسیاب شدند و روی 15 گرم از هر نمونۀ آسیاب‌شده، 48 میلی‌لیتر استونیتریل، 9 میلی‌لیتر متانول و 3 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد و مواد به‌مدت 3 ساعت روی شیکری با سرعت 170 دوردردقیقه قرار داده شدند. مخلوط حاصل با کاغذ صافی واتمن صاف شد و عصارة حاصل از ستون تصفیۀ حاوی رزین کاتیونی و مخلوط آلومینا- کربن عبور داده شد؛ به این منظور، ابتدا و انتهای ستون با یک لایه پشم‌ شیشه مسدود شد، روی آن 1 گرم مخلوط آلومینا- کربن اضافه شد و دوباره یک لایه پشم ‌شیشه روی آن قرار داده شد. رزین کاتیونی که به‌مدت یک ساعت در آب مقطر قرار گرفته بود، در ستون ریخته شد و پس‌از‌آن، عصارة نمونه‎ها از ستون عبور داده شدند. عصارة عبور‌داده‌شدة ستون اول دوباره با استفاده از ستون تصفیة دوم به‌ترتیب شامل پشم شیشه، آلومینا- کربن و پشم شیشه خالص شد و عصارة عبور‌داده‌شده از ستون تصفیة دوم برای تبخیر حلال به آون 70 درجة سلسیوس منتقل شد. پس‌از خشک‌شدن عصارة استخراج‌شده، 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (10 به 90) به آن اضافه و به‌مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داده شد؛ سپس 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (5 به 95) و 2 میلی‌لیتر محلول استونیتریل- متانول (3 به 1) به آن افزوده شد و به‌منظور تبخیر حلال، دوباره در آونی با دمای 70 درجۀ سلسیوس قرار داده شد؛ درنهایت، 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (5 به 95) به عصارة خشک‌شده اضافه شد و عصاره‎های استخراج‌شده در دمای منفی 20 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- مراحل استخراج توکسین؛ a. ‌آماده‌سازی بستر ذرت در ارلن مایر، b. رشد قارچ روی بستر ذرت و شلتوک برنج، c. خشک‌کردن قارچ در آون 70 درجۀ سلسیوس، d. آسیاب‌کردن قارچ خشک‌شده، e. توکسن‌های ناخالص قارچی، f. خالص‌سازی توکسین قارچی


.سنجش کلی سمهای تولیدی قارچهابه روشTLC[7]:روش موسویان و همکاران (21) برای سنجش TLC استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که پس‌از استخراج سموم، محلول‎های نمونه و استاندارد روی صفحۀ Thin Layer Chromatography (TLC) )صفحه‌ای آلومینیومی همراه با سیلیکاژل) در یک راستا نقطه‌گذاری شدند. پس‌از اینکه صفحه در مخزن TLC قرار داده شد و محلول متانول-استونیتریل (88 به 12) از آن بالا رفت و صفحه شسته شد، صفحه در هوا خشک و زیر نور UV با طول موج 365 نانومتر ارزیابی و شدت نقطۀ فلورسانس آبی نمونه با نقطۀ‎ ‎فلورسانس استاندارد مقایسه شد.

.ارزیابی کمّی توکسینهای موجود در عصاره به روش [8]HPLC: دستگاه تحلیل‌گر HPLC موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه لرستان و دانشگاه خوارزمی تهران برای ارزیابی کمّی توکسین‌های موجود در عصاره به روش HPLC استفاده شد. به‌منظور تجمیع بیشتر توکسین‏ها، عصارة به‌دست‌آمده به ستون ایمونوافینیتی[9] (Biopharm Rhone Ltd, UK(R- با قطر ذرات داخلی 5/0 میلی‌متر وارد شد که به‌علت وجودداشتن آنتی‌بادی‎های سطحی روی ذرات، ابتدا توکسین‎ها نگهداری شدند و سپس با عبور متانول، از ستون خارج شدند و آب دیونیزه اضافه شد. دستگاه HPLC برای سنجش کمّی توکسین‎ها استفاده شد؛ به این‌ منظور، 20 میکرولیتر عصاره به ستون کروماتوگرافی فاز معکوس C18-Supelco Discovery به طول 25 سانتی‌متر، قطر داخلی 5/4 میلی‎متر و قطر ذرات 5 میکرومتر متصل به دستگاه Unicam-Crystal-200 (Brand Kinesis, UK) تزریق شد. فاز متحرک شامل مخلوط استونیتریل (20 درصد)، متانول (20 درصد) و آب دیونیزه (60 درصد) بود و با سرعت 1 میلی‌لیتربردقیقه از ستون عبور کرد. آشکارساز از نوع فلورسانس در طول موج تحریکی 365 نانومتر و طول موج خروجی 445 نانومتر تنظیم و به‌منظور تقویت فلورسانس توکسین‎ها از ستون مشتق‌ساز تولیدکنندة بر PB. PB با قطر ذرات داخلی 5/0 میلی‌متر (R-Biopharm Rhone Ltd, UK) استفاده شد. هرکدام از انواع توکسین‎ها بر اساس مطابقت پیک خروجی با زمان بازداری پیک استاندارد و بر اساس غلظت نمونة استاندارد تعیین هویت و غلظت شد (30 و 31).

 

نتایج.

نتایج نشان دادند جیره‌های غذایی شامل ذرت، سویا، کنسانتره، دان مخلوط در خوراک طیور و همچنین جیره‌های غذایی ذرت و جو، یونجه، کاه و کلش، کنسانتره و ذرت علوفه‌ای در خوراک دام به قارچ‎های مختلفی ازجمله Aspergillus، Rhizopus، Rhizomocur، Penicillium، Alternaria، Absidia، Trichotecium، Mucor و Fusarium آلوده‌اند.

از 40 جدایۀ قارچی شناسایی‌شده در خوراک طیور، 27 جدایه در روش TLC زیر نور فرابنفش، پرتو‌های فلورسانس آبی‌رنگ از خود ساطع کردند و 13 جدایۀ دیگر پرتو‌های فلورسانس نداشتند. بیشترین جدایه‎ها به قارچ‎های Fusarium با تعداد 11 جدایه (35 درصد)، Rhizomocur و Absidia با تعداد 6 جدایه (5/12 و 7/11 درصد) مربوط بودند که باتوجه‌به توکسین‌زایی قارچ Fusarium و اهمیت فومونیسین‎ها، این قارچ یکی از عوامل اصلی در بحث توکسین‌زایی در نظر گرفته شد. جنس‌‌های Alternaria و Trichotecium با 1 جدایه (7 درصد)، کمترین جدایه‌های قارچی و درصد فراوانی را به ‌خود اختصاص دادند. فراوانی آلودگی خوراک طیور به جدایه‌های قارچی شامل دان مخلوط (14 جدایه)، سویا (13 جدایه)، ذرت (10 جدایه) و کنسانتره (3 جدایه) بود (جدول 1). فراوانی توکسین‌زایی قارچ‎ها به‌ترتیب شامل Fusarium با 11 جدایه (35 درصد)، Penicilliumبا 5 جدایه (16 درصد)، Rhizomucor و Absidiaهریکبا 6 جدایه (5/12 و 7/11 درصد)، Aspergillus و Rhizopusهرکدام با 4 جدایه (7 و 10 درصد) و Alternariana و Trichotecium هریکبا 1 جدایه (5/2 و 8/1 درصد) بود؛ همچنین از این تعداد قارچ توکسین‌زا، 11 جدایه سویا، 10 جدایه دان مخلوط، 4 جدایه ذرت و 2 جدایه کنسانتره را آلوده کردند.

از 37 جدایۀ مربوط به خوراک دام، 17 جدایۀ قارچی در روش TLC زیر نور فرابنفش، پرتو‌های فلورسانس آبی‌رنگ از خود ساطع کردند و 20 جدایۀ دیگر پرتو‌های فلورسانس نداشتند. بیشتر جدایه‎ها به قارچ‌ Fusarium مربوط بودند که گونه‌های F. prolifratum و F. verticillioides به‌ترتیب با 23 جدایه (61 درصد) و 10 جدایه (26 درصد) بیشترین جدایه‎ها و درصد فراوانی را به‌ خود اختصاص دادند؛ همچنین کمترین درصد فراوانی به جنس‌ Alternaria و گونة F. concentericum هریک با 1 جدایه (6/6 و 4/1 درصد) مربوط بود. فراوانی آلودگی خوراک دام به جدایه‎های قارچی شامل کنسانتره (15 جدایه)، ذرت و جو (8 جدایه)، ذرت علوفه‌ای (7 جدایه)، کاه و کلش (4 جدایه) و یونجه (3 جدایه) بود (جدول 2). فراوانی توکسین‌زایی قارچ‎ها به‌ترتیب شامل F. verticillioides با 8 جدایه (6/21 درصد)،F. prolifratum با 8 جدایه (6/21 درصد) و F. fujikuoroi با 1 جدایه (7/2 درصد) بود؛ همچنین از این تعداد قارچ توکسین‌زا، فراوانی آلودگی خوراک به‌ترتیب شامل کنسانتره با 9 جدایه، ذرت و جو با 6 جدایه، کاه و کلش با 2 جدایه و یونجه و ذرت علوفه‌ای بدون نمونۀ توکسین‌زا بود.


 

جدول 1- تعداد نمونه و درصد آلودگی جیره غذایی آلوده به قارچ در خوراک طیور

تعداد جدایه و درصد آلودگی

 

Fusarium spp.

Alternaria alternata

Penicillium glabrum

Aspergillus spp.

Absidia corymbifer

Terichotecium sp.

Rhizopus oryzae

Mucor sp.

Rhizomucor sp.

نمونه

تعداد جدایه

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (%)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

جدایه

آلودگی متوسط (درصد)

ذرت

10

2

2/0

1

1/0

-

-

-

-

1

1/0

-

-

4

4/0

-

-

2

2/0

سویا

13

6

46/0

-

-

2

15/0

1

08/0

1

08/0

-

-

-

-

-

-

3

23/0

کنسانتره

3

2

67/0

-

-

1

33/0

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

دان مخلوط

14

1

07/0

-

-

2

14/0

3

21/0

4

29/0

1

07/0

-

-

2

14/0

1

07/0

مجموع

40

11

35/0

1

025/0

5

16/0

4

07/.

6

117/0

1

018/0

4

1/0

2

035/0

6

125/0

درصد آلودگی

 

 

35

 

5/2

 

16

 

7

 

7/11

 

 

 

10

 

5/3

 

5/12

 

 

 

جدول 2- تعداد نمونه و درصد آلودگی جیرۀ غذایی آلوده به قارچ در خوراک دام

تعداد جدایه و درصد آلودگی

 

 

F. prolifratum

F. verticillioides

F concentericum

F. fujikuoroi

Alternaria alternata

نمونه

تعداد جدایه

جدایه

متوسط آلودگی (درصد)

جدایه

متوسط آلودگی (درصد)

جدایه

متوسط آلودگی (درصد)

جدایه

متوسط آلودگی (رصد)

جدایه

متوسط آلودگی (درصد)

ذرت و جو

8

3

38/0

3

38/0

-

-

2

25/0

-

-

کنسانتره

15

9

6/0

5

33/0

1

07/0

-

-

-

-

کاه و کلش

4

3

75/0

1

25/0

-

-

-

-

-

-

یونجه

3

1

33/0

1

33/0

-

-

-

-

1

33/0

ذرت علوفه‌ای

7

7

1

-

-

-

-

-

-

-

-

مجموع

37

23

61/0

10

26/0

1

013/0

2

05/0

1

067/0

درصدآلودگی

 

 

%61

 

%26

 

%3/1

 

%5

 

%7/6

 


.نتایج مطالعه روی محیط‌کشت نارگیل‌ آگار: این روش برای تشخیص جدایه‌های توکسین‎زای Aspergillus پیش از عملیات استخراج توکسین و TLC استفاده شد. نتایج نشان دادند گونه‎های Aspergillus فلورسانس آبی از خود نشان می‌دهند و گونه‎های دیگر فلورسانس نشان نمی‌دهند (شکل 2).

 

 

 

شکل 2- نتایج مطالعه روی محیط نارگیل آگار (Aspergiluus flavus)؛ a. قارچ بدون توکسین در محیط PDA، b. قارچ بدون توکسین در محیط نارگیل آگار، c. قارچ دارای توکسین در محیط PDA، d. قارچ دارای توکسین در محیط نارگیل آگار

 


نتایج آزمایش‌های TLC و HPLC: تجزیه‌و‌تحلیل آزمایش‌های TLC و HPLC نشان داد قارچ‌های F. prolifratum و F. verticillioidesبیشترین نور را از خود ساطع می‌کنند و این در حالیست که قارچ Rhizomucor کمترین نور و درنتیجه، کمترین توکسین‌زایی را به خود اختصاص می‌دهد. باتوجه‌به خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین زیر نور UV و با درنظرگرفتن اینکه هرچه غلظت سم بیشتر باشد، انتظار می‎رود شدت نور فلورسانس بازتابیده از آن نیز بیشتر باشد، جدایه‎هایی که توکسین بیشتری داشتند، فلورسانس بیشتری نیز تولید کردند (شکل 3).

 

 

شکل 3- نقطه‌گذاری فومونیسین‎های استاندارد و نمونه‌های استخراجی تیمارهای مختلف روی صفحۀ TLC و زیر نور UV

 

نتایج آزمایش‌های HPLC سه جدایه از قارچ Fusarium: پس‌از انجام آزمایش TLC مربوط به گونه‎های F. prolifratum، F. verticillioides و F .fujikouri، کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا برای دستیابی به نوع و میزان توکسین استخراج‌شده انجام شد (شکل 4، a، b، c و d). نتایج HPLC اولیه برای جدایه‌های Fusarium نشان دادند قارچ F. verticillioidesبیشترین توانایی تولید فومونیسین B1 را نسبت به F. proliferatum و F. fujikuroi دارد. بر اساس این یافته‌‌‌ها، غلظت فومونیسین جدایه‌های F. verticillioide که بیشترین توانایی توکسین‌زایی را بین جدایه‌ها داشتند، 332/0 میکروگرم‌برمیلی‎لیتر بود (جدول 3).

 

جدول 3- غلظت فومونیسین B1 در آزمایش HPLC

غلظت فومونیسین B1 (µgr/ml)

نمونه قارچ

332/0

Fusarium verticillioides

05/0

Fusarium prolifratum

02/0

Fusarium fujikuroi

 

کروماتوگرام حاصل از HPLC نمونۀ استاندارد قارچ Fusarium و گونه‎های F. verticillioides، F. proliferatum و F. fujikuroi نشان داد گونه‎های مطالعه‌شده توکسین فومونیسین B1 را دارند (شکل 4، a، b، c و d).

.نتایج آزمایش‌های HPLC قارچ Aspergillus: پس‌از انجام آزمایش TLC، دو نمونه از توکسین‎های تولیدی مربوط به گونه‎های A. niger و A. flavusبرای تعیین نوع و میزان توکسین استخراج‌شده به روش کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا ارزیابی شدند و نتایج HPLC اولیه برای جدایه‌های Aspergillus  نشان دادند گونة A. flavus بیشترین میزان تولید آفلاتوکسین B1 و گونۀ A. niger بیشترین میزان آفلاتوکسین G1 را دارد (شکل 4، e و f). گونۀ A. flavus با غلظت 19/17 میکروگرم‌بر‌میکرولیتر بیشترین میزان تولید آفلاتوکسین B1 و گونۀ A. nigerبا غلظت 25/12 میکروگرم‌برمیلی‎لیتر بیشترین میزان آفلاتوکسین G1 را دارد (جدول 4).

 

 

شکل 4- کروماتوگرام HPLC فومونیسین B1؛ a. تولیدی از نمونة استاندارد Fusarium، b. تولیدی از قارچ F. verticillioides، c. تولیدی از F. proliferatum، d. تولیدی از F. fujikuroi، e. تولیدی از Aspergillus niger، f. تولیدی از A. flavus

 

 

جدول 4- غلظت آفلاتوکسین B1، B2، G1، G2 در آزمایش HPLC

نمونۀ قارچ

B1 (µgr/ml)

B2 (µgr/ml)

G1 (µgr/ml)

G2 (µgr/ml)

Aspergillus niger

25/12

59/0

86/5

28/0

Aspergillus flavus

19/17

57/1

07/4

40/0

 

بحث.

قارچ Aspergillus flavus در محیط‌کشت نارگیل آگار خاصیت فلورسانس از خود نشان ‎داد که بادرنظرگرفتن خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین‎ها، این قارچ توانایی تولید آفلاتوکسین را دارد و حضور ترکیباتی در محیط‌کشت سبب تحریک خاصیت فلورسانس آن می‌شود؛ به‌طوری‌که این ترکیبات به شناسایی آفلاتوکسین‎ها کمک می‌کنند. ازآنجاکه این قارچ در محیط‌کشت PDA خاصیت فلورسانس ندارد؛ پس‌از نقطه‌‎گذاری روی صفحۀ TLC، نقاط حاوی آفلاتوکسین‎های بیشتر، شدت فلورسانس بیشتری از خود نشان می‌دهند. پژوهش‌های بسیاری در این زمینه انجام‌ شده‌اند و مشخص شده است تولید نور فلورسانس به‌علت ماهیت طبیعی آفلاتوکسین‌هاست و فلورسانس طبیعی آفلاتوکسین‌ها از ساختار حلقوی پنتاهیدروسیکلیک اکسیژنۀ آنها ناشی می‌شود (32). ایامانکا[x] و همکاران بیان کردند حضور برخی ترکیبات در محیط‌کشت سبب تحریک خاصیت فلورسانس می‌شود و به گسترش و روش‌های شناسایی این ترکیبات کمک می‌کند؛ گزارش‌های این پژوهشگران نتایج آزمایش حاضر را تأیید می‌کنند (33). نتایج نمونه‌های مطالعه‌شده با نتایج پژوهشگرانی ازجمله دیویس[xi] و همکاران (1987) و میلنز[xii] و همکاران (2002) که از محیط‌کشت نارگیل آگار برای شناسایی سریع آفلاتوکسینی استفاده کردند که گونه‎های مختلف قارچ Aspergillus تولید می‌کنند، مطابقت دارند. پس‌از تجزیۀ سموم تولیدی به روش TLC و HPLC مشخص شد در قارچ A. flavus، کمیت آفلاتوکسین‎ها با شدت نور حاصل از محیط‌کشت و کاغذ TLC رابطۀ مستقیم دارد (27 و 34)؛ این مطلب در پژوهش‎های کوتولی[xiii] و همکاران اثبات شده است (28). لمک[xiv] و همکاران پس‌از کشت قارچ Aspergillusروی محیط نارگیل آگار بیان کردند مشاهدۀ هالۀ فلورسانس اطراف پرگنۀ قارچ‌ها زیر نور فرابنفش در طول موج 365 نانومتر نشان‌دهندۀ توانایی قارچ‌ها در تولید آفلاتوکسین‎هاست (35). در پژوهش‌های دیگر مشخص شده است خاصیت فلورسانس این ماده زیر نور فرابنفش به‌علت وجود متیل‌بتاسیکلودکسترین است که با تأثیر آنزیم سید‎ترانس‎گلیکولاز روی دکستران تولید و طی واکنش با آفلاتوکسین‎ها سبب افزایش خاصیت فلورسانس آنها زیر نور فرابنفش با طول موج 360 نانومتر می‎شود (36).

استفاده از روش‌های متعددی مانند کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، کروماتوگرافی مایع (LC)، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و روش Enzyme Link Immuno Sorbant Assary. (ELISA).برای سنجش آفلاتوکسین امکان‌پذیر است (37 و 38). در پژوهش حاضر، میزان کمّی و کیفی آفلاتوکسین‎های تولیدی گونه‎های Aspegillus با سه روش محیط‌کشت نارگیل آگار، TLC و HPLC سنجیده شد؛ اساس کار دو روش اول بر خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین‎هاست. در روش نارگیل آگار، صرفاً توانایی تولید آفلاتوکسین‎‎ها بررسی می‌شود، ولی در دو روش دیگر میزان تولید آفلاتوکسین نیز تعیین می‌شود. در روشTLC، مجموع سموم تولیدی محاسبه می‌شود، ولی در روش HPLC آفلاتوکسین‎ها تفکیک و میزان تولید هرکدام مشخص می‌شود. گزارش شده است روش TLC ضریب تغییرات نسبتاً زیادی دارد و تنها در جایی به کار می‌رود که سطوح آلودگی میکوتوکسین بیشتر از حدود کنترل‌پذیر باشد؛ باوجوداین، روش یادشده یکی از آسان‎ترین روش‎های شناسایی آفلاتوکسین‎هاست که در زمان‎ها و مکان‏های مختلف‎ می‌توان توکسین‎ها را به‌سهولت و با کمترین امکانات تشخیص داد و از آثار سوء آنها پیشگیری کرد (39).اغلب روش‌هایی که به‌تازگی برای شناسایی و اندازه‌گیری آفلاتوکسین‌ها استفاده می‌شوند، حساسیت زیادی دارند؛ باوجوداین، مرحلۀ استخراج آفلاتوکسین به کمک حلال را نیاز دارند و هزینه‌بر و زمان‌برند؛ از‌این‌رو استفاده از محیط‌‌های کشت اختصاصی آفلاتوکسین‎ها، روشی ساده و اقتصادی برای شناخت اولیۀ قارچ‎های آفلاتوکسین‎زا در آزمایشگاه‎هایی است که امکانات لازم برای شناسایی شیمیایی آفلاتوکسین را ندارند (40). پژوهشگران بسیاری از روش به‌کارگیری محیط‎های کشت اختصاصی استفاده کرده‌اند: آلمیدا[xv] و همکاران برای جداسازی فلور قارچی و شناسایی آفلاتوکسین در نمونه‎های ذرت به‌ترتیب از محیط‎های کشت سیب‌زمینی دکستروز آگار و نارگیل آگار استفاده کرده‌اند (41). لمک و همکاران از محیط‌کشت عصارۀ نارگیل با عنوان روشی مناسب برای شناسایی آفلاتوکسین‎ها برای کشت A. flavus و A. parasiticus استفاده کرده‌اند (38). لین[xvi] و دیانز[xvii] از محیط نارگیل آگار برای شناسایی آفلاتوکسین‎ها استفاده کرده‌اند (42). دیویس و همکاران و میلانز و همکاران ‌هالۀ آبی‌رنگ و فلورسانت‌شدۀ آفلاتوکسین‎ها را با استفاده از محیط‌کشت مشخص کرده‌اند (27 و34).

نقطه‎گذاری روی صفحۀ TLC مشخص کرد نمونه‎های آفلاتوکسین استخراجی از روی بسترۀ ذرت پس‌از نقطه‎گذاری، چنانچه غلظت سم زیادی داشته باشند، شدت فلورسانس بیشتری نیز از خود نشان می‎دهند و نور بازتابیده از آنها بیشتر و حتی اندازۀ نقاط بزرگ‌تر است (شکل 2). در همین زمینه، فنت[xviii] و همکاران بیان کرده‌اند خاصیت فلورسانس این ماده زیر نور فرابنفش از وجود متیل‌بتاسیکلودکسترین ناشی می‌شود (43).

قارچی مانند A. flavus ازنظر توکسین‎زایی اهمیت دارد. این قارچ آفلاتوکسین B1 را تولید می‌کند که بیشترین سمیت را نسبت به سایر آفلاتوکسین‎های تولیدی قارچ Aspergillus‎ دارد. بین دو گونۀ قارچ Aspergillus آزمایش‌شده که توکسین‎زایی آنها بررسی شد، گونۀ A. flavus با تولید 19/17 میکروگرم‌در‌میلی‎لیتر در مقایسه با گونۀA. nigerبا تولید 25/12 میکروگرم‌در‌میلی‎لیتر، تولید آفلاتوکسین بیشتری داشت. باتوجه‌به سمیت زیاد و مقدار زیاد توکسین تولیدی، فعالیت این قارچ روی بذرها و جیره‎های غذایی سلامت انسان و دام را به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم به خطر می‌اندازد؛ برای نمونه، خوردن تخم‎مرغ آلوده به توکسین این قارچ یا شیر آلوده به آفلاتوکسین M1 که از مشتقات آفلاتوکسین B1 است، انسان را به عوارض ناشی از مصرف آفلاتوکسین‎ها مبتلا می‌کند. این قارچ در مرغ‌داری‎ها سبب ایجاد بیماری آفلاتوکسیکوزیس[xix] در طیور می‎شود (44). سازمان غذا و داروی ایالات‌ متحدۀ آمریکا سطح قابل‌‌تحمل آفلاتوکسین‎ در جیرۀ طیور را 20 قسمت در بیلیون (ppb) گزارش کرده است (45). هنک[xx] و همکاران در سال 2001 گزارش کرده‌اند از میان 142 نمونه دانۀ گیاهی جیرۀ طیور جمع‌آوری‌شده از بخش‌های مرکزی، جنوبی و شرقی تگزاس، 7 درصد نمونه‌ها بیش از 100 میکروگرم‌در‌کیلوگرم آفلاتوکسین داشتند و 83 درصد این نمونه‌ها ذرت بودند (46). علاوه‌بر گونه‌های Aspergillus، جنس‌های دیگری از سایر گروه‌های قارچی در جیرۀ غذایی طیور وجود داشتند که برخی از گونه‌های آنها مانند F. proliferatumدارایقابلیت توکسین‎زایی بودند. اگرچه سایر قارچ‌های شناسایی‌شده در پژوهش حاضر قابلیت توکسین‎زایی ندارند، ازنظر حساسیت‌زایی و ایجاد حساسیت‌های پوستی در طیور و کارگران اهمیت زیادی دارند (16). باتوجه‌به میزان مجاز سمیت (LD50) آفلاتوکسین B1 که سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) برابر 5/0 تا 10 میلی‌گرم به‌ازای هر کیلوگرم وزن بدن تعیین کرده است، بدیهی است در کودکان به‌علت کم‌بودن وزن آنها و دریافت آفلاتوکسین بیش از مقدار مجاز و به‌ویژه تجمع‌پذیری درازمدت سموم در کبد و کلیه‌ها، عوارض سوء بیشتر بروز می‌کنند. اگل[xxi] و همکاران گزارش کرده‌اند میزان ترکیب آلبومین- آفلاتوکسین موجود در خون کودکان نه‌ماهه تا پنج‌سالۀ بنین و توگو واقع در غرب آفریقا به میزان ۹۹ درصد افزایش ‌یافته است که از وجود آفلاتوکسین در ذرت و بادام‌زمینی مصرفی در رژیم غذایی ناشی می‌شود (47). ذرت یکی از ترکیبات غذایی اصلی به‌کار‌رفته در جیرۀ غذایی طیور و دام است و شرایط میزبانی و ترکیبات به‌کاررفته در دانۀ ذرت، شرایط را برای ترجیح میزبانی و استقرار قارچ‌های توکسین‌زا فراهم می‌کند. سوسل[xxii] و همکاران با مطالعه روی شش نوع دانۀ گیاهی جیرۀ پرندگان گزارش کردند همراه با افزایش رطوبت دان و مدت زمان نگهداری آن، میزان آلودگی قارچی و توکسین‎زایی آن افزایش می‌یابد (48). بسیاری از جدایه‎های Aspergillus جداشده روی بسترۀ ذرت قابلیت توکسین‎زایی داشتند؛ به‌طوری‌که بیشتر جدایه‎ها روی محیط‌کشت نارگیل آگار و TLC رنگیزۀ فلورسانس آبی از خود نشان دادند. به نظر می‌رسد میزان رطوبت و دمای محل نگهداری (واحد تولیدی بلغور و واحد مصرف‌کنندۀ بلغور) در فراهم‌کردن شرایط رشد و فعالیت قارچ‌ها که به تولید آفلاتوکسین منجر می‌شود، نقش بسزایی دارند (49). با‌توجه‌به مطالب یادشده، شرایط رطوبتی و تهویۀ نامناسب و رعایت‌نکردن اصول درست خشک‌کردن و انبارداری ذرت و سایر بذرها از سوی انبارداران و مرغ‎داران در مراحل مختلف تولید تا مصرف عامل مهم افزایش درصد فراوانی این‌گونه قارچ‌ها و درنتیجه، توکسین تولیدی از آنهاست؛ ازاین‌رو، رعایت اصول صحیح انبارداری باید مدنظر مرغ‎داری‎ها قرار گیرند. نتایج خسروی[xxiii] و همکاران در زمینۀ بررسی قارچ‎شناسی ترکیب اجزای غذای دامی در گاوداری‎های شهر قم نشان دادند میزان آلودگی به قارچ Aspergillus زیاد است و A. flavus با 48 درصد بیشترین میزان آلودگی را دارد (50)؛ در نتایج وسنا[xxiv] و همکاران در زمینۀ بررسی قارچ‏های جداشده از خوراک طیور گوشتی صربستان نیز تعداد گونه‎های آسپرژیلوس 54 درصد گزارش شده است (51).

از 108 نمونۀ آزمایش‌شده در مطالعۀ کارانجا[xxv] و همکاران روی قارچ‎های توکسین‎زا در صربستان، 84 درصد به Fusarium و 59 درصد به قارچ‎های دیگر آلوده بودند که بر حسب گونه‎های قارچی غالب تقریباً با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارد (52). چنانچه فرآورده‌هایی ازجمله پودر ماهی، ذرت و کنجالۀ سویا در محیط‌های مرطوب نگهداری شوند یا در فرآوری آنها یا در مسیر حمل‌ونقل آنها دقت لازم نشود، شرایط رشد قارچ روی آنها فراهم‌ می‌شود، اسپورهای موجود رشد و تولید سم می‌کنند (53). از مقایسۀ نتایج این بررسی و مطالعه‌های انجام‌شده در سایر کشورها می‌توان نتیجه گرفت آلودگی به قارچ و سم ناشی از آن در اقلام عمدۀ مواد غذایی و خوراک دام و طیور وجود دارد و باید هنگام برداشت تمام اقلام تشکیل‌دهندۀ خوراک دام و طیور، استانداردهای جهانی اِعمال شوند و شرایط مناسبی برای حمل و نگهداری تا زمان مصرف آنها فراهم شود. نکتۀ شایان توجه دیگر اینست که هرچه زمان برداشت محصول در نقطۀ پایانی خط تولید یا در زمان تهیۀ خوراک تا زمان مصرف کمتر باشد، احتمال آلودگی کمتر است.

استفاده از روش‌های متعددی مانند کروماتوگرافی لایۀ نازک (TLC)، کروماتوگرافی مایع[xxvi]‌، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و روش الایزا[xxvii] برای سنجش فومونیسین میسر است (54 و 55). در پژوهش حاضر، میزان کمّی و کیفی فومونیسین‎های تولیدی از قارچ F. verticillioides با استفاده از دو روش TLC و HPLC سنجیده شد (56). در روش TLC می‌توان مجموع سموم تولیدی را به‌دست آورد، ولی در روش HPLC می‎توان میزان تولید فومونیسین‎ها را تفکیک و میزان تولید هرکدام از جدایه‌‌‌ها را مشخص کرد؛ درحقیقت، فومونیسین تولیدی قارچ F. verticillioides چهار نوع است که فومونیسین B1 به بیشترین میزان ممکن تولید می‌شود.

نگارندگان در بازدید از مرغ‌داری‌ها و گاوداری‎های شهرستان خرم‎آباد با انباشت بسیاری از جیره‎های غذایی مواجه شدند که بدون استفاده در انبارها جمع‌آوری‌ شده بودند و در پاسخ به پرسش دربارۀ علت بی‌استفاده‌ماندن آنها، تلفات در اثر مصرف روزانۀ این مواد به‌ویژه در ماکیان مشخص شد. در نمونه‎های منتقل‌شده به آزمایشگاه نیز مشخص شد غالباً آلودگی‌های کپکی موجود روی ذرت و سویا عامل مرگ‌ومیر طیور است و بیشتر قارچ‎‎های جداشده روی نمونه‎ها به دو گونۀ F. prolifratum و F. verticillioides مربوط بودند که هر دو از گونه‎های توکسین‎زا و کپک‎هایی‌اند که قابلیت بیماری‎زایی و حساسیت‎زایی در انسان و طیور را دارند؛ این در حالی است که بنا به گزارش لانیاسونیا[xxviii] و همکاران در سال 2005، تا مرحلۀ تبدیل اقلام به دان مخلوط و آماده‌شده، در اثر ناآگاهی بسیاری از مرغ‎داران از نگهداری درست دان آماده‌شده یا وجودنداشتن انبار و جایگاه مناسب برای نگهداری دان به‌ویژه در مناطق و فصل‌هایی که درصد رطوبت هوا زیاد است، شرایط مساعد برای رشد بیشتر قارچ و تولید بیشتر سم فراهم می‌شود (57).

امروزه نیز دو روش TLC و HPLC همچنان به‌طور وسیع در تشخیص و ردیابی فومونیسین‎ها کاربرد دارند. دانتزر[xxix] و همکاران غلظت فومونیسین B1 را در محیط‌کشت مایع فیزیکی با استفاده از روش HPLC اندازه‌گیری و میزان آن را ۷۵۰ میلی‌گرم بیان کردند ‌(58). در بررسی دیگر که ولوتی[xxx] و همکاران روی ۵۸ نمونه مواد غذایی مبتنی بر ذرت در اسپانیا انجام دادند، با استفاده از HPLC مشخص شد ۸۶ درصد نمونه‌ها حاوی مقادیر زیادی از فومونیسین B1 هستند (59). در پژوهش دیگری که علی‌اکبری[xxxi] و همکاران در مزارع ذرت منطقۀ مغان انجام دادند، میزان داکسی‎نیوالنول (DON) نمونه‌ها با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) تعیین شد و نتایج تجزیۀ نمونه‌ها نشان دادند آلودگی ذرت‌های این منطقه به DON در ۴۵ درصد کل نمونه‌ها وجود دارد و میانگین کل آلودگی ۳۰/۹۵ نانوگرم‌درگرم است (60).

باتوجه‌به آلودگی زیاد فوزاریوم‎ها در غذای ترکیبی طیور در کاراتاکای هند، از 71 ترکیب خوراک طیور بررسی‌شده، گونة Fusariumverticilloidesبا 89 درصد بیشترین فراوانی را بین گونه‎های Fusarium به خود اختصاص داد (61).

در بررسی آلودگی‌های خوراک دامی به قارچ‎های توکسین‎زا در صربستان و نگاهی اختصاصی به گونه‎های Fusarium در بلگراد، از 108 نمونۀ مختلف خوراک دامی جمع‎آوری‌شده از مزارع دامی، 84 درصد گونه‎های Fusarium، 59 درصد گونه‎های Aspergillus، 49 درصد Rhizopus، 44 درصد Mucor و 42 درصد Penicillium جداسازی شدند که گونة F. vertecilloides (با فراوانی 46 درصد) بیشترین فراوانی را در گونه‎های Fusarium به خود اختصاص داد (51). در بررسی فلور قارچی خوراک طیور در کشور مصر، از 110 نمونۀ جمع‎آوری‌شده، گونه‎های Fusarium، Penicillium، A. fumigatus و Rhizopusگونه‌های غالب به‌دست‌آمده از جیره‎های غذایی معرفی شدند (62).

 

نتیجه‌گیری

درمجموع از 100 نمونه خوراک دام و طیور، 77 نمونۀ قارچی روی محیط‌کشت PDA رشد کردند که از این تعداد، 40 نمونه قارچ به خوراک طیور و 37 نمونه قارچ به خوراک دام مربوط بودند. به‌طورکلی گونه‌های مختلفی ازجمله Aspergillus، Rhizopus، Rhizomocur، Penicillium، Alternaria، Absidia، Trichotecium، Mucor و Fusarium از خوراک دام و طیور جداسازی شدند که به‌علت وجود انواع فومونیسین‎ها و آفلاتوکسین‌ها به‌ویژه B1، می‎توان آنها را عوامل اصلی توکسین‌زایی در خوراک دام و طیور برشمرد؛ به‌طوری‎که این قارچ‎ها به‌علت انواع ترکیبات توکسینی و همچنین توکسین‌زایی و سمیت زیادی که دارند، اهمیت دارند. نتایج آزمایش TLC نشان دادند گونه‎های قارچی از خود فلورسانس آبی نشان می‌دهند و برخی جدایه‌ها فلورسانس آبی را به‌وضوح نشان نمی‌دهند؛ ازاین‌رو، قارچ‌های F. prolifratum و F. verticillioides بیشترین نور را از خود ساطع کردند و نتایج HPLC به‌دست‌آمده از قارچ‌های Fusarium و Aspergillus نشان دادند قارچ F. verticillioides بیشترین توانایی تولید فومونیسین B1 را نسبت به F. proliferatum و F. Fujikuroi دارد و A. flavus با تولید آفلاتوکسین B1 و A. niger با تولید آفلاتوکسین G1 بیشترین توانایی تولید توکسین را دارند. حاکم‌نبودن شرایط مطلوب در انبار مواد غذایی و مزرعه سبب ابتلای مواد غذایی به قارچ می‌شود که علاوه‌بر خسارت به گیاهان، خطرهای بسیار زیادی با تولید توکسین برای سایر موجودات دارد.



[1]- Thin Layer Chromatography (TLC)

[2]- Potato Dextrose Agar (PDA)

[3]- Nash and Snyder

[4]- Sub culture

[5]- Coconut Agar

[6]- Davis et al.

[7]- Moosavian

[8]- High-Performance Liquid Chromatography

[9]- Immunoaffinity columns(IAC)

[x]- Iamanaka

[xi]- Davis

[xii]- Milanez

[xiii]- Cutuli

[xiv]- Lemke

[xv]- Almeida

[xvi]- Lin

[xvii]- Dianese

[xviii]- Fente

[xix]- Aflatoxicosis

[xx]- Henke

[xxi]- Egal

[xxii]- Scussel

[xxiii]- Khosravi

[xxiv]- Vesna

[xxv]- Krnjaja

[xxvi]- Liquid Chromatography (LC)

[xxvii]- Enzyme Link Immuno Sorbant Assary (ELISA)

[xxviii]- Lanyasunya

[xxix]- Dantzer

[xxx]- Velluti

[xxxi]- Aliakbari

References

(1) Mikaili A. Aflatoxin bread flour and yeast species in Kermanshah in 2003. 9th Iranian Nutrition Congress Tabriz. Tabriz: University of Tabriz press; 2003.

(2) Asevedo I., Gambale W., Correa B., Paula C., Almeida R., Framil V. Influence of temperature and relative humidity on production of aflatoxins in samples of stored maize artificially contaminated with Aspergillus flavus (Link). Revista de Microbiologia 1993; 24: 32-37.

(3) Stanley VG., Ojo R., Woldesenbet S., Hutchinson DH., Kubena LF. The use of Saccharomyces cerevisiae to suppress the effects of aflatoxicosis in broiler chicks. Poultry Science 1993; 72: 1867-1872.

(4) Kazemi VA. Consumption of rice contamination by fungi that produce mycotoxins in East Azerbaijan Province. Medical Science 2008; 30(3): 111-118.

(5) Hamzehkhani R., Khavari H. The toxicity of mycotoxins, prevention and treatment. Asian Journal of food and Agro-Industry 2009; 114.

(6) Razzaghi-Abyaneh M., Shams-Ghahfarokhi M., Allameh A., Kazeroon-Shiri A., Ranjbar-Bahadori S., Mirzahoseini H., A survey on disribution of Aspergillus section Flavi in corn field soils in Iran: population patterns based on aflatoxins, cyclopiazonic acid and sclerotia production. Mycopathologia 2006; 161(3): 183-192.

(7) Frobish R., Bradley B., Wagner D., Long-Bradley P., Hairston H. Aflatoxin residues in milk of dairy cows after ingestion of naturally contaminated grain. Journal of Food Protection 1986; 49: 781-785.

(8) Sweeney MJ., Dobson AD. Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species. International Journal of Food Microbiology 1998; 43: 141-158.

(9) Khosravi AR., Shokrp H., Yahyaraeyat R., Soltani M. Isolation toxigenic and nontoxigenic fungi from feedstuffs referred to the center of mycology. Journal Faculty Veterenary Medicin 2004; 59(3): 221-226.

 

(10) Frisvad JC., Skouboe P., Samson RA. Taxonomic comparison of three different groups of aflatoxin producers and a new efficient producer of aflatoxin B1, sterigmatocystin and 3-O-methylsterigmatocystin, Aspergillus rambellii sp. nov. Systematic and Applied Microbiology 2005; 28: 442-453.

(11) Wild CP., Gong YY. Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue. Carcinogenesis 2010; 31: 71-82.

(12) Scott PM. Recent research on fumonisins: A review. Food Additives and Contaminants: Part A 2012; 29(2): 242-248.

(13) Rheeder JP., Marasas WFO., Vismer HF. Production of fumonisin analogs by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology 2002; 68(5): 2101-2105.

(14) Canxing D., Qin Z., Yang Z., Li W., Sun S., Zhu Z., Wang X. Identification of pathogenic Fusarium spp. causing maize ear rot and potential mycotoxin production in China. Toxins 2016; 8(6): 186.

(15) Abbas HK., Cartwright RD., Shier WT., Abouzied MM., Bird CB., Rice LG., Frank Ross PG., Sciumbato L. and Meredith FI. Natural occurrence of fumonisins in rice with Fusarium sheath rot disease. Plant Diseases 1998; 82(1): 22-25.

(16) Boujari J. and Ershad D. An Investigation on Corn- seed Mycoflora. Iranian Journal of Plant Pathology 1993; 29: 23-35.

(17) Contamination of some corn hybrids with Aflatoxins B1 and B2 and its producing fungi in field. Plant Diseases 2001; 69(2): 79-84.

(18) Rasti Ardakani M. Determination of aflatoxin contamination of corn in central depository of Isfahan. M.Sc. Thesis. Tehran University of Medical Sciences 1995; 14-17.

(19) Davari M., Safaie N., Darvishnia M., Didar Taleshmikaeel R. Occurrence of deoxynivalenol producing isolates of Fusarium graminearum species complex associated with head blight of wheat in Moghan area. Journal of Crop Protection 2014; 3: 113-123.

(20) Moosavian M., Darvishnia M., Bazgir E. The effect of pH and NaCl on the aflatoxin production of Aspergillus parasiticus. Iranian Journal of Plant Protection 2016; 46(2): 259-267.

(21) Moosavian M., Darvishnia M., Khosravinia HA., Comparison of growth of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus in different conditions of temperature, moisture and pH. Applied Research in Plant Protection 2016; 5(2): 1-12.

(22) Cavalheiro AC. Aflatoxin and Aflatoxicosis- A Review. World's Poultry Science Journal 1981; 37: 34-38.

(23) Bennett J., Dunn J., Goldsman C. Influence of white light on production of aflatoxins and anthraquinones in Aspergillusparasiticus. Applied and Environmental Microbiology 1981; 41: 488-491.

(24) Viquez OM., Castell-Perez ME., Shelby RA. Occurrence of fumonisin B1 in maize grown in Costa Rica. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1996; 44(9): 2789-2791.

(25) Doko BM., Canet C., Brown N., Sydenham EW., Mpuchane S., Siame BA. Natural co-occurrence of fumonisins and zearalenone in cereals and cereal-based foods from Eastern and Southern Africa. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1996: 44(10): 3240-3243.

(26) Abdelhamid A. Occurrence of some mycotoxins (aflatoxin, ochratoxin A, citrinin, zearalenone and vomitoxin) in various Egyptian feeds. Archives of Animal Nutrition 1990; 40: 647-664.

(27) Davis N., Iyer S., Diener U. Improved method of screening for aflatoxin with a coconut agar medium. Applied and Environmental Microbiology 1987; 53: 1593-1595.

(28) Cutuli M., Cuellar A., Camara J., Mateos A., Suarez G. Different media and methodologies for the detection of aflatoxin production by Aspergillus flavus strains isolated from trout feed. Mycopathologia 1991; 113: 121-125.

(29) Atanda O., Ogunrinu M., Olorunfemi F. A neutral red desiccated coconut agar for rapid detection of aflatoxigenic fungi and visual determination of aflatoxins. World Mycotoxin Journal 2011; 4: 147-155.

(30) Trucksess MW., Stack ME., Nesheim S., Albert RH., Romer TR. Multifunctional column coupled with liquid chromatography for determination of aflatoxins B1, B2, G1, and G2 in corn, almonds, Brazil nuts, peanuts, and pistachio nuts: Collaborative study. Journal of AOAC International 1994; 77(6): 1512-1521.

(31) Shephard G., Krska R. Aflatoxin analysis at the beginning of the twenty-first century. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2009; 395: 1215-1224.

(32) Tavakoli HR., Kamkar A., Riazipour M., Mozaffari Nejad A., Rafati H. Assessment of aflatoxin M1 levels by enzyme-linked immunosorbent assay in yoghurt consumed in Tehran, Iran. Asian Journal Chemistry 2013; 25: 2836-2838.

(33) Iamanaka BT., de Menezes HC., Vicente E., Leite RS., Taniwaki MH. Aflatoxigenic fungi and aflatoxins occurrence in sultanas and dried figs commercialized in Brazil. Food Control 2007; 18: 454-457.

(34) Milanez T., Schoenlein-Crusius I., Okino L. Evaluation of Brazilian terrestrial Aspergillus strains for mycotoxin production. Revista do Instituto Adolfo Lutz 2002; 61: 7-11.

(35)Lemke PA., Davis ND., Iyer SK., Creech GW., Diener UL. Fluorometric analysis of iodinated aflatoxin in minicultures of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Journal of Industrial Microbiology 1988; 3: 119-125.

(36)Fente CA., Jaimez JO., Vazquez BI., Franco CM., Cepeda CM. New additive for culture media for rapid identification of aflatoxin- producing Aspergillus strains. Applied Environment Microbiology 2001; 67(10): 4858-4862.

(37)Ahmed SA., Abo El-Makarem HS. Aflatoxin M1 levels in milk and some dairy products in Alexandria City. Assiut Veternary Medical Journal 2013; 59(139): 93-98.

(38)Rastogi S., Dwivedi PD., Khanna SK., Das M. Detection of aflatoxin M1 contamination in milk and infant milk products from Indian markets by ELISA. Food Control 2004; 15(4): 287-290.

(39) Sydenham EW., Shephard GS., Thiel PG., Stockenström S., Snijman PW., Van DJS. Liquid chromatographic determination of fumonisins B1, B2, and B3 in corn: AOAC-IUPAC Collaborative Study. Journal of AOAC International 1996; 79(3): 688-696.

(40) Arseculeratne S., De Silva L., Wijesundera S., Bandunatha C. Coconut as a medium for the experimental production of aflatoxin. Applied Microbiology 1969; 18: 88-94.

(41) Almeida AP., Corrêa B., Mallozzi MA., Sawazaki E., Soares LMV. Mycoflora and aflatoxin/fumonisin production by fungal isolates from freshly harvested corn hybrids. Brazilian Journal of Microbiology 2000; 31: 321-326.

(42) Lin M., Dianese J. A coconut agar medium for rapid detection of anatoxin production by Aspergillus spp. Phytopathology 1976; 66: 1466-1469.

(43) Fente CA., Jaimez JO., Vazquez BI., Franco CM., Cepeda CM. New additive for culture media for rapid identification of aflatoxin- producing Aspergillus strains. Applied Environment Microbiology 2001; 67(10): 4858-4862.

(44) Choudhary G. Biodeterioration in Emblica based Medicinal products and their Aflatoxin contamination. Ancient Science of Life 2011; 30: 65.

(45) Aravind KL., Patil VS., Devegowda G., Umakantha B., Ganpule SP. Efficacy of modified glucamannan to counteract mycotoxicosis in naturally contaminated feed on performance, serum biochemical and hematological parameters in broilers. Poultry Science 2003; 82: 570-576.

(46) Henke SE., Gallardo VC., Martinez B., Bailey R. Survey of aflatoxin concentrations in wild bird seed purchased in Texas. Journal of Wildlife Diseases 2001; 37: 831-835.

(47)          Egal S., Hounsa A., Gong Y., Turner P., Wild C., Hall A., Hell K., Cardwell K. Dietary exposure to aflatoxin from maize and groundnut in young children from Benin and Togo, West Africa. International Journal of Food Microbiology 2005; 104: 215-224.

(48) Scussel VM. Aflatoxin and food safety: recent South American perspectives. Journal of Toxicology: Toxin Reviews 2004; 23: 179-216.

(49) Bandyopadhyay R., Kiewnick S., Atehnkeng J., Donner M., Cotty P., Hell K. Biological control of aflatoxin contamination in maize in Africa. Abstr. Tropentag 2005 Conf. Int. Agric. Res. Dev. Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Switzerland; 2005.

(50) Khosravi AR., Dakhili M., Shokri HA mycological survey on feed ingredients and mixed animal feeds in Ghom Province, Iran. Pakistan Journal of Nutrition 2008; 7: 31-34.

(51) Vesna K., Stonjonovic R. Contamination of animal feed with potentially toxigenic fungi with spicial refrence to genus Fusarium species .Oriental Science 2008: 823-826.

(52) Krnjaja V., Stojanović L., Cmiljanić R., Trenkovski S., Tomašević D. The presence of potentially toxigenic fungi in poultry feed. Biotechnology in Animal Husbandry 2008; 24: 87-93.

(53)          Schweitzer SH., Quist CF., Grimes GL., Forster DL. Aflatoxin levels in corn available as wild turkey feed in Georgia. Journal of Wildlife Diseases 2001; 37: 657-659.

(54) Krstović S., PopovićVrangeš A., Kasalica A., Jevtić M., Jajić I. Aflatoxin M1 transfer rate from milk into cheese and wehy during the production of hard cheese. Contemporary Agriculture 2018; 67(3-4): 215-220.

(55) Rastogi S., Dwivedi PD., Khanna SK., Das M. Detection of aflatoxin M1 contamination in milk and infant milk products from Indian markets by ELISA. Food Control 2004; 15(4): 287-290.

(56) Sydenham EW., Shephard GS., Thiel PG., Stockenström S., Snijman PW., Van DJS. Liquid chromatographic determination of fumonisins B1, B2, and B3 in corn: AOAC-IUPAC Collaborative Study. Journal of AOAC International 1996; 79 (3): 688-696.

(57) Lanyasunya T., Wamae L., Musa H., Olowofeso O., Lokwaleput I. The risk of mycotoxins contamination of dairy feed and milk on smallholder dairy farms in Kenya. Pakistan Journal of Nutrition 2005; 4: 162-169.

(58) Dantzer WR., Hopmans E., Clark A., Hauck C., Murphy PA. Purification of fumonisin B1 from liquid cultures of Fusarium proliferatum. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1996; 44(12): 3730-3732.

(59) Velluti A., Marin S., Sanchis V., Ramos AJ. Note. Occurrence of fumonisin B1 in Spanish corn-based foods for animal and human consumption. Food Science and Technology International 2001: 7(5): 433-437.

(60) Aliakbari Z., Aminian H., Mirabulfathi M., Karami Osboo R. Fusarium species and Deoxynivalenol in maize product of Moqan region. Entomology and Phytopathology 2011; 79(2): 163-180.

(61) Dass RS., Sreenivasa MY., Janardhana GR. High Incidence of Fusarium verticillioides in Animal and Poultry Feed Mixtures Produced in Karnataka, India. Plant Pathology Journal 2007; 6(2): 174-178.

62- Moharram A., Abdel‐Gawad K., Megalla S., Mahmoud AL. Fungal flora of poultry feedstuff ingredients. Journal of Basic Microbiology 1989; 29: 491-499.