اثر نانوذره اکسیدمس بر سیستم رنگدانه ای جلبک Scenedesmus dimorphus

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه محیط زیست، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه ازاد اسلامی واحد لاهیجان، لاهیجان، ایران

2 گروه محیط زیست، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، لاهیجان، ایران

چکیده

مقدمه: نانومواد به دلیل اندازه‌ بسیار کوچک خواص متمایزی نسبت همان ماده در حالت توده‌ای دارند. اندازه‌ی نانویی باعث غالبیت بعضی خواص مربوط به اتم‌ در نانوذرات می‌شود. این ویژگی‌ها ممکن است اثراتی منفی بر فیتوپلانکتونها در پایه زنجیره‌ غذایی داشته باشد. در تحقیق حاضر اثر سمیت نانوذره اکسیدمس (CuO-NP) Scenedesmus dimorphus به روش OECD201 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها: سمیت نانو ذرات مس در 5 غلظت متفاوت 5/2، 5/6، 4/17، 7/45 و 120 میلی‌گرم بر لیتر CuO-NP با سه تکرار در مقابل شاهد بررسی شد. نمونه‌ها در دمای ثابت و شرایط کنترل‌شده‌ روشنایی و تاریکی نگه داشته شدند و شمارش جلبک‌ها در بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت انجام شد. سنجش کلروفیل و کاروتنوئید به روش ASTM انجام شد. 
نتایج: طی این پژوهش EC10، EC50 و EC90برای 72 ساعت به ترتیب 18/0، 84/28 و 35/4677 میلی‌گرم بر لیتر حاصل شد. غلظت کلروفیل در همه‌ی تیمارها، جز 68/57 میلی‌گرم بر لیتر با گذشت زمان افزایش یافت. در بررسی کاروتنویید مشاهده شد اختلاف معنی‌دار بین شاهد و تیمارها و نیز تیمارها با یکدیگر با افزایش زمان مواجهه بیشتر شده و در زمان 72 ساعت هر سه تیمار با شاهد اختلاف معنی‌دار دارند .(p<0.05)
بحث و نتیجه گیری: این نتایج نشان داد که نانو ذرات مس اثر سمیت قابل توجهی بر جلبک داشته و باعث کاهش نرخ رشد ویژه و افزایش زمان دو برابر شدن گردید. درصد بازدارندگی با ازدیاد غلظت CuO-NP افزایش یافت. همچنین افزایش غلظت نانوذره باعث کاهش میزان کلروفیل a و کاروتنویید در جلبک Scenedesmus dimorphus شد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The effect of Copper Oxide Nanoparticle on Pigments Systems of Algae Scenedesmus dimorphus

نویسندگان [English]

  • Mansooreh Kazemi 1
  • Fatemeh Shariati 2
1 Department of environment, natural Resources faculty, Islamic Azad university, Lahijan, Iran
2 Department of environment, Natural resources faculty, Islamic Azad university, Lahijan branch, lahijan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Due to very small dimensions, nanomaterials can have different properties compared to their bulk form. In nanometer dimension of material, atomic behavior dominates. Such behavior changes may adversely affect biological organism, especially phytoplankton as the basis of food chain cycle. For this reason, in current research, toxicity of CuO nanoparticles (CuO NP) on Scenedesmus dimorphus has been evaluated. The average size of CuO NP used were 20 nm. 
Materials and methods: The experiments were conducted under OECD201 method. The toxic effect of CuO NP was investigated at 5 different concentrations of 2.5, 6.5, 17.4, 45.7, 120 mg/L against control in three replicates for each treatment and control. All samples were treated at constant temperature of 24 °C and 12-hour period of light and dark for 72 hours. Algae count was done at time intervals of 24, 48 and 72h. Chlorophyll assay was done according to ASTM standard. 
Results: EC10, EC50, and EC90 amounts for 72 hours were 0.18, 28.84 and 4477.35 mg/L, respectively. With time, chlorophyll concentration was decreased in all treatments except for 57.68 mg/L. Carotenoid showed significant decrease between all treatments and the control and also among different treatments (p<0.05) and in 72h three treatments had different carotenoids (p<0.05).
Discussion and conclusion: These results showed that CuO NP had significant toxic effect on Scenedesmus dimorphus and resulted to reduction in growth rate and increase in doubling time. Also, the percent inhibition was increased with increasing CuO NP concentration. The chlorophyll and carotenoid levels decreased in Scenedesmus dimorphus by increasing CuO NP concentration.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Algae Scenedesmus dimorphus
  • Chlorophyll
  • CuO nanoparticle
  • Growth Inhibition
  • Toxicity

مقدمه

امروزه با پدیدارشدن نانوفناوری و استفادۀ روزافزون از آن در جنبه‌های مختلف علوم و فناوری، محصولات بیشماری به وجود آمده‌اند که در ترکیب و ساخت آنها از نانومواد استفاده شده است. نانوذرات به‌علت اندازۀ بسیار کوچکی (1 تا 100 نانومتر) که دارند، ویژگی‌ها و رفتارهای متفاوتی نسبت به ذرات درشت (توده) از خود نشان می‌دهند؛ از‌این‌رو، کاربرد نانوذرات در زمینه‌های مختلف درحال گسترش است. نانوذرۀ اکسید‌مس[1] (CuO-NP) به اشکال مختلف وجود دارد و کاربردهای متنوعی نظیر استفاده در ساخت حسگرهای گاز، باتری‌ها، سلول‌های فتوولتائیک[2]، مایعات انتقال حرارت و به‌عنوان کاتالیست دارد؛ پساب هریک از فعالیت‌های یادشده ممکن است حاوی نانوذرات اکسیدمس باشد و سبب ورود آنها به محیط‌زیست آبی شود (1-5). پژوهش‌ها نشان می‌دهند نانوذرات رفتارهای زیستی متفاوتی ایجاد می‌کنند؛ ازجمله اینکه عامل اندازۀ ذرات (در حد نانومتر) توانایی عبور و امکان پشت‌سر‌گذاشتن سدهای زیستی را به ذره می‌دهد که دستیابی به آن برای ذرات درشت‌دانه و توده‌ای ممکن نیست (6 و 7). اندازۀ ذره ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی نانومواد را تغییر می‌دهد و باعث افزایش جذب این مواد و تعامل بیشتر آنها با بافت‌های موجودات زنده می‌شود؛ جذب نانوذرات در موجودات آبزی اهمیت فراوانی دارد. در سطح سلولی، پروکاریوت‌هایی[3] مانند باکتری‌ها و جلبک‌ها ممکن است به‌علت نداشتن سازوکارهای جلوگیری‌کننده از انتقال تودۀ ذرات کلوئیدی و سوپرکلوئیدی از طریق دیوارۀ سلولی در برابر جذب بسیاری از انواع نانوذرات آسیب‌پذیر شوند (8-10). اگرچه سازوکار اصلی عملکرد نانوذرات هنوز به‌طور کامل شناخته نشده است، مطالعه‌های گوناگون در محیط‌های مصنوعی[4] و طبیعی[5] نشان می‌دهند آنها قادرند گونه‌های فعال اکسیژن[6] (ROS) را تولید کنند و بنابراین می‌توانند در غلظت کلسیم درون‌سلولی، فعال‌کردن عوامل رونویسی و ایجاد تغییر در سایتوکین‌ها[7] نقش داشته باشند. ROS به روش‌‌های مختلفی مانند آسیب‌رساندن به DNA، تداخل با مسیرهای علامت‌دهی[8] سلولی، تغییر در روند رونویسی ژن‌ها و ... به سلول‌ها آسیب می‌زنند (11 و 12). مرگ سلولی ناشی از ROS درنتیجۀ واکنش‌های اکسیداتیوی نظیر پراکسیداسیون اسیدهای چرب غشا، اکسیداسیون پروتئین‌ها، ممانعت از فعالیت آنزیم‌ها و خسارت به DNA و RNA در اثر تولید رادیکال‌های آزاد رخ می‌دهد (11، 13-16). در مطالعه‌ای، نقش گونه‌های ROS در سمیت مس برای دو گونه جلبک Pseudokirchneriella subcapitata و Chlorella vulgaris بررسی و مشخص شد با افزایش زمان مواجهه، آزادسازی ROS در غشای پلاسمایی اتفاق می‌افتد (17).

در اکوسیستم‌های آبی، جلبک‌ها و فیتوپلانکتون‌ها بخش مهمی از زنجیرۀ غذایی موجودات آبزی و ماهی‌ها را تشکیل می‌دهند (18 و 19). پژوهش دربارۀ سمیت نانوذرات بر جلبک‌های مختلف طی چند سال اخیر آغاز شده و درحال گسترش است. بکارو[9] و همکاران در سال 2015، سمیت ذرات نانونقرۀ تثبیت‌شده با پلی‌وینیل‌الکل[10] را روی جلبک‌ها و سخت‌پوستان میکروسکوپی (شامل سه گونۀ Artemia salina،Pseudokirchneriella subcapitata و Daphnia similis)بررسی و تأیید کردند (20). در مطالعه‌ای، سمیت حاد نانوذرات اکسیدمس (CuO) و اکسیدروی (ZnO) روی دو گونه سخت‌پوست و یک گونه پروتوزوآ[11] بررسی شد؛ [12]EC50 نانو اکسیدمس برای دو سخت‌پوست در محدودۀ 90 تا 224 میلی‌گرم‌بر‌لیتر و حدود 10 برابر کمتر از EC50 برای حالت توده‌ای[13] اکسید‌مس بود (2). در بررسی دیگری، آثار سمی نانوسوسپانسیون‌های[14] اکسید‌مس بر سلول‌های جلبک‌ ماکروفیت[15]Nitellopsis obtusa ، جلبک میکروفیتsp.[16]Chlorella، میگوی Thamnocephalus platyurus و روتیفر[17] Brachionus calyciflorus بررسی و تأیید شد (21). در مطالعه‌ای، سمیت نانوذرات اکسیدهای آلومینیوم، تیتانیوم، سیلیسیم و روی بر جلبکsp.  Chlorella بررسی شد و طبق نتایج، نانوذرات اکسیدروی سمیت چشمگیری داشتند و سه نانوذرۀ دیگر سمیت درخور توجهی نداشتند (22).

طی مطالعه‌ای، ماهی گورخری، دافنی[18] و گونه‌ای جلبک در معرض اشکال نانویی و نمک‌های محلول عناصر نقره، مس، آلومینیوم، نیکل و نانوذرات دی‌اکسید‌تیتانیوم قرار گرفتند؛ بر اساس نتایج، نانونقره و نانومس در هر سه موجود زنده سمیت داشتند و حساسیت گونه‌های مختلف در برابر نانوفلزات متفاوت بود (23). .در پژوهشی، بازدارندگی رشد و میزان رنگدانۀ فتوسنتزی در جلبک Scenedesmus obliquus پس‌از رویارویی با نانوسیلیکا بررسی شد و EC50 برای 72 ساعت 1/388 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به دست آمد. مقدار کلروفیل در غلظت‌های میانی و زیاد (50، 100 و 200 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) پس‌‌‌از 96 ساعت به‌طور چشمگیری کاهش یافت، اما کاروتنوئید کم نشد (24). اگرچه تاکنون پژوهش‌هایی دربارۀ آثار غلظت‌های مختلف نانو‌ذرات روی ممانعت از رشد، میزان فتوسنتز و ویژگی‌های ریختی و تغییر شکل جلبک‌ها در جهان انجام شده است (25-28)، در داخل ایران و خارج از آن گزارشی دربارۀ تأثیر نانوذرۀ اکسیدمس روی جلبک سبز تک‌سلولی Scenedesmus dimorphusمنتشر نشده است؛ ازاین‌رو در پژوهش حاضر، آثار سمیت نانوذرۀ اکسیدمس بر جلبک S. dimorphus بررسی شد.

 

مواد و روش‌ها.

جلبک S. dimorphus از آزمایشگاه کاوشگران طبیعت پاک[19] تهیه شد. نانوذرات اکسیدمس از شرکت پیشگامان نانومواد ایران[20] (نانو ثانی) تهیه شد که محصولات آن تولید کشور آمریکاست (شکل 1).

آماده‌سازی محیط‌کشت و کشت جلبک: در مطالعۀ حاضر، محیط‌کشت BBM[21] برای رشد جلبک استفاده شد. به‌منظور اطمینان‌یافتن از خلوص جلبک، ابتدا کشت در محیط نوترینت‌آگار[22] انجام شد و پتری‌دیش‌ها به‌مدت 10 تا 12 روز در دمای 27 درجۀ سانتی‌گراد و در معرض نور فلورسنت نگهداری شدند؛ سپس تعدادی از کلنی‌های Scenedesmus در لوله‌های آزمایش حاوی محیط‌کشت مایع کشت و مدت 7 روز در آنها نگهداری شدند. به‌منظور اطمینان‌یافتن از خلوص جلبک، نمونه‌ها طی پنج مرحله سانتریفیوژ و شستشو شدند و سپس به محیط‌کشت یک لیتری انتقال یافتند و به‌مدت 7 روز در دمای محیط و در معرض نور فلورسنت قرار گرفتند. طی این مدت، میزان رشد نمونه‌ها هر روز از طریق شمارش سلولی تا زمان ورود به فاز نمایی رشد کنترل شد؛ به‌این‌ترتیب، حجم زیادی از سلول‌های S. dimorphusبرای انجام مراحل بعدی آزمایش تهیه شد.

آماده‌سازی ذخیرۀ[23] نانوذرات: پس‌از سه مرحله آزمون دامنه‌یابی، محدودۀ اصلی غلظت‌ها بر مبنای لگاریتمی شامل صفر (شاهد)، 5/2، 5/6، 4/17، 7/45 و 120 میلی‌گرم‌بر‌لیتر انتخاب و بررسی‌ها با سه تکرار برای هر تیمار و شاهد انجام شدند.

 

 

 

شکل 1- عکس میکروسکوپ الکترونی عبوری[24] (TEM) (سمت چپ)، میکروسکوپ الکترونی روبشی [25](SEM)  (سمت راست) نانوذرات اکسیدمس تهیه‌شده توسط شرکت نانو‌مواد ایران

 


قراردادن جلبک‌ها در معرض نانوذرات: مطابق روش OECD، تعداد 104×5 سلول جلبک به لوله‌های آزمایش حاوی محیط‌کشت استریل و نانوذره با حجم ثابت 10 میلی‌لیتر و در سه تکرار تلقیح شد (29). لوله‌های آزمایش به‌مدت 72 ساعت داخل اطاقک رشد[26] (مدل JG-300، شرکت ژال طب، ساخت ایران) و در شرایط 12 ساعت نوردهی با لامپ فلورسنت سرد و شدت نور 5000 لوکس و 12 ساعت تاریکی و دمای 1±24 درجۀ سانتی‌‌گراد  قرار داده شدند. نمونه‌ها هر 12 ساعت بررسی شدند.

بررسی ممانعت از رشد: پس از 24، 48 و 72 ساعت از آغاز آزمایش، نمونه‌ها ابتدا با مخلوط‌کن هم زده شدند و سپس از محلول لوله‌های آزمایش با سمپلر نمونه‌برداری شد. نمونه با لام توما زیر میکروسکوپ نوری (صاایران مدل N- 180M) با بزرگنمایی 40× در 6 تکرار شمارش شد. تعداد سلول‌ها از رابطۀ زیر به دست آمد:

رابطۀ (1)

تراکم سلولی در میلی‌لیتر=کل سلول‌های شمارش‌شده در مربع بزرگ×104

محاسبۀ مقادیر EC10، EC50 و EC90 بر اساس روش پروبیت[27] انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا اعداد پروبیت مربوط به غلظت‌های مدنظر از جدول آن استخراج شدند و سپس برای تعیین مقادیر EC از معادلۀ خطی رگرسیون[28] استفاده شد (30). به‌منظور بررسی وجودداشتن یا نداشتن اختلاف معنادار بین شاهد و تیمارهای غلظت در هر زمان مواجهه از آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و در ادامه از آزمون توکی استفاده شد؛ سطح معناداری 95 درصد در نظر گرفته شد.

زمان دوبرابرشدن (G)، مدت زمان لازم برای دوبرابرشدن اندازه یا تعداد سلول‌هاست. زمان دوبرابرشدن ویژگی مناسبی برای رابطۀ رشد نمایی است (31). مقدار NOEC و همچنین مقادیر µ و G از رابطه‌های پیشنهادی محاسبه شد (32).

رابطۀ (2)

ln x1 – ln x0 (t1 – t0)-1 = µ

µ: نرخ رشد ویژه، x1: میانگین تعداد سلول‌ها در زمان t1، x0: میانگین تعداد سلول‌ها در زمان t2

 

رابطۀ (3)

G = ln2 µ-1

G: زمان دوبرابرشدن

 

رابطۀ (4)

I = µc - µt  / µc × 100

I: درصد ممانعت از نرخ رشد ویژه، µt: نرخ رشد در تیمار، µc: میانگین نرخ رشد در شاهد

رابطۀ (5)

NOEC=EC50/10

NOEC: غلظت بدون اثر قابل‌مشاهدۀ یک شاخص است که غلظتی از یک آلاینده را نشان می‌دهد که باتوجه‌به تأثیر مورد‌مطالعه به گونۀ مورد‌بررسی صدمه نمی‌زند.

اندازه‌گیری کلروفیل و کاروتنوئید: به‌منظور بررسی اثر غلظت‌های مختلف نانو اکسید‌مس بر میزان رنگدانۀ جلبک Scenedesmusبه روش ASTM D3731- 87(2012) (33)، چهار تیمار با غلظت‌های صفر، 42/12، 84/28 و68/57 میلی‌گرم‌بر‌لیتر که به‌ترتیب نصف، برابر و دو برابر EC50 بودند، در سه تکرار تهیه شدند و در شرایط کنترل‌شدۀ نور و دما قرار گرفتند. نمونه‌برداری در فواصل زمانی منظم 24ساعته انجام شد. ابتدا نمونه‌ها به‌منظور جداسازی محیط‌کشت از محلول جلبکی سانتریفیوژ شدند و سپس محلول رویی جدا شد؛ سپس استون 90 درصد به رسوب جلبکی باقیمانده اضافه و مقدار جذب نوری در طول‌موج‌های630، 647 و 664 نانومتر خوانده شد.

رابطۀ (6)

Ca= 11.85 ( A664) – 1.54 (A647) – 0.08 (A630)

رابطۀ (7)

g/mlµCaa=Ca × Vaceton/ Vwater × 1000

رابطۀ (8)

Cc = 10 (A470) × Vaceton/ Vwater × 1000 µg/ml

Caa: غلظت کلروفیل، Cc: غلظت کاروتنوئید

 

نتایج

ممانعت از رشد: همان‌طور که در شکل 2 مشاهده می‌شود، داده‌های آزمایش ممانعت از رشد نشان می‌دهند تعداد سلول‌ها در تمام تیمارها طی 72 ساعت روند افزایشی داشته است؛ اما با افزایش غلظت نانوذرۀ اکسیدمس، رشد جلبک در تیمارها نسبت به نمونۀ شاهد کاهش یافته است و هرچه غلظت نانوذره بیشتر شده، کاهش رشد نیز بیشتر اتفاق افتاده است و این اختلاف بین شاهد و تیمارها و بین غلظت‌های مختلف تیمارها در زمان مواجهۀ 48 و 72 ساعت معنادار بوده است (p<0.05)؛ این نتیجه آثار منفی نانوذرۀ اکسیدمس را بر رشد جلبک Scenedesmus نشان می‌دهد.

 

 

 

شکل 2- میانگین تعداد سلول‌های جلبکی شمارش‌شده بر حسب زمان در غلظت‌های مختلف نانوذرۀ اکسید‌مس. اعداد میانگین 18 تکرار±انحراف معیار است. حرف‌های یکسان نبود اختلاف معنادار در سطح اطمینان 95 درصد را با استفاده از آزمون توکی نشان می‌دهند.

 


غلظت مؤثر بازدارندگی (EC) نانوذرۀ اکسیدمس بر گونۀ جلبک :S. dimorphusطبق جدول 1،غلظت مؤثر (EC50) نانو اکسیدمس طی 72 ساعت مقدار 84/28 میلی‌گرم‌بر‌لیتر و EC90 طی 72 ساعت مقدار 35/4677 میلی‌گرم‌برلیتر محاسبه شد. همچنین EC10، EC50 و EC90 با گذشت زمان روند کاهشی داشتند که نشان‌دهندۀ افزایش سمیت نانوذره با گذشت زمان است.

 

جدول 1- مقادیر EC10، EC50، EC90 و NOEC نانوذرۀ اکسید‌مس برای جلبک Scenedesmus dimorphus

غلظت مؤثر(میلی‌گرم برلیتر)

24 ساعته

48 ساعته

72 ساعته

EC10

07/4

93/0

18/0

EC50

18/162

56/65

84/28

EC90

54/6456

35/4677

35/4677

NOEC

22/16

55/6

88/2

 

نرخ رشد ویژۀ جلبک S. dimorphus در اثر تماس با نانوذرۀ اکسیدمس: در بررسی نرخ رشد ویژۀ (µ) گونۀ Scenedesmus dimorphus در اثر تماس با نانو اکسیدمس، کاهش بیشتر نرخ رشد با افزایش غلظت نانوذره نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل 3). حداکثر نرخ رشد ویژه (maxµ) بین تیمارهای مختلف، متفاوت بود و از غلظت کمتر به غلظت بیشتر روند کاهشی وجود داشت و مشاهده شد پس‌از گذشت 72 ساعت، نرخ رشد نسبت به 24 و 48 ساعت کاهش بیشتری می‌یابد. همچنین نرخ رشد طی 24 ساعت اول آزمایش نسبت به بازه‌های زمانی بعدی کاهش کمتری  نشان داد که این مسئله به‌علت رشد نمایی جلبک است و همۀ تیمارها با غلظت‌های مختلف نانو‌ذره از این الگوی رشد پیروی می‌کنند.

 

 

 

شکل 3- نمودار نرخ رشد ویژۀ جلبک Scenedesmus dimorphusدر اثر تماس با CuO-NP

 


زمان دوبرابرشدن جلبک S. dimorphus در اثر تماس با نانوذرۀ اکسیدمس: شاخص G یا زمان دوبرابرشدن با افزایش غلظت نانوذره در تیمارهای موردآزمایش روند افزایشی نشان داد وکمترین زمان دوبرابر‌شدن سلول‌ها در نمونۀ شاهد محاسبه شد؛ همچنین با پیشرفت آزمایش، زمان دو‌برابر‌شدن سلول‌های جلبک به‌تدریج افزایش یافت که علت آن، کاهش نرخ رشد جلبک در همۀ تیمارها و شاهد نسبت به زمان آغاز آزمایش است (شکل 4). بررسی درصد ممانعت از رشد (I) در گونۀ S. dimorphus با افزایش غلظت نشان داد روند بازدارندگی از رشد نسبت به نمونۀ شاهد همواره افزایشی است (جدول 2)؛ همچنین با افزایش زمان مواجهه، میزان ممانعت از رشد افزایش می‌یابد (به‌جز در روز سوم و غلظت 120 میلی‌گرم‌بر‌لیتر که تفاوت چندانی با روز دوم آزمایش ندارد)؛ صرف‌نظر از این مورد، درصد بازدارندگی از رشد جلبک Scenedesmus در معرض نانوذرۀ اکسیدمس همواره افزایشی است و رشد آن کاهش می‌یابد.

 

 

 

شکل 4- زمان دوبرابرشدن (G) سلول‌های جلبک Scenedesmus dimorphus در مدت آزمایش در غلظت‌های مختلفCuO-NP

 

 

جدول 2- درصد بازدارندگی رشد ویژۀ (I) جلبک Scenedesmus dimorphus نسبت به نمونۀ شاهد در اثر تماس با CuO-NP

غلظت (میلی‌گرم‌بر‌لیتر)

24 ساعت

48 ساعت

72 ساعت

5/2

57/5 درصد

35/8 درصد

42/12 درصد

5/6

01/9 درصد

04/17 درصد

80/21 درصد

4/17

52/19 درصد

15/24 درصد

35/24 درصد

7/45

18/25 درصد

02/34 درصد

99/35 درصد

120

59/43 درصد

06/44 درصد

37/43 درصد

 

.تأثیر غلظت نانو اکسیدمس بر مقدار کلروفیل: بررسی داده‌های مربوط به سنجش کلروفیل نشان‌دهندۀکاهش غلظت کلروفیل در همۀ تیمارها و زمان‌ها نسبت به شاهد بود؛ همچنین مقدار کلروفیل در همۀ تیمارها (به‌جز 68/57 میلی‌گرم‌بر‌لیتر) باگذشت زمان افزایش یافت، هرچند میزان افزایش در شاهد بیشتر از سایر تیمارها بود (شکل 5). این امر آثار منفی نانوذرۀ اکسیدمس را بر فرایند فتوسنتز در جلبک S. dimorphus نشان می‌دهد. در شکل 5 مشاهده می‌شود با افزایش زمان مواجهه، تفاوت میزان کلروفیل شاهد با تیمارها معنادار می‌شود (p<0.05).

 

 

شکل5- میانگین کلروفیل a در جلبک Scenedesmus dimorphus با غلظت‌های مختلف CuO-NP. میانگین 3 تکرار±انحراف معیار است و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ نبود اختلاف معنادار در سطح اطمینان 95 درصد با آزمون توکی است.

 


بررسی تأثیر غلظت نانو اکسیدمس بر مقدار کاروتنوئید: میزان کاروتنوئید در نمونۀ شاهد همواره افزایشی بود و طی 3 روز به میزان 150 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر رسید؛ در حالی‌که این رنگدانه در همۀ تیمارها روند به‌شدت کاهشی داشت و میزان کاهش آن با افزایش غلظت تیمار متناسب بود (شکل 6). اختلاف معنادار بین شاهد و تیمارها و نیز تیمارها با یکدیگر با افزایش زمان مواجهه بیشتر شد و در زمان 72 ساعت، هر سه تیمار با شاهد اختلاف معنادار داشتند .(p<0.05)

 

 

 

شکل6- میانگین کاروتنوئید در جلبک Scenedesmus dimorphus با غلظت‌های مختلفCuO-NP. میانگین 3 تکرار±انحراف معیار است و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ نبود اختلاف معنادار در سطح اطمینان 95 درصد با آزمون توکی است.

 


بحث

پژوهش حاضر نشان داد سمیت نانوذرات بسته به غلظت و زمان درمعرض‌بودن متفاوت است. اکسیدهای فلزی نانوذرات قدرت سمیت و کشندگی متفاوتی دارند که نشان می‌دهد سمیت نانوذرات علاوه‌بر ساختار نانویی و نسبت زیاد سطح به جرم و قابلیت تحرک به سایر عوامل نیز بستگی دارد. جلبک‌ها و فیتوپلانکتون‌ها به‌عنوان پایۀ زنجیرۀ غذایی در تعادل اکوسیستم نقش حیاتی دارند و برخی نانوذرات به‌علت سمیتی که دارند، باعث کاهش جمعیت جلبک‌ها در محیط و عواقب ناشی از آن می‌شوند.

در پژوهش حاضر، سمیت نانوذرۀ اکسیدمس بر جلبک سبز S. dimorphusبررسی و کاهش رشد جلبک با افزایش غلظت نانوذره مشاهده شد. همچنین EC50 اکسیدمس روی جلبک Scenedesmus طی 72 ساعت برابر 84/28 میلی‌گرم‌برلیتر محاسبه شد که در مقایسه با پژوهشی که پنداشته[xxix] و همکاران (2013) انجام داده‌اند و در آن، EC50 نانو اکسیدروی 09/0 میلی‌گرم‌بر‌لیتر روی این جلبک به دست آمده است، سمیت بسیار بیشتر نانو اکسیدروی روی جلبک S. dimorphus را نشان می‌دهد (26).

در پژوهشی، سمیت نانو اکسیدتیتانیوم بر جلبک Scenedesmus بررسی و میزان EC50 آن 44 میلی‌گرم‌بر‌لیتر گزارش شد که در مقایسه با نتایج پژوهش حاضر نشان‌ می‌دهد سمیت نانوذرۀ اکسیدمس از نانو اکسیدتیتانیوم طی 72 ساعت حدود 52/1 برابر بیشتر است (27). در بررسی دیگری، آثار غلظت‌های مختلف نانوذرۀ اکسید‌مس روی رشد، کلروفیل a و کاروتنوئید جلبک Chlorella vulgaris به‌مدت شش روز بررسی شد و بر اساس نتایج، تعداد سلول‌ها با افزایش غلظت نانوذره کاهش معناداری داشت. این نانوذره باعث افزایش نرخ بازدارندگی در Chlorella vulgaris شد؛ همچنین میزان کلروفیل کل، کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید در همۀ غلظت‌های آزمایشی در مقایسه با شاهد کاهش داشتند و میزان کاهش آنها با غلظت نانوذره متناسب بود (34). طی پژوهش دیگری که وانگ[xxx] و همکاران در سال 2013 انجام دادند، اکسیدمس در سه حالت نانویی، میکرویی و یونی روی جلبک‌های خانوادۀ Chlorellaceae آزمایش شد؛ طبق یافته‌های ایشان، EC50 96ساعته برای یون‌های Cu2+ معادل 06/1 و برای نانو CuO معادل 61/74 میلی‌گرم‌بر‌لیتر بود. مقایسۀ این نتایج با یافته‌های پژوهش حاضر نشان می‌دهد سمیت CuO-NP برای جلبک Scenedesmus بیشتر از Chlorella است و این گونه حساسیت بیشتری نسبت به ذرات نانویی مس دارد (28). همچنین آزادشدن یون Cu2+ از نانوذرات اکسیدمس با غلظت 2/0 میلی‌گرم‌بر‌لیتر باعث ممانعت از تشکیل کلروفیل a در جلبک Chlorellaشد. ضمناً پس‌از مواجهه با نانوذرات اکسیدمس با غلظت 160 میلی‌گرم‌بر‌لیتر، میزان کلروفیل 89/2 میلی‌گرم در 108 سلول بود که نسبت به مقدار شاهد یعنی 75/4 میلی‌گرم در 108 سلول کاهش داشت؛ در پژوهش حاضر نیز نتایج مشابهی به دست آمد (28).

در مطالعه‌ای به بررسی اثر سمیت نانوذره و بالک (توده) اکسیدمس بر جلبک Pseudokirchneriella subcapitata پرداخته و طی آن، EC50 طی 72 ساعت برای نانوذرۀ اکسید‌مس 71/0 میلی‌گرم‌بر‌لیتر و برای حالت توده 55/11 میلی‌گرم‌بر‌لیتر گزارش شد (25). اختلاف سمیت محاسبه‌شده طی این آزمایش‌‌ها با نتایج پژوهش حاضر، علاوه‌بر احتمال وجود خطاهای شخصی و تفاوت در جزئیات روش مانند دامنۀ دمایی، شدت نور و نوع محیط‌کشت که آثاری هرچند اندک دارند، از تفاوت گونه‌های جلبک در دو پژوهش ناشی می‌شود. تفاوت بین‌گونه‌ای در جلبک‌های مختلف به‌علت تفاوت در نرخ جذب از طریق غشای پلاسمایی در سازوکارهای اتصال داخلی و یا سازوکارهای سمیت‌زدایی است(35). مقایسۀ این دو پژوهش نشان می‌دهد حساسیت جلبک Pseudokirchneriella subcapitata نسبت به نانوذرۀ اکسید مس 56/40 برابر بیشتر از جلبک Scenedesmus dimorphus است. طی پژوهشی دربارۀ سمیت نانوذرۀ اکسیدمس پوستۀ هسته[xxxi] روی جلبک سبز Chlamydomonas reinhardtii در محدودۀ 4 تا 20 میلی‌گرم‌بر‌لیتر به‌مدت 6 ساعت، ساختار جمعیت جلبک تغییر کرد؛ همچنین این نانوذره بر کلروفیل اثر تخریبی داشت و کاهش فتوسنتز در آن به تشکیل گروه‌های ROS نسبت داده شد (36). در مطالعۀ دیگری، تأثیر همین نانوذره به دو شکل دارای روکش و بدون روکش بر جلبکChlamydomonas reinhardtii بررسی و مشاهده شد هر دو شکل در غلظت‌های 5 تا 40 میلی‌گرم‌بر‌لیتر پس‌از 6 ساعت مواجهه برای جلبک سمی‌اند، اما سمیت نانوذرۀ دارای روکش بیشتر از نوع بدون روکش است و علت آن، افزایش قابلیت نفوذ به داخل سلول است (37). در پژوهش دیگری، تأثیر غلظت‌های صفر تا 10 میلی‌گرم‌بر‌لیتر نانوذرۀ نقره بر دو گونه جلبک شامل Chlorella vulgarisوDunaliella tertiolecta طی 24 ساعت مواجهه بررسی و مشاهده شد میزان کلروفیل به‌شدت کاهش می‌یابد (38)؛ در پژوهش حاضر نیز کاهش کلروفیل در اثر رویارویی با CuO-NP مشاهده شد.

آل سعدی[xxxii] و همکاران در پژوهشی به بررسی آثار سمیت فلزات سنگین کادمیوم و سرب بر جلبک Scenedesmus quadricauda پرداختند. طبق نتایج ایشان، نرخ رشد جلبک با افزایش غلظت فلزات کاهش می‌یابد و مقدار کلروفیل در مقایسه با شاهد کاهش معناداری نشان می‌دهد (39)؛ این نتایج با یافته‌های میزان کلروفیل و نرخ رشد در پژوهش حاضر مطابقت دارد. در مطالعۀ دیگری، تأثیر نانوذرۀ اکسیدمس بر برنج بررسی و مشاهده شد میزان فتوسنتز، میزان تعرق و میزان رنگدانه در غلظت 1000 میلی‌گرم‌بر‌لیتر کاهش می‌یابد (40).

بر اساس نتایج پژوهش حاضر، نانوذرۀ اکسید‌مس باعث کاهش تعداد سلول‌ها و نیز رنگدانه‌ها در جلبک سبز Scenedesmus dimorphus می‌شود. با‌توجه‌به آثار کشف‌نشده و بعضاً منفی برخی نانوذرات بر موجودات زنده و محیط‌زیست ضروریست آثار واقعی نانوفناوری پیش‌‌از اینکه پسماندهای نانو در محیط ظاهر شوند و همچنین پیش‌از معرفی نانوتولیدات جدید به بازار تعیین و شناسایی شوند.



References

(1)Abboud Y., Saffaj T., Chagraoui A., El Bouari A., Brouzi K., Tanane O., et al. Biosynthesis, characterization and antimicrobial activity of copper oxide nanoparticles (CuNPs) produced using brown alga extract (Bifurcaria bifurcata). Applied Nanoscience 2014; 4(5): 571-576.

(2) Blinova I., Ivask A., Heinlaan M., Mortimer M., Kahru A. Ecotoxicity of nanoparticles of CuO and ZnO in natural water. Environmental Pollution 2010; 158(1): 41-47.

(3) Chang Y-N., Zhang M., Xia L., Zhang J., Xing G. The toxic effects and mechanisms of CuO and ZnO nanoparticles. Materials 2012; 5(12): 2850-2871.

(4) Studer AM., Limbach LK., Van Duc L., Krumeich F., Athanassiou EK., Gerber LC., et al. Nanoparticle cytotoxicity depends on intracellular solubility: comparison of stabilized copper metal and degradable copper oxide nanoparticles. Toxicology Letters 2010; 197(3): 169-174.

 

(5) Zhou K., Wang R., Xu B., Li Y. Synthesis, characterization and catalytic properties of CuO nanocrystals with various shapes. Nanotechnology 2006; 17(15): 3939.

(6) Ayatallahzadeh Shirazi M., Shariati, F., Ramezanpour, Z. Toxic effect of aluminum oxide nanoparticles on green micro-algae Dunaliella salina. International Journal of Environmental Research 2015; 9(2): 585-594.

(7) Monteiro-Riviere NA., Lang Tran C., Nanotoxicology: characterization, dosing and health effects. New York: CRC Press; 2007.

(8) Moore M. Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic environment? Environment International 2006; 32(8): 967-976.

(9) Navarro E., Baun A., Behra R., Hartmann NB., Filser J., Miao A-J., et al. Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi. Ecotoxicology 2008; 17(5): 372-386.

(10) Nowack B., Bucheli TD. Occurrence, behavior and effects of nanoparticles in the environment. Environmental Pollution 2007; 150(1): 5-22.

(11) Hassibi P. Physiological changes of low temperature tension on different genotypes of the rice in seedling stage. Ahvaz: Shahid Chamran University; 2007.

(12) Kamali M., Rostami, A. and Mohseni Koochesfehani, H. Cellular toxicity of nanoparticles in vitro. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal 2013; 3(12): 62-75.

(13) Hassibi P., Moradi, F., Nabipour, M. The effect of low temperature on antioxidants metabolism of sensitive and tolerant rice genotypes in seedling stage. Iranian Journal of Crop Sciences 2008; 10(39): 262-280

(14) Klaine SJ., Alvarez PJ., Batley GE., Fernandes TF., Handy RD., Lyon DY., et al. Nanomaterials in the environment: behavior, fate, bioavailability, and effects. Environmental Toxicology 2008; 27(9): 1825-51.

(15) Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science. 2002; 7(9): 405-410.

(16) Suman T., Rajasree SR., Kirubagaran R. Evaluation of zinc oxide nanoparticles toxicity on marine algae Chlorella vulgaris through flow cytometric, cytotoxicity and oxidative stress analysis. Ecotoxicology Environmental Safety 2015; 113: 23-30.

(17) Knauert S., Knauer K. The role of reactive oxygen species in copper toxicity to two freshwater green algae 1. Journal of Phycology 2008; 44(2): 311-319.

(18) Pourafrasyabi MaR, Z. (2011) Phytoplanktons as pollution indicators. The 5th Conference on Environment Engineering, Environment Faculty, University of Tehran, Tehran, Iran.

(19) Li F., Liang Z., Zheng X., Zhao W., Wu M., Wang Z. Toxicity of nano-TiO2 on algae and the site of reactive oxygen species production. Aquatic Toxicology 2015; 158: 1-13.

(20) Becaro AA., Jonsson CM., Puti FC., Siqueira MC., Mattoso LH., Correa DS., et al. Toxicity of PVA-stabilized silver nanoparticles to algae and microcrustaceans. Environmental Nanotechnology, Monitoring 2015; 3: 22-29.

(21) Manusadžianas L., Caillet C., Fachetti L., Gylytė B., Grigutytė R., Jurkonienė S., et al. Toxicity of copper oxide nanoparticle suspensions to aquatic biota. Environmental Toxicology Chemistry. 2012; 31(1): 108-114.

(22) Ji J., Long Z., Lin D. Toxicity of oxide nanoparticles to the green algae Chlorella sp. Chemical Engineering Journal 2011; 170(2-3): 525-530.

(23) Griffitt RJ., Luo J., Gao J., Bonzongo JC., Barber DS. Effects of particle composition and species on toxicity of metallic nanomaterials in aquatic organisms. Environmental Toxicology Chemistry 2008; 27(9): 1972-1978.

(24) Wei C., Zhang Y., Guo J., Han B., Yang X., Yuan J. Effects of silica nanoparticles on growth and photosynthetic pigment contents of Scenedesmus obliquus. Journal of Environmental Sciences 2010; 22(1): 155-160.

(25) Aruoja V., Dubourguier H-C., Kasemets K., Kahru A. Toxicity of nanoparticles of CuO, ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata. Science of the Total Environment 2009; 407(4): 1461-1468.

(26) Pendashte H., Shariati F., Keshavarz A., Ramzanpour Z. Toxicity of zinc oxide nanoparticles to Chlorella vulgaris and Scenedesmus dimorphus algae species. World Journal of Fish Marine Sciences 2013; 5(5): 563-570.

(27) Sadiq IM., Dalai S., Chandrasekaran N., Mukherjee A. Ecotoxicity study of titania (TiO2) NPs on two microalgae species: Scenedesmus sp. and Chlorella sp. Ecotoxicology Environmental Safety 2011; 74(5): 1180-1187.

(28) Wang L., Wang M., Peng C., Pan J. Toxic Effects of Nano-CuO, Micro-CuO and Cu2+ on Chlorella sp. Journal of Environmental Protection 2013; 4(01): 86.

(29) OECD guidelines for testing of chemical. Freshwater algae and cyanobacteria growth inhibition tests, 2011; Test NO.201.

(30) Finny D. Probit analysis. Cambridge: Cambridge University Press; 1971.

(31) Levasseur M., Thompson PA., Harrison PJ. Physiological acclimation of marine phytoplankton to different nitrogen sources 1. Journal of Phycology 1993; 29(5): 587-595.

(32) Fogg GE., Thake B. Algal culture and phytoplankton ecology. 3rd ed. Madison: The University of Wisconsin press; 1987.

(33) ASTM. Standard Practices for Measurement of Chlorophyll Content of Algae in Surface Waters 2012; D3731-87(2012).

(34) Miri MaKB H. Effect of CuO nanoparticle on growth, protein content, Chlorophyll and carotenoid in Chlorella Vulgaris. Journal of Plant Researches 2016; 29(1): 235-242

(35) Levy JL, Stauber JL, Jolley DF. Sensitivity of marine microalgae to copper: the effect of biotic factors on copper adsorption and toxicity. Science of the Total Environment 2007; 387(1-3): 141-154.

(36) Saison C., Perreault F., Daigle J-C., Fortin C., Claverie J., Morin M., et al. Effect of core–shell copper oxide nanoparticles on cell culture morphology and photosynthesis (photosystem II energy distribution) in the green alga, Chlamydomonas reinhardtii. Aquatic Toxicology 2010; 96(2): 109-114.

(37) Perreault F., Oukarroum A., Melegari SP., Matias WG., Popovic R. Polymer coating of copper oxide nanoparticles increases nanoparticles uptake and toxicity in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Chemosphere. 2012; 87(11): 1388-1394.

(38) Oukarroum A., Bras S., Perreault F., Popovic R. Inhibitory effects of silver nanoparticles in two green algae, Chlorella vulgaris and Dunaliella tertiolecta. Ecotoxicology Environmental Safety 2012; 78: 80-85.

(39) Al-Saadi, HA., Kassin, TI., Use of alga Scenedesmus quadricauda in control and treatment of some Heavy metals. Proceedings of International Symposium on Environmental Pollution Control and Waste Management 2002; 7: 147-154.

(40) Da Costa M., Sharma P. Effect of copper oxide nanoparticles on growth, morphology, photosynthesis, and antioxidant response in Oryza sativa. Photosynthetica 2016; 54(1): 110-119.