شناسایی گونه‌های Chaetomium و Amesia همراه بیماری‌های مختلف در گیاهان زینتی علفی اهواز

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز

2 دانشیار بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

3 استاد بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

10.22108/bjm.2019.117357.1205

چکیده

مقدمه: گیاهان زینتی آهار (Zinnia elegans)، اختر (Canna sp.)، اطلسی (Petunia hybrida)، کمپکت (Dracaena Compacta)، کوکب (Dahlia sp.)، گازانیا (Gazania sp.)، گل جعفری (Tagetes sp.)، گلناز (Portulaca grandiflora) و لادن (Tropaeolum majus) از گیاهان زینتی در شهر اهواز میباشند. شناسایی قارچ‌های همراه این گیاهان به بهبود مدیریت پرورش آن‌ها در آینده کمک خواهد کرد. اعضای جنس‌های Amesia و Chaetomium عموما در خاک، آب، گیاهان، حیوانات و انسان یافت شده‌اند. در این مطالعه، 12 جدایه‌ از جنس‌های Chaetomium و Amesia، جداسازی شده از گیاهان زینتی علفی، بر اساس ریخت‌شناسی و تجزیه و تحلیل تبارشناسی شناسایی شدند.
مواد و روش‏ها: در طول سال‌های 97-1396، 40 نمونه‌ از گیاهان فوق با علایم پوسیدگی ریشه، شانکر ساقه و لکه‌برگی جمع‌آوری و قارچ‌های همراه این علایم جداسازی شد. در بین آن‌ها، 12 جدایه‌ از خانواده Chaetomiaceae بدست آمد که مشخصات ریخت‌شناسی و مولکولی آن‌ها مورد بررسی قرار گرفت. جدایه‏های قارچی در محیط‌ کشت سیبزمینی- دکستروز - بروث (PDB) رشد یافته و زیست‏توده میسیلیومی آن‌ها، پس از عبور از کاغذ سترون جمع‌آوری و سپس خشک - انجمادی گردید. نواحی ITS و بخش‌هایی از ژن‌های 28S-D1/D2 (برای چهار جدایه‌) و tub2 (برای نه جدایه) با استفاده از آغازگرهای مناسب تکثیر و توالی‌یابی شدند.
نتایج: جدایه‌های تحت مطالعه با سویه‌های شناخته‌شده، با استفاده از الگوریتم جستجوی بلاست و تجزیه و تحلیل تبارشناسی مبتنی بر ناحیه‌های ITS، 28S و tub2، مقایسه شدند. بر این اساس، گونه‌های Chaetomium olivaceum، C. ascotrichoides ،C. globosum ، C. rectangulare و Amesia atrobrunnea شناسایی گردیدند. مشخصات ریخت‌شناسی این جدایه‌ها با سویه‌های تایپ هر گونه انطباق داشت.
بحث و نتیجه‏گیری: بر اساس دانش ما، این اولین گزارش گونه‌ی C. ascotrichoides در ایران و همراهی C. rectangulare روی کمپکت،C. globosum روی آهار و اختر، C. ascotrichoides روی اطلسی وC. olivaceum روی آهار، لادن و جعفری در جهان می‌باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Identification of Chaetomium and Amesia species associated with different diseases of some herbaceous ornamentals in Ahvaz

نویسندگان [English]

  • Reihaneh Larki 1
  • Mehdi Mehrabi-Koushki 2
  • Reza Farokhinejad 3
1 MSc Student of Plant Pathology, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran
2 Associate Professor of Plant Pathology, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran; Biotechnology and Bioscience Research Center, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran
3 Professor of Plant Pathology, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran
چکیده [English]

Introduction: Common zinnia (Zinnia elegans), canna (Canna sp.), petunia (Petunia hybrida), compacta (Dracaena Compacta), dahlia (Dahlia sp.), gazania (Gazania sp.), marigold (Tagetes sp.), rose moss (Portulaca grandiflora) and nasturtium (Tropaeolum majus) are common ornamental plants in Ahvaz. The identification of fungi associated with these plants will contribute to improving the future managment of their cultivation. Members of the genera Amesia and Chaetomium are widely distributed in soil, water, plants, animals and humans. In this study, 12 isolates from Chaetomium and Amesia genera, obtained from herbaceous ornamentals, were identified based on morphology and phylogenetic analysis.
Materials and methods: During 2017-2018, 40 symptomatic plants, showing root rot, stem canker and leaf spot, were collected and their associated fungi were isolated. Among those, 12 chaetomiaceae-like isolates were obtained, which their morphological and molecular characterizations were surveyed. Mycelial biomass of the isolates, produced into potato-dextrose-broth (PDB), was collected by passing through filter paper and freeze-dried. ITS and partial regions of the 28s-D1/D2 (for 4 isolates) and tub2 (for 9 isolates) were amplified using appropriate primers and sequenced.
Results: The isolates under survey were compared with known strains using BLASTn search and phylogenetic analysis beased on ITS, 28S and tub2 regions. Accordingly, the isolates under study were identified as follow: Amesia atrobrunnea, Chaetomium rectangulare, C. globosum, C. ascotrichoides and C. olivaceum. The morphological characteristics of these isolates were in accordance with the type strains of each species.
Discussion and conclusion: To our knowledge, this is the first record of C. ascotrichoides in Iran and the association of C. rectangulare on compacta, C. globosum on zinnia and canna, C. ascotrichoides on petunia, C. olivaceum on common zinnia, nasturtium and marigold throughout the world.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chaetomiaceae
  • β‐tubulin
  • Molecular phylogeny
  • Morphology
  • associated fungi

مقدمه

گیاهان زینتی آهار (Zinnia elegans)، اختر (Canna sp.)، اطلسی (Petunia hybrida)، کمپکت (Dracaena Compacta)، کوکب (Dahlia sp.)، گازانیا (Gazania sp.)، گل جعفری (Tagetes sp.)، گل ناز (Portulaca grandiflora) و لادن (Tropaeolum majus) از گیاهان زینتی شهر اهواز هستند. گیاه آهار دارای گل‌های جذاب و کوچک، برگ‏هایی با بافت کاغذی و ساقه‌های سفتی است که در مرکز به رنگ سبز کم‌رنگ هستند و در ارتفاع 15 تا 100 سانتی‌متر رشد می‌کند. اختر، گیاهی ریزوم‌دار با ساقه‌های طویل و بدون انشعاب است، برگ‌های آن بزرگ، پهن با رگبرگ‌های برجسته و سبز تا مسی یا ارغوانی هستند و گل‌های نامنظم آن به‌شکل خوشه در انتهای ساقه قرار می‌گیرند. گیاه اطلسی جزو گیاهان علفی با ساقۀ نیمه‌چوبی است که گل‏هایش به‌شکل قیف با دو رنگ بنفش و سفید دیده می‌شوند. این گیاه زینتی به‌علت داشتن گل‏های فراوان، در تزیین تپه‌گل‏ها و حاشیه‏های صاف یا شیب‏دار استفاده می‌شود. گیاه کمپکت، برگ‌های پهن و کشیده‌‌ای به رنگ سبز تیره دارد و نام گیاه از آرایش برگ‌ها در کنار هم گرفته شده است؛ برگ‌ها به‌شکل متراکم و دسته‌ای در انتهای شاخه‌ها تشکیل می‌شوند. گیاه کوکب دارای برگ‌های متناوب، بیضی‌شکل و قدری کشیده و کرک‌دار و خشن و ساقه‌های ضخیم و منشعب و گل‌های شبیه آفتابگردان با مخروطی به رنگ سیاه، قهوه‌ای یا سبز در وسط است؛ گل‌ها اواخر تابستان یا اوایل پاییز ظاهر می‌شوند. گیاه گازانیا دارای برگ‌های سبز تیره و صاف در سطح بالایی و نمدی‌شکل و سفید در پشت است، گل‌های این گیاه در روشنایی آفتاب، باز و در شب و هوای ابری و مه‌آلود، بسته می‌شوند. گل‌ها درخشان و به رنگ‌های نارنجی، زرد، کرم و قرمز برنزی و اغلب در قاعدۀ خود دارای هاله‌هایی به رنگ‌های تیره یا روشن هستند. گل جعفری دارای برگ‌های مرکب است و گل‌های آن به رنگ زرد لیمویی، زرد، کرم، طلایی و نارنجی قهوه‌ای دیده می‌شوند. گل ناز دارای برگ‌های ضخیم و گوشتی و مرتب و متناوب در خوشه‌های کوچک است و گل‌ها با پنج گلبرگ به رنگ‌های متغیر قرمز، نارنجی، صورتی، سفید و زرد دیده می‌شوند. گیاه لادن دارای برگ‌های دایره‌ای‌شکل و دمبرگ‌های بلند است و گل‌ها به رنگ نارنجی پرتقالی و درشت هستند و از کنار برگ‌ها خارج می‌شوند و دمگل بلندی دارند.

وجود قارچ‌های بیمارگر و همراه در گیاهان یادشده (ازجمله گونه‌های Amesia و Chaetomium) روی وضعیت رشدی آنها تأثیر می‌گذارد و شناسایی این قارچ‌ها به مدیریت مناسبت‌تر پرورش این گیاهان کمک می‌کند. جنس Chaetomium و آرایه‌های وابسته به آن به‌علت داشتن توانایی تخریب سلولز و تولید انواع متابولیت‌های زیستی، قادر به کلونیزه‌کردن بسترهای مختلف هستند. بیش از 400 گونه از جنس Chaetomium توصیف و برخی گونه‌ها عامل حساسیت‌زای مهم در هوا گزارش شده‌اند که به گسترش ورم غشای مخاطی بینی و آسم )به‌علت تولید مایکوتوکسین‌ها و ترکیبات آلی فرار( کمک می‌کنند (1-6). جنس Chaetomium معمولاً آسکوکارپ‌هایی با دیوارۀ غشایی‌ تولید می‌کند که زیر پوشش موهای نسبتاً زیاد رشد کرده‌اند. این جنس دارای آسکوسپورهای تک‌سلولی، صاف و رنگی با منفذ تندش است (7 و 8). ابتدا کنز[1] گونۀ C. globosum را معرفی و توصیف (9) کرد و سپس چندین بار بر اساس ریخت‌شناسی موهای اطراف آسکوکارپ‌ها توصیف شد (7، 10-16)؛ باوجوداین، فیوکل[1] (17) با کشف آسک‌های استوانه‌ای و زوف[1] (12) با کشف منافذ جوانه‌زنی آسکوسپورها بینش بهتری در توصیف ریخت‌شناسی جنسChaetomiumارائه کردند. سورگل[2] (18) و دریفس[3] (19) ویژگی‌های ریخت‌شناسی آسکوسپورها، آسک‌ها و ساختار سطح دیوارۀ آسکوکارپ‌ها را برای طبقه‌بندی جنس Chaetomium پیشنهاد کردند. میلنر[4] و همکاران (20) برای طبقه‌بندی گونه‌های Chaetomium با استفاده از ویژگی‌های منافذ جوانه‌زنی آسکوسپورها و پاسخ‌های رشدی گونه‌ها در درجه‌حرارت‌های مختلف تلاش کردند. مطالعه‌های تکمیلی وونارکس[5] و همکاران (21) که اساس طبقه‌بندی معاصر جنس Chaetomium را تشکیل می‌دهند، مطالعه‌های پیشین را مد‌نظر قرار می‌دهند؛ هرچند بر ریخت‌شناسی آسک‌ها، آسکوسپورها، منافذ جوانه‌زنی و ساختار دیوارۀ آسکوکارپ‌ها تأکید می‌کنند و ریخت‌شناسی موهای اطراف آسکوکارپ‌ها را مبنا قرار نمی‌دهند؛ بر اساس این طبقه‌بندی، C. globosum دارای آسکوکارپ‌هایی با اشکال کروی تا تخم‌مرغی یا تخم‌مرغی معکوس، متشکل از دیوارۀ اسفنجی و پوشیده از اشکال متنوعی از موهایی صاف، انعطاف‌پذیر یا به‌طور منظم پیچ‌خورده است. آسکوکارپ‌ها حاوی آسک‌های چماقی‌شکل و آسکوسپورهای لیمویی‌شکل و دوطرفه مسطح‌شده با اندازۀ 12-9×10-8×8-6 میکرومتر و دارای منفذ قارچی در رأس خود هستند. بر اساس توصیف یادشده، 28 گونه مترادف با C. globosum شناخته شده‌اند (8 و 21).

گریف[6] و همکاران (22) ارتباط تبارشناسی جنس Chaetomium را با استفاده از داده‌های توالی LSU، β-tubulin و rpb2 بررسی کردند و نتیجه گرفتند Chaetomidium چند‌نیایی است. عسگری[7] و زارع[8] ریخت‌شناسی جنس Chaetomium را در ایران مطالعه کردند (23). در این مطالعه، بررسی تبارشناسی چند‌ژنی مبتنی بر نواحی ITS، LSU-nrDNA و tub2، جایگاه طبقه‌بندی و جداسازی تبارشناسی پنج گروه گونۀ Chaetomium را به‌طور درخور توجهی روشن کرد و این تفکیک تا حدی با ریخت‌شناسی، ساختار پریدیم، شکل آسکوسپور‌ها و موقعیت منافذ تندش منطبق بود. این مطالعه نشان داد ارتباط تبارشناسی دوری بین جدایه‌های معتبر C. globosum (CBS 148.51) و سویۀ C. coarctatum CBS 162.62 وجود دارد (23). بر اساس نتایج تبارشناسی مبتنی بر شش جایگاه ژنی، ویژگی‌های ریخت‌شناسی (24) و حدود و ثغور گونۀC. globosum بازنگری شد و شش گونه که مترادف C. globosum معرفی شده بودند (8)، احیا شدند. در مطالعۀ وونارکس و همکاران، Chaetomidium به‌عنوان جنس بدون منفذ آسکوکارپ (استیول) و مترادف Chaetomium معرفی شده است (24). این جنس دارای آسکوکارپ با موهای بلند و انعطاف‌پذیر است و آسکوسپورها بیضی‌ تا لیمویی‌شکل، تک‌سلولی با یک منفذ جوانه‌زنی در رأس خود هستند. در حال حاضر، این جنس شامل 12 گونه است (25-28). با مطالعۀ تبارشناسی بر اساس ژن‌های SSU، LSU، tub2 وrpb2 (27)، جنس‌های Amesia (با 3 گونه)، Arcopilus (با 1 گونه)، Collariella (با 4 گونه)، Dichotomopilus (با 7 گونه) و Ovatospora (با 2 گونه) برای نخستین‌بار معرفی و توصیف شدند. در مطالعۀ وونارکس و همکاران، جنس Amesia با تغییر نام چند گونۀ Chaetomium و توصیف گونۀ A. atrobrunnea، گونۀ نام‌گذاری یا تایپ معرفی شد. گونه‌های موجود در این جنس ازنظر ریخت‌شناسی به‌ویژه شکل موهای اطراف کلیستوتسیوم و ریخت‌شناسی آسکوسپورها متنوع هستند. گونه‌های توصیف‌شدۀ این جنس عبارتند از: Amesia atrobrunnea، Amesia cymbiformis و Amesia nigricolor. در این جنس، آسکوکارپ‌های سطحی، منفذ‌دار و کروی، بیضوی یا تخم‌مرغی‌شکل تشکیل می‌شوند. آسک‌ها چماقی یا دوکی‌شکل و حاوی هشت آسکوسپور هستند که با نظم و پشت‌سر‌هم تشکیل می‌شوند و دیوارۀ آنها تجزیه‌شونده است. آسکوسپورهای قهوه‌ای‌رنگ معمولاً دوکی‌شکل یا تخم‌مرغی کشیده با منفذ جوانه‌زنی رأسی یا زیررأسی هستند. تاکنون شکل جنسی این قارچ مشاهده نشده است (27).

در مطالعۀ حاضر، 12 جدایه‌ از جنس‌های Chaetomium و Amesia که از گیاهان زینتی علفی شهر اهواز (دارای نشانه‌های پوسیدگی ریشه، لکه‌برگی و شانکر ساقه) جداسازی شده بودند، بر اساس ریخت‌شناسی و تجزیه‌و‌تحلیل تبارشناسی شناسایی شدند.

 

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری نمونه‌های گیاهی:طی سال زراعی 1397-1396، 40 نمونه از نه گونه گیاه زینتی علفی با نشانه‌های پوسیدگی ریشه، لکه‌برگی و شانکر ساقه از مناظر شهری اهواز جمع‌آوری (جدول 1) و تا زمان جداسازی درون کیسه‌های کاغذی (قرارداده‌شده در کیسه‌های نایلونی) و در یخچال نگهداری شدند. به‌منظور جداسازی بیمارگرهای احتمالی، برشی از مرز مشترک بافت آلوده و سالم هر نمونۀ گیاهی (قطعه‌هایی با اندازۀ 5×5 میلی‌متر) تهیه و پس‌از ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت‌سدیم 2 درصد به‌مدت 1 تا 2دقیقه، نمونه‌ها سه بار با آب مقطر استریل شستشو شدند. پس‌از خشک‌شدن نمونه‌ها به‌وسیلۀ کاغذ صافی استریل، قطعه‌های گیاهی روی محیط غذایی سیب‌زمینی- دکستروز- آگار (PDA) قرار گرفتند. پس‌از 3 تا 7 روز نگهداری تشتک‌های پتری در انکوباتور 28 درجۀ سانتی‌گراد، پرگنه‌های قارچی ظاهر‌شده روی محیط‌کشت به محیط‌کشت جدید مایه‏زنی شدند.

خالص‌سازی جدایه‌های قارچی: مقدار 9 میلی‌لیتر محلول 1/0 درصد توئین 80 به هر شیشۀ مکارتی اضافه و به‌مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجۀ سانتی‌گراد استریل شد. تعدادی از آسکوکارپ‌های تولیدی روی سطح پرگنۀ قارچی با لوپ استریل‌شده جمع‌آوری و به لوله‌های مکارتی اضافه شدند؛ سپس این لوله‌ها به‌شدت با ویبراتور تکان داده شدند. سوسپانسیون حاصل از لایۀ پشم‌شیشۀ استریل عبور داده شد تا قطعه‌های ریسه، بقایای آسکوکارپ و محیط‌کشت از آن جدا شوند. مقدار 100 میکرولیتر از رقت‌های مختلف (1/0 و 01/0) این سوسپانسیون آسکوسپور به ظروف پتری حاوی PDA اضافه و با پخش‏کنندۀ L‌شکل به‌خوبی پخش شد. ظروف پتری به‌مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و تاریکی مطلق نگهداری شدند و با مشاهدۀ پرگنه‌های مستقل قارچ در ظروف پتری، یکی از آنها به‌عنوان قارچ تک‌اسپور‌شده به محیط‌کشت PDA جدید مایه‌زنی شد.


جدول 1- ویژگی‌های گیاهان نمونه‌برداری‌شده و جدایه‌های به‌دست‌آمده از آنها

کد جدایه

میزبان

نام علمی

محل جمع‌آوری

تاریخ جمع‌آوی

نشانه‌های نمونه

SCUA-C1

گل آهار

Zinnia elegans

فلکۀ فرودگاه

27/8/96

لکه‌برگی

SCUA-D1

گل آهار

Zinnia elegans

نیوساید

27/8/96

لکه‌برگی

SCUA-D2

گل آهار

Zinnia elegans

نیوساید

27/8/96

لکه‌برگی

SCUA-AT3

گل اطلسی

Petunia hybrida

ملت، فاز4

18/1/97

شانکر ساقه

SCUA-AT10

گل اطلسی

Petunia hybrida

ملت، فاز 4

18/1/97

پژمردگی گیاه

SCUA-Z9

گل ناز

Portulaca grandiflora

زیتون

31/6/97

شانکر ساقه و پوسیدگی ریشه

SCUA-Q1

گازانیا

Gazania sp.

کیانپارس

20/7/96

لک‌برگی

SCUA-K3

کمپکت

Dracaena Compacta

گلخانۀ کیانپارس

20/7/96

لکه‌برگی

SCUA-CO1

کوکب

Dahlia sp.

شهرک نفت

12/9/96

لکه‌برگی

S8 SCUA-

گل جعفری

Tagetes sp.

سایت دانشگاه

21/9/96

لکه‌برگی و شانکر ساقه

SCUA-C3

اختر

Canna sp.

شهرک دانشگاه

10/10/96

لکه‌برگی

SCUA-L2

گل لادن

Tropaeolum majus

نیوساید

18/1/97

لکه‌برگی

SCUA-Neae

-

-

دانشگاه

17/8/96

-

 


بررسی ریخت‌شناسی و شاخص‌های رشدی: شکل و انداز‌ۀ آسکوکارپ‌ها و آسکوسپورها بررسی شد (29). یک قطره محلول رنگ‌آمیزی لاکتوفنل یا آبی‌لاکتیک (لاکتوفنول+کاتن‌بلو) روی لام اسلاید ریخته و چند آسکوکارپ با سوزن سترون و به‌آرامی به قطرۀ موجود روی لام منتقل شد؛ سپس ساختارهای قارچی با قراردادن لامل روی آنها، هواگیری و تثبیت با شعله مشاهده شدند. جدایه‌ها به روش بینک[9] و روگرز[10] (30) روی اسلاید کشت شدند. در تشتک پتری حاوی کاغذ صافی، لام و لامل استریل، قطعه‌های کوچک مربع‌شکلی از محیط‌کشت PDA روی لام قرار داده شدند و مقدار کمی از پرگنۀ قارچ مدنظر با سوزن استریل برداشته و به‌آرامی به چهار سوی آن منتقل شد؛ سپس لامل روی قطعه‌های PDA قرار داده شد و تشتک پتری در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد انکوباتور نگهداری شد. پس‌از رشد قارچ مدنظر روی لام و لامل، اسلاید ساختارهای قارچی با استفاده از محلول رنگ‌آمیزی تهیه شد.

به‌منظور تعیین سرعت رشد، دیسک‌های یکسانی از حاشیۀ درحال رشد پرگنۀ جدایه‌های قارچی تهیه و روی محیط‌کشت‌های PDA قرار داده شدند و کشت‌ها در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد انکوباتور و تاریکی مطلق نگهداری شدند. میزان رشد پرگنه‌های جدایه‌های بررسی‌شده به‌طور روزانه و به‌مدت هشت روز اندازه‌گیری شد.

.تولید زیست‏تودۀ جدایه‌ها و آماده‌سازی برای استخراج DNA: قطعه‌های 5 میلی‌متری از حاشیۀ پرگنه‌های درحال رشد قارچ جدا و به محیط‌کشت مایع سیب‌‌زمینی- دکستروز- براث (PDB) (100 میلی‌لیتر عصارۀ سیب‌زمینی همراه با 1 گرم ساکارز) اضافه شدند. ظروف کشت 5 تا 15 روز در شرایط تاریکی مطلق، دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و 80 تا 120 تکان در دقیقه روی شیکر نگهداری شدند. تودۀ میسیلیومی رشدیافته در محیط‌کشت‌های PDB با پمپ خلأ، قیف و کاغذ صافی استریل جمع‌آوری و با آب مقطر استریل شستشو شد. تودۀ میسیلیومی حاصل بی‌درنگ به لوله‌های سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری منتقل و تا مرحلۀ خشک- انجمادی در فریزر منفی 80 درجۀ ‌سانتی‌گراد نگهداری شد. به‌منظور خشک- انجمادی، درِ لوله‌های سانتریفیوژ حاوی توده‌های میسلیومی منجمدشده با قطعه‌های گاز استریل جایگزین و به‌مدت 24 ساعت در دستگاه فریزدرایر (منفی 20 تا منفی 54 درجۀ سانتی‌گراد) قرار داده شدند. تودۀ میسیلیومی خشک‌شده به هاون چینی استریل منتقل و با ازت مایع به‌خوبی پودر شد. پودر ایجادشده در لولۀ 2 میلی‌لیتری جمع‌آوری و با پارافیلم مسدود شد. نمونه‌ها تا زمان استخراج DNA در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند.

استخراج DNA و تکثیر نواحی ژنی: استخراج DNA به روش ریدر[11] و برودا[12] (31) با اندکی تغییر (32) انجام شد. به‌منظور تکثیر حدود 1200 جفت باز از نواحی 18S، ITS1، 5.8S، ITS2 و 28S مربوط به rDNA هسته‌ای از آغازگر‌های عمومی ITS1 (33) و NL4 (34) و برای تکثیر حدود 700 جفت‌ باز از ژن بتاتوبولین از جفت آغازگر اختصاصی T1 (35) و tub4Rd (36) استفاده شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از ترموسایکلر مدل Biometra و Biorad انجام شد. برای 50 میکرولیتر مخلوط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، 5 میکرولیتر بافر 10x Taq buffer، 4 میکرولیتر MgCl2 (25 میلی‌مولار)، 2 میکرولیتر آغازگر مستقیم (10 میکرومولار)، 2 میکرولیتر آغازگر معکوس (10 میکرومولار)، 2 میکرولیتر از مخلوط 5/2 میکرومولار هرکدام از dNTP‌ها، 6/0 میکرولیتر آنزیم (5 واحد‌بر‌میکرولیتر) Taq DNA Polymarase (GenBio، کرۀ جنوبی)، 5/2 میکرولیتر DNA الگو (حدود 500 نانوگرم) و 9/31 میکرولیتر آب مقطر دوبار تقطیر‌شده استفاده شد. در تکثیر با هر جفت آغازگر، مخلوط واحدی برای تمام نمونه‌ها از مواد موردنیاز (به‌غیر‌از DNA الگو) روی یخ ساخته، با ورتکس مخلوط و سپس در میکروتیوب‌های استریل تقسیم شد؛ سپس، DNA الگو به هرکدام از میکروتیوب‌ها اضافه شد. برنامۀ حرارتی واکنش زنجیره‏ای پلیمراز شامل یک مرحله‏ واسرشته‏سازی اولیه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه، 35 چرخۀ تکراری (شامل یک مرحلۀ 30 ثانیه‏ای در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد، 30 ثانیه‏ای در دمای 51 تا 56 درجۀ سانتی‌گراد برای ITS و 50 تا 55 درجۀ سانتی‌گراد برای tub2 و 90 ثانیه‏ای در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد) و یک مرحلۀ طویل‌شدن نهایی در 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسیکلر (مدل MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler) بود. محصولات PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز بررسی شدند.

.خالص‏سازی محصولات PCR، توالی‌یابی و تجزیه‌وتحلیل توالی‌ها: تعداد 9 نمونه‌ به روش استخراج از ژل توسط شرکت ماکروژن (Humanizing Genomics, Macrogen, South Korea) خالص‌سازی و سپس با آغازگرهای رفت و برگشت توالی‌یابی شدند. محصولات PCR مربوط به 8 نمونه بدون انجام خالص‌سازی توسط شرکت نرگس (اهواز) توالی‌یابی شدند. توالی‏های به‌دست‌آمده از هر ژن با نرم‏افزار BioEdit v. 7.0.9.0 (37) ویراستاری و خوانش‏های پیش‏رو و معکوس با نرم‌افزار DNA Baser Sequence Assembeler v4 (www.DnaBaser.com) مونتاژ شدند. توالی‏ها‌ با الگوریتم BLASTn و تجزیه‌وتحلیل تبارشناسی (الگوریتم درست‌نمایی بیشینه) با توالی‌های مربوط به سویه‌های تیپ یا شناخته‌شده با نرم‌افزار MEGA 6 (38) مقایسه شدند.

 

نتایج.

در پژوهش حاضر، 40 نمونه از 9 گونه گیاه زینتی با نشانه‌های پوسیدگی ریشه، لکه‌برگی و شانکر ساقه از مناظر شهری اهواز جمع‌آوری شدند و پس‌از کشت روی PDA، 12 جدایۀ قارچی متعلق به خانوادۀ Chaetomiaceae به دست آمدند (جدول 1). پس‌از بررسی‌های ریخت‌شناسی و تبار‌شناسی مولکولی (شکل 1)، جدایه‌ها در سطح گونه شناسایی شدند و شامل گونه‌های Chaetomium olivaceum، C. ascotrichoides، C. globosum، C. rectangulareوAmesia atrobrunnea بودند. جزئیات شناسایی این گونه‌ها و شرح ریخت‌شناسی آنها در ادامه به تفکیک آورده شده است.

بررسی مولکولی جدایه‌های مورد‌مطالعه: واکنش زنجیره‌‌‌ای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگر عمومی ITS-F و NL4-Rبرای تکثیر نواحی ITS و بخش‌هایی از 28S(D1/D2) به تولید قطعه‌های تکثیری حدود 1200 جفت بازی برای تمام جدایه‌ها منجر شد. تکثیر بخش‌هایی از ژن tub2 با استفاده از جفت آغازگرهای T1 و Btub4Rd به ظهور باندهای حدود 700 جفت بازی برای جدایه‌های ChaetomiumوAmesia در ژل آگارز منجر شد. توالی‌های تولید‌‌شده در مطالعۀ حاضر با شماره‌های دسترسی یادشده در جدول 2 در بانک ژن NCBI ثبت شدند. یک بررسی تبارشناسی مبتنی بر ناحیۀ tub2 و با استفاده از الگوریتم درست‌نمایی بیشینه انجام شد (شکل 1) که در آن، گونه‌های بررسی‌شده با سویه‌های تیپ یا شناخته‌شدۀ خود همراه و ازنظر تبارشناسی از سایر گونه‌ها متمایز شدند.

بررسی ریخت‌شناسی و مولکولی گونه‌های بررسی‌شده

1- گونۀ Chaetomium olivaceum Cooke & Ellis, Grevillea 6(39): 96(1878).

1-1- ریخت‌شناسی گونۀ C. olivaceum (جدایۀ SCUA-C1) (شکل 2): قطر پرگنه روی PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از هشت روز برابر 49 میلی‌متر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتک‌های پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ بیرنگ و منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوه‌ای تیره در مرکز و حاشیۀ منظم به رنگ کرم مشاهده می‌شود. میسلیوم‌ها به‌شکل کرکی و بی‌رنگ و آسکوکارپ‌ها به‌سمت مرکز به‌طور فشرده‌تر رشد می‌کنند. موهای اطراف آسکوکارپ‌ها در محیط PDA به رنگ خاکستری مایل به زیتونی هستند. سطح زیرین پرگنه به رنگ قهوه‌ای تیره با حاشیۀ روشن است.

آسکوکارپ‌ها به‌شکل انفرادی یا تجمع زنجیرمانند در سطح محیط تشکیل می‌شوند و رنگ آنها با افزایش سن تیره‌تر می‌شود. آسکوکارپ‌ها عمدتاً تخممرغی‌شکل و به رنگ قهوه‌ای تیره با موهای فراوان در دو سمت طول خود مشاهده می‌شوند؛ ابعاد آسکوکارپ‌ها 304-152(-103)×(407-)347-212(-6/186) میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 43/44 ±240×29/55±85/280 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 99/252-46/227×73/296-97/246 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوه‌ای روشن، کروی تا لیمویی‌شکل و در دو سمت تخت هستند؛ اندازۀ آنها (64/12)-24/11-62/5×33/14-83/9 میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 61/1±01/9×32/1±34/12 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 46/9-56/8×71/12-97/11 میکرومتر قرار دارند.

1-2- نتایج مولکولی گونۀ C. olivaceum: نتایج جستجویبلاست جدایۀSCUA-C1C. olivaceumنشان دادند توالی ITS این جدایه با سویه‌های شناخته‌شده‌ای از گونه‌های C. cucumericola، C. globosum و C. olivaceum دارای 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 نیز مشخص کرد جدایه‌های مطالعه‌شده (SCUA-C1، SCUA-L2 و SCUA-S8) با سویۀ شناختهشدۀ C. olivaceumCGMCC 3.12878 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارند. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایه‌های مطالعه‌شده با سویه‌های شناخته‌شدۀ C. olivaceumCGMCC 3.12878 و C. olivaceumCGMCC 3.9465 خوشهبندی شدند و شاخه‌ای تکاملی با ارزش بوت‌استراپ 100 درصد ایجاد کردند.


 

 

شکل 1- درخت تبارشناسی جدایه‌های بررسی و انتخاب‌شده از بانک ژن که در تجزیه‌وتحلیل درست‌نمایی بیشینه بر اساس توالی tub2 با استفاده از مدل K2+G+I به دست آمده است. درصد تکرار شاخه‌های تکاملی در 1000 بار نمونه‌گیری کاذب (بوت‌استراپ) در محل ریشۀ شاخۀ تکاملی درج شده است. نمونه‌های بررسی‌شده با دایرۀ توپر نشان داده شده‌اند. درخت تبارشناسی با گونۀ Humicola grisea ریشه‌دار شده است.

جدول 2- شماره‌های دسترسی توالی‌های نوکلئوتیدی ثبت‌شده در بانک ژن NCBI مربوط به جدایه‌های بررسی‌شده

شمارۀ دسترسی توالی‌ها در بانک ژن

نام جدایه

نام گونه

tub2

28S

ITS

MN417754

MN402716

MN402762

SCUA-K3

Chaetomium rectangulare

MN417746

-

-

SCUA-CO1

Amesia atrobrunnea

MN417750

MN402714

MN402760

SCUA-C1

C. olivaceum

MN417753

-

-

SCUA-S8

C. olivaceum

MN417751

-

-

SCUA-L2

C. olivaceum

MN417747

-

-

SCUA-C3

C. globosum

MN417749

MN402717

MN402763

SCUA-Neae

C. globosum

MN417748

MN402715

MN402761

SCUA-D1

C. globosum

MN417755

-

-

SCUA-AT10

C. ascotrichoides

 


 

شکل 2- ریخت‌شناسی گونۀ C. olivaceum (جدایۀ SCUA-C1)؛ A. همراه با نشانه‌های لکه‌برگی و سوختگی مشاهده‌شده در گیاه Zinnia elegans، B. پرگنۀ هشت‌روزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ، D. آسکوسپورها

 


2- گونۀ Chaetomium ascotrichoidesCalviello, Revta Mus. argent. Cienc. nat., B. Aires, Bot.: 372 (1972).

2-1- ریخت‌‌شناسی گونۀ C. ascotrichoides (جدایۀ SCUA-AT10) (شکل 3): قطر پرگنه‌ها روی PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت هشت روز برابر 40 میلی متر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتک‌های پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ منظم است و با افزایش سن به رنگ کرم تیره با حاشیۀ نامنظم مشاهده می‌شود. آسکوکارپ‌ها به‌سمت مرکز به‌طورفشردهتر ایجاد می‌شوند. موهای اطراف آسکوکارپها در محیط PDA به رنگ زیتونی هستند. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ زرد با حاشیۀ بی‌رنگ و نا‌منظم مشاهده می شود. میسلیوم‌ها به‌شکل کرکی و سفیدرنگ رشد می‌کنند.

آسکوکارپ‌ها به‌شکل انفرادی یا تجمع زنجیر‌مانند در سطح محیط‌کشت تشکیل می‌‌شوند و رنگ آنها با افزایش سن تیره‌تر می‌شود. آسکوکارپ‌ها عمدتاً تخم‌مرغی‌شکل هستند، اما اشکال کروی نیز بین آنها دیده می‌‌شوند و رنگ آنها قهوه‌ای تیره با موهای فراوان در یک انتهای خود است. ابعاد آسکوکارپ‌ها (315-)250164(-130)×(378-)320184(-152) میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 69/38±38/213×75/55±08/262 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 27/22450/202×76/27740/246 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوه‌‌ای روشن تا قهوهای تیره، کروی تا بیضوی با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها 83/9-43/8×64/12-83/9 میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 62/0±006/9×43/0± 14/11 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 20/9-80/8×28/11-001/11 میکرومتر قرار دارند.

2-2- نتایج مولکولی گونۀ C. ascotrichoides:نتایج جستجوی بلاست جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 نشان دادند توالی تکثیری tub2 این جدایه با سویه‌های تایپ شناخته‌شده از گونه‌های C. ascotrichoides و C. madrasense دارای 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 با سویه‌های تایپ C. ascotrichoides CGMCC 311378، C. ascotrichoides CBS 11083 و C. madrasenseCGMCC 312880 خوشه‌بندی شد و یک شاخۀ تکاملی با ارزش بوتاستراپ 100 درصد ایجاد کردند. بررسی‌های ریخت‌شناسی این جدایه (داشتن موهای صاف در اطراف آسکوکارپ) مشخص کرد جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 از سویۀ تیپ C. madrasenseCGMCC 312880 متمایز است.

3- گونۀ Chaetomium globosumKunze ex Fr., Systema Mycologicum 3: 255 (1829) .

3-1- ریخت‌شناسی گونۀC. globosum (جدایۀSCUA-D1)(شکل 4): قطر پرگنه‌ها روی محیط PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد به‌مدت هشت روز برابر 84 میلی‌متر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتک‌های پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوه‌ای روشن تا قهوه‌ای تیره با حاشیۀ بی‌رنگ و منظم مشاهده می‌شود. آسکوکارپ‌ها از مرکز به‌سمت حاشیۀ پرگنه به‌طور فشرده‌تر ایجاد می‌شوند. موهای اطراف آسکوکارپ‌ها در محیط PDA به رنگ خاکستری است. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ نارنجی تا قهوه‌ای روشن دیده می‌شود. میسلیوم‌ها به‌شکل کرکی و بی‌رنگ رشد می‌کنند.

آسکوکارپ‌ها به‌شکل انفرادی یا تجمع زنجیر‌مانند در سطح محیط‌کشت تشکیل می‌شوند و رنگ آنها با افزایش سن تیره‌تر می‌شود. آسکوکارپ‌ها به رنگ قهوه‌ای تیره و به‌شکل کروی یا نیمه‌کروی با موهای فراوان و فنری‌شکل در اطراف خود مشاهده می‌شوند. ابعاد آسکوکارپ‌ها (233-)198-5/120(-4/81)×(281-)228-152(-6/108) میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 04/27±60/163×60/28±67/195 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 37/17184/155×89/20346/187 میکرومتر قرار دارند.آسکوسپورها به رنگ قهوه‌ای روشن، کروی یا لیمویی‌شکل با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها 71/8-9/5×24/11-43/8 میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 51/0±13/8× 79/0±32/10 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 28/8-99/7×55/10-10/10 میکرومتر قرار دارند.

 

 

 

شکل 3- ریخت‌شناسی گونۀ C. ascotrichoides (جدایۀ SCUA-AT10)؛ A.همراه با نشانه‌های پوسیدگی ساقۀ مشاهده‌شده در گیاه Petunia hybrida، B. پرگنۀ هشت‌روزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ. D. آسکوسپورها

 

 

3-2- نتایج مولکولی گونۀ C. globosum: نتایج جستجوی بلاست جدایۀ C. globosumSCUA-D1 نشان دادند توالی ITS این جدایه دارای 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی با سویۀ شناخته‌شدۀ C. globosumCBS 160.62است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 نیز مشخص کرد جدایه‌های مطالعه‌شده (SCUA-D1،SCUA-C3 و SCUA-Neae) با سویه‌های شناخته‌شده از گونۀ C. globosum دارای 98 تا 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، این جدایه‌ها (SCUA-D1، SCUA-C3 و SCUA-Neae) با سویه‌های C. globosumCBS 160.62 و C. globosum ChL-K14 خوشه‌بندی شدند و شاخۀ تکاملی معتبری با ارزش بوت‌استراپ 98 درصد ایجاد کردند.

 

 

 

شکل 4- ریخت‌شناسی گونۀ C. globosum (جدایۀ SCUA-D1)؛ A. همراه با نشانه‌های لکه‌برگی مشاهده‌شده در گیاه Zinnia elegans، B. پرگنۀ هشت‌روزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکواسپورها، D. آسکوکارپ

 


4-گونۀChaetomium rectangulareAsgari & Zare, Mycologia 103 (4): 872 (2011).

4.-1- ریخت‌شناسی گونۀ C. rectangulare (جدایۀSCUA-K3) (شکل 5): قطر پرگنه‌ها روی محیط‌کشت PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد به‌مدت هشت روز برابر 55 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در سطح رویی تشتک‌های پتری زرد با حاشیۀسفید و منظم و در سطح پشتی به رنگ زرد با حاشیۀ بی‌رنگ و منظم مشاهده می‌شود. آسکوکارپ‌ها پس‌از حدود سه هفته در سطح محیط تشکیل می‌شوند.

اندام‌هایی که شبیه آسکوکارپ و بدون آسکوسپور هستند (شبه‌آسکوکارپ‌ها) به‌شکل انفرادی پس‌از حدود سه هفته در سطح محیط تشکیل میشوند. شبه‌آسکوکارپ‌ها به رنگ قهوه‌ای تیره و شکل کروی یا نیمه‌کروی با موهای صاف و ضخیم در اطراف خود مشاهده می‌شوند. ابعاد شبه‌آسکوکارپ (35/53-)88/41-94/20×(35/52-)88/41-41/31(-94/20) میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 87/8±72/31×1/9±42/38 میکرومتر (بر اساس 50 عدد شبه‌آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 24/34-20/29×02/41-82/35 میکرومتر قرار دارند. شبه‌آسکوکارپ‌های عقیم و بدون آسکوسپور تشکیل می‌شود..

 

4-2- نتایج مولکولی گونۀ C. rectangulare:نتایج جستجوی بلاست جدایۀC. rectangulare SCUA-K3 نشان دادند توالی ITS این جدایه با سویه‌های شناخته‌شدۀ‌ C. rectangulareIRAN1641C و C. rectangulareCBS 126778 دارای 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 این جدایه مشخص کرد با سویۀ شناخته‌شده‌ای از گونۀ C. rectangulareChL-K17 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀC. rectangulare SCUA-K3 با سویه‌های C. rectangulareChL-A34وC. rectangulare ChL-K17خوشه‌بندی شدند و یک شاخۀ تکاملی معتبر با ارزش بوت‌استراپ 100 درصد ایجاد کردند.

 

 

 

شکل 5- ریخت‌شناسی گونۀ C. rectangulare(جدایۀ SCUA-K3)؛ A. همراه با نشانه‌های لکه‌برگی مشاهده‌شده در گیاه Dracaena Compacta، B. پرگنۀ هشت‌روزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C و D. ‌آسکوکارپ

 


5- گونۀAmesia atrobrunnea(L.M. Ames) X. Wei Wang & Samson, Studies in Mycology 84: 158 (2016)

5-1- ریخت‌شناسی گونۀ A. atrobrunnea (جدایۀ SCUA-CO1)(شکل 6): قطر پرگنه‌ها روی محیط‌کشت PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت هشت روز برابر 41 میلی‌متر است. در مراحل اولیۀ رشد، رنگ پرگنه در سطح رویی تشتک‌های پتری سفید با حاشیۀ بی‌رنگ و منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوه‌ای مایل به زیتونی با حاشیۀ سفید و منظم مشاهده می‌شود.

آسکوکارپ‌ها در مرکز به‌طور فشرده‌تر ایجاد می‌شوند و موهای اطراف آنها قهوه‌ای‌رنگ هستند. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ زیتونی دیده می‌شود. میسلیوم‌ها به رنگ سفید رشد می‌کنند. آسکوکارپها به‌شکل انفرادی یا تجمع زنجیر‌مانند در سطح یا فرو‌رفته در محیط تشکیل می‌شوند و رنگ آنها با افزایش سن تیرهتر میشود. آسکوکارپ‌ها به رنگ قهوهای ‌تیره و به‌شکل کروی یا نیمهکروی با موهای صاف و ضخیم در اطراف خود مشاهده می‌‌شوند. ابعاد آسکوکارپ‌ها 126-70(-63)×(155-)140-96(-87) میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 04/18±21/95×8/15±07/115 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 34/100-09/90×51/119-62/110 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوه‌ای روشن تا قهوه‌ای تیره و بادامی‌شکل با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها (86/7-)62/5-21/4×24/11-7 میکرومتر و میانگین اندازه‌گیری‌ها 40/0±58/5×94/0±41/9 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازه‌گیری‌ها در بازۀ اطمینان 69/5-47/5×67/9-16/9 میکرومتر قرار دارند.

5-2- نتایج مولکولی گونۀA. atrobrunnea: نتایج جستجوی بلاست جدایۀA. atrobrunneaSCUA-CO1 نشان دادند توالی تکثیری ناحیۀ tub2 این جدایه با سویه‌های شناخته‌شدۀ A. atrobrunneaCBS 379.66 و CBS 250.75 A. atrobrunnea به‌ترتیب 98 و 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀ A. atrobrunneaSCUA-CO1 با سویۀ تایپ CBS 379.66 A. atrobrunnea خوشهبندی شد و یک شاخۀ تکاملی معتبر با ارزش 100 درصد ایجاد کرد.

 

 

 

شکل 6- ریخت‌شناسی گونۀ A. atrobrunnea (جدایۀ SCUA-CO1)؛ A. همراه نشانه‌های لکه‌برگی مشاهده‌شده در گیاه Dahlia sp.، B. پرگنۀ هشت‌روزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ، D. آسکواسپورها


بحث

در مطالعۀ حاضر، گونه‌های Chaetomium olivaceum، C. ascotrichoides، C. globosum، C. rectangulareو Amesia atrobrunnea از روی گیاهان زینتی علفی جداسازی و شناسایی شدند. گونۀ C. olivaceumرانخستین‌بار کوک[xiii] و الیس[xiv] (39) توصیف کردند؛ این گونه تاکنون از کود گاو (هند)، کود شتر، خاک (چین) (24) و کنجد (Sesamum indicum) در ایران (40) جداسازی و شناسایی شده است. گونۀ C. ascotrichoides را نخستین‌بار کالویلو و همکاران (1972) توصیف کردند (24)؛ پیش‌از‌آن، این گونه با نام‌های C. gibberosporum، C. madrasense وC. heterosporum معرفی شده بود. گونۀ یادشده از پنبه (آرژانتین)، پشم گوسفند، گوسفند مرده (چین) و خاک (اسرائیل) گزارش شده است (24). گونۀ C. globosum را نخستین‌بار کنز در 1829 توصیف کرد (24). گونۀ یادشده از کمپوست (آلمان)، کتاب کپک‌زده (هلند)، کاغذ، خاک رس و پنبه (آمریکا)، باغ گیاه‌شناسی (لهستان) و ساقۀ از‌بین‌رفتۀ گیاه هرز سازو (مجارستان) جداسازی شده است (24)؛ همچنین در ایران از گیاه زردتاغ (Haloxylon ammodendron)، سفیدتاغ (Haloxylon persicum) در گنبد و سبزوار، ذرت (Zea mays) در کرج، ساری و مغان، سویا (Glycine max) و پنبه (Gossypium hirsutum) گزارش شده است (40). گونۀ C. rectangulare را نخستین‌بار عسگری و زارع (23) از دانۀ گندم (Triticum aestivum) در هادی‌شهر (آذربایجان غربی) و برگ‌های جو (Hordeum vulgare) در سلماس (آذربایجان شرقی) گزارش و توصیف کردند؛ این گونه از کود حیوانی در چین نیز جداسازی شده است (24). گونۀ Amesia atrobrunnea را نخستین‌بار وانگ و همکاران (27) بیمارگر انسانی معرفی کردند. چندین جدایه از این گونه باعث عفونت سیستمیک و عمیق در انسان می‌شوند. نام پیشین این گونه، C. atrobrunneum L.M. Amesاست که از مواد و تجهیزات نظامی گزارش شده است (41)؛ همچنین، این گونه از مواد کپک‌زده و هوا در ایسلند و هند (27) و از گیاه جو (Hordeum vulgare) در آذربایجان شرقی ایران جداسازی شده است (40).

 

نتیجه‌گیری

همراهی گونۀ C. olivaceum روی گیاهان زینتی آهار، لادن و جعفری، گونۀ C. ascotrichoides روی گیاه زینتی اطلسی، گونۀ C. globosum روی گیاهان زینتی آهار و اختر، گونۀ C. rectangulare روی گیاه زینتی کمپکت و گونۀ A. atrobrunnea روی گیاه زینتی کوکب برای نخستین‌بار در مطالعۀ حاضر گزارش شد؛ همچنین بر اساس دانش ما، این نخستین گزارش از گونۀ C. ascotrichoides در ایران است. شناسایی و توصیف گونه‌های دو جنس Chaetomium و Amesia از روی گیاهان موردبررسی به شناسایی بیشتر میکوبیوتای ایران و میزبان‌های آنها کمک می‌کند.

 

سپاسگزاری

از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت مالی از پژوهش حاضر سپاسگزاری می‏‌‌‌‌‌شود.

 
 

(1) Gonianakis M., Neonakis I., Darivianaki E. Airborne Ascomycotina on the island of crete: seasonal patterns based on an 8-year volumetric survey. Aerobiologia 2005; 21: 69-74.

 

(2) Apetrei IC., Draganesc GE., Popescu IT. Possible cause of allergy for the librarians: books manipulation and ventilation as sources of fungus spores spreading. Aerobiologia 2009; 25: 159-166.

(3) Polizzi V., Delmulle B., Adams A., Moretti A., Susca A., Picco AM. JEM spotlight: Fungi, mycotoxins and microbial volatile organic compounds in mouldy interiors from water-damaged buildings. Journal of Environmental Monitoring 2009; 11: 1849-1858.

(4) Mason S., Cortes D., Horner WE. Detection of gaseous effluents and byproducts of fungal growth that affect environments (RP-1243). Heating, Ventilation and Air Conditioning (HVAC) Systems Research 2010; 16: 109-121.

(5) Andersen B., Frisvad JC., Søndergaard I., Rasmussen IS., Larsen LS. Associations between fungal species and water-damaged building materials. Applied and Environmental Microbiology 2011; 77: 4180-4188.

(6) Miller JD., McMullin DR. Fungal secondary metabolites as harmful indoor air contaminants: 10 years on. Applied Microbiology and Biotechnology 2014; 98: 9953-9966.

(7) Ames LM. A monograph of the Chaetomiaceae. Series 2. Washington D. C.: U. S. Army Research and Development; 1961.

(8) von Arx JA., Guarro J., Figueras MJ. The Ascomycete genus Chaetomium. Beihefte Zur nova Hedwigia 1986; 84: 1-162.

(9) Kunze G., Schmidt JK. Mykologische Hefte. vol. 2. Leipzig: Vossische Buchhandlung; 1817.

(10) Corda ACJ. Icones Fungorum Hucusque Cognitorum. vol. 4. Prague: Calve JG.; 1840.

(11) Fries E. Summa vegetabilium scandinaviae. Stockholm and Leipzig: Typographia Academica; 1849.

(12) Zopf W. Zur Entwicklungsgeschichte der Ascomyceten: Chaetomium. Nova Acta der Kaiserlich Leopoldinisch-Carolinisch Deutschen Aakademie der Naturforscher 1881; 42: 199-292.

(13) Chivers AH. A monograph of the genera Chaetomium and Ascotricha. Memoirs of the Torrey Botanical Club 1915; 14: 155-240.

(14) Skolko AJ., Groves JW. Notes on seed-borne fungi VII. Chaetomium. Canadian Journal of Botany 1953; 31: 779-809.

(15) Udagawa S. A taxonomic study on the Japanese species of Chaetomium. The Journal of General and Applied Microbiology 1960; 6: 223-251.

(16) Seth HK. A monograph of the genus Chaetomium. Beihefte Zur nova Hedwigia 1970; 37: 1-133.

(17) Fuckel L. Symbolae mycologicae. Beitrage zur Kenntniss der Rheinischen Pilze. Jahrbucher des Nassauischen Vereins fur Naturkunde 1870; 23-24: 1-459.

(18) Sorgel G. Zum problem der trennung von arten bei pilzen, dargestellt am beispiel der ascomycetengattung Chaetomium. Archives of Microbiology 1960; 36: 51-66.

(19) Dreyfuss M. Taxonomische untersuchungen innerhalb der gattung Chaetomium. Sydowia 1976;28: 50-133.

(20) Millner PD., Motta JJ., Lentz PL. Ascospores, germ pores, ultrastructure, and thermophilism of Chaetomium. Mycologia 1977; 69: 720-733.

(21) von Arx JA., Dreyfuss M., Muller E. A reevaluation of Chaetomium and Chaetomiaceae. Persoonia 1984; 12: 169-179.

(22) Greif MD., Stchigel AM., Miller AN., Huhndorf SM. A re-evaluation of genus Chaetomidium based on molecular and morphological characters. Mycologia 2009; 101: 554-564.

(23) Asgari B., Zare R. The genus Chaetomium in Iran, a phylogenetic study including six new species. Mycologia 2011; 103: 863-882.

(24) Wang XW., Lombard L., Groenewald JZ., Li J., Videira SI., Samson RA., Liu XZ., Crous PW. Phylogenetic reassessment of the Chaetomium globosum species complex. Persoonia 2016a; 36: 83-133.

(25) Stchigel AM., Guarro J., Jato V., Aira MJ. Two new species of Chaetomidium (Sordariales). Studies in Mycology 2004; 50: 215-220.

(26) Greif MD., Currah RS. Development and dehiscence of the cephalothecoid peridium in Aporothielavia leptoderma shows it belongs in Chaetomidium. Mycological Research 2007; 111: 70-77.

(27) Wang XW., Houbraken J., Groenewald JZ., Meijer M., Andersen B., Nielsen KF., Crous PW., Samson RA. Diversity and taxonomy of Chaetomium and chaetomium-like fungi from indoor environments. Studies in Mycology 2016b; 84: 145-224.

(28) von Arx JA. On Achaetomium and a new genus Subramaniula. Proceedings of the Indian Academy of Science (Plant Science) 1975; 94: 341-345.

(29) Alexopoulos CJ, Beneke ES. Laboratory manual for introductory mycology. Minneapolis: Burgess Pub. Co; 1962.

(30) Beneke ES., Rogers AL. Medical mycology and human mycoses. Belmont: Star Publishing Company; 1996.

(31) Raeder U., Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology 1985; 1: 17-20.

(32) Ahmadpour SA., Mehrabi-Koushki M., Farokhinejad R. Neodidymelliopsis farokhinejadii, a new fungal species from dead branches of trees in Iran. Sydowia 2017; 69: 171-182.

(33) White TJ., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA., Gelfand DH., Shinsky JJ., White TJ., editors. PC Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press; 1990: 315-322.

(34) O’Donnell K. Fusarium and ITS near relatives. In: Reynolds DR., Taylor JW., editors. The fungal jolomorph: mitotic, meiotic and pleomorphic speciation in fungal systematics. Wallingford: CAB International; 1993: 225-233.

(35) O’Donnell K., Cigelnik E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Molecular Phylogenetics and Evolution 1997; 7: 103-116.

(36) Groenewald JZ., Nakashima C., Nishikawa J., Shin HD., Park JH., Jama AN., Groenewald M., Braun U., Crous PW. Species concepts in Cercospora: spotting the weeds among the roses. Study in Mycology 2013; 75: 115-170.

(37) Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 1999; 41: 95-98.

(38) Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 2013; 30: 2725-2729.

(39) Cooke MC., Ellis JB. New Jersey fungi. Grevillea 1878; 6: 81-96.

(40) Ershad D. Fungi of Iran. 3rd ed. Tehran: Iranian research institute of plant protection; 2009.

(41) Ames LM. New cellulose destroying fungi isolated from military material and equipment. Mycologia 1949; 41: 641.