شناسایی مولکولی گونه‌‌های باسیلوس مقاوم به سرب و محرک رشد گیاه جداسازی شده از خاک حاوی سرب

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه علوم کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه پیام نور، اصفهان، ایران

2 گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهزکرد، ایران

3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران

4 گروه زراعت، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: آلودگی خاک به فلزات سنگین از جمله سرب، یکی از مهم‌ترین مخاطرات زیست‌محیطی و عامل مهمی در به هم خوردن تعادل و توازن طبیعت می‌باشد. زیست پالایی توسط باکتری‌های مقاوم یکی از روش‌های مناسب برای حذف این فلزات سنگین به شمار می‌رود که از مزایای دیگری از جمله سازگاری با محیط زیست، هزینه اندک و تحریک رشد گیاه برخوردار است. پژوهش حاضر با هدف جداسازی و شناسایی ریزوباکترهای مقاوم به سرب از خاک ریزوسفری حاوی سرب با سابقه دراز مدت بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی، آزمون‌های بیوشیمیایی و توالی ژن 16SrRNA انجام شد.
مواد و روش: نمونه‌برداری از ریزوسفر گیاهان در خاک مورد نظر انجام شد. پس از رقیق‌سازی نمونه‌ها بر سطح محیط کشت آگار لوریا - برتانی (LB) اصلاح شده، کلونی‌های رشد یافته، بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی، آزمون‌های بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفتند و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالی‌یابی ژن 16SrRNA انجام شد.
نتایج: در این مطالعه، پنج سویه از ریزوباکترهای مقاوم به سرب جداسازی و شناسایی شد. تمامی سویه‌ها قابلیت تحمل غلظت‌های بالای فلز سرب (26/3 تا 09/5 میلی مولار) را نشان دادند، علاوه بر این تمامی نمونه‌ها از توانایی تولید ایندول استیک اسید (88/7 تا 58/38 میلی‌گرم بر لیتر) برخوردار بودند.
بحث و نتیجه گیری: استفاده از این سویه‌های متحمل به سرب در تلقیح گیاهان بسیار انباشتگر، می‌تواند در بهبود گیاه‌پالایی از خاک‌های آلوده به سرب موثر واقع شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Molecular identification of lead-resistant plant growth promoting Bacillus species isolated from lead-contaminated soil

نویسندگان [English]

  • Mehrana Koohi Dehkordi 1
  • Masoumeh Yousefzadeh 2
  • Roholah Hemmati 3
  • Abdolrazagh Danesh Shahraki 4
1 Department of Agricultural Science, Faculty of Agriculture, Payame Noor University, Isfahan, Iran
2 Department of Genetics, Faculty of Basic Science, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
3 Department of Bilology, Faculty of Basic Science, Shahrekord University, Shahrekord, Iran.
4 Department of َAgronomy, Faculty of Agriculture, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
چکیده [English]

Introduction: Soil contamination by heavy metals, including lead, is one of the most important environmental hazards and a major factor in the ecological collapse. Bioremediation by resistant bacteria is one of the suitable methods for the removal of these heavy metals, which has other advantages, including environmental compatibility, low cost and stimulation of plant growth. The present study was conducted to isolate and identify lead-resistant rhizobacteria from long-term lead-contaminated soil based on morphological characteristics, biochemical tests and sequencing of 16SrRNA gene.
Materials and Methods: The rhizosphere samples were collected and diluted on the modified LB media.The colonies were studied based on morphological characteristics, biochemical tests, and ultimately molecular identification based on sequencing of the 16SrRNA gene.
Results: Five isolates of lead-resistant Rhizobacteria were identified in this study. All strains showed the ability to tolerate high concentrations of lead (3.26 to 5.9 mM), moreover, all samples have the ability to produce indole acetic acid (88.87 to 38.58 mgl-1).
Discussion and Conclusion: Inoculation of hyperaccumulator plants with these lead tolerant rhizobacteria can be effective in improvement of the phytoremediation efficiency in lead contaminated soils.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lead-resistant rhizobacteria
  • Plant Growth Regulators
  • Minimum inhibitory concentration
  • IAA
  • 16SrRNA

مقدمه

آلودگی با فلزات سنگین یکی از مشکلات زیست‌محیطی به شمار می‌آید که سبب آلوده‌شدن زنجیرۀ غذایی و به‌خطر‌افتادن سلامت جوامع انسانی می‌شود (1). فلزات سنگین به عناصری مانند سرب، کادمیم،کروم، مس، جیوه، نیکل و روی اطلاق می‌شود که جرم اتمی آنها از 40 گرم و جرم حجمی مخصوص آنها از 5 گرم‌بر‌سانتی‌مترمکعب بیشتر است (2 و 3). باوجود سمی‌بودن درخور توجه این فلزات، بسیاری از ریزموجودات مقاوم به این آلاینده‌ها سازوکارهای مقاومتی متنوعی را برای کاهش شدت تنش فلزات سنگین توسعه داده‌اند. آنها با سازوکارهایی نظیر تجمع یون‌های فلزی در سلول، تبدیل فلزات سنگین به شکل‌های دارای سمیت کمتر، پمپ‌کردن یون‌های فلزی به فضای خارج از سلول و رسوب آنها در بیرون از سلول، واجذب فلزات، اتصال در سطح سلول، استفاده از این فلزات به‌عنوان گیرندۀ نهایی الکترون در تنفس بی‌هوازی، تجزیۀ زیستی عوامل کلات‌ساز و دگرگونی زیستی به گونه‌های مقاوم با توانایی تحمل در حضور فلزات سمی تبدیل شده‌اند که برای کاهش آلودگی فلزات در محیط‌زیست استفاده می‌شوند (4 و 5).

روش‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی برای پالایش فلزات سنگین از مکان‌های آلوده استفاده شده‌اند که در این میان، روش‌های فیزیکی و شیمیایی پرهزینه‌اند و مقرون‌به‌صرفه نیستند؛ در‌حالی‌که زیست‌پالایی توسط باکتری‌ها، روشی مقرون‌به‌صرفه و ساده‌ و فناوری نوینی به شمار می‌آید که برای پالایش آلودگی‌ها از خاک مدنظر قرار گرفته و مطالعه شده است (6-8). باکتری‌های ریزوسفری که بر سطح یا درون ریشه‌های گیاه کلنی تشکیل می‌دهند و رشد گیاه میزبان را ارتقا می‌بخشند، ریزوباکترهای محرک رشد گیاه نامیده می‌شوند (9). پالایش تسهیل‌شدۀ فلزات سنگین توسط ریزوباکترهای محرک رشد گیاه، درحقیقت استفادۀ هم‌زمان از گیاهان و ریزموجودات ریزوسفری وابسته به آنهاست که به‌طور طبیعی یا با تلقیح آگاهانۀ ریزموجودات ویژه رخ می‌دهد (10-12). مطالعه‌های انجام‌شده نشان می‌دهند این ریزموجودات ریزوسفری سمیت زیستی فلزات سنگین را از طریق سازوکارهای مختلف به حداقل می‌رسانند یا رشد گیاهان را در شرایط بروز تنش‌های محیطی نظیر غرقاب، بیماری‌زا‌های گیاهی، خشکی، شوری و غیره ارتقا می‌دهند (13). باکتری‌های ریزوسفری محرک رشد علاوه‌بر نقشی که در حفاظت گیاهان در برابر سمیت فلزات سنگین بر عهده دارند، می‌توانند از طریق روش‌های مختلف ازجمله تولید هورمون‌های رشدی مانند ایندول-3-استیک‌اسید (IAA) سبب حاصلخیزی خاک، افزایش بازدهی و رشد گیاه شوند (14). این ریزوباکترهای سودمند به‌علت برخورداری از صفت‌های چندگانه نظیر مقاومت به فلزات سنگین، تبدیل آنها به شکل‌‌های دارای سمیت کمتر و همچنین توانایی ارتقای رشد گیاهان از طریق سازوکارهای مختلف، یکی از مناسب‌ترین گزینه‌ها برای مطالعه‌های مربوط به زیست‌پالایی خاک‌های آلوده به فلزات سنگین محسوب می‌شوند (14).

سرب یکی از پایدارترین عناصر و گسترده‌ترین عنصر سنگین و سمی ازنظر انتشار در محیط‌زیست است و معمولاً جذب زیادی در خاک دارد (15). زیست‌تودۀ میکروبی، اسیدیتۀ خاک، دما و زمان ازجمله عوامل مهم در جذب سرب به شمار می‌آیند. این عنصر ازجمله عناصری است که حتی مقدار بسیار کم آن نیز آثار فیزیولوژیکی زیان‌‌آوری دارد (16). سرب باعث ازبین‌رفتن حاصلخیزی خاک، تغییر رشد گیاه و درنهایت کاهش عملکرد آن می‌شود؛ همچنین به‌علت تجمع در گیاهان و سمیت زیاد برای دام و انسان، آلاینده‌ای بسیار مهم شناخته می‌شود (17). تاکنون پژوهش‌های گسترده‌ای در زمینۀ مقاومت به سرب در باکتری‌های جداشده از محیط‌های طبیعی انجام شده است؛ برای نمونه، در پژوهش چیبوک[1] و اوبیورا[2] (18)، اشرف[3] و علی (19) و اسمجکاوولا [4]و همکاران (20)، حذف زیستی سرب توسط باکتری‌های مقاوم مطالعه شده است. کرات العین[5] و همکاران (7) نیز باکتری های مقاوم در برابر غلظت های زیاد سرب را شناسایی و گزارش کرده‌اند. موروتی[6] و همکاران (21) نیز 60 باکتری مقاوم به سرب را جداسازی و شناسایی و بر اساس آزمون کمترین غلظت بازدارندۀ رشد (MIC)، 6 جدایه را توانمندترین گونه‌ها در برابر سرب معرفی کرده‌اند.

باتوجه‌به اهمیت موضوع یادشده، جداسازی و شناسایی ریزوباکترهای بومی مقاوم به سرب و محرک رشد گیاه از خاک ریزوسفری گیاهان حاشیۀ معدن سرب و روی باما بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناختی، آزمون‌های بیوشیمیایی و تعیین توالی ژن 16S rRNA در پژوهش حاضر انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

جداسازی ریزوباکترهای مقاوم به سرب: معدن سرب و روی باما، سومین معدن بزرگ سرب و روی ایران، در منطقۀ ایرانکوه و در فاصلۀ 20 کیلومتری جنوب‌غربی استان اصفهان واقع شده است. سرب کل و سرب قابل‌جذب این معدن به‌ترتیب 375 و 39 میلی‌گرم‌بر‌کیلوگرم و اسیدیتۀ آن نیز 5/7 است. به‌منظور جداسازی باکتری‌های بومی از خاک ریزوسفری گیاهان غالب این منطقه، 3 تا 5 گیاه انتخاب و 3 نمونه از هر گیاه در نظر گرفته شد. اطراف بوته‌های مدنظر به فاصلۀ 20 سانتی‌متر خالی شد و ریشه‌های آنها از عمق صفر تا 20 سانتی‌متری خاک خارج شدند. خاک اضافی اطراف ریشه‌ها حذف شد و خاک چسبیده به ریشۀ گیاهان با قلم‌موی استریل از سطح ریشه‌ها به پلاستیک فریزر استریل انتقال یافت. نمونه‌ها به کمک فلاسک و در دمای 5 درجۀ سانتی‌گراد به آزمایشگاه منتقل شدند. حدود 1 گرم از مخلوط خاک جمع‌آوری‌شده به روش رقت‌های متوالی با سرم فیزیولوژی استریل رقیق شد و بر سطح محیط‌کشت لوریا- برتانی[7] (LB) آگار اصلاح‌شده حاوی 1 گرم گلوکز، 50 میلی‌گرم‌بر‌لیتر نیترات‌سرب و 500 میلی‌گرم‌بر‌لیتر قارچ‌کش سیکلوهگزامید توزیع و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد (22 و 23). کلنی‌های رشدیافته ازنظر ماکروسکوپی و میکروسکوپی ارزیابی، بر اساس شکل و رنگ کلنی تفکیک و با انتقال به محیط‌های جداگانه خالص‌سازی شدند.

شناسایی بیوشیمیایی باکتر‌ی‌های جداشده: شناسایی اولیۀ پنج کلنی خالص‌شده مطابق راهنمای سیستماتیک باکتری‌شناسی برگی[8] و بر اساس شکل، رنگ‌آمیزی گرم، تشکیل اسپور، تحرک، تولید آنزیم کاتالاز، همولیز محیط بلاد‌‌آگار، احیای نیترات، آزمون متیل رِد-وگس پروسکائور، آزمون سولفید- ایندول- تحرک و هیدرولیز نشاسته انجام شد (24).

شناسایی مولکولی و تحلیل فیلوژنتیک باکترهای جداسازی‌شده: باکتری‌های مطالعه‌شده به‌طور جداگانه در محیط LB مایع، در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت 180 دوردردقیقه به‌مدت 16 تا 20 ساعت در انکوباتور شیکردار کشت شدند. به‌منظور رسوب‌گیری از سانتریفیوژ به‌مدت 2 دقیقه در 12000 دوردردقیقه استفاده شد. استخراج DNA از رسوب باکتریایی با استفاده از کیت Cell DNA Isolation kit تهیه‌شده از شرکت Gene All انجام شد. تکثیر ژن 16S rRNA به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[9] (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی پیشرو و معکوس F27 و R1492 انجام و محصول PCR پس‌از تخلیص، به‌منظور تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره ارسال شد. توالی آغازگرهای استفاده‌شده به شرح زیر بود:.

Primer 27F

5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'

Primer 1492R

5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

.اجزای واکنش PCR شامل 5/2 میکرولیتر بافر X10، 5/1 میلی‌مولار Mgcl2، 2/0 میلی‌مولار dNTPs، 10 پیکومول از هریک از آغازگرهای پیشرو و معکوس، 75/0 میکرولیتر DNA ژنومی و 25/0 میکرولیتر آنزیم Polymerase Taq DNA بود که با آب مقطر استریل به حجم نهایی 25 میکرولیتر رسید. واکنش در شرایط واسرشت‌سازی اولیه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی ثانویه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه، اتصال در دمای 56 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 50 ثانیه، سنتز در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌‌مدت 90 ثانیه و مرحلۀ طویل‌شدن نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه با استفاده از دستگاه گرادیانت ترموسایکلر اپندورف انجام شد. درنهایت، محصول PCR به طول 1500 جفت باز الکتروفورز و پس‌از خالص‌سازی، توسط شرکت ماکروژن کره به‌شکل دوطرفه تعیین توالی شد. توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار آنلاین BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) با توالی‏های معتبر ثبت‌شده در پایگاه دادۀ NCBI مقایسه شدند و نزدیک‌ترین سویه بر اساس توالی ژن 16S rRNA و نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی انتخاب شد. به‌منظور بررسی ارتباط فیلوژنی میان سویه‌های جداسازی‌‌شده و ترسیم درخت فیلوژنی، هم‌ردیفی تمام توالی‌های 16S rRNA با نرم‌افزارClustal W انجام شد. درخت فیلوژنی با نرم‌افزار MEGA4 و الگوریتم Neibour-Joining (NJ) ترسیم (24) و اعتبار شاخه‏های درخت به کمک الگوریتم Bootstrap با 500 تکرار بررسی شد (25). توالی‌های به‌دست‌آمده از پژوهش حاضر در بانک ژنی NCBI ثبت شدند.

.تعیین حداقل غلظت بازدارندگی سرب (MIC) در ریزوباکترهای جداسازی‌شده: حداقل غلظت بازدارندگی سرب به روش افزایش تدریجی غلظت سرب سنجیده شد؛ به‌این‌ترتیب که در هر مرتبه، 50 میلی‌گرم‌بر‌لیتر (ppm50) سرب به محیط‌کشت اضافه شد. آزمون با غلظت ابتدایی 50 میلی‌گرم‌بر‌لیتر سرب آغاز شد و کلنی‌های باکتریایی که روی آخرین غلظت فلز سنگین درحال رشد بودند به محیط‌کشت حاوی غلظت بیشتر سرب منتقل شدند. غلظتی که باکتری‌های جداشده دیگر قادر به رشدکردن روی محیط‌کشت جدید نبودند، حداقل غلظت بازدارندگی برای آن باکتری ثبت شد (26).

.ارزیابی تولید ایندول-3-استیک‌اسید(IAA) در سویه‌های جداسازی‌شده: تولید ایندول-3-استیک‌اسید توسط باکتری‌های جداشده بر اساس روش گلیک‌من و دساکس[10] ارزیابی شد (27). بر اساس این روش، باکتری‌ها به‌طور جداگانه در 25 میلی‌لیتر محیط LB مایع در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد و با سرعت 150 دوردردقیقه کشت شدند؛ سپس نمونه‌ها سانتریفیوژ شدند و مقدار جذب هر نمونه در طول موج 600 نانومتر از طریق حل و معلق‌کردن رسوب‌ها در سرم فیزیولوژی استریل تقریباً تا 2/1 تنظیم شد. میزان 5 میلی‌لیتر از هر سوسپانسیون باکتریایی به 25 میلی‌لیتر محیط دورکین و فاستر[11] (DF) تلقیح شد. کشت‌های باکتریایی به‌مدت 72 ساعت در دمای 27 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت 175 دوردردقیقه قرار داده شدند. رسوب باکتریایی با سانتریفیوژ در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 15 دقیقه و با سرعت 11000 دوردردقیقه از محیط‌کشت جدا و 2 میلی‌لیتر از معرف سالکووسکی[12] به 1 میلی‌لیتر از مایع رویی بدون باکتری اضافه و محلول به‌مدت 25 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد؛ درنهایت، میزان جذب محلول در طول موج 535 نانومتر خوانده شد (28). به‌منظور تعیین مقدار ایندول-3-استیک‌اسید تولیدشده، منحنی استانداردی در غلظت‌های 5، 10، 15، 20، 30، 40، 60، 80، 100، 125 و 150 پی‌پی‌ام رسم شد (29). این آزمون سه بار تکرار شد.

 

نتایج

پنج ریزوباکتری بومی از ریزوسفر گیاهان موجود در معدن سرب و روی باما با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی جداسازی شدند. ویژگی‌های هریک از این ریزوباکتری‌ها در جدول 1 ارائه شده است.

به‌‌منظور شناسایی مولکولی هریک از ریزوباکتر‌های جداسازی‌شده، آغازگرهای اختصاصی ژن 16S rRNA استفاده شدند (شکل 1). پس‌‌از تعیین توالی ژن 16S rRNA و بررسی توالی‌های به‌دست‌آمده در مقایسه با توالی‌های معتبر موجود در بانک اطلاعاتی ژنوم (NCBI) از طریق نرم‌افزار BLAST، نزدیک‌ترین سویه‌ها با‌توجه‌به ویژگی‌های بیوشیمیایی مطالعه‌شده به شرح جدول 2 تعیین شدند و بیشترین و کمترین میزان شباهت به‌ترتیب 93/99 و 56/99 درصد بود.

نتایج پژوهش‌های انجام‌شده گویای اینست که میان تاکسون ریزوباکتری، جنس‌های Azospirillum، Pseudomonas و Bacillus ازجمله ریزموجودات ریزوسفری تجاری به شمار می‌آیند که به‌طور گسترده‌ بررسی شده‌اند (30). پنج گونۀ شناسایی‌شده در پژوهش حاضر نیز به جنس Bacillus تعلق دارند که با نتایج مشاهده‌های ریخت‌شناسی همخوانی دارد و این نتایج در بیشتر موارد با نتایج شناسایی بیوشیمیایی مشابهت دارند. در پژوهش‌های متعدد، گونه‌های جنس Bacillusبه‌عنوان ریزوباکتر‌های محرک رشد گزارش و نقش‌های دیگری نیز برای آنها مطرح شده‌اند؛ برای نمونه، Bacillus cereusدرتحرکفسفر در تلقیح با گیاه(31)،Bacillus subtilis در القای بیوسنتز مالیک‌اسید در ریشۀ برنج (32) و Bacillus amyloliquefaciens در القای تحمل به تنش‌های غیرزیستی در گیاه (33) و بهبود گیاه‌پالایی به‌منظور رویارویی با تنش مس (34) مؤثر بوده‌اند.

درخت فیلوژنی به‌منظور بررسی رابطۀ فیلوژنتیکی میان ریزوباکترهای شناسایی‌شده ترسیم شد (شکل 2). همان‌طور که مشاهده می‌شود، ریزوباکترها در دو شاخۀ اصلی گروه‌بندی شده‌اند: در گروه اول، گونه‌های B. subtilis، B. amyloliquefaciens وB. tequilensisو در گروه دوم، دو سویۀ مربوط به B. cereusقرار گرفته‌اند.

 

جدول 1- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی ریزوباکتر‌های استخراج‌شده از خاک حاوی سرب با پیشینۀ درازمدت

Colony

Morphology

Gram stain

Catalase test

Spore formation

Motility

Starch hydrolysis

Nitrate reduction

Blood Agar Hemolysis

MR test

VP test

H2S

Indole

1

Bacilli

Cream

+

+

+

+

+

+

Β

-

+

-

-

2

Bacilli

Dark cream

+

+

+

+

+

-

Γ

-

+

-

-

3

Bacilli

Cream

+

+

+

+

+

+

Β

-

+

-

-

4

Bacilli

Light cream

+

+

+

+

+

+

Γ

-

+

-

-

5

Bacilli

+

+

+

+

+

-

Α

-

+

-

-

 

 

 

شکل 1- محصول PCR ژن 16S rRNA در باکتری‌های جداسازی‌شده؛ 1، 2، 3، 4 و 6. نمونه‌های جداسازی‌شده، 5. نمونۀ شاهد، 7. اندازه‌‌نما

 

جدول 2- شناسایی مولکولی ریزوباکترهای جداسازی‌شده بر اساس مقایسۀ توالی ژن 16S rRNA با سویه‌های معتبر در بانک اطلاعاتی ژنوم

شمارۀ کلنی*

شمارۀ دسترسی**

نام سویه

درصد شباهت

1

MK910207

Bacillus cereus strain A

7/99

2

MK910208

Bacillus subtilis

93/99

3

MK910209

Bacillus cereus strain B

78/99

4

MK910210

Bacillus tequilensis

93/99

5

MK910211

Bacillus amyloliquefaciens

57/99

* شمارۀ کلنی‌ها با شمارۀ کلنی‌ها در جدول 1 منطبق است. ** شمارۀ دسترسی توالی‌های ثبت‌شده در بانک اطلاعات ژنوم NCBI است.

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنی ریزوباکترهای شناسایی‌شده به روش Neibour-Joining (NJ) و ضریب Bootstrap 500


آزمون حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) سرب: بر اساس نتایج آزمون حداقل غلظت بازدارندگی سرب، اختلافمعنا‌داری بین ریزوباکترهای بومی استخراج‌شده مشاهده شد (شکل 3). سویۀ Bacillus cereus strain A بیشترین میزان مقاومت (با MIC معادل 09/5 میلی‌مولار) را نشان داد و پس‌از‌آن، B. amyloliquefaciens و B. cereus strain B به‌ترتیب در مقام دوم و سوم قرار گرفتند. در پژوهش ایجیدی[13] و همکاران (35)، چندین ژن مربوط به مقاومت نسبت به فلزات سنگین شامل کروم، کادمیم، آرسنیک و مس و همچنین آنتی‌بیوتیک‌ها در سویۀ B. cereus شناسایی شدند؛ ازاین‌رو، آنها گزارش کردند این سویه پتانسیل زیادی برای مقاومت در برابر بسیاری از تنش‌های زیست‌محیطی دارد. در پژوهش سید[14] و همکاران (36)، سویه‌ای از Bacillus cereusشناسایی شد که توانایی زیستی چشمگیری در جذب سرب (حدود 87 تا 90 درصد) دارد. کسری کرمانشاهی و همکاران (37) طی مطالعۀ خود روی باکتری‌های مقاوم به سرب خاک‌های استان اصفهان اظهار داشتند 60 درصد از گونه های باکتریایی مقاوم به سرب استخراج‌شده دارای MIC بین 4 تا 8 میلی‌مولار هستند. در پژوهش دیگری نیز سطح مقاومت باکتری‌های خاک نسبت به فلز سنگین سرب بین 5/2 تا 6/5 میلی‌مولار گزارش شد (38).

 

 

 

شکل 3- بررسی تحمل به سرب در ریزوباکترهای جداسازی‌شده از خاک حاوی سرب با پیشینۀ درازمدت

 


ارزیابی تولید ایندول-3-استیک‌اسید(IAA) توسط سویه‌های باکتریایی: نتایج آزمون ارزیابی تولید ایندول-3-استیک‌اسید توسط ریزوباکترهای مقاوم به سرب جدا‌شده نشان دادند تمام سویه‌های شناسایی‌شده توانایی تولید این هورمون گیاهی را دارند (شکل 4). از میان باکتری‌های مطالعه‌شده، سویه‌های B. subtillisبا میانگین 58/38 میلی‌گرم‌بر‌لیتر و B. tequilensis با میانگین 88/7 میلی‌گرم‌بر‌لیتربه‌ترتیب بیشترین و کمترین میزان ایندول-3-استیک‌اسید را تولید کردند.

بر اساس نتایج پژوهش‌های انجام‌‌شده، بخشی از آثار محرک رشدی ریزوباکترهای گوناگون به تولید هورمون‌های گیاهی نظیر ایندول-3-استیک‌اسید توسط آنها وابسته است (39). در پژوهشی، توانایی تولید ایندول-3-استیک‌اسید در ریزوباکترهای متحمل به سرب بررسی شد و تمام باکتری‌های مطالعه‌شده توانایی تولید این ترکیب را به میزان متغیری از 089/0 تا 55/63 میکروگرم‌برلیتر نشان دادند. تلقیح گیاه Lathyrus sativus با ریزوباکتر‌ها در غلظت 5/0 میلی‌مولار سرب در شرایط هیدروپونیک از یک سو سبب افزایش درخور توجه زیست‌تودۀ ساقه (59 درصد) و ریشه (56 درصد) و از سوی دیگر سبب افزایش میزان جذب سرب در ساقه (39) و ریشه (47 درصد) نسبت به گیاهان شاهد شد (40). در پژوهش دیگری که به‌منظور بررسی مقاومت ریزوباکتر‌های تولید‌کنندۀ ایندول-3-استیک‌اسید در برابر سمیت سرب در خاک آلوده انجام شد، گزارش شد ریزوباکترهای Exiguobacterium aurantiacum و Bacillus firmus به مقدار 500 پی‌پی‌ام سرب مقاومت نشان می‌دهند و قادرند در حضور یا عدم‌‌حضور سرب،ایندول-3-استیک‌اسید تولید کنند (41).

 

 

 

شکل 4- ارزیابی تولید ایندول-3-استیک اسید (IAA) در ریزوباکترهای جداسازی‌شده از خاک حاوی سرب با پیشینۀ درازمدت

 


بحث و نتیجه‌گیری

فلزات سنگین به‌ویژه سرب، آلایندههای مهم زیستمحیطی‌اند که تهدیدی جدی برای محیطزیست و سلامت انسان و حیوان به شمار می‌آیند (42). طی دهههای اخیر، آلودگی با فلزات سنگین به‌علت خطرهایی که برای سلامتی انسان و سایر موجودات هنگام انباشت در سیستم زیستی دارد، مدنظر و مطالعه‌های بسیار قرار گرفته است. گیاه‌پالایی روشی مناسب برای حذف آلودگی فلزات سنگین از خاک است (43)؛ هرچند اثربخشی این روش به‌علت رشد آهسته و زیست‌تودۀ کم گیاهان بسیار انباشتگر محدود است (44) مطالعه‌های انجام‌شده گویای اینست که باکتری‌های مقاوم به فلزات سنگین می‌‌توانند جذب فلز توسط گیاهان بسیار انباشتگر را افزایش دهند (45 و 46)؛ در این راستا، جداسازی و شناسایی باکتری‌های متحمل به عناصر سنگین در محیط‌های آلوده نقش مهمی در بهبود زیستگاه‌های آلوده دارد (47)..

در پژوهش حاضر برای نخستین‌بار، تعیین هویت ریزوباکترهای بومی جداشده از معدن سرب و روی اصفهان بر اساس شناسایی ژن 16Sr RNA انجام شد. تمام ریزوباکترهای شناسایی‌شده پتانسیل درخور توجهی برای تحمل غلظت‌های زیاد سرب و همچنین تولید ایندول-3-استیک‌اسید نشان دادند؛ بنابراین می‌توان گفت این ریزوباکترها علاوه‌بر پالایش زیستی خاک، به‌علت تولید ایندول-3-استیک‌اسید به‌عنوان ریزوباکترهای محرک رشد در همزیستی با گیاهان بسیار انباشتگر مؤثر واقع می‌شوند. در مطالعه‌های آتی، نقش این باکتری‌ها در گیاه‌پالایی، جذب فلز، حرکت درون گیاه، انباشتگی ساقه و فرایندهای ریستی که در سم‌زدایی فلزات در گیاهان بسیار انباشتگر نقش دارند، مدنظر قرار خواهد گرفت.

 

سپاسگزاری

پژوهش حاضر از طرح پژوهشی «شناسایی ریزوباکترهای بومی متحمل به سرب از خاک حاوی سرب با پیشینۀ درازمدت بر اساس ژن 16S rRNA» با شماره قرارداد 7911/09/11/د/94 استخراج شده است که دانشگاه پیام نور آن را ازنظر مالی حمایت کرده است و به این وسیله سپاسگزاری می‌شود.



 

 
(1)              Alloway BJ. Heavy metals in soils: Trace metals and metalloids in soils and their bioavailability. 3rd ed. London: Springer; 2012.
(2)              Canli M., Atli G. The relationships between heavy metal (Cd, Cr, Cu, Fe, Pb, Zn) levels and the size of six Mediterranean fish species. Environmental pollution 2003; 121(1): 129-36.
(3)              Järup L. Hazards of heavy metal contamination. British Medical Bulletin 2003; 68(1): 167-82.
(4)              Chen M., Xu P., Zeng G., Yang C., Huang D., Zhang J. Bioremediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons, petroleum, pesticides, chlorophenols and heavy metals by composting: applications, microbes and future research needs. Biotechnology Advances. 2015; 33(6): 745-755.
(5)              Vegliò F., Esposito A., Reverberi AP. Standardisation of heavy metal biosorption tests: equilibrium and modelling study. Process Biochemistry 2003; 38(6): 953-961.
(6)              Gholami M., Etemadifar Z. Isolation and molecular identification of a new strain of Microbacterium resistens, capable of tolerating the extreme conditions. Biological Journal of Microorganism 2013; 2(5): 27-42.
(7)              Qurat-ul-Ain A., Erum S., Uzma B., Jameela A. Isolation and characterization of bacterial isolates having heavy metal tolerance. Journal of Basic and Applied Sciences 2009; 5(2): 55-60.
(8)              Perriguey J., Sterckeman T., Morel JL. Effect of rhizosphere and plant-related factors on the cadmium uptake by maize (Zea mays L.). Environmental and Experimental Botany 2008; 63(1-3): 333-341.
(9)              Khan AG. Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal contaminated soils in phytoremediation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 2005; 18(4): 355-364.
(10)          Motesharrei Z., Mahmoodi H., Owlia P., Salimi H. Study of ACC deaminase activity of Rhizobacteria isolated from soils of northern Iran. Biological Journal of Microorganism 2014; 3(11): 37-46.
(11)          Glick BR. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotechnology Advances 2003; 21(5): 383-393.
(12)          Glick BR. Using soil bacteria to facilitate phytoremediation. Biotechnology Advances 2010; 28(3): 367-374.
(13)          Khan MS., Zaidi A. Synergistic effects of the inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria and an arbuscular mycorrhizal fungus on the performance of wheat. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 2007; 31(6): 355-362.
 
(14)          Khan AL., Bilal S., Halo BA., Al-Harrasi A., Khan AR., Waqas M., Al-Thani GS., Al-Amri I., Al-Rawahi A., Lee IJ. Bacillus amyloliquefaciens BSL16 improves phytoremediation potential of Solanum lycopersicum during copper stress. Journal of Plant Interactions 2017; 12(1): 550-559.
(15)          Ping L., Boland W. Signals from the underground: bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis. Trends in Plant Science 2004; 9(6): 263-266.
(16)          Huang DL., Zeng GM., Jiang XY., Feng CL., Yu HY., Huang GH., Liu HL. Bioremediation of Pb-contaminated soil by incubating with Phanerochaete chrysosporium and straw. Journal of Hazardous Materials 2006; 134(1-3): 268-276.
(17)          Lone MI., He ZL., Stoffella PJ., Yang XE. Phytoremediation of heavy metal polluted soils and water: progresses and perspectives. Journal of Zhejiang University Science B 2008; 9(3): 210-220.
(18)          Chibuike GU., Obiora SC. Heavy metal polluted soils: effect on plants and bioremediation methods. Applied and Environmental Soil Science 2014; 1-12.
(19)          Ashraf M., Ahmad MS., Ozturk M. Plant adaptation and phytoremediation. New York: Springer; 2010.
(20)          Smejkalova M., Mikanova O., Boruvka L. Effects of heavy metal concentrations on biological activity of soil micro-organisms. Plant Soil and Environment 2003; 49(7): 321-326.
(21)          Murthy S., Sarangi SK. Lead biosorption by a bacterium isolated from industrial effluents. International Journal of Microbiology Research 2012; 4(3): 196-200.
(22)          Ma Y., Rajkumar M., Freitas H. Inoculation of plant growth promoting bacterium Achromobacter xylosoxidans strain Ax10 for the improvement of copper phytoextraction by Brassica juncea. Journal of Environmental Management 2009; 90(2): 831-937.
(23)          Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 1987; 4(4): 406-425.
(24)          Sneath PH., Mair NS., Sharpe ME., Holt JG. Bergey's manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams and Wilkins; 1986.
(25)          Tamura K., Dudley J., Nei M. and Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 2007; 24(8): 1596-1599.
(26)          Singh V., Chauhan PK., Kanta R., Dhewa T., Kumar V. Isolation and characterization of Pseudomonas resistant to heavy metals contaminants. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 2010; 3(2): 164.
(27)          Glickmann E., Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Applied and Environmental Microbiology 1995; 61(2): 793-796.
(28)          Dell’Amico E., Cavalca L., Andreoni V. Improvement of Brassica napus growth under cadmium stress by cadmium-resistant rhizobacteria. Soil Biology and Biochemistry 2008; 40(1): 74-84.
(29)          Torres-Rubio MG., Valencia-Plata SA., Bernal-Castillo J., Martínez-Nieto P. Isolation of Enterobacteria, Azotobacter sp. and Pseudomonas sp., producers of indole-3-acetic acid and siderophores, from Colombian rice rhizosphere. Revista Latinoamericana de Microbiología 2000; 42(4): 171-176.
(30)          Tabatabaei FS., Saeedizadeh A. Rhizobacteria cooperative effect against Meloidogyne javanica in rhizosphere of legume seedlings. Hellenic Plant Protection Journal 2017; 10(1): 25-34.
(31)          Arif MS., Muhammad RI., Shahzad SM., Yasmeen T., Shafaqat AL., Akhtar MJ. Phosphorus-mobilizing rhizobacterial strain Bacillus cereus GS6 improves symbiotic efficiency of soybean on an Aridisol amended with phosphorus-enriched compost. Pedosphere 2017; 27(6): 1049-1061.
(32)          Rekha K., Baskar B., Srinath S., Usha B. Plant-growth-promoting rhizobacteria Bacillus subtilis RR4 isolated from rice rhizosphere induces malic acid biosynthesis in rice roots. Canadian Journal of Microbiology 2017; 64(1): 20-27.
(33)          Tiwari S., Prasad V., Chauhan PS., Lata C. Bacillus amyloliquefaciens confers tolerance to various abiotic stresses and modulates plant response to phytohormones through osmoprotection and gene expression regulation in rice. Frontiers in Plant Science 2017; 8: 1510.
(34)          Khan N., Bano A. Role of plant growth promoting rhizobacteria and Ag-nano particle in the bioremediation of heavy metals and maize growth under municipal wastewater irrigation. International Journal of Phytoremediation 2016; 18(3): 211-221.
(35)          Egidi E., Wood JL., Mathews E., Fox E., Liu W., Franks AE. Draft genome sequence of Bacillus cereus LCR12, a plant growth–promoting rhizobacterium isolated from a heavy metal–contaminated environment. Genome Announcements 2016; 4(5): e01041-16.
(36)          Syed S., Chinthala, P. Heavy metal detoxification by different Bacillus species isolated from solar salterns. Scientifica 2015; 1-15.
(37)          Kasra Kermanshahi R., Ghazifard A., Tavakoli A. Identification of bacteria resistant to heavy metals in the soils of Isfahan Province. Iranian Journal of Science and Technology (Sciences). 2007; 31(1): 7-16.
(38)          Sabry SA., Ghozlan HA., Abou‐Zeid DM. Metal tolerance and antibiotic resistance patterns of a bacterial population isolated from sea water. Journal of Applied Microbiology 1997; 82(2): 245-252.
(39)          Esitken A., Pirlak L., Ipek M., Donmez MF., Cakmakci R., Sahin F. Fruit bio-thinning by plant growth promoting bacteria (PGPB) in apple cvs. Golden Delicious and Braeburn. Biological Agriculture and Horticulture 2009; 26(4): 379-390.
(40)          Abdelkrim S., Jebara SH., Saadani O., Chiboub M., Abid G., Jebara M. Effect of Pb‐resistant plant growth‐promoting rhizobacteria inoculation on growth and lead uptake by Lathyrus sativus. Journal of basic microbiology 2018; 58(7): 579-589.
(41)          Rehman B., Hassan TU., Bano A. Potential of indole-3-acetic acid-producing rhizobacteria to resist Pb toxicity in polluted soil. Soil and Sediment Contamination: An International Journal 2019; 28(1): 101-21.
(42)          Yuan W., Yang N., Li X. Advances in understanding how heavy metal pollution triggers gastric cancer. BioMed Research International. 2016; 2016.
(43)          Sekhar KC., Kamala CT., Chary NS., Balaram V., Garcia G. Potential of Hemidesmus indicus for phytoextraction of lead from industrially contaminated soils. Chemosphere 2005; 58(4): 507-514.
(44)          Burd GI., Dixon DG., Glick BR. Plant growth-promoting bacteria that decrease heavy metal toxicity in plants. Canadian Journal of Microbiology. 2000; 46(3): 237-245.
(45)          Rajkumar M., Freitas H. Effects of inoculation of plant-growth promoting bacteria on Ni uptake by Indian mustard. Bioresource Technology 2008; 99(9): 3491-3498.
(46)          Sheng XF., Xia JJ. Improvement of rape (Brassica napus) plant growth and cadmium uptake by cadmium-resistant bacteria. Chemosphere 2006; 64(6): 1036-1042.
(47)          Piotrowska-Seget Z., Cycoń M., Kozdroj J. Metal-tolerant bacteria occurring in heavily polluted soil and mine spoil. Applied Soil Ecology 2005; 28(3): 237-246.