بهینه‌سازی تولید گلوکونات‌سدیم در دمای زیاد با استفاده از باکتری استیک‌اسید مقاوم به گرما (استوباکتر سنگالنسیس)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسنده

استادیار گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، ‌‌ایران

چکیده

مقدمه: امروزه، گلوکونیک‌اسید و مشتقات آن کاربرد وسیعی در صنایع غذایی دارند؛ بااین‌حال، هنوز پژوهش‌های وسیعی برای بهینه‌سازی تولید این اسید با استفاده از روش‌های تخمیری درحال انجام است. هدف اصلی پژوهش حاضر، بررسی تأثیر دماها و اسیدیته‌های مختلف بر برخی پارامترهای سینتیکی تخمیر و عملکرد مجموعه آنزیم‌های دهیدرو‌ژناز سلول است.
مواد و روش‏‏ها: استوباکتر سنگالنسیس در کشت ناپیوسته در غلظت‌های مختلف قند، دماها و اسیدیته‌های مختلف کشت شد و ویژگی‌های سینتیکی رشد و تولید گلوکونات‌سدیم بررسی شدند؛ سپس تأثیر اسیدیته بر ترکیب جمعیت سلول‌های فاز نمایی و سکون و تولید محصولات جانبی به‌ترتیب با استفاده از فلوسیتومتری و روش‌های کروماتوگرافی بررسی شد.
نتایج: بررسی‌های فلوسیتومتری نشان دادند با پیشرفت تخمیر و ورود سلول‌ها به فاز سکون، جمعیت سلولی واگرا می‌شود و دو زیر‌جمعیت ازنظر فعالیت دهیدروژنازها به وجود می‌آیند. اسیدیتۀ محیط‌کشت تأثیر بسیار زیادی در درصد زیرجمعیت‌های فعال و غیر‌فعال سلول‌ها طی فاز تولید گلوکونیک‌اسید در فاز سکون دارد؛ به‌طوری‌که در اسیدیتۀ کمتر، میزان زیرجمعیت دارای دهیدروژنازهای غیرفعال به‌طور معناداری تا 61 درصد کل جمعیت سلول‌ها افزایش یافت؛ همچنین میزان ناخالصی‌های تولید‌شده به اسیدیتۀ تخمیر وابسته است؛ به‌طوری‌که میزان مشتقات کتونی گلوکونیک‌اسید در اسیدیتۀ 5/4 بیش از 6 برابر افزایش یافت؛ بنابراین، اسیدیته‌های 5 و 5/5 بهترین اسیدیته برای استوباکتر سنگالنسیس به‌منظور تخمیر 95 گرم گلوکز در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد هستند.
بحث و نتیجه‏گیری: استوباکتر سنگالنسیس می‌تواند به‌عنوان باکتری بالقوه برای تولید گلوکونات‌سدیم در دمای زیاد استفاده شود؛ باوجوداین، واگرایی جمعیت سلولی طی تخمیر موجب کاهش تعداد سلول‌های فعال تولیدکنندۀ محصول و درنتیجه، کاهش حداکثر سرعت مصرف منبع کربنی می‌شود. لازم است در پژوهش‌های بعدی راهکارهای جلوگیری از واگرایی جمعیت سلولی یا برگرداندن آنها به حالت اول بررسی شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Improvement of Sodium Gluconate Production using a Thermo-tolerant Acetic Acid bacterium, Acetobacter Senegalensis

نویسنده [English]

  • Rasoul Shafiei
Assistant professor, Department of Biology, Faculty of sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Nowadays, gluconic acid and its derivatives usages have been broadening in food industry. However, there are still many studies to optimize the production of gluconic acid by fermentation methods. The main goal of the present study was to assess the influences of temperature and pH on some fermentation kinetic parameters and activity of total cellular dehydrogenase.
Materials and methods: Acetobacter senegalensis was cultured in batch mode fermentation in different conditions (different concentrations of carbohydrates, temperatures and pHs). In addition, the effect of pH onsub-population formation and by-product production was studied by flow cytometry and different chromatography techniques, respectively.
Results: Flow cytometric assessment showed that bacterial cells segregated during stationary phase, and two sub-populations were appeared based on the activity of total cellular dehydrogenases. Culture medium pH affected the sub-populations formation and the percentage of each sub-population. As culture medium pH decreased, higher percentage(up to 61% of inactive cells) were formed during stationary phase. In addition, it was proved that at low pH (4.5), the percentage of by-products such as keto-gluconic acids increased more than 6 times. Based on the obtained results, the optimum pH for A. senegalensis to ferment 95 g/L glucose to sodium gluconat at 38°C was 5-5.5.
Discussion and conclusion: Acetobacter senegalensis can be used as a potential microorganism to produce gluconic acid. However, cell segregation during fermentation seems to result in decreased active producing cells and decreased maximum glucose consumption rate. In future studies, it is necessary either to find a method to prevent cell population from segregation or to resuscitate them into functional cells.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ketogluconic Acid
  • Fermentation
  • Dehydrogenase
  • Flow Cytometry

مقدمه

مشتقات قندها به‌ویژه مشتقات اسیدی یکی از پر‌مصرف‌ترین ترکیبات در صنایع مختلف محسوب می‌شوند. گلوکونیک‌اسید در بین قندهای یادشده اهمیت ویژه‌ای دارد و درنتیجۀ اکسیداسیون نخستین کربن گلوکز ایجاد می‌شود (1). این قند غیرسمی به‌طور طبیعی در عسل (تا 1 درصد)، نوشیدنی‌های الکلی (تا 25/0 درصد) و سرکه و انواع میوه‌ها یافت می‌شود (2). سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) در سال 1986، گلوکونیک‌اسید و مشتقات آن ازجمله گلوکونو-δ-لاکتون و ‌گلوکونات‌سدیم را به‌عنوان افزودنی‌های مجاز مواد غذایی تأیید کرد (1) و ازاین‌رو، نمک‌های این قند مصارف گسترده‌ای در صنایع غذایی و دارویی یافتند (3). تجزیۀ 98 درصدی گلوکونیک‌اسید طی دو روز و به‌طور طبیعی مهم‌ترین مزیت این ترکیب از جنبۀ زیست‌محیطی است. مشتقات گلوکونیک‌اسید از‌جمله نمک سدیم و کلسیم آن در صنایع غذایی و دارویی، نساجی، تصفیۀ آب، شوینده‌های صنعتی و خانگی استفاده می‌شوند (4)؛ افزون‌بر کاربردهای یادشده، این ترکیب تأثیر مثبتی بر جمعیت باکتری‌های روده دارد و سبب افزایش آنها می‌شود (5)؛ به‌طوری‌که باکتری‌های پروبیوتیک روده گلوکونیک‌اسید را مصرف و محصولاتی مانند لاکتات تولید می‌کنند. محصولات یادشده اسیدیتۀ محیط را کاهش می‌دهند و می‌توانند با اتصال و جذب‌شدن به موکوس برای سلول‌های اپی تلیال انرژی فراهم کنند (6 و 7). یکی از مباحث مهم در غنی‌سازی مواد غذایی، دردسترس قرارگرفتن مواد معدنی آن است؛ ازاین‌رو، گلوکونات‌آهن و گوکونات‌کلسیم که هر دو تأییدیۀ FDA و اتحادیۀ اروپا را دارند، برای غنی‌سازی مواد غذایی استفاده می‌شوند (8).

.روش‌های گوناگونی برای تولید گلوکونیک‌اسید استفاده می‌شوند؛ در بین این روش‌ها، دو روش شیمیایی و زیستی بیشترین کاربرد را دارند. واکنش‌های ناخواسته و پایداری کم از مهم‌ترین کاستی‌های روش شیمیایی به شمار می‌آیند (9) و هزینه‌های زیاد و غیرفعال‌شدن کاتالیست، تولید گلوکونیک‌اسید از طریق روش‌های شیمیایی را با مشکل روبه‌رو کرده است (10)؛ به‌همین‌علت، تولید سبز گلوکونیک‌اسید مدنظر قرار گرفته است. در این روش که از ریزموجودات مختلف استفاده می‌شود، قابلیت انتخابی پیش‌ماده و به‌صرفه‌بودن اقتصادی مدنظر قرار دارد. گونه‌های آسپرژیلوس و پنی‌سیلیوم از مهم‌ترین ریزموجودات مولد گلوکونیک‌اسید هستند که در دیوارۀ سلولی خود آنزیم گلوکزاکسیداز دارند و به‌شدت هوازیند (11). ایجاد حالت میسلیومی و درنهایت، افزایش ویسکوزیتۀ محیط‌کشت و جلوگیری از هوادهی و هموژنیزه‌کردن محیط مشکل عمدۀ قارچ‌های رشته‌ای مانند آسپرژیلوس نایجر[1] است؛ برای حل مشکل یادشده می‌توان از اسپورهای این قارچ در شرایط غیرجوانه‌زنی و حتی تثبیت این اسپورها استفاده کرد (12). باکتری‌های استیک‌اسید، گونه‌های استوباکتر[2]و گلوکونوباکتر[3] نیزگلوکونیک‌اسید را به‌عنوان محصولی فرعی در مسیرهای تجزیه‌ای خود تولید می‌کنند. گلوکونوباکتر اکسیدانس[4] گلوکز را توسط آنزیم موجود در فضای پری‌پلاسمی خود به گلوکونیک‌اسید تبدیل و آن را به خارج از سلول ترشح می‌کند و مقداری از آن را برای تأمین انرژی خود وارد سلول می‌کند؛ این امر به خارج‌شدن اسیدهای قندی از دسترس سایر باکتری‌ها در محیط‌کشت منجر می‌شود و درنهایت، گلوکونوباکتر بدون رقابت به رشد خود در محیط‌کشت ادامه می‌دهد (13). با‌وجود مطالب یادشده، از‌بین‌رفتن جمعیت سلولی و تخریب سلول‌ها به‌ویژه در موارد تنش (دمای زیاد، اسیدیتۀ نامطلوب و ...) طی تخمیر اسید‌های آلی مشکل عمده در صنعت است. پیشنهادهای مختلفی برای رفع این مشکل ارائه شده‌اند؛ برای نمونه، روش‌های تثبیت سلولی برای تبدیل سریع کربوهیدرات‌ها به اسیدهای آلی استفاده می‌شوند (14). باوجوداین، معمولاً روش‌های ارائه‌شده به‌علت پیچیدگی‌های فنی، قابلیت انجام در مقیاس صنعتی را ندارند. استفاده از ریزموجودات گرمادوست و یا ریزموجودات مقاوم به گرما که در دمای بیش از 37 درجۀ سانتی‌گراد رشد و محصول تولید می‌کنند، ضمن کاهش هزینۀ سرمایش بیوراکتورها سبب کاهش امکان آلودگی با ریزموجودات مزوفیل و در اغلب موارد موجب افزایش سرعت رشد و تولید می‌شود (15). استوباکتر سنگالنسیس[5] باکتری مقاوم به گرماییست که در سال 2006 از نوشیدنی‌های درحال تخمیر در کشور سنگال جدا شده است. پژوهش‌های نسبتاً بسیاری دربارۀ استفاده از آن در تولید استارتر سرکه، تولید سرکه در مقیاس نیمه‌صنعتی و ... انجام شده است (16-21). این باکتری در بازۀ دمایی 30 تا 42 درجۀ سانتی‌گراد با استفاده از اتانول به‌خوبی رشد می‌کند (22). در پژوهشی که شفیعی[6] و همکاران در سال 2016 انجام دادند، تولید گلوکونیک‌اسید توسط این باکتری مطالعه شد. در این پژوهش مشخص شد باکتری یادشده توانایی تولید گلوکونات‌سدیم در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد را دارد (15)؛ با‌این‌حال، تولیدگلوکونات‌سدیم و محصولات جانبی آن توسط استوباکتر سنگالنسیس در شرایط مختلف بررسی نشده است.

بر اساس آنچه بیان شد و اطلاعات نویسنده و باوجود مزیت باکتری‌های مقاوم به گرما، پژوهش در زمینۀ استفاده از گونه‌های مقاوم به گرمای جنس استوباکتر برای تولید گلوکونات‌سدیم کمتر انجام شده است. با‌توجه‌به مطالعه‌های پیشین نویسنده (15)، بهینه‌سازی شرایط کشت ناپیوستۀ باکتری استوباکتر سنگالنسیس به‌منظور تولید گلوکونات‌سدیم در دمای زیاد و بررسی اثر اسیدیته بر جمعیت سلولی طی فازهای رشد و تولید و تأثیر آن بر تولید محصولات جانبی هدف اصلی پژوهش حاضر است؛ همچنین علل کاهش سرعت مصرف قند در اسیدیته‌های مختلف با بررسی جمعیت سلولی در فازهای مختلف بررسی خواهند شد.

 

مواد و روش‏ها

ریزموجود مورداستفاده و روش کشت: در پژوهش حاضر از استوباکتر سنگالنسیس استفاده شد که نخستین‌بار از ترکیبات درحال تخمیر در کشور سنگال جداسازی شده است (16). این باکتری در ویال‌های میکروبانک شرکت پرولب[7] در دمای منفی 70 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری و برای کشت آن در محیط جامد و تهیۀ مایۀ تلقیح از محیط GYEA[8] استفاده شد. این محیط حاوی ترکیبات زیر است: 20 گرم‌در‌لیتر گلوکز، 50 گرم‌در‌لیتر اتانول، 5 گرم‌در‌لیتر استیک‌اسید، 5 گرم‌در‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌در‌لیتر پپتون کازئین و 15 گرم‌در‌لیتر آگار. در مواردی که به کشت مایع نیاز بود، آگار از ترکیب محیط‌کشت حذف شد. پس‌از کشت باکتری روی پلیت حاوی محیط GYEA، پلیت‌ها به‌مدت 48 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط هوازی گرماگذاری شدند. از کلنی‌های خالص برای تلقیح به محیط مایع استفاده شد.

تهیۀ مایۀ تلقیح: در پژوهش حاضر، مایۀ تلقیح به‌منظور تولید سوسپانسون باکتری (زیست‌توده) لازم برای تلقیح به بیوراکتور استفاده شد. محیط‌کشت مایع GYEA برای تهیۀ مایۀ تلقیح استفاده شد. این محیط در ارلن‌های 500 میلی‌لیتری و به حجم 200 میلی‌لیتر تهیه شد. پس‌از تلقیح کلنی خالص به این محیط، ارلن‌ها روی شیکر (150 دوردردقیقه) و در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. هنگامی که جذب نوری در طول موج 540 نانومتر (OD540nm) به حدود 1/0±5/1 رسید، سوسپانسون سلولی برای تلقیح به بیوراکتور استفاده شد. بر اساس آزمایش‌های اولیه، میزان سلول‌ها در این جذب نوری برابر با 105×5 در هر میلی‌لیتر بود.

تخمیر گلوکونیک‌اسید: تخمیر گلوکونیک‌اسید در بیوراکتورهای آزمایشگاهی شرکت Infors مدل Labfors با حجم کل 5/2 لیتر و حجم مفید 2 لیتر انجام شد. بیوراکتور مجهز به حسگرهای دما، اسیدیته، اکسیژن محلول و ضد کف بود و هوادهی آن با استفاده از اسپارژر و دو پروانه روشتون انجام شد. برای انجام تخمیر از محیط‌کشت GY استفاده شد که حاوی ترکیبات زیر بود:

95 گرم‌در‌لیتر گلوکز، 7 گرم‌در‌لیتر عصارۀ مخمر، 7 گرم‌در‌لیتر پپتون کازئین، 1 گرم‌در‌لیتر آمونیوم‌فسفات، 2/0 گرم‌در‌لیتر سولفات‌منیزیم. اسیدیتۀ اولیۀ محیط پس‌از استریل‌کردن محیط‌کشت با فسفریک‌اسید و هیدروکسید‌سدیم در چهار سطح 4، 5/4، 5 و 5/5 تنظیم شد.

برای انجام تخمیر، 2 لیتر محیط‌کشت GY درون بیوراکتور (دمای 121 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه) استریل شد. گلوکز موجود در این محیط به‌طور جداگانه استریل و پس‌از خنک‌شدن بیوراکتور و در شرایط استریل به آن اضافه شد. پس‌از خنک‌شدن و در شرایط استریل، مایۀ تلقیح یادشده در بخش پیش به آن اضافه و تخمیر در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد با میزان هوادهی vvm 1 انجام شد. اسیدیتۀ محیط‌کشت طی تخمیر با فسفریک‌اسید و هیدروکسیدپتاسیم ثابت نگه داشته شد. نمونه‌گیری طی ساعت‌های مختلف و در شرایط استریل انجام شد و نمونه‌ها ازنظر بررسی مقدار قند، میزان زیست‌تودۀ سلول و ‌گلوکونات‌سدیم تولید‌شده بررسی شدند.

بررسی کیفی میزان گلوکونات‌سدیم، 2-کتوگلوکونات و 5-کتوگلوکونات: بررسی کیفی و نیمه‌کمی گلوکونات‌سدیم، 2-کتوگلوکونات و 5-کتوگلوکونات توسط کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و استفاده از صفحۀ نازک سیلیکاژل (Silica Gel 60 plate) مطابق با روش سایشینو[9] انجام شد (23). 5 میکرولیتر از استاندارد‌های هریک از ترکیبات مورد‌بررسی و نیز مایع رویی محیط‌کشت (فیلترشده) در انتهای صفحۀ سیلیکاژل قرار داده و در دمای اتاق خشکانده شد. حلال (فاز متحرک) شامل اتیل‌استات، استیک‌اسید، متانول و آب دیونیزه به نسبت 1: 5/1: 5/1: 6 استفاده شد. معرف ایجاد‌کنندۀ رنگ شامل مخلوط دی‌فنیل‌آمین (2 گرم)، آنیلین (2 میلی‌لیتر)، استون (100 میلی‌لیتر) و فسفریک‌اسید (15 میلی‌لیتر) به‌شکل تازه تهیه شد. پس‌از قرار‌دادن صفحۀ سیلیکاژل به‌مدت حدود 1 ساعت در تانک حاوی حلال و در دمای اتاق (25 تا 30 درجۀ سانتی‌گراد)، صفحۀ سیلیکاژل در دمای اتاق خشک و معرف ایجادکنندۀ رنگ روی آن اسپری شد. سپس صفحۀ سیلیکاژل به‌مدت 20 دقیقه برای ایجاد رنگ در دمای 120 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. 2-کتوگلوکونات و 5-کتوگلوکونات به‌ترتیب به‌شکل لکه‌های بنفش- قرمز تیره و قرمز تیره ظاهر شدند.

اندازه‌گیری میزان زیست‌تودۀ سلول، گلوکونات‌سدیم و مشتقات کتونی: اندازه‌گیری زیست‌تودۀ سلول، گلوکونات‌سدیم، 2-کتوگلوکونات، 5-کتوگلوکونات و تعداد سلول‌های قابل‌کشت بر اساس روش شفیعی و همکاران (2017 و 2013) انجام شد (15 و 19). به‌طور خلاصه، کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد (Agilent 1110) مجهز به ستون Supelcogel C610 در دمای 40 درجۀ سانتی‌گراد و جریان 5/0 میلی‌متردردقیقه برای سنجش غلظت ترکیبات یادشده استفاده شد. فسفریک‌اسید 1/0 درصد به‌عنوان فاز متحرک استفاده شد و گلوکونات و مشتقات آن در 210 نانومتر شناسایی شدند.

بررسی عملکرد آنزیم‌های دهیدروژناز طی مراحل مختلف تخمیر: تأثیر شرایط تخمیر روی عملکرد آنزیم‌های دهیدروژناز سلول در دو فاز نمایی و سکون در هر اسیدیته بررسی شد. پس‌از نمونه‌گیری از بیوراکتور در فاز رشد، تعداد سلول‌ها با استفاده از محیط‌کشت جدید GY (به بخش تخمیر مراجعه کنید) در حد 107 سلول در هر میلی‌لیتر تنظیم شد. از فلوروکروم[10] CTC برای بررسی عملکرد مجموعه آنزیم‌های دهیدروژناز در سلول‌های زنده و از رنگ تیازولین نارنجی[11] (TO) برای رنگ‌آمیزی سلول‌های مرده و زنده استفاده شد. میزان غلظت و زمان رنگ‌آمیزی طبق روش شفیعی و همکاران (2013) تنظیم شد (20)..

 

نتایج

بر اساس مطالعۀ پیشین شفیعی و همکاران (2017)، استوباکتر سنگالنسیس در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد می‌تواند 95 گرم‌در‌لیتر گلوکز را در اسیدیتۀ 5/5 تحمل و با بازدۀ بیش از 80 درصد گلوکز را به گلوکونیک‌اسید تبدیل کند (15). در مطالعۀ حاضر، میزان تولید گلوکونات‌سدیم و مشتقات آن در کشت ناپیوسته در دو دمای 30 و 38 درجۀ سانتی‌گراد و اسیدیته‌های مختلف بررسی شد.

بررسی تأثیر دما، غلظت قند و اسیدیته بر برخی پارامترهای سینتیکی تخمیر: در اسیدیتۀ ثابت و کنترل‌شده (5/5) و دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد، استوباکتر سنگالنسیس می‌تواند قند گلوکز را تا 120 گرم‌در‌لیتر طی مدت 69 ساعت مصرف کند. افزایش غلظت قند موجب کاهش بسیار شدید سرعت مصرف قند می‌شود؛ به‌طوری‌که زمان تخمیر بسیار طولانی می‌شود و تخمیر ناتمام به پایان می‌رسد؛ بر این اساس در پژوهش حاضر، تخمیر بیش از 120 گرم‌در‌لیتر قند گلوکز استفاده نشد. همان‌طور‌که در جدول 1 مشاهده می‌شود، بین حداکثر سرعت مصرف قند و دمای تخمیر و غلظت اولیۀ قند رابطه وجود دارد. اگرچه حداکثر سرعت تولید زیست‌تودۀ سلول به دما وابسته است، در غلظت‌های مختلف قند در دمای ثابت مشابه است. با افزایش دما به 38 درجۀ سانتی‌گراد در غلظت اولیۀ 120 گرم‌در‌لیتر قند گلوکز، تولید زیست‌تودۀ سلول با μmax. بیشتر از دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد پیش می‌رود؛ با‌این‌حال، حداکثر سرعت مصرف قند گلوکز با افت شدید نسبت به دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد روبه‌‌رو می‌شود. با کاهش غلظت اولیۀ قند در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد، حداکثر سرعت مصرف قند دوباره افزایش می‌یابد؛ اما تا‌حدی نسبت به دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد کمتر است و بنابراین در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد، غلظت 95 گرم‌در‌لیتر گلوکز و یا کمتر از آن برای تولید گلوکونیک‌اسید مناسب است.

ازآنجاکه گلوکونیک‌اسید یک اسید آلی و تأثیر آن بر سلول به اسیدیته وابسته است، تأثیر اسیدیتۀ محیط‌کشت بر برخی پارامترهای سینتیکی تخمیر بررسی شد. بر اساس نتایج، حداکثر سرعت مصرف قند با کاهش اسیدیته به‌طور معناداری در هر دو دمای 30 و 38 درجۀ سانتی‌گراد کاهش می‌یابد (جدول 2)؛ به‌طوری‌که در اسیدیتۀ 4، سرعت مصرف قند در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد ناچیز است و تخمیر به‌طور کامل انجام نمی‌شود و بیش از 50 درصد قند در محیط باقی می‌ماند. با افزایش اسیدیته، زمان مصرف گلوکز به‌طور معناداری کاهش می‌یابد؛ به‌طوری‌که این زمان در اسیدیتۀ 5/4 حدود 88 ساعت است و در اسیدیتۀ 5/5 به 48 ساعت کاهش می‌یابد. استوباکتر سنگالنسیس در اسیدیتۀ 5/4 تا 5 بیش از 80 درصد گلوکز اولیه را در هر دو دمای یادشده به گلوکونات‌سدیم تبدیل می‌کند. با‌توجه‌به نتایج این بخش و به‌منظور دستیابی به حداقل زمان تولید، در ادامۀ کار برای تولید گلوکونات‌سدیم در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد از 95 گرم‌در‌لیتر قند گلوکز در اسیدیتۀ 5/5 استفاده شد.

 

 

جدول 1- پارامترهای سینتیکی تخمیر مقادیر مختلف قند گلوکز به گلوکونیک‌اسید در دماهای مختلف و اسیدیتۀ 5/5 *

 

30 درجۀ سانتی‌گراد

38 درجۀ سانتی‌گراد

غلظت قند

(گرم‌درلیتر)

120

95

75

120

95

75

μmax

(بر ساعت)

57/0

51/0

53/0

63/0

68/0

66/0

qs max

(بر ساعت)

1/3

8/3

3/4

2/1

2/3

7/3

*اسیدیته در تمام طول تخمیر ثابت نگه داشته شد (2/0±)

 

جدول 2- پارامترهای سینتیکی تخمیر 95 گرم‌در‌لیتر قند گلوکز به گلوکونات‌سدیم در دما و اسیدیته‌های مختلف و کنترل‌شده

 

30 درجۀ سانتی‌گراد

38 درجۀ سانتی‌گراد

اسیدیتۀ 5/5

اسیدیتۀ 0/5

اسیدیتۀ 5/4

اسیدیتۀ 0/4

اسیدیتۀ 5/5

اسیدیتۀ 0/5

اسیدیتۀ 5/4

اسیدیتۀ 0/4

μmax.x

(بر ساعت)

51/0

43/0

47/0

28/0

50/0

51/0

48/0

19/0

qs max

(بر ساعت)

8/3

9/3

7/2

3/1

2/4

5/3

3/1

4/0

* اسیدیته در تمام طول تخمیر ثابت نگه داشته شد (2/0±)

 

 

همان‌طور که شکل 1 نشان می‌دهد اگرچه گلوکونات‌سدیم در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد در هر دو مرحلۀ رشد (فاز نمایی و سکون) تولید می‌شود، عمده تولید آن در فاز سکون است. با‌توجه‌به میزان قند اولیه (95 گرم‌در‌لیتر)، در تمام حالات حدود 80 گرم‌در‌لیتر گلوکونات‌سدیم تشکیل می‌شود. به‌طورکلی، در تمام اسیدیته‌‌ها درصد کمی از قند گلوکز به‌عنوان پیش‌ماده برای رشد سلول‌ها استفاده می‌شود و بخش عمدۀ گلوکز موجود در محیط صرف تولید گلوکونات‌سدیم می‌شود. با کاهش اسیدیته، زمان تخمیر طولانی‌تر می‌شود (شکل 1، A)؛ به‌طوری که تولید گلوکونیک‌اسید در اسیدیتۀ 5/4 به زمان طولانی (حدود 80 ساعت) نیاز دارد، اما در اسیدیته‌های بیشتر (5 تا 5/5) مدت تخمیر نهایتاً 36 ساعت است؛ باوجوداین، اسیدیته تأثیری بر فاز نمایی ندارد و رشد سریع سلول‌ها در همۀ موارد انجام می‌شود (شکل 1، A-C).

 

 
 
 

شکل 1- منحنی رشد (◊) و تولید گلوکونات‌سدیم (∆) طی تخمیر ناپیوسته در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد و اسیدیته‌های ثابت و کنترل‌شده (میزان قند اولیه 95 گرم‌در‌لیتر بوده است)؛ A. تخمیر در اسیدیتۀ 2/0±5/4، B. تخمیر در اسیدیتۀ 2/0±0/5، C. تخمیر در اسیدیتۀ 2/0±5/5

 

بررسی میزان تولید محصولات جانبی طی تخمیر گلوکونیک‌اسید:در پژوهش حاضر، میزان تولید محصولات جانبی تخمیر بررسی شد. به این منظور، نمونه‌های گرفته‌شده در ساعت‌های پایانی تخمیر با دو روش کیفی و کمی یعنی کروماتوگرافی لایه نازک و HPLC تجزیه‌و‌تحلیل شدند. بررسی با کروماتوگرافی لایۀ نازک نشان داد گلوکونات‌سدیم ترکیب عمدۀ تولید‌شده در هر سه اسیدیتۀ 5/4، 5 و 5/5  است. همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود در اسیدیته‌های 5 و 5/5، گلوکونات‌سدیم محصول غالب تولیدشده است. در هر سه اسیدیته، نوار باریک قرمزرنگی دیده می‌شود که وجود مشتقات کتونی گلوکونیک‌اسید را نشان می‌دهد؛ با‌این‌حال، نتایج کروماتوگرافی لایه نازک قطعیت لازم را ندارند و از‌این‌رو، تجزیه‌و‌تحلیل با استفاده از کروماتوگرافی مایع تحت فشار زیاد انجام شد.

 

 

شکل 2- کروماتوگرافی لایه نازک برای تشخیص محصولات تخمیر گلوکز توسط استوباکتر سنگالنسیس در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد و اسیدیته‌های مختلف. نمونه مخلوط (Mix) شامل گلوکونات‌سدیم (Gluc)، 2-کتوگلوکونات (2-KT)، گلوکز و 5-کتوگلوکونات (5-KT) است. اسیدیته‌ها اسیدیته‌ای را نشان می‌دهند که تخمیر گلوکونیک‌اسید در آن انجام شده است. نمونۀ شاهد شامل محیط‌کشت اولیه بدون تلقیح باکتری است.

 

تجزیه‌و‌تحلیل کمی نمونه‌های تخمیر با HPLC تا حد زیادی داده‌های کروماتوگرافی لایه نازک را تأیید کرد؛ به‌طوری‌که گلوکونات‌سدیم (79 گرم‌در‌لیتر) و 2-کتوگلوکونیک‌اسید (2/1 گرم‌در‌لیتر) مهم‌ترین ترکیبات تولیدشده در انتهای تخمیر و در اسیدیته‌های 5 و 5/5 بودند و در هر دو اسیدیته، میزان 5-کتوگلوکونیک‌اسید بسیار ناچیز (05/0 گرم‌در‌لیتر) بود. افزایش میزان 2-کتوگلوکونیک‌اسید در اسیدیتۀ 5/4 جالب بود؛ به‌طوری‌‌که میزان این ترکیب حدود 6 برابر تخمیر در اسیدیتۀ 5/5-5 بود. اگرچه کروماتوگرافی لایه نازک میزان گلوکونات‌سدیم را در اسیدیتۀ 5/4 ناچیز نشان داد ( شکل 2)، تجزیه‌و‌تحلیل HPLC میزان گلوکونات‌سدیم را 3/79 گرم‌درلیتر نشان داد.

در پژوهش حاضر، به‌منظور پی‌بردن به ترکیب جمعیت سلول‌ها طی تخمیر و یافتن علت کاهش حداکثر سرعت تولید در اسیدیته‌های کمتر از دو فاز نمایی و سکون هر تخمیر نمونه‌گیری و فعالیت مجموعه آنزیم‌های دهیدروژناز سلولی با فلوسیتومتر تجزیه‌و‌تحلیل شد.

 

 

     
     

شکل 3- بررسی فلوسیتومتری فعالیت مجموعه دهیدروژنازهای سلول‌های استوباکتر سنگالنسیس طی تخمیر گلوکونیک‌اسید. سلول‌ها از دو فاز نمایی و سکون در اسیدیته‌های مختلف به دست آمدند و فعالیت مجموعه دهیدروژنازهای آنها بررسی شدند. سلول‌ها در محیط‌کشت حاوی گلوکز در معرض CTC (معرف دهیدرو‌ژنازهای فعال) و در دمای 38 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شدند و سپس با رنگ TO رنگ‌آمیزی شدند. A-C به‌ترتیب عملکرد دهیدروژ‌نازها را در جمعیت سلول‌های فاز نمایی در اسیدیته‌های 5/4، 5 و 5/5 و D-F به‌ترتیب عملکرد دهیدروژ‌نازها را در جمعیت سلول‌های فاز سکون در اسیدیته‌های 5/4، 5 و 5/5 نشان می‌دهند. مناطقی که جمعیت سلول‌ها دهیدروژناز فعال دارند با Deh pos. و مناطقی که جمعیت سلول‌ها ازنظر فعالیت دهیدروژنازی منفی است با علامتDeh Neg.  مشخص شده است. به‌طور خلاصه، با کاهش اسیدیته به 5/4 (قسمت D)، میزان جمعیت سلول‌های غیرفعال (Deh. Neg) در فاز سکون افزایش می‌یابد.

 

 

بر اساس نتایج (شکل 3)، جمعیت باکتری‌ها (بیش از 90 درصد سلول‌ها) در فاز نمایی در هر سه اسیدیتۀ 5/4، 5 و 5/5 با داشتن مجموعه آنزیم‌های دهیدروژناز فعال قادر به انجام تنفس و احیای رنگ CTC هستند و بنابراین، همگی به‌طور زنده ظاهر می‌شوند. این نتایج با نتایج جدول 2 همخوانی دارد؛ زیرا در فاز نمایی که حداکثر سرعت رشد در آن دیده می‌شود، μmax در همۀ حالات بسیار به هم نزدیک است. ترکیب جمعیت سلولی در فاز سکون نسبت به فاز نمایی تغییر می‌کند و به دو بخش سلول‌های دارای دهیدروژناز فعال و سلول‌های دارای دهیدروژناز غیرفعال تبدیل می‌شود. تشکیل این ترکیب جمعیتی هرچند به اسیدیته وابسته نیست و در تمام اسیدیته‌ها اتفاق می‌افتد، درصد سلول‌های فعال و غیرفعال به اسیدیتۀ محیط‌کشت وابسته است. با‌توجه‌به اینکه نمونه‌گیری برای همۀ تخمیرها در شرایط یکسان (با‌توجه‌به شکل 1، زمانی که میزان غلظت گلوکونات‌سدیم 60 گرم‌در‌لیتر بود) انجام شد، میزان سلول‌های غیرفعال ازنظر دهیدروژنازها با کاهش اسیدیته افزایش می‌یابد؛ جالب اینکه در اسیدیتۀ 5/4، بیش از 61 درصد سلول‌های فاز سکون به‌شکل دهیدروژناز منفی ظاهر می‌شوند (شکل 3، D) و این در حالیست که زیرجمعیت غیرفعال در اسیدیته‌های 5 و 5/5 به‌ترتیب 52 و 45 درصد است.

 

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، شرایط رشد و تولید گلوکونیک‌اسید توسط استوباکتر سنگالنسیس که باکتری مقاوم به گرماست، بررسی و تأثیرغلظت قند در دماها و اسیدیته‌های مختلف بر برخی پارامترهای سینتیکی تخمیر مطالعه شد. همچنین تولید مهم‌ترین محصولات جانبی بررسی شد.

امروزه، تولید گلوکونیک‌اسید در محصولات تخمیری غذایی ازجمله نوشیدنی‌ها مدنظر قرار گرفته است. اگرچه طی سال‌های اخیر، گونه‌های متعددی از باکتری‌های مولد استیک‌اسید برای تولید گلوکونیک‌اسید یا مشتقات کتونی آن آزمایش شده‌اند (24)، باکتری‌های استیک‌اسید گرمادوست یا مقاوم به گرما کمتر مورد‌توجه قرار گرفته‌اند و دلیل این امر احتمالاً ماهیت پیش‌مادۀ مورداستفاده (اغلب ضایعات میوه) است (25)؛ زیرا انجام تخمیر در دمای زیاد تأثیر نامطلوبی بر ویژگی‌های حسی آنها می‌گذارد. در مواردی که ویژگی‌های حسی مطرح نباشند، تولید محصولات تخمیری در دمای زیاد به‌علت کاهش هزینه‌های خنک‌سازی بیوراکتورها و همچنین کاهش امکان آلودگی اهمیت بسزایی دارد. با‌توجه‌به اینکه دمای در‌نظر‌گرفته‌شده در پژوهش حاضر 38 درجۀ سانتی‌گراد بود، فعالیت متابولیسمی باکتری می‌تواند این دما را طی مراحل رشد و تولید گلوکونیک‌اسید ایجاد ‌کند و نیازی به تأمین گرما برای رسیدن به این دما نیست.

بر اساس پژوهش‌های جدید، واگرایی جمعیت سلول‌های میکروبی طی تخمیر موجب تغییرات ملایم تا شدید در فرایند تولید می‌شود. در پژوهش حاضر ثابت شد سلول‌ها ازنظر فعالیت دهیدروژنازی در فاز نمایی کاملاً یکدست‌اند، اما طی فاز سکون به دو زیرجمعیت دهیدروژناز مثبت و دهیدروژناز منفی تقسیم می‌شوند. ازآنجاکه تبدیل گلوکز به گلوکونات‌سدیم در اثر فعالیت تخمیری اکسیداتیو اتفاق می‌افتد و این کاتابولیسم در باکتری‌های استیک‌اسید به دهیدروژنازهای غشایی- پری‌پلاسمی وابسته است، کاهش فعالیت یا غیر‌فعال‌شدن دهیدروژناز‌ها طی فاز سکون احتمالاً موجب خارج‌شدن بخشی از جمعیت سلولی از چرخۀ متابولیسمی تولید گلوکونیک‌اسید می‌شود. این امر با داده‌های جدول 2 هماهنگی دارد؛ زیرا حداکثر سرعت مصرف گلوکز (که در فاز سکون است) باکاهش اسیدیته کاهش می‌یابد و به عبارتی، هرچه از جمعیت سلولی فعال (سلول‌های دهیدروژناز مثبت) کاسته شود، میزان سرعت مصرف قند نیز کم می‌شود. دلایل متعدی برای غیرفعال‌شدن مجموعه دهیدروژنازهای سلول وجود دارد که ازجملۀ آنها عبارتند از: افزایش تأثیر اسیدهای آلی (مانند استیک‌اسید و یا لاکتیک‌اسید و ...) بر متابولیسم سلول‌ها در اسیدیتۀ کم و کاهش ترکیبات احیاکنندۀ داخل سلولی. اگرچه گلوکونیک‌اسید نیز جزئی از اسیدهای آلی محسوب می‌شود، در مطالعه‌های اولیه ثابت شد در صورت انتقال سلول‌های فاز نمایی به محیط‌کشت حاوی غلظت زیاد گلوکونات‌سدیم در اسیدیته‌های مختلف، رشد وتکثیر سلول‌ها بی‌وقفه ادامه می‌یابد؛ ازاین‌رو، غیرفعال‌شدن سلول‌ها نمی‌تواند در اثر تأثیر منفی گلوکونات‌سدیم باشد و دلایل دیگری دارد.

مهم‌ترین محصولات جانبی‌ای که طی تولید گلوکونیک‌اسید تولید می‌شوند، مشتقات کتونی گلوکونیک‌اسید هستند. این محصولات طی یک سری واکنش‌های متوالی تولید می‌شوند که توسط دهیدروژنازهای وابسته به غشای سلول در فضای پری‌پلاسمی انجام می‌شوند (26). ترکیبات یادشده اهمیت دارند و در تولید ترکیبات دارویی نظیر ویتامین ث استفاده می‌شوند؛ باوجوداین، اگر هدف تولید گلوگونیک‌اسید یا نمک‌های آن باشد، تولید محصولات جانبی باید به حداقل برسد. در پژوهش حاضر ثابت شد استوباکتر سنگالنسیس به مقدار بسیار اندک 2- کتوگلوکونات تولید می‌کند و میزان 5-کتو‌گلوکونات بسیار ناچیز است؛ همچنین تولید محصولات کتونی تا حدی به اسیدیتۀ محیط‌کشت وابسته است. باکتری‌های استیک‌اسید ازنظر تولید محصولات جانبی بسیار متنوعند و به نظر می‌رسد میزان تولید مشتقات کتونی به عوامل مختلفی وابسته است؛ برای نمونه، نتایج پژوهش Saichana و همکاران (2009) نشان دادند تولید 5-کتوگلوکونیک‌اسید توسط جدایۀ گلوکونوباکتر مقاوم به گرما (37 درجۀ سانتی‌گراد) به دمای محیط‌کشت وابسته است (23).

بر اساس نتایج، باکتری استوباکتر سنگانسیس قادر است در دمای زیاد  (38 درجۀ سانتی‌گراد) ضمن تولید گلوکونات‌سدیم، کمترین مقدار محصولات جانبی را تولید کند؛ همچنین با‌توجه‌به تجزیه‌و‌تحلیل فلوسیتومتری، در صورت تشکیل زیرجمعیت‌ها میکروبی مختلف طی تخمیر، احتمال تغییر روند تولید نظیر کاهش سرعت تولید، اتمام زودرس تخمیر و ... وجود دارد؛ بنابراین، لازم است راهکارهایی برای کاهش تشکیل زیرجمعیت‌ها هنگام تخمیر در پیش گرفته شوند.

 

سپاسگزاری

پروژۀ حاضر با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاری‌های علمی بین‌المللی انجام شده است.



[1]- Aspergillus niger

[2]- Acetobacter

[3]- Gluconobacter

[4]- Gluconobacter oxydans

[5]- Acetobacter senegalensis

[6]- Shafiei

[7]- Prolab®

[8]- Glucose-yeast extarct- ethanol- acetic acid medium

[9]- Saichana

[10]- 5-Cyano-2,3-ditolyl-2H-tetrazolium chloride 

[11]- Thiazole orange

(1)              Ramachndran S., Fontanille P., Pandey A., Larroche C. Gluconic acid: Properties, applications and microbial production. Food Technology and Biotechnology 2006; 44: 185-95.

(2)              Mounir M., Shafiei R., Zarmehrkhorshid R., Hamouda A., Alaoui MI., Thonart P. Simultaneous production of acetic and gluconic acids by a thermotolerant Acetobacter strain during acetous fermentation in a bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering 2016; 121(2): 166-171.

(3)              Ordóñez JL., Cañete‐Rodríguez AM., Callejón RM., Santos‐Dueñas MI., Troncoso AM., García‐García I., et al. Effect of gluconic acid submerged fermentation of strawberrypurée on amino acids and biogenic amines profile. Journal of Food Processing and Preservation 2017; 41(2): e12787.

(4)              Blom RH., Pfeifer VF., Moyer AJ., TraufRer DH., Conway HF., Crocker CK., et al. Sodium gluconate production: Fermentation with Aspergillus niger. Industrial and Engineering Chemistry 1952; 44(2): 435-440.

(5)              Poeikhampha T., Bunchasak C. Comparative effects of sodium gluconate, mannan oligosaccharide and potassium diformate on growth performances and small intestinal morphology of nursery pigs. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 2011; 24(6): 844-850.

(6)              Asano T., Kondo R., Mori Y. Bifidobacterium growth promotant. U.S. Patent No. 5,800,830. 1 Sep. 1998.

(7)              Tsukahara T., Koyama H., Okada M., Ushida K. Stimulation of butyrate production by Gluconic acid in batch culture of pig cecal digesta and identification of Butyrate-producing bacteria. The Journal of Nutrition 2002; 132(8): 2229-2234.

(8)              Fairweather-Tait SJ., Teucher B. Iron and calcium bioavailability of fortified foods and dietary supplements. Nutrition Reviews 2002; 60(11): 360-367.

(9)              Biella S., Prati L., Rossi M. Selective oxidation of D-Glucose on gold catalyst. Journal of Catalysis 2002; 206(2): 242-247.

(10)          Pal P., Kumar R., Banerjee S. Manufacture of gluconic acid: A review towards process intensification for green production. Chemical Engineering and Processing 2016; 104: 160-171.

(11)          Johnstone-Robertson M., Clarke KG., Harrison STL. Characterization of the distribution of glucose oxidase in Penicillium sp. CBS 120262 and Aspergillus niger NRRL-3 cultures and its effect on integrated product recovery. Biotechnology and Bioengineering 2008; 99(4): 910-918.

(12)          Ramachandran S., Fontanille P., Pandey A., Larroche C. Permeabilization and inhibition of the germination of spores of Aspergillus niger for gluconic acid production from glucose. Bioresource Technology 2008; 99(11): 4559-4565.

(13)          Velizarov S., Beschkov V. Biotransformation of glucose to free gluconic acid by Gluconobacter oxydans: substrate and product inhibition situtations. Process Biochemistry 1998; 33(5): 527-534.

(14)          Sankpal N., Kulkarni B. Optimization of fermentation conditions for gluconic acid production using Aspergillus niger immobilized on cellulose microfibrils. Process Biochemistry 2002; 37(12): 1343-1350.

(15)          Shafiei R., Zarmehrkhorshid R., Mounir M., Thonart P., Delvigne F. Influence of carbon sources on the viability and resuscitation of Acetobacter senegalensis during high-temperature gluconic acid fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering 2017; 40(5): 769-780.

(16)          Ndoye B., Cleenwerck I., Engelbeen K., Dubois-Dauphin R., Guiro AT., Van Trappen S., et al. Acetobacter senegalensis sp. nov., a thermotolerant acetic acid bacterium isolated in Senegal (sub-Saharan Africa) from mango fruit (Mangifera indica L.). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2007; 57(7): 1576-1581.

(17)          Ndoye B., Lebecque S., Destain J., Guiro AT., Thonart P. A new pilot plant scale acetifier designed for vinegar production in Sub-Saharan Africa. Process Biochemistry 2007; 42(11): 1561-1565.

(18)          Ndoye B., Weekers F., Diawara B., Guiro AT., Thonart P. Survival and preservation after freeze-drying process of thermoresistant acetic acid bacteria isolated from tropical products of Subsaharan Africa. Journal of food engineering 2007; 79(4): 1374-1382.

(19)          Shafiei R., Delvigne F., Babanezhad M., Thonart P. Evaluation of viability and growth of Acetobacter senegalensis under different stress conditions. International Journal of Food Microbiology 2013; 163(2-3): 204-213.

(20)          Shafiei R., Delvigne F., Thonart P. Flow-cytometric assessment of damages to Acetobacter senegalensis during freeze-drying process and storage. Acetic Acid Bacteria 2013; 2(1s): 10.

(21)          Shafiei R., Zarmehrkhorshid R., Bentaib A., Babanezhad M., Leprince P., Delvigne F., et al. The role of protein modifications in senescence of freeze-dried Acetobacter senegalensis during storage. Microbial cell factories 2014; 13(1): 26.

(22)          Ndoye B., Lebecque S., Dubois-Dauphin R., Tounkara L., Guiro A-T., Kere C., et al. Thermoresistant properties of acetic acids bacteria isolated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar. Enzyme and Microbial Technology 2006; 39(4): 916-923.

(23)          Saichana I., Moonmangmee D., Adachi O., Matsushita K., Toyama H. Screening of thermotolerant Gluconobacter strains for production of 5-keto-D-gluconic acid and disruption of flavin adenine dinucleotide-containing D-gluconate dehydrogenase. Applied and Environmental Microbiology 2009; 75(13): 4240-4247.

(24)          Sainz F., Navarro D., Mateo E., Torija M., Mas A. Comparison of d-gluconic acid production in selected strains of acetic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology 2016; 222: 40-47.

(25)          Cañete-Rodríguez AM., Santos-Dueñas IM., Torija-Martínez MJ., Mas A., Jiménez-Hornero JE., García-García I. Preparation of a pure inoculum of acetic acid bacteria for the selective conversion of glucose in strawberry purée into gluconic acid. Food and Bioproducts Processing 2015; 96: 35-42.

(26)          Kataoka N., Matsutani M., Yakushi T., Matsushita K. Efficient production of 2, 5-diketo-d-gluconate via heterologous expression of 2-keto-gluconate dehydrogenase in Gluconobacter japonicus. Applied and Environmental Microbiology 2015; AEM. 04176-14.