تولید زیستی نانوذرات نقره با استفاده از قارچ Aspergillus flavus و بررسی برخی عوامل موثر بر آن

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران

چکیده

مقدمه: قارچ‌ها، منابع آنزیمی برای کاتالیز واکنش‌های ویژه‌ای هستند که به ساخت نانوذرات غیرآلی منجر می‌شوند و استفاده از قارچ‌ها در حال توسعه است. قارچ LinkAspergillus flavus پتانسیل زیادی برای سنتز خارج‌سلولی نانوذرات نقره دارد و به علت رشد سریعی که این قارچ در محیط ساده دارد، استفاده از آن در مقایسه با سایر روش‌ها بسیار ارزان است.
مواد و روش‏‏ها: تولید نانوذرات نقره با افزودن نیترات‌نقره 1 میلی‌مولار به عصارۀ سلولی قارچ A. flavusانجام شد. وجود نانوذرات به‌طور چشمی و با‌توجه‌به تغییر‌رنگ عصاره و طیف‌سنجی نور فرابنفش- مرئی تأیید شد. بررسی‌های بیشتر با روش‌های XRD، FTIR و TEM انجام شدند. پایداری نانوذرات بیوسنتز‌شده و اثر محیط‌کشت و غلظت نیترات‌نقره روی تولید نانوذرات نیز بررسی شد.
نتایج: رنگ عصارۀ سلولی قارچ از بیرنگ به قهوه‌ای تغییر یافت که تولید خارج‌سلولی نانوذرات نقره را نشان می‌دهد. داده‌های طیف‌سنجی، وجود پیک در 420 نانومتر را نشان دادند که ویژۀ نانوذرات نقره است. طیف حاصل از پراش اشعۀ ایکس نیز ماهیت کریستالی نانوذرات تولیدشده را نشان داد. بررسی شکل و اندازۀ نانوذرات با TEM مشخص کرد نانوذرات نقرۀ تولید‌شده کروی‌شکل و پراکنده هستند و میانگین اندازۀ آنها 2/18 نانومتر است. نانوذرات نقرۀ حاصل تا 11 ماه پایداری نشان دادند و تجزیه‌وتحلیل FTIR، حضور پروتئین‌ها را، عامل پایدارکننده‌ای نشان داد که نانوذرات نقره را احاطه می‌کند. محیط سیب‌زمینی‌دکستروز (PDB)کارایی زیادی در تولید نانوذرات نقره داشت و میزان بیوسنتز با افزایش غلظت نیترات‌نقره افزایش یافت.
بحث و نتیجه‏گیری: نانوذرات حاصل در پژوهش حاضر علاوه بر ماهیت کریستالی، اندازۀ به‌نسبت کوچک و یکنواختی زیادی که داشتند به‌ علت پوشش‌یافتن با پروتئین‌های ترشح‌شده از قارچ‌ به‌شدت پایدار بودند. این میزان پایداری تاکنون گزارش نشده است و این امکان وجود دارد که روش یادشده به‌عنوان روشی زیست‌سازگار و سبز جایگزین روش‌های فیزیکی و شیمیایی معمول شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Biosynthesis of silver nanoparticles using Aspergillus flavus and investigation of some effective factors on its production

نویسندگان [English]

  • Afsaneh Ghabooli
  • Soheila Mirzaei
Plant Protection Department, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran
چکیده [English]

Introduction: : Using fungi as sources of enzymes that can catalyze specific reactions conducing to inorganic nanoparticles, is being developed. Aspergillus flavus has a great potential in extracellular biosynthesis of silver nanoparticles. Since this fungus can grow on simple media quickly and adequately, it is cheaper to use it in silver nanoparticles biosynthesis than other methods.
Materials and methods: Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles was carried out by adding 1mM silver nitrate to A. flavus cell filtrate. Nanoparticles production was confirmed by visual observation of color change in the cell filtrate and UV-vis spectrophotometry. More investigation was conducted using XRD, FTIR and TEM. The stability of nanoparticles and the effect of culture media and silver nitrate concentration on nanoparticles’ production were studied too.
Results: The color change of cell filtrate from pale to brown confirmed the extracellular production of silver nanoparticles. The absorption spectra indicated a peak at 420nm attributable to the sliver nanoparticles. X-ray diffraction showed crystalline nature of the biosynthesized nanoparticles. Characterization of sliver nanoparticles’ shape and size using TEM showed that they were spherical and 18.2 nm in diameter. These nanoparticles were stable for 11 months and FTIR demonstrated the presence of proteins as capping agents which lead to their stability. More silver nitrate caused more nanoparticles production and PDB was the best media in this process.
Discussion: Biosynthesized nanoparticles were crystalline in nature, small in size and monodispersed. Besides, they were very stable due to capping by fungal secreted proteins; this stability is reported for the first time in the world. The fungal-mediated green and ecofriendly approach towards the synthesis of nanoparticles can be used as an alternative to the more popular physical and chemical methods for the synthesis of nanoparticles

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biosynthesis
  • Silver Nanoparticles
  • Aspergillus Flavus

مقدمه.

نخستین‌بار در سال 1974، Norio Taniguchi از دانشگاه توکیو واژۀ نانوفناوری را عمل تولید موادی با اندازۀ 1 تا 100 نانومتر تعریف کرد. نانوفناوری، علمی بین‌رشته‌ای و شامل جنبه‌های مختلف پژوهش و توسعۀ فناوری در بسیاری از زمینه‌های فیزیک، شیمی و زیست‌شناسی است (1 و 2). ساخت نانوذرات با ترکیبات شیمیایی متفاوت، اشکال مختلف و پراکندگی کنترل‌شده یکی از جنبه‌های مهم پژوهش در زمینۀ نانوفناوری است؛ درواقع نیاز به کنترل شکل نانوذرات، استفاده از روش‌های جدید را مطرح می‌کند (3).

با‌توجه‌به اهمیت نانومواد در فناوری آینده، بسیاری از کشورها هزینۀ زیادی را صرف پژوهش در زمینۀ نانوفناوری کرده‌اند (3) و در سال‌های اخیر، روش‌های بسیاری ازجمله روش‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی برای سنتز نانوذرات طراحی شده‌اند (4-6). روش‌های فیزیکی و شیمیایی شامل استفاده از عوامل شیمیایی احیاکنندۀ قوی مانند بروهیدراد‌سدیم[1] و عوامل احیاکنندۀ ضعیف مانند سیترات‌سدیم[2] و الکل‌ها و استفاده از اشعۀ UV هستند (7) که عموماً انرژی زیادی مصرف می‌کنند تا فشار و دمای زیاد لازم برای انجام آنها فراهم شود. همچنین در این روش‌ها از مواد سمی استفاده می‌شود که بقایای آنها در طبیعت بسیار خطرناک هستند و احتمالاً طی تولید نانوذرات وارد محیط می‌شوند. افزایش آگاهی دربارۀ این آلودگی‌ها، توجه به روش‌های جدید ساخت نانوذرات با استفاده از ریزموجودات را اجتناب‌ناپذیر کرده است (8). استفاده از عوامل بیولوژیک، ارزان‌تر و سازگارتر با طبیعت است. تاکنون ساخت نانوذرات با استفاده از باکتری‌ها، قارچ‌ها، مخمرها و گیاهان ثابت شده است (6، 9-12).

قارچ‌ها ازجمله عوامل زیستی هستند که در تولید نانوذرات فلزی به آنها توجه شده است. توانایی قارچ‌ها در تولید مقادیر فراوان پروتئین و هیدرولیز یون‌های فلزی به تولید تودۀ درخور توجهی از نانوذرات منجر می‌شود. علاوه‌بر‌این، جداسازی و کشت قارچ‌ها آسان است و فرایند‌های پایین‌دست و دست‌ورزی زیست‌تودۀ قارچی پیچیدگی کمتری نسبت به روش‌های مصنوعی دارند (13).

زمان حداقل، کوچکی اندازه و خطرناک‌نبودن فرایند از شاخص‌های کلیدی پذیرش هر نوع فناوری است و تولید نانوذرات نقره که برخی قارچ‌ها انجام می‌دهند، تمام ویژگی‌های یادشده را دارد (14). فرایندی که قارچ‌ها، نانوذرات فلزی را سنتز می‌کنند، میکوفابریکیشن[3] گفته می‌شود (15). در سال‌های اخیر، سیستم‌های قارچی با عنوان کارخانه‌های زیستی[4] شناخته شده‌اند که نانوذرات نقره، طلا، پلاتینیوم و سولفید‌کادمیوم تولید می‌کنند (15). قارچ‌ها، یون‌های فلزی را با سازوکار‌های فیزیکوشیمیایی و زیستی شامل اتصال خارج‌سلولی به متابولیت‌ها و پلیمرها، اتصال به پلی‌پپتیدهای ویژه و تجمع وابسته به متابولیسم در خود جمع می‌کنند (16)؛ ازاین‌رو، برخلاف باکتری‌ها به مرحلۀ اضافه برای استخراج نانوذرات از عصارۀ فلوئیدی نیازی نیست. قارچ‌ها در مقایسه با باکتری‌ها و اکتینومیست‌ها، منابع درخور توجهی برای ترشح پروتئین هستند که به عملکرد بهتر نانوذرات منجر می‌شود (3). با‌توجه‌به ویژگی‌های یادشده، قارچ‌ها به‌طور وسیعی برای بیوسنتز سریع و زیست‌ایمن نانوذرات فلزی استفاده می‌شوند. در مطالعۀحاضر، قارچ Aspergillus flavus برای تولید خارج‌سلولی نانوذرات نقره استفاده و سعی شد برخی عوامل اثرگذار روی تولید نانوذرات بهینه‌سازی شوند.

مواد و روش‌ها

تهیۀ جدایۀ قارچی: در پژوهش حاضر، 20 جدایۀ خالص قارچ A. flavus استفاده شدند که شناسایی آنها به روش مولکولی تأیید شده بود. جدایه‌های قارچی از دانشگاه ولی‌عصر رفسنجان تهیه شدند.

تولید نانوذرات نقره: به‌منظور تهیۀ زیست‌تودۀ لازم برای تولید نانوذرات نقره، از محیط‌کشت مایع سیب‌زمینی‌دکستروز (PDB[5]) سترون استفاده شد. محیط با استفاده از اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی‌گراد، فشار 5/1 اتمسفر و مدت 15 دقیقه سترون شد. جدایه‌های قارچی در محیط یادشده کشت شدند و ارلن‌های حاوی قارچ در شیکرانکوباتور با دمای 34 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت 120 دور در دقیقه قرار گرفتند. پس از گذشت هفت روز، توده‌های میسلیومی جدا و با آب مقطر استریل شسته شدند تا بقایای محیط‌کشت از آنها پاک شود. سپس 10 گرم از زیست‌تودۀ حاصل به ارلن‌های حاوی 100 میلی‌لیتر آب دوبار تقطیر استریل افزوده شد و سه روز در همان شرایط قرار داده شدند. پس از گذشت مدت زمان لازم، عصارۀ قارچی به کمک کاغذ صافی واتمن شمارۀ 1 تهیه شد. محلول نیترات‌نقره به نیمی از عصارۀ حاصل افزوده شد تا غلظت نهایی به 1 میلی‌مولار برسد (نمونۀ تیمار) و باقیماندۀ عصاره (بدون افزودن نیترات‌نقره) نمونۀ شاهد در نظر گرفته شد. ازآنجاکه این واکنش به نور حساس است، ارلن‌ها در شرایط تاریکی قرار گرفتند.

ارزیابی نانوذرات تولید‌شده: ابتدا تولید نانوذرات به‌طور چشمی و بر اساس تغییر‌رنگ مخلوط واکنش بررسی شد. پس از مشاهدۀ تغییر‌رنگ که نخستین نشانۀ تشکیل نانوذرات است، از طیف‌سنجی نور مرئی– فرابنفش[6] برای اثبات تولید نانوذرات استفاده شد. مقداری از نمونه در فاصله‌های زمانی معین (24، 48، 72 و 96 ساعت از شروع واکنش) برداشته و جذب آن با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis (مدلVariancaryconc 100 ) با دقت 1 نانومتر و محدودۀ 200 تا 800 نانومتر اندازه‌گیری شد تا از ایجاد نانوذرات اطمینان حاصل و میزان افزایش یا کاهش جذب و پایداری آنها بررسی شود. سپس عصاره‌های قارچی تغییر‌رنگ‌یافته به مدت 6 تا 7 روز در آون با دمای 40 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند تا پودر لازم برای تجزیه‌وتحلیل [7]XRD، [8]TEM و FTIR[9] حاصل شود.

برای تعیین ماهیت نانوذرات نقرۀ تولید‌شده از روش پراش اشعۀ ایکس (XRD) (دستگاه مدل APD2000 ساخت شرکت ITAL STRUCTURE) استفاده و الگوی XRD بین زوایای θ2 از 30 تا 90 درجه بررسی شد. برای تعیین شکل نانوذرات نقرۀ تولید‌شده و تعیین میانگین اندازۀ آنها از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) (مدل CM 120 ساخت شرکت Philips) استفاده شد. برای این امر، پودر حاصل از عصاره‌های قارچی به مؤسسۀ تحقیقاتی پرطاووس مشهد فرستاده شد و تصاویر دریافتی با نرم‌افزار Digimizer (version 4.6.1) بررسی شدند و اندازۀ نانوذرات محاسبه شد.

تجزیه‌وتحلیل FTIR با دستگاه طیف‌سنج مدل PerkinElmer Spectrum انجام شد. نمونه‌ها در محدودۀ عدد موج cm-14000-550 بررسی شدند. مشخص‌کردن برهمکنش نانوذرات با پروتئین قارچی و نقش این پروتئین‌ها به‌عنوان عوامل پایدارکننده‌ای که نانوذرات نقره را احاطه می‌کنند، هدف روش یادشده است.

انتخاب جدایۀ برتر:پس از مقایسۀ نتایج تغییر‌رنگ و داده‌های طیف‌سنجی، چهار جدایۀ A8-2، A15-2، A83 و A87 که بهترین نتایج را در مشاهده‌های چشمی و تجزیه‌وتحلیل‌های طیف‌سنجی داشتند، انتخاب و بررسی‌های بیشتر روی آنها انجام شدند تا بهترین جدایه انتخاب شود. علاوه بر ارزیابی هر‌یک از چهار جدایۀ یادشده به‌تنهایی، از ترکیب جدایه‌های A8-2 و A15-2 و جدایه‌های A83 و A87 با هم نیز استفاده شد. این آزمایش برای بررسی توانایی جدایه‌ها به شکل ترکیبی نسبت به حالت کشت منفرد انجام شد. در‌نهایت جدایۀ A8-2، جدایۀ برتر انتخاب و برای تولید نانوذرات نقره استفاده شد.

بررسی برخی عوامل مؤثر در بیوسنتز نانوذرات

بررسی اثر نوع محیط‌کشت: برای این منظور از سه محیط‌کشت مایع سیب‌زمینی‌دکستروز، مالت‌پپتون و محیط ترکیبی سترون استفاده شد. محیط ترکیبی شامل 7/0 گرم KH2PO4، 2/0 گرم K2HPO4، 01/0 گرم MgSO4.7H2O، 1/0 گرم (Na4)2SO4، 06/0 گرم عصارۀ مخمر و 1 گرم گلوکز به ازای 100 میلی‌لیتر بود.

بررسی اثر غلظت نیترات‌نقره:غلظت نیترات‌نقره از عوامل مهم و کلیدی در بیوسنتز نانوذرات نقره است. برای بررسی اثر میزان غلظت نیترات‌نقره بر بیوسنتز نانوذرات نقره، سه غلظت x، x2 و 2/x روی محیط‌های یادشده آزمایش شدند. در غلظت x، غلظت نهایی مخلوط واکنش 1 میلی‌مولار در نظر گرفته شد.

بررسی پایداری نانوذرات تولیدی: در بیوسنتز نانوذرات، تولید و پایداری آنها اهمیت ویژه‌ای دارد. پایداری نانوذرات تولید‌شده با اندازه‌گیری میزان جذب طی ماههای نگهداری بررسی شد. به این منظور، محلول‌های واکنش در شرایط تاریکی و روشنایی در انکوباتور نگهداری شدند و نانوذرات سنتز‌شده پس از گذشت 8 تا 11 ماه با اسپکتروفتومتر UV-Vis بررسی شدند.

 

نتایج

برای انتخاب بهترین جدایۀ قارچ A. flavus، بررسی مقدماتی تولید نانوذرات نقره با مشاهدۀ تغییر‌رنگ مخلوط‌های واکنش انجام شد. تغییررنگ، نخستین نشانۀ تشکیل نانوذرات نقره است که در بیشتر تیمارهای قارچی مشاهده شد (داده‌ها نشان داده نشده‌اند)، اما شدت تغییر‌رنگ در آنها متفاوت بود و توانایی متفاوت جدایه‌های یادشده را نشان می‌دهد. تمام نمونه‌ها برای اطمینان از احیای یون‌های نقره با اسپکتروفتومتر UV-Vis بررسی شدند (نتایج نشان داده نشده‌اند). عصارۀ سلولی برخی جدایه‌های قارچی تیمار‌شده با نیترات‌نقره (1 میلی‌مولار)، پیک مشخصی با جذب زیاد در 420 نانومتر نشان دادند که ویژۀ نانوذرات نقره است. در این طول موج، میزان جذب در جدایه‌هایی بیشتر بود که تغییر‌رنگ واضح داشتند و در نمونه‌های دارای تغییر‌رنگ کمتر، پیک نمودار کوتاه‌تر بود.

چهار جدایه که جذب زیادی داشتند، با ترکیب دوتایی در محیط مایع کشت شدند تا میزان تولید نانوذرات آنها در این حالت نسبت به حالت تکی هرکدام سنجیده شود. به این منظور، جدایه‌های A8-2، A15-2، A83 و A87 با هم و به‌طور جداگانه کشت شدند. نتایج نشان دادند در تمام نمونه‌ها، جدایه‌های A. flavusتوانایی بیوسنتز نانوذرات نقره را دارند (شکل 1)، اما جدایۀ A8-2 در حالت تکی قابلیت بیشتری در این زمینه دارد؛ بنابراین، جدایۀ برتر انتخاب و آزمایش‌های تکمیلی روی آن انجام شد.

 

 

الف

 

ب

 

ج

 

د

 

ه

 

و

شکل 1- طیف‌های UV-Vis ثبت‌شده برای واکنش عصارۀ سلولی کشت‌های دوگانه‌ و تکی جدایه‌های برتر قارچ Aspergillus flavus با محلول نیترات‌نقره 1 میلی‌مولار، الف. A8-2، ب. A15-2، ج. A83، د. A87، ه.A8-2 + A15-2 ، و. A83 + A87

 

 

در جدایۀ A8-2، رنگ مخلوط واکنش پس از تیمار با محلول 1 میلی‌مولار نیترات‌نقره به‌تدریج از بیرنگ به قهوه‌ای و درنهایت قهوه‌ای تیره تغییر کرد (شکل 2). طیف‌سنجی در فاصله‌های زمانی معین (شکل 3) نشان داد با افزایش دورۀ انکوباسیون، میزان جذب در 420 نانومتر افزایش می‌یابد. پس از اطمینان‌یافتن از وجود نانوذرات نقره، پودری از عصارۀ قارچی تهیه و در آزمایش‌های XRD، TEM و FTIR استفاده شد.

 

 

شکل 2- عصارۀ سلولی قارچ Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2). الف.: بدون نیترات‌نقره، ب. در حضور نیترات‌نقره پس از 24 ساعت، ج. در حضور نیترات‌نقره پس از 48 ساعت

 

شکل 3- طیف‌های UV-Vis ثبت‌شده در زمان‌های مختلف برای واکنش عصارۀ سلولی قارچ Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2) با محلول نیترات‌نقرۀ 1 میلی‌مولار

 

XRD: الگوی XRD حاصل تأیید کرد نانوذرات نقرۀ تشکیل‌شده به شکل نانوکریستال‌های نقره هستند. الگوی XRD سه پیک در محدوده‌های 143/38، 493/64، 270/77 درجه نشان داد (شکل4) که با پیک‌های مربوط به نقره مطابقت داشتند (17).

FTIR: پایداری و پراکندگی مناسب نانوذرات به برهمکنش آنها با پروتئین‌های قارچی نسبت داده می‌شود. به نظر می‌رسد عامل پوششی، پروتئین‌هایی باشند که قارچ A. flavusترشح کرده است. طی فرایند تولید نانوذرات، پروتئین‌ها احتمالاً پوششی روی نانوذرات تشکیل می‌دهند و با جلوگیری از تراکم ذرات موجب پایداری آنها می‌شوند. نمودار حاصل در پژوهش حاضر، 12 پیک در محدوده‌های 88/617، 52/825، 31/1038، 1101، 8/1240، 7/1320، 08/1384، 3/1540، 21/1635، 8/2406، 9/2925 و cm-1 46/3426 نشان داد (شکل 5).

 

 

 

شکل 4- طیف پراش اشعۀ X نانوذرات سنتز‌شده توسط قارچ Aspergillus flavus (A8-2)

 

 

شکل 5- طیف‌‌های FTIR ثبت‌شده از پودر نانوذرات نقرۀ سنتز‌شده توسط قارچ  Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2)

 

TEM: مطالعه‌های بیشتر برای تعیین شکل و اندازۀ نانوذرات با TEM انجام شد. تصاویر به‌خوبی نشان دادند بیشتر نانوذرات نقره تقریباً کروی و در محدودۀ 6 تا 45 نانومتر هستند و 59 درصد آنها در محدودۀ 13 تا 36 نانومتر قرار دارند (شکل‌های 6 و7). اندازۀ متوسط ذرات 2/18 نانومتر بود که تقریباً با مقدار محاسبه‌شده از XRD یکسان است.

 

 

   

 

 

   

شکل 6- تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری از نانوذرات سنتز‌شده توسط قارچ Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2)

 

 

شکل 7- توزیع اندازۀ نانوذرات نقرۀ تولیدی توسط Aspergillus flavus  (جدایۀ A8-2)

 

پایداری نانوذرات نقرۀ تولید‌شده: نانوذرات موجود در محیط آبی، دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط تاریکی و روشنایی نگهداری و در فاصله‌های زمانی مختلف بررسی شدند. 11 ماه پس از شروع واکنش، هیچ رسوبی در محلول مشاهده نشد که شاهدی بر پایداری نانوذرات نقره است. طیف‌های حاصل از اسپکتروفتومتر (شکل 8) نیز این مطلب را تأیید و مشخص کردند نانوذرات بسیار پایدارند و جذب زیادی در 420 نانومتر نشان می‌دهند. همانگونه که در شکل نیز مشخص است نگهداری نانوذرات مدنظر در تاریکی به کاهش مقدار نانوذرات منجر نشد و میزان آنها با گذشت زمان افزایش یافت.

 

 

شکل 8- طیف‌های UV-Visثبت‌شده برای واکنش عصارۀ سلولی قارچ Aspergillus flavus (جدایۀA8-2) با محلول نیترات‌نقره طی سه روز اول تولید و 11 ماه پس از شروع واکنش در نمونۀ نگهداری‌شده در شرایط تاریکی (7 برابر رقیق‌شده) و روشنایی

.بررسی عوامل مؤثر بر تولید نانوذرات نقره در قارچ A. flavus: بهینه‌کردن شرایط تولید نانوذرات ازجمله عواملی است که واکنش را اقتصادی‌تر و مؤثرتر می‌کند و محیط‌کشت قارچ و غلظت نیترات‌نقره دو رکن اساسی در این زمینه هستند. به‌منظور بررسی اثر عوامل یادشده، تولید نانوذرات نقره با تغییر غلظت یون‌های Ag+ و استفاده از محیط‌های مختلف انجام شد. جدایۀA8-2در سه محیط مایع سیب‌زمینی‌دکستروز، مالت‌پپتون و محیط ترکیبی در سه تکرار کشت داده شد و به هر تکرار، غلظت‌های مختلف x (1 میلی‌مولار)، x2 و 2/x نیترات‌نقره افزوده شدند. مقایسۀ ظاهری میزان رشد در محیط‌های مختلف نشان داد قارچ در محیط ترکیبی رشد مناسبی ندارد و میزان زیست‌تودۀ تولیدی آن بسیار کم است. احتمالاً این امر موجب می‌شود قارچ، میزان کافی آنزیم و پروتئین ترشح‌ نکند و در نتیجه، تغییر‌رنگ این گروه بسیار اندک بود (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). این کاهش شدت رنگ در غلظت 2/x محسوس‌تر بود. اگرچه میزان رشد در دو محیط مالت‌پپتون و سیب‌زمینی‌دکستروز تقریباً مشابه بود، سرعت تشکیل نانوذرات در محیط PDB بیشتر بود. شدت تغییر‌رنگ مخلوط واکنش در غلظت x2 بیشتر از سایر غلظت‌ها بود. نتایج طیف‌سنجی فرابنفش- مرئی در زمان‌های مختلف، نتایج یادشده را تأیید کردند (شکل 9)؛ بنابراین بر اساس مشاهده‌ها و نتایج، بیشترین میزان تولید نانوذرات نقره در محیط PDB و غلظت x2 اتفاق افتاد.

در این آزمایش، نمونه‌ها پس از تولید در دمای 34 درجۀ سانتی‌گراد (دمای تولید) نگهداری شدند. طیف‌های اسپکتروفتومتر پس از 8 ماه نشان دادند با‌ وجود نگهداری نانوذرات در همان دمایی که تولید شده بودند، کاهش جذب و در نتیجه ناپایداری دیده می‌شود (شکل 10).

 

 

PDBx

 

PDB2x

 

PDBx/2

 

 

MPx

 

MP2x

 

MPx/2

 

Tx

 

T2x

 

Tx/2

شکل 9- طیف‌های UV-Vis ثبت‌شده در زمان‌های مختلف برای واکنش عصارۀ سلولی قارچ Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2) در محیط‌کشت‌ها و غلظت‌های مختلف نیترات‌نقره. PDB. محیط سیب‌زمینی‌دکستروز، MP. محیط مالت‌پپتون، T. محیط ترکیبی، x. غلظت 1 میلی‌مولار نیترات‌نقره

 

     

شکل 10- طیف‌های UV-Vis ثبت‌شده برای واکنش عصارۀ سلولی قارچ Aspergillus flavus (جدایۀ A8-2) کشت‌شده در محیط‌های مختلف با محلول نیترات‌نقره پس از گذشت 8 ماه. PDB. محیط سیب‌زمینی‌دکستروز، MP. محیط مالت‌پپتون، T. محیط ترکیبی، x. غلظت 1 میلی‌مولار نیترات‌نقره


بحث و نتیجه‌گیری

یکی از اهداف مهم نانوفناوری، توسعۀ روش‌های ایمن، سازگار با محیط‌زیست و کم‌هزینه برای تولید نانوذرات است. در مطالعه‌های بسیاری، قارچ Aspergillus پتانسیل زیادی برای تولید نانوذرات نشان داده است (18-27)؛ ازاین‌رو در پژوهش حاضر، از گونۀ A. flavus برای تولید نانوذرات نقره استفاده شد و با افزودن نیترات‌نقره به عصارۀ قارچی، رنگ آن به قهوه‌ای تغییر کرد. ظهور رنگ قهوه‌ای نشان‌دهندۀ تشکیل ذرات نقرۀ کلوئیدی در محیط است و این تغییرات، القای رزونانس پلاسمون سطحی در نانوذرات فلزی را نشان می‌دهند. شکل و اندازۀ نانوذرات تولید‌شده بر رزونانس پلاسمون سطحی تأثیر می‌گذارند (28 و 29). همچنین تغییر‌رنگ عصارۀ قارچی، تولید خارج‌سلولی نانوذرات نقره را نشان می‌دهد. اگرچه تولید داخل‌سلولی نانوذرات به ایجاد ذراتی با اندازۀ کوچک‌تر منجر می‌شود، مزیت تولید خارج‌سلولی این است که به مرحلۀ اضافه‌ برای آزاد‌کردن نانوذرات از بیومس با تیمار فراصوتی یا واکنش با مواد شویندۀ مناسب نیاز ندارد.

نتایج طیف‌سنجی نشان دادند شدت جذب با گذشت زمان افزایش می‌یابد و این امر ناشی از افزایش مقدار نانوذرات تشکیل‌شده است. یک باند جذبی در طول موج 290 نانومتر مشاهده شد که به علت برانگیختگی الکترونی تریپتوفان و تیروزین آزاد در پروتئین‌ها به وجود می‌آید (30). این مشاهده نشان می‌دهد قارچ، پروتئین‌ها را آزاد می‌کند و همچنین سازوکاری احتمالی برای احیای یون‌های فلزی موجود در محلول پیشنهاد می‌کند (31-33). هرچند سازوکار دقیق سنتز نانوذرات با استفاده از قارچ‌ها کاملاً روشن نشده است، به نظر می‌رسد آنزیم نیترات‌ردوکتاز وابسته به NADH در این فرایند درگیر باشد (31).

پایداری نانوذرات بیوسنتز‌شده، اهمیت ویژه‌ای دارد. نتایج FTIR، حضور پروتئین‌ها را عاملی پوششی اثبات کردند که سبب پایداری نانوذرات می‌شود. طیف‌های حاصل، حضور گروههای کاربردی مختلف مانند باندهای O-H کششی، پیوندهای آمیدی، ارتعاشات کششی -N-H، C-O و C-OH را نشان دادند. کومار[x] و همکاران (22) بر اساس نتایج FTIR اشاره کردند نانوذرات نقره در محلول با عاملی پوششی پایدار شده‌اند که احتمالاً پروتئین‌هایی هستند که قارچ ترشح‌ می‌کند. در پژوهش حاضر، بیشترین جذب در محدودۀ cm-13426 مشاهده شد که به باندهای جذبی وابسته به O-H کششی حاصل از گروههای کربوکسیلیک‌اسید اختصاص دارد (29 و 34). پیک در cm-1 9/2925 به پیوندهای C-H کششی متقارن و غیرمتقارن مربوط به حالت‌های آلیفاتیک اشاره دارد و مشابه کار سانقی و ورما (35) است. وجود باند در محدودۀ cm-1 2401 به پیوند O-H کششی مربوط است (29) و پیک حاصل در cm-1 8/2406 به آن شباهت دارد. طیف در cm-1 21/1635 به باند ارتعاشی آمید I و II از باندهای پروتئین مربوط می‌شود و این باندها با نتایج پژوهش کومار و همکاران (22) مطابقت دارند. بر اساس یافته‌های باساواراجا و همکاران (36) باند در cm-1 1540 به آمید II اختصاص دارد که به علت کشش کربونیل و ارتعاشات کششی N-H- پیوندهای آمیدی پروتئین‌ها به وجود می‌آید. این گروههای آمیدی و پیوندهای پپتیدی پروتئین‌ها، توانایی باند‌شدن با فلز را دارند و به جلوگیری از تراکم نانوذرات کمک می‌کنند؛ در مطالعۀ حاضر نیز باند مشابهی دیده شد. طیف در محدودۀ cm-1 1390-1350 به باقیمانده‌های نیترات در محلول مربوط است (34 و 37) و وجود باند در cm-108/1384 آن را تأیید می‌کند. پیک موجود در cm-17/1320، کشش C-O اترهای آروماتیک را نشان می‌دهد و شباهت بسیار زیادی به پیکی دارد که کومار و همکاران (22) به دست آورده‌اند. ارتعاشات کششی پیوندهای Ag-N در پیک cm-1 1240 مشخص شدند که در راستای یافته‌های موخرجی و همکاران (38) هستند. طیف‌های cm-11101، cm-131/1038 و cm-152/825 به ارتعاشات منحرفی C-OH ناشی از پروتئین‌ها مرتبط هستند و قاسمی‌نژاد و همکاران (29) نیز پیک‌های مشابهی به دست آورده‌اند. در‌نهایت، طیف قرار‌گرفته در محدودۀ cm-1 617 به گروه R-CH اختصاص دارد و مشابه کار کومار و همکاران (22) است.

پروتئین‌ها از راه گروههای آمین آزاد یا باقیمانده‌های سیستئین در پروتئین‌ها و یا از راه جاذبۀ الکترواستاتیک با گروههای کربوکسیلات دارای بار منفی آنزیم‌های موجود در دیوارۀ سلولی میسلیوم‌ها به نانوذرات متصل و سبب پایداری نانوذرات می‌شوند. اینگل[xi] و همکاران (39)، شارما[xii] و همکاران (40) و کومار و همکاران (22) نیز این موضوع را تأیید کرده‌اند. نانوذرات تولید‌شده با این روش بسیار پایدارند و به علت استفاده‌نشدن مواد شیمیایی، قابلیت استفاده در زمینه‌های زیستی را دارند. نانوذرات بیوسنتز‌شده پس از گذشت 11 ماه همچنان پایدار بودند و جذب زیادی از خود نشان دادند. این اندازه پایداری تاکنون بی‌سابقه بوده است و برای نخستین‌بار دربارۀ این قارچ گزارش می‌شود.

در پژوهش دیگری، هنگامی که قارچ A. flavus در معرض یون‌های نقرۀ آبی قرار گرفت، نانوذرات را در دیوارۀ سلولی خود ایجاد کرد. نانوذرات تولید‌شده به کمک پروتئین پایدار شدند و به نظر می‌رسد پروتئین‌های قارچی مسئول این پایداری باشند (41). پاتیل[xiii] و همکاران (25) نیز قارچ یادشده را برای تولید نانوذرات نقره استفاده کردند.

شناخت ماهیت دقیق ذرات نقرۀ تشکیل‌شده اهمیت ویژه‌ای دارد و با اندازه‌گیری طیف پراش اشعۀ ایکس نمونه‌ها حاصل می‌شود. الگوی XRD تأیید کرد نانوذرات نقرۀ تشکیل‌شده به شکل نانوکریستال‌های نقره هستند. بینوپریا[xiv] و همکاران (42) نیز تشکیل نانوکریستال‌های نقره را در Aspergillus oryzae var. viridis گزارش کرده‌اند. شکل، پراکندگی و تراکم‌نداشتن نانوذرات از معیارهای مهم در تولید آنها هستند. بر اساس نتایج تصاویر TEM، نانوذرات به‌خوبی از یکدیگر جدا شده و بیشتر به شکل تقریباً کروی با متوسط اندازۀ 2/18 نانومتر بودند که تقریباً با مقدار محاسبه‌شده از طریق XRD یکسان است.

بررسی اثر محیط‌کشت و غلظت نیترات‌نقره در تولید نانوذرات نشان داد محیط PDB کارایی زیادی در تولید نانوذرات دارد و میزان تولید نانوذرات با افزایش غلظت نیترات‌نقره افزایش می‌یابد. کربکندی[xv] و همکاران (43) نیز حداکثر غلظت پیش‌ماده برای تولید نانوذرات را در قارچ Fusarium oxysporum مطالعه کردند و نتیجه گرفتند با افزایش تدریجی غلظت نیترات‌نقره تا 5 میلی‌مولار، احیای نانوذرات افزایش می‌یابد. نگهداری نانوذرات تولید‌شده در محیط و غلظت‌های مختلف نیترات‌نقره در دمای 34 درجۀ سانتی‌گراد نشان داد این ذرات پایداری کمی دارند؛ درحالی‌که نانوذرات نگهداری‌شده در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد پایداری زیادی نشان می‌دهند. به نظر می‌رسد دمای نگهداری نانوذرات بیوسنتز‌شده نقش مهمی در پایداری آنها دارد، هرچند پژوهش‌های بیشتر در این زمینه لازم است.

در‌نهایت، نتیجه گرفته می‌شود قارچ‌ A. flavus پتانسیل زیادی برای سنتز خارج‌سلولی نانوذرات نقره دارد و استفاده از این قارچ به علت رشد سریع و زیاد آن در محیط ساده، روشی بسیار ارزان در مقایسه با سایر روش‌هاست. پایداری نانوذرات تولیدی این قارچ، آن را گزینۀ مناسبی برای مطالعه‌های بیشتر مطرح می‌کند.



[1]- Sodium borohydride

[2]- Sodium citrate

[3]- Mycofabrication

[4]- Bionanofactories

[5]- Potato Dextrose Broth

[6]- UV-Visible Spectrophotometer

[7]- X-Ray Diffraction

[8]- Transmission Electron Microscopy

[9]- Fourier Transform Infrared Spectroscopy

[x]- Kumar

[xi]- Ingle

[xii]- Sharma

[xiii]- Patil

[xiv]- Binupriya

[xv]- Korbekandi

(1)              McNeil SE. Nanotechnology for the biologist. Journal of Leukocyte Biology 2005; 78: 585-593.

(2)              Uskokovic V. Nanomaterials and nanotechnologies: approaching the crest of  this big wave. Current Nanoscience 2008; 4: 119-129.

(3)              Sastry M., Ahmad A., Khan MI., Kumar R. Biosynthesis of metal nanoparticles using fungi and actinomycetes. Current Science 2003; 85(2): 162-170.

(4)              Jana NR., Pal T., Sau TK., Wang ZL. Seed- mediated growth method to prepare cubic copper nanoparticles. Current Science. 2000; 79(9): 1367-1370.

(5)              Kohler JM., Hubner U., Romanus H., Wagner J. Formation of star-like and core-shell Au-Ag nanoparticles during two and three step preparation in batch and microfluidic systems. Journal of Nanomaterial 2007; 1155: 98134-98141.

(6)              Rai M., Yadav A., gade A. Current trends in phytosynthesis of metal nanoparticles. Critical Reviews in Biotechnology 2008; 28(4): 277-284.

(7)              Nair LS., Laurencin CT. Silver nanoparticles: Synthesis and therapeutic applications. Journal of Biomedical Nanotechnology. 2007; 3: 301-316.

(8)              Shankar SS., Ahmad A., Pasricha R., Sastry M. Bioreduction of chloroaurate ions by Geranium leaves and its endophytic fungus yields gold nanoparticles of different shapes. Journal of Material Chemistry 2003; 13: 1822-1826.

(9)              Golinska P., Wypij M., Ingle AP., Gupta I., Dahm H., Rai M. Biogenic synthesis of metal nanoparticles from actinomycetes: biomedical applications and cytotoxicity. Applied Microbiology and Biotechnology 2014; 98(19): 8083-8097.

(10)          Pantidos N., Horsfall LE. Biological synthesis of metallic nanoparticles by bacteria, fungi and plants. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology 2014; 5: 233. doi: 10.4172/2157-7439.1000233.

(11)          Saminathan K. Biosynthesis of silver nanoparticles using soil Actinomycetes Streptomyces sp. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 2015; 4(3): 1073-1083.

(12)          Singh R., Shedbalkar UU., Wadhwani SA., Chopade BA. Bacteriagenic silver nanoparticles: synthesis, mechanism, and applications. Applied Microbiology and Biotechnology 2015; 99: 4579. doi: 10.1007/s00253-015-6622-1.

(13)          Mandal D., Bolander M., Mukhopadhyay D., Sarkar G., Mukherjee P. The use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application. Applied Microbiology and Biotechnology 2006; 69(5): 485-492.

(14)          Mohanpuria P., Rana NK., Yadav SK. Biosynthesis of nanoparticles: technological concepts and future applications. Journal of Nanoparticle Research 2008; 10(3): 507-517.

(15)          Rai M., Yadav A., Gade A. Mycofabrication, mechanistic aspect and multifunctionality of metal nanoparticles- Where are we? And where should we go? In: Mendez-Vilas A., editor. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiologyand Microbial Biotechnology. Badajoz, Spain: Formatex Research Center; 2010: 343-354.

 

(16)          Holan ZR., Volesky B. Accumulation of cadmium, lead and nickel by fungal and wood biosorbents. Applied Biochemistry and Biotechnology 1995; 53(2): 133-146.

(17)          Metuku RP., Pabba S., Burra S., Gudikandula K., Charya MS. Biosynthesis of silver nanoparticles from Schizophyllum radiatum HE 863742.1: their characterization and antimicrobial activity. 3 Biotech. 2014; 4(3): 227-234.

(18)          Bala M., Arya V. Biological synthesis of silver nanoparticles from aqueous extract of endophytic fungus Aspergillus fumigatus and its antibacterial action. International Journal of Nanomaterials and Biostructures 2013; 3: 37-41.

(19)          Bhainsa KC., D'Souza SF. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus fumigatus. Colloids and surfaces B: Biointerfaces 2006; 47(2): 160-164.

(20)          Devi LS., Joshi S. Ultrastructures of silver nanoparticles biosynthesized using endophytic fungi. Journal of Microscopy and Ultrastructure 2015; 3(1): 29-37.

(21)          Gade AK., Bonde P., Ingle AP, Marcato PD., Duran N., Rai MK. Exploitation of Aspergillus niger for synthesis of silver nanoparticles. Journal of Biobased Material and Bioenergy 2008; 2: 243-247.

(22)          Kumar RR., Priyadharsani KP., Thamaraiselvi K. Mycogenic synthesis of silver nanoparticles by the Japanese environmental isolate Aspergillus tamarii. Journal of Nanoparticle Research. 2012; 14(5): 1-7.

(23)          Li G., He D., Qian Y., Guan B., Gao S., Cui Y., et al. Fungus-mediated green synthesis of silver nanoparticles using Aspergillus terreus. International Journal of Molecular Sciences 2012; 13(1): 466-476.

(24)          Ninganagouda S., Rathod V., Singh D. Characterization and biosynthesis of silver nanoparticles using a fungus Aspergillus niger. International Letters of Natural Sciences 2014; 15: 49-57.

(25)          Patil H., Borse S., Patil D., Patil U., Patil H. Synthesis of silver nanoparticles by microbial method and their characterization. Archives of Physics Research 2011; 2(3): 153-158.

(26)          Velhal SG., Kulkarni SD., Latpate RV. Fungal mediated silver nanoparticle synthesis using robust experimental design and its application in cotton fabric. International Nano Letters 2016; 6(4): 257-264.

(27)          Zomorodian K., Pourshahid S., Sadatsharifi A., Mehryar P., Pakshir K., Rahimi MJ., et al. Biosynthesis and characterization of silver nanoparticles by Aspergillus species. BioMed Research International 2016; 2016: 6.

(28)          Castro Longoria E., Vilchis Nestor AR., Avalos Borja M. Biosynthesis of silver, gold and bimetallic nanoparticles using the filamentous fungus Neurospora crassa. Colloids and surfaces B: Biointerfaces 2011; 83(1): 42-48.

(29)          Ghaseminezhad SM., Hamedi S., Shojaosadati SA. Green synthesis of silver nanoparticles by a novel method: Comparative study of their properties. Carbohydrate Polymers 2012; 89(2): 467-472.

(30)          Bhainsa KC., D’Souza SF. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus fumigates. Colloids and Surfaces B: Biointerface 2006; 47: 160-164.

(31)          Ahmad A., Mukherjee P., Senapat S., Mandal D., Khan MI., Kumar R., et al. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium oxysporum. Colloids and surfaces B: Biointerfaces 2003; 28(4): 313-318.

(32)          Duran N., Marcato PD., Alves OL., DeSouza G., Esposito E. Mechanistic aspects of biosynthesis of silver nanoparticles by several Fusarium oxysporum strains. Journal of Nanobiotechnology 2005; 3: 1-8.

(33)          Sundaramoorthi C., Kalaivani M., Mathews DM., Palanisamy S., Kalaiselvan V., Rajasekaran A. Biosynthesis of silver nanoparticles from Aspergillus niger and evaluation of its wound healing activity in experimental rat model. International Journal of Pharm Tech Research 2009; 1(4): 1523-1529.

(34)          Luo L-B., Yu S-H., Qian H-S., Zhou T. Large-scale fabrication of flexible silver/cross-linked poly (vinyl alcohol) coaxial nanocables by a facile solution approach. Journal of the American Chemical Society 2005; 127(9): 2822-2823.

(35)          Sanghi R., Verma P. pH dependant fungal proteins in the ‘green’synthesis of gold nanoparticles. Advanced Materials Letters 2010; 1(3): 193-199.

(36)          Basavaraja S., Balaji SD., Lagashetty A., Rajasab AH., Venkataraman A. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium semitectum. Material Research Bulletin 2008; 43(5): 1164-1170.

(37)          Gajbhiye MB., Kesharwani JG., Ingle AP., Gade AK., Rai MK. Fungus mediated synthesis of silver nanoparticles and its activity against pathogenic fungi in combination of fluconazole. Nanomedicine 2009; 5(4): 382-386.

(38)          Mukherjee P., Roy M., Mandal BP., Dey GK., Mukherjee PK., Ghatak J., et al. Green synthesis of highly stabilized nanocrystalline silver particles by a non-pathogenic and agriculturally important fungus T. asperellum. Nanotechnology 2008; 19: 103-110.

(39)          Ingle A., Rai MK., Gade A., Bawaskar M. Fusarium solani: a novel biological agent  for  the extracellular synthesis of silver nanoparticles. Journal of Nanoparticle Research 2009; 11: 2079.

(40)          Sharma S., Ahmad N., Prakash A., Singh VN., Ghosh AK., Mehta BR. Synthesis of Crystalline Ag Nanoparticles (AgNPs) from Microorganisms. Materials Sciences and Applications 2010; 01(01): 1-7.

(41)          Vigneshwaran N., Ashtaputre M., Nachane RP., Paralikar KM., Balasubramanya H. Biological synthesisof silver nanoparticles using the fungus Aspergillus flavus. Material Letters. 2007; 61(6): 1413-1418.

(42)          Binupriya AR., Sathishkumar M., Vijayaraghavan K., Yun SI. Bioreduction of trivalent aurum to nanocrystalline gold particles by active and inactive cellsand cell free extract of Aspergillus oryzae var. viridis. Journal of Hazardous Materials. 2010; 177(1-3): 539-545.

Korbekandi H., Ashari Z., Iravani S., Abbasi S. Optimization of biological synthesis of silver nanoparticles using Fusarium oxysporum. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2013; 12(3): 289-298.