جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم از ریزوسفر ریشۀ ‏برنج لنجان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا

2 استادیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا

3 کارشناسی ارشد، گروه بیوشیمی، دانشگاه اوتاگو (نیوزیلند)

چکیده

مقدمه: پروبیوتیک به گروهی از ریزموجودات زنده اطلاق می‌شود که آثار سودمندی بر سلامتی میزبان دارند. لاکتوباسیلوسها از مهم‌ترین باکتری‌های پروبیوتیک هستند. تحریک‌کنندگی سیستم ایمنی و کاهش عفونت دستگاه گوارش و خطر بیماری التهاب روده‌ای با تولید ترکیبات ضدمیکروبی ازجمله آثار مفید لاکتوباسیلوس‌ها در انسان و حیوان هستند. اثر باکتری‌های ریزوسفر خاک مانند لاکتوباسیلوس‌ها در تولید هورمون، انحلال ترکیبات غذایی گیاهی، تسهیل جذب مواد غذایی نظیر نیتروژن و کاهش بیماری‌های گیاهی گزارش شده است. جداسازی لاکتوباسیل‌ها از منابع مختلف لبنی و غیرلبنی گزارش شده است. هدف پژوهش حاضر بررسی حضور لاکتوباسیلوس پلانتاروم، یکی از مهم‌ترین باکتری‌های پروبیوتیک، در ریزوسفر گیاه برنج و مطالعۀ ویژگی‌های مولکولی، بیوشیمیایی و پروبیوتیکی این ریزموجود است.
مواد و روش‏‏ها: نمونه‌برداری از ریزوسفر برنج رقم لنجان (منطقۀ لنجان، اصفهان) انجام شد. رقت‌های صفر تا 4-10 از نمونه به محیط MRS منتقل و آزمایش‌های بیوشیمیایی شامل تخمیر قندها و فعالیت آنزیمی روی جدایه‌های باسیلی‌شکل گرم مثبت انجام شدند. توانایی رشد جدایه‌ها در حضور نمک صفراوی و اسیدیته‌ها و دماهای مختلف بررسی و سپس، مقاومت جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک مطالعه شد. آغازگر اختصاصی لاکتوباسیلوس پلانتاروم برای شناسایی مولکولی استفاده شد.
نتایج: از بین 16 ریزموجود جداشده از ریزوسفر گیاه مطالعه‌شده، 10 باکتری باسیلی‌شکل و 8 جدایه گرم مثبت، اکسیداز و کاتالاز منفی (ویژگی لاکتوباسیلوس‌ها) بودند. آزمایش‌های تخمیر قند، 6 جدایه را با ویژگی لاکتوباسیلوس پلانتاروم مشخص کردند. استفاده از آغازگرهای اختصاصی لاکتوباسیلوس پلانتاروم این نتایج را تأیید کرد. این باکتری‌ها در محیط اسیدی با اسیدیتۀ برابر 5/3، دمای 40 درجۀ سانتی‌گراد و حضور 3/0 درصد صفرا به‌خوبی (مشابه نمونه‌های شاهد) رشد کردند. باکتری‌ها به 7 آنتی‌بیوتیک از 12 آنتی‌بیوتیک بررسی‌شده مقاومت نشان دادند.
بحث و نتیجه‌‏گیری: پژوهش حاضر نشان داد ریزوسفر برنج منبعی طبیعی برای جداسازی لاکتوباسیلوس پلانتاروم است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and Biochemical and Molecular Identification of Lactobacillus Plantarum ‎Bacteria from Rhizosphere of Lenjan Rice

نویسندگان [English]

  • Sabere Nouri 1
  • sonbol nazeri 2
  • Parham Hosseyni 3
1 Msc Student, Dept. of Biotechnology, Fac. of agricuture, Bu-Ali Sina Un.
2 Assistant Professor, Dept. of Biotechnology, Fac. of Agriculture, Bu-Ali Sina Un.
3 Msc Student, Dept. of Biochemistry, Otago Un (New Zealand)
چکیده [English]

Introduction: Probiotics refers to a group of living microorganisms that have beneficial effects on host health. Lactobacilli are one of the most important probiotic bacteria. The stimulatory effects of the immune system, besides reduction of gastrointestinal infections and the risk of inflammation of intestines in humans and animals, are some of Lacobacillus benefits. The effect of rhizospher bacteria, like Lactobacillus, on production of plant hormones, dissolving plant nutrient, facilitates the absorption of nutrients (like nitrogen), and the reduction of plant diseases were reported. Isolation of Lactobacillus has been reported of various sources of dairy and non-dairy sources. The purpose of this study was to investigate the presence of  L. plantarum, one of most important probiotic bacteria, in rice rhizosphere, along with examination of the morphological, molecular, biochemical and probiotic properties of the isolated microorganisms.
Materials and Methods: Sampling of rhizosphere rice variety was carried out in Lenjan (Lenjan, Isfahan) carried out. Dillutions of samples were transferred to MES medium. Biochemical test, as sugar fermentation and enzyme activity, performed on gram-positive isolate bacilli. The ability of bacteria to grow in presence of Bile salt, and different pH and temperatures was investigated. Antibiotic resistance of isolates was examined. Specific primers of L. plantarum was used for molecular identification.
Results: Of 16 microorganisms, isolated from the rice's rhizosphere, there were 10 bacillus-shaped bacteria, which eight gram-positive isolates were oxidase and catalase negative (characteristic of Lactobacillus species). Sugar fermentation experiments identified six isolates with L. plantarum characteristics. Molecular experiments with the specific primers of L. plantarum confirmed the results. The bacteria grew very well (similar to control samples) in acidic medium at pH 3.5,  40ºC, and in presence of 0.3% bile. Resistance to seven of 12 antibiotics was detected.
Discussion and conclusion: The present study showed that rhizosphere of rice is the natural source for isolationof L. plantarum.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Probiotic
  • Lactobacillus plantarum
  • Rhizosphere
  • Lenjan Rice
  • Antibiotic Resistance‎‏.‏

مقدمه

واژۀ پروبیوتیک[1] از واژۀ یونانی پروبیوس به معنای حیات‌بخش یا زیست‌بخش گرفته شده است. نخستین‌بار، لیلی[2] و استیلول[3] در سال 1965 این واژه را با مفهوم متفاوتی از مفهوم امروزی تعریف کردند و پروبیوتیک‌ها را عوامل تحریک‌کنندۀ رشد دانستند که از ریزموجودات ترشح می‌شوند و باعث تحریک رشد سایر ریزموجودات می‌شوند. در تعریف کنونی، پروبیوتیک‌ها ریزموجودات زنده‌ای تعریف می‌شوند که با فعالیت زیستی خود در روده و یا هر اندام دارای پوشش مخاطی در حفظ توازن فلور میکروبی سودمند هستند و نقش مثبتی در سلامت میزبان (انسان و حیوان) ایفا می‌کنند (1). پروکاریوت‌هایی که رشد گیاه را بهبود می‌بخشند یا از بیماری‌های گیاهی جلوگیری می‌کنند با عنوان PGPB[4] (باکتری‌های القا‌کنندۀ رشد) یا PPB[5] (باکتری‌های پروبیوتیک گیاهی) شناخته می‌شوند (2). هاس[6] و همکاران و پس‌ازآن، پیکارد[7] و همکاران اصطلاح پروبیوتیک را برای این دسته از باکتری‌های گیاهی به کار بردند (3 و 4). این باکتری‌ها YIB[8] (باکتری‌های افزایش‌دهندۀ عملکرد) نیز نامیده می‌شوند (2). لاکتوباسیلوس‌هابا گونه‌های متعدد یکی از مهم‌ترین جنس‌های باکتری‌های پروبیوتیک هستند و لاکتوباسیلوس پلانتارومها یکی از مهم‌ترین این باکتری‌ها به شمار می‌روند. علاوه‌بر جنبه‌های مختلف لاکتوباسیلوس پلانتاروم در سلامتی انسان و حیوان و نیز صنعت، این باکتری به‌علت داشتن توانایی زیاد در سازگار و منطبق‌شدن با نیچ‌های متفاوت درخور توجه است (5). لاکتوباسیلوس پلانتاروم‌ها ازنظر ریخت‌شناسی باکتری‌های میله‌ای‌شکل با انتهای گرد هستند، آرایش سلولی آنها به‌شکل منفرد، جفتی و زنجیره‌های کوتاه است، از گروه ریزموجودات بی‌هوازی اختیاری هستند و کلنی آنها ازنظر شکل ظاهری گرد و صاف و سفید یا زرد است (5).

مصرف فراورده‌های غذایی حاوی پروبیوتیک‌ها در انسان و دام آثار مختلفی بر سلامت دارد که کاهش عفونت دستگاه گوارش و خطر بیماری التهاب روده‌ای و آثار تحریک‌کنندۀ سیستم ایمنی ازجملۀ این آثار هستند. تولید ترکیبات آنتی‌بیوتیکی توسط این باکتری‌ها به‌ویژه به‌علت بروز مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در ریزموجودات بیماری‌زا که مشکلات عدیده‌ای در درمان بیماری ایجاد می‌کند، یکی از دلایل عمدۀ جداسازی این ریزموجودات از منابع مختلف است (6).

مطالعه‌ها نشان داده‌اند باکتری‌های ریزوسفر خاک (ازجمله لاکتوباسیلوس‌ها) به‌شکل‌های مختلفی در رشد و سلامت گیاه مؤثر هستند (7). ریزموجودات ریزوسفر با فراهم‌کردن مواد غذایی، فیتوهورمون‌ها، ترکیبات سرکوب‌کنندۀ بیماری‌زاها یا افزایش مقاومت در برابر تنش‌های زیستی مانند گرما، شوری و خشکی آثار بسیار مفیدی بر رشد و سلامت گیاهان دارند (3 و 8). اگرچه باکتری‌ها در همۀ اجزای گیاه زندگی می‌کنند، بسیاری از آنها به‌طور سنتی از بافت زیرزمینی و ریزوسفر به دست می‌آیند (9). ویژگی نمونه‌های ریزوسفری برای جداسازی باکتری‌های پروبیوتیک گیاهی، تماس مستقیم آنها با گیاه و خاک است (10). باکتری‌های پروبیوتیک درشت‌مغذی‌ها و ریزمغذی‌های لازم برای گیاه را تأمین می‌کنند؛ از سوی دیگر، آنها کربوهیدرات‌های مختلف، آمینواسیدها، اسیدهای آلی (ترشح‌شده از ریشه) و سایر ترکیبات موجود در ریزوسفر را متابولیزه می‌کنند. باکتری‌ها از طریق آزادسازی فسفر ترکیبات آلی مانند فیتات به تغذیۀ گیاه کمک می‌کنند و رشد گیاه را به‌طور غیرمستقیم افزایش می‌دهند؛ علاوه‌بر‌این، پروبیوتیک فعالیت ریزموجودات بیماری‌زا را از طریق آنتاگونیسم‌های میکروبی کاهش می‌دهد و با فعال‌سازی گیاه برای حفاظت بهتر از خود باعث پدیدۀ «مقاومت سیستمیک القاشده» می‌شود (8-11). نشان داده شده است لاکتوباسیلوس‌ها در مهار قارچ‌های میکروسکوپی ازجمله Penicillium expansum، Botrytis cinerea، Aspergillus niger، Aspergillus flavus وFusarium graminarumو باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی ازجمله Xanthomonas campestris و Erwinia carotovora کارآمد هستند (2 و 10). این باکتری‌ها در تجزیۀ زیستی آلاینده‌های محیطی[9] و تولید مواد کلاته‌کنندۀ فلزهای سنگین و کاهش سمیت فلزهای سنگین[10] نقش دارند (2).

باکتری‌های لاکتیک‌اسید در صنعت به‌علت فیزیولوژی ویژه و ویژگی‌های بیوشیمیایی مانند تولید اگزوپلی‌ساکاریدها، اسیدهای آلی، ترکیبات معطر، تحمل فعالیت آبی کم و تولید مواد ضدمیکروبی درخور توجه هستند و کاربردهای مختلفی یافته‌اند؛ ازجمله، در بررسی‌ها نشان داده شده است برخی سویه‌های باکتری‌های لاکتوباسیل قادر به مهار بیماری‌زاهای خوراکی مانند Listeria monocytogenes،Escherichia coli،Salmonella typhimuriumو Staphylococcus aureus هستند. با‌توجه‌به مشکلات آلودگی‌های میکروبی به یافته‌هایی از این قبیل در صنایع غذایی بسیار توجه شده است (10).

برنج (Oryza sativa) با بسیاری از محصولات متفاوت است؛ زیرا معمولاً در خاک سیلاب کشت می‌شود و در نتیجه، محیط اکسیژنیک و غیراکسیژنیک درون ریزوسفر برنج گروه فیزیولوژیکی ویژه‌ای از ریزموجودات دارای هر دو نوع متابولیسم هوازی و غیرهوازی را انتخاب می‌کند (12). واریتۀ برنج لنجان یکی از انواع برنج‌های ایران است که در منطقۀ لنجانات (در فاصلۀ 50 کیلومتری جنوب‌غربی اصفهان) کشت می‌شود. این خطه به‌علت آب‌وهوای مناسب و خاک غنی از درشت‌مغذی‌ها و ریزمغذی‌ها ازنظر کشاورزی مهم‌ترین تولید‌کنندۀ برنج در استان اصفهان به شمار می‌آید و واریتۀ برنج لنجان از برنج‌های محبوب ایرانیان محسوب می‌شود. در چند مطالعۀ انجام‌شده، حضور فلزهای سنگینی مانند کروم، سرب و کادمیوم در محیط‌کشت برنج لنجان گزارش شده است (13 و 14).

شناسایی لاکتوباسیلوس‌ها با روش‌های معمول بیوشیمیایی و مولکولی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام می‌شود. پژوهش‌ها نشان داده‌اند وقتی سوش‌های لاکتوباسیلوس (در گونه‌های بسیار نزدیک به ‌هم) توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA مشابهی دارند، تعیین توالی نوکلئوتیدی محصولات همانند‌سازی ژن‌های کد‌کنندۀ پروتئین‌های اختصاصی مانند [11]RecA تفاوت‌های لازم برای جدا‌کردن آنها را فراهم می‌کند. پروتئین RecA پروتئین فعالی در سلول‌های پروکاریوت است که وظایف چندگانه‌ای در سلول باکتری ایفا می‌کند. پروتئین RecA پروتئین کوچکی است که عملکردهای مختلف آن در اتصال DNA (تک‌رشته و دو‌رشته)، جفت‌شدن و تبادل هومولوگ DNA و هیدرولیز ATP اثبات شده است. پژوهشگران آغازگر اختصاصی ژن recA را در بررسی گونه‌های مختلف لاکتوباسیلوس به‌ویژه لاکتوباسیلوس پلانتاروم استفاده و تأیید کرده‌اند (15).

با‌توجه‌به اهمیت ریزموجودات خاک و ریزوسفر ریشه به‌ویژه لاکتوباسیلوس‌ها در رشد‌و‌نمو گیاهان و نیز کمک به رویارویی با تنش‌های محیطی ازجمله حضور فلزهای سنگین و همچنین اهمیت آنها در صنایع غذایی و بخش پزشکی، پژوهش حاضر با هدف اولیۀ بررسی حضور لاکتوباسیلوس پلانتاروم در ریزوسفر برنج لنجان انجام شد.

 

مواد و روش‌ها.

جمع‌آوری و آماده‌سازی نمونه‌ها: چهار نمونه از ریزوسفر برنج لنجان مزارع برنج واقع در خطۀ نکوآباد اصفهان (در موقعیت 32 درجه و 22 دقیقۀ عرض شمالی و 51 درجه و 31 دقیقۀ شرقی) جمع‌آوری و به آزمایشگاه فناوری دانشگاه بوعلی‌سینای همدان منتقل شدند. سری‌های رقت (رقت‌های صفر تا 4-10) از نمونه‌ها در سرم فیزیولوژی استریل تهیه شدند.

کشت و گرماگذاری نمونه‌ها: 100 میکرولیتر از رقت‌های مختلف نمونه‌ها با پیپت پاستور روی محیط‌کشت [12]MRS (مناسب برای رشد باکتری‌های پروبیوتیک به‌ویژه لاکتوباسیلوس‌ها)کشت داده شد و به‌مدت 72 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد (16).

.بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی:ویژگی‌های ظاهری هر کلنی و سلول با میکروسکوپ نوری و پس‌از رنگ‌آمیزی گرم بررسی و ثبت شدند. از کلنی‌های مشابه لاکتوباسیلوس با ویژگی باکتریایی میله‌ای‌شکل، گرم مثبت و بدون اسپور برای انجام آزمون بیوشیمیایی و تأیید مولکولی گونۀ لاکتوباسیلوس پلانتاروم نمونه‌برداری شد. برای تأیید خلوص باکتری، هر سویه چند بار در محیط MRS واکشت شد. آزمون‌های اکسیداز و کاتالاز در کشت این باکتری‌ها انجام شدند؛ در آزمون کاتالاز، محیط‌کشت بدون باکتری برای شاهد منفی و باکتری استافیلوکوکوس اورئوس برای شاهد مثبت و در آزمون اکسیداز، استافیلوکوکوس اورئوس برای شاهد مثبت و استرپتوکوک پنومونیا برای شاهد منفی استفاده شد (16).

تولید اسید از قندها با به‌کارگیری محیط MRS بدون عصارۀ گوشت و گلوکز انجام شد؛ به این منظور، در هر لولۀ آزمایش (دارای لولۀ دورهام) 2 میلی‌لیتر محیط MRSمایع مخصوص تخمیر (حاوی 1 درصد قند مدنظر) و معرف فنل‌رد ریخته شد. پس‌از تلقیح 1 درصد از کشت فعال جدایۀ باکتری موردشناسایی، لوله‌ها به‌مدت 72 ساعت تا یک هفته در انکوباتور 37‍ درجۀ سانتی‌گراد و در شرایط 5 درصد گاز دی‌اکسید‌کربن نگهداری شدند. تبدیل رنگ قرمز محیط به رنگ زرد به معنای مصرف قند و تولید اسید تلقی شد (قند گلوکز برای شاهد در نظر گرفته شد) (17).

ارزیابی ویژگی‌های پروبیوتیکی:ازآنجاکه توانایی رشد باکتری‌های پروبیوتیک در شرایط مختلف ازجمله اسیدیته، دما و حضور نمک برای استفاده در صنعت (ازجمله صنایع غذایی و کشاورزی) و نیز شرایط رشدی در بدن (انسان و حیوانات) بسیار مهم است، آزمایش‌هایی طراحی شدند. توانایی رشد باکتری‌ها در شرایط اسیدی با استفاده از محیط MRS با اسیدیته‌های مختلف (5/3، 4، 5/4 و 5) آزمایش شد. توانایی بقای باکتری‌ها در محیط‌های صفراوی با استفاده از محیط MRS حاوی 3/0 و 5/0 درصد اکس‌گال[13] ارزیابی شد. برای انجام این آزمایش‌ها، ابتدا کشت فعال از هر ذخیرۀ باکتریایی تهیه و به نسبت 1 درصد به محیط‌کشت مایع موردآزمایش اضافه شد. محیط‌کشت‌ها به‌مدت 72 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. توانایی رشد جدایه‌های مطالعه‌شده در محیط‌های یادشده با مشاهدۀ تغییر کدورت پس‌از 24، 48 و 72 ساعت بررسی و نتایج به‌شکل مثبت یا منفی تعیین شد (18). توانایی رشد جدایه‌های لاکتوباسیلوس‌ها در دماهای 15، 20، 40 و 45 درجۀ سانتی‌گراد و در غلظت‌های نمک (NaCl) 5/4 و 5/6 درصد نیز بررسی شد. همچنین توانایی این ریزموجودات برای احیای نیترات پیگیری شد (19). در آزمایش‌ها، میزان رشد طی مدت 24 ساعت یا بیشتر با بررسی کدورت رشد باکتری (OD600) بررسی شد. نمونه‌ها هر یک ساعت یک بار طی شش ساعت اول و سپس در انتهای 24 ساعت بررسی شدند. پس‌از 24 ساعت، کدورت بیش از 8/2 رشد مناسب و کدورت کمتر از 8/0 رشد ضعیف در نظر گرفته شد.

محافظت فلور میکروبی دستگاه گوارش پس‌از درمان با آنتی‌بیوتیک یکی از فواید استفاده از باکتری‌های پروبیوتیک مقاوم به آنتی‌بیوتیک است (20)؛ ازاین‌رو، مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌های لاکتوباسیلوس پلانتاروم در برابر آنتی‌بیوتیک‌های مختلف بررسی شد. آزمایش بر اساس روش سبسی[14] و همکاران (2003) انجام شد. 200 میکرولیتر از کشت غنی‌شده به 4 میلی‌لیتر محیط‌کشت MRS‌آگار (1 درصد آگار) اضافه شد. دیسک‌های آنتی‌بیوتیک در سطح محیط قرار گرفتند و قطر هالۀ بازدارندگی رشد اطراف دیسک‌ها در پلیت‌ها پس‌از 24 ساعت گرماگذاری در 37 درجۀ سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد. دیسک‌های آنتی‌بیوتیک شامل تتراسیکلین (30 میکروگرم)، ونکومایسین (30 میکروگرم)، سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم)، پنی‌سیلین (10 میکروگرم)، آموکسیکلاو (30 میکروگرم)، سفتریاکسون (30 میکروگرم)، اریترومایسین (15 میکروگرم)، نالیدیکسیک اسید (30 میکروگرم)، توبرامایسین (10 میکروگرم)، ریفامپیسین (5 میکروگرم)، اوفلوکساسین (5 میکروگرم)، تتراسایکلین (30 میکروگرم) بودند. هالۀ بازدارندگی کمتر از 9 میلی‌متر مقاوم در نظر گرفته شد (21 و 22).

شناسایی مولکولی:DNA باکتری به روش موری[15] و تامسون[16] با اندکی تغییر خالص شد (23). در این روش، 10 میلی‌لیتر سوپانسیون باکتریایی از کشت 24ساعته با سرعت 13000 دوردردقیقه به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب به درون ویال‌های جدید منتقل و 1 میلی‌لیتر بافر لیز‌کنندۀ CTAB (بافر لیزکننده شامل پودر CTAB به همراه بافر 1 مولار TRic-Hcl (اسیدیتۀ برابر 8)، محلول 5/0 مولار Na2EDTA (اسیدیتۀ برابر 8) و NaCl 5/0 مولار بود) با دمای 65 درجۀ سانتی‌‌گراد به آن اضافه شد. نمونه‌ها به مدت نیم ساعت در حمام آب گرم در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد  قرار داده شدند و طی این مدت، ویال‌ها هر 5 دقیقه یک بار تکان داده شدند. هم‌حجم نمونه‌ها، کلروفرم ایزوآمیل‌الکل (1:24) افزوده شد و نمونه‌ها به‌شدت مخلوط شدند. نمونه‌ها 10 دقیقه روی شیکر قرار داده شدند و هر چند دقیقه یک بار ویال‌ها به‌مدت 5 ثانیه به‌شدت تکان داده شدند؛ سپس نمونه‌ها به‌مدت 5 دقیقه با سرعت 13000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. در این مرحله، سه فاز تشکیل شد و مایع بالایی به ویال جدید منتقل و هم‌حجم آن ایزوپروپانول سرد خالص اضافه شد. محتویات هر ویال به‌آرامی و با وارونه‌کردن ویال‌ها کاملاً مخلوط شد و ویال‌ها 10 دقیقه روی یخ قرار داده شدند. برای ته‌نشین‌شدن DNA، نمونه‌ها 10 دقیقه با سرعت 13000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. مایع بالایی به‌آرامی خارج شد و 500 میکرولیتر اتانول 70 درصد به رسوب DNA اضافه شد. نمونه‌ها 5 دقیقه با سرعت 13000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و فاز رویی به‌آرامی از ویال خارج شد. سپس ویال‌ها به‌مدت 1 ساعت در معرض هوا قرار داده شدند تا DNA خشک شود. پس‌از‌آن، 100 میکرولیتر آب مقطر استریل دیونیزه به هر ویال اضافه شد و نمونه‌ها یک شب در یخچال با دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند. نمونه‌ها برای نگهداری طولانی‌مدت به فریزر منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شدند. کیفیت DNA استخراج‌شده با الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد و بررسی جذب نوری تأیید شد (23).

PCR: هر مخلوط واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 7 میکرولیتر نمونۀ DNA بود. برای شناسایی جدایه‌هایی که بر اساس ویژگی‌های فنوتیپی لاکتوباسیلوس پلانتاروم شناسایی شده بودند از آغازگر اختصاصیplantF (پیش‌برنده) و آغازگر عمومی pRE (معکوس) برای جنس لاکتوباسیلوس استفاده شد. آغازگر اختصاصی بر اساس توالی ویژه‌ای از ژن rec A (طراحی‌شده توسط توریانی[17] و همکاران) استفاده شد (15). آغازگرها از شرکت سیناژن خریداری شدند.

غلظت نهایی آغازگر در هر مخلوط واکنش PCR معادل 1 میلی‌مولار بود؛ به این منظور، 5/0 میکرولیتر از محلول آغازگر به هر مخلوط واکنش اضافه شد و سپس مستر‌میکس (آمپلیکون[18]، دانمارک) شامل مخلوط نوکلئوتیدی dNTP، MgCl2، آنزیم Taq‌پلیمراز و بافر افزوده شد. برنامۀ PCR (دستگاه تکن[19]، انگلیس) به‌شکل دناتوره‌شدن در 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه و پس‌از‌آن، واکنش تکثیری مرحلۀ اول در 30 چرخه شامل واسرشت‌سازی در 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگر در 51 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه، مرحلۀ طویل‌شدن در 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و گسترش نهایی در 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه تنظیم شد. برای مشاهدۀ محصولات PCR، 5 میکرولیتر از محصول در چاهک‌های ژل آگارز 1 درصد در بافر TBE دارای مشاهده‌گر سبز[20] با ولتاژ ثابت 80 ولت الکتروفورز شد. جریان برق پس‌از گذشت 90 دقیقه قطع شد و از ژل در دستگاه ژل‌داک[21] با اشعۀ ماورای بنفش عکس‌برداری شد.

 

نتایج

16 ریزموجود جداسازی‌شده روی محیط‌کشت MRS شامل کوکسی‌های گرم مثبت و گرم منفی و باسیل‌های میله‌ای گرم مثبت و گرم منفی بودند (جدول 1). در بین این ریزموجودات، 10 جدایه باکتری‌های باسیلی‌شکل بودند و در بین این گروه، از 8 جدایه که پاسخ آنها به آزمون‌های کاتالاز، اکسیداز و احیای نیترات منفی بود به‌عنوان لاکتوباسیلوس‌هایاحتمالی در آزمایش‌های بعدی استفاده شد.

در 24 ساعت اول گرماگذاری، باکتری‌ها در دماهای 20 و 40 درجۀ سانتی‌گراد به‌خوبی رشد کردند. زمان رشد برای دمای 15 درجۀ سانتی‌گراد 48 ساعت در نظر گرفته شد. فقط جدایه‌های V1، V9 و V16 در دمای 45 درجۀ سانتی‌گراد رشد کردند. باکتری‌ها در غلظت‌های 5/4 و 5/6 درصد نمک توانایی رشد داشتند. در غلظت 5/4 درصد کدورت رشد بسیار زیاد و مشابه نمونه‌های شاهد بود. جدایه‌های V1، V3، V8، V12، V13 و V16 رشدی نزدیک به شاهد در غلظت 5/6 درصد نمک داشتند (جدول 2).

همۀ جدایه‌ها در غلظت 3/0 درصد نمک صفراوی اکس‌گال به‌خوبی (مشابه شاهد در محیط بدون نمک) رشد کردند. جدایه‌های V3، V8، V12، V13 و V16 رشد خوبی در غلظت 5/0 درصد اکس‌گال نشان دادند (جدول 2). همۀ 8 جدایه در اسیدیتۀ 5/3 به‌خوبی رشد کردند هرچند هیچ‌یک از آنها توانایی رشد در اسیدیته‌های 2 و 6/9 را نداشتند (جدول 2).

استفادۀ باکتری از قندها در جدول 3 نشان داده شده است. باتوجه‌به تخمیر قندها، مطابق با طبقه‌بندی برجی[22] (17)، جدایه‌های V1، V3، V5، V8، V12 و V16 باکتری‌های لاکتوباسیلوس پلانتاروم احتمالی انتخاب و با آغازگرهای اختصاصی (از طریق واکنش PCR) بررسی شدند. تشکیل باند 318 جفت بازی در الکتروفورز محصولات PCR هر 6 جدایه نشان‌دهندۀ گونۀ لاکتوباسیلوس پلانتاروم و تأیید‌کنندۀ نتایج بیوشیمیایی بود (شکل 1).

طبق نتایج، جدایه‌های لاکتوباسیلوس پلانتاروم به آنتی‌بیوتیک‌های ونکومایسین، سیپروفلوکساسین، اوفلوکساسین، نالیدیکسیک‌اسید، اریترومایسین، جنتامایسین و کانامایسین مقاوم هستند.

 

جدول 1- ویژگی‌های ریخت‌شناسی و آنزیمی ریزموجودات جداسازی‌شده از ریزوسفر برنج لنجان

شمارۀ جدایه

شکل سلول

گرم

کاتالاز

اکسیداز

V1

باسیل

مثبت

-

-

V2

کوکسی

مثبت

+

+

V3

باسیل

مثبت

-

-

V4

کوکسی

منفی

+

-

V5

باسیل

مثبت

-

-

V6

کوکسی

منفی

+

-

V7

باسیل

منفی

+

-

V8

باسیل

مثبت

-

-

V9

باسیل

مثبت

-

-

V10

کوکسی

مثبت

+

-

V11

باسیل

منفی

+

+

V12

باسیل

مثبت

-

-

V13

باسیل

مثبت

-

-

V14

کوکسی

منفی

+

-

V15

کوکسی

منفی

+

+

V16

باسیل

مثبت

-

-

 

 

جدول 2- رشد جدایه‌های  لاکتوباسیلوس جداشده از ریزوسفر برنج در غلظت‌های مختلف نمک، اکس‌گال و اسیدیته‌های متفاوت

سویه

15درجه

20درجه

40درجه

45درجه

اسیدیتۀ 2

اسیدیتۀ 5/3

اسیدیتۀ 6/9

3/0درصد اکس‌گال

5/0درصد اکس‌گال

5/4درصد نمک

5/6درصد نمک

V1

+

+

+

+

-

+

-

+

W

+

+

V3

+

+

+

W

-

+

-

+

+

+

+

V5

+

+

+

W

-

+

-

+

W

+

W

V8

+

+

+

W

-

+

-

+

+

+

+

V9

+

+

+

+

-

+

-

+

W

+

W

V12

+

+

+

W

-

+

-

+

+

+

+

V13

+

+

+

W

-

+

-

+

+

+

+

V16

+

+

+

+

-

+

-

+

+

+

+

+: رشد، -: رشدنکردن، w: رشد ضعیف

 

جدول 3- ویژگی رشدی جدایۀ لاکتوباسیلوس جداشده از ریزوسفر برنج در محیط‌های حاوی قندهای مختلف

سویه

آرابینوز

سلوبیوز

فروکتوز

گالاکتوز

گلوکونات

لاکتوز

مانوز

مانیتول

ملبیوز

سوربیتول

رافینوز

ترهالوز

ریبوز

زایلوز

V1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

W

+

-

V3

W

+

+

+

W

+

+

+

+

+

+

+

+

-

V5

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

V8

+

+

+

+

+

+

+

+

W

+

+

+

+

-

V9

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

V12

+

+

+

+

W

+

W

+

+

+

+

+

+

-

V13

-

+

-

+

W

+

+

W

+

+

W

W

+

+

V16

W

W

+

+

W

+

+

+

W

+

+

+

+

-

+: رشد، -: رشدنکردن، w: رشد ضعیف

 


 

شکل 1- تشکیل باند 318 جفت بازی در الکتروفورز محصولات. PCR لاکتوباسیلوس پلانتاروم. V1، V3، V5، V8، V12 و V16:. جدایه‌های باکتری، M: نشانگر.

 

بحث و نتیجه‌گیری.

در سال‌های اخیر علاوه‌بر زمینۀ پزشکی و سلامتی، تمایل به کاربردهای غذایی و کشاورزی پروبیوتیک‌ها افزایش یافته است؛ به‌طوری‌که استفاده از این باکتری‌ها در بخش کشاورزی برای کاهش‌دادن استفاده از مواد شیمیایی و به‌حداقل‌رساندن آلودگی مؤثر بوده و مصرف منابع انرژی تجدیدپذیر را افزایش داده است؛ به‌همین‌علت یافتن سویه‌های پروبیوتیک جدید با کاربردهای متنوع اهمیت بسیاری یافته است. اگرچه محصولات لبنی نخستین منابع مواد غذایی پروبیوتیک شناخته‌شده هستند (9 و 11)، مطالعه‌ها طی دهه‌های اخیر نشان داده‌اند منابع غیرلبنی و غیرروده‌ای مانند آبمیوه‌ها، غذاهای سنتی تخمیری، خاک ریزوسفر درختان میوه، گیاهان خوراکی و خاک مزارع نگهداری حیوانات منابع خوبی برای جداسازی این باکتری‌ها هستند (6 و 24). استفاده از این باکتری‌ها به‌عنوان پروبیوتیک در صنایع مختلف مستلزم تحمل این باکتری‌ها نسبت به شرایط نامطلوب محیطی است؛ برای نمونه، این باکتری‌ها می‌بایست شرایط اسیدی تا قلیایی دستگاه گوارش و وجود صفرا در بدن انسان و حیوان را تحمل و رشد کنند. در صنایع غذایی نیز این باکتری‌ها باید بتوانند در مواد غذایی متنوع با اسیدیته‌ها و دماهای مختلف و گاه حضور نمک زنده بمانند. در خاک نیز باکتری‌ها باید شرایط خاک (وجود املاح و ترکیبات مختلف) و شرایط محیطی (گرما یا سرما) را تحمل کنند و به رشد و بقای خود ادامه دهد (25)..

در مطالعۀ حاضر، نتایج بیوشیمیایی و مولکولی (با استفاده از آغازگرهای اختصاصی) حضور باکتری‌های پروبیوتیک به‌ویژه لاکتوباسیلوس پلانتاروم که از مفیدترین باکتری‌های این گروه است را در شرایط محیطی خاک ریزوسفر برنج لنجان اثبات کرد. در ایران، این باکتری فقط از لبنیات استخراج شده است و گزارش‌هایی مبنی بر استخراج این گونه از زیتون تخمیری و شیر مادر نیز وجود دارد (26 و 27). تاکنون گزارشی مبنی بر جداسازی این گونه از ریزوسفر ریشۀ برنج مشاهده نشده است. در مطالعۀ حاضر، باکتری‌های بررسی‌شده توانایی مناسبی برای تحمل اسیدیته، دماهای مختلف و شرایط اسیدی از خود نشان دادند و توانایی رشد این باکتری‌ها در دامنۀ دمایی 15 تا 45 درجۀ سانتی‌گراد نشان داد این باکتری‌ها توانایی زنده‌ماندن و حتی تکثیر‌شدن در خاک، فصل‌های مختلف و بدن حتی هنگام تب را دارند. در مطالعه‌های پیشین، لاکتوباسیلوس‌های استخراج‌شده تحمل کمی به شرایط اسیدی (اسیدیتۀ کمتر از 4) از خود نشان داده‌اند اما در مطالعۀ حاضر، باکتری‌های استخراج‌شده در اسیدیته‌های کمتر (اسیدیتۀ 3) نیز به‌خوبی رشد کردند (28). در پژوهش‌های د-وریس[xxiii] و همکاران نشان داده شده است لاکتوباسیلوس‌ها اکثراً در غلظت نمک بیش از 5 درصد رشد ضعیفی دارند و درصد بقا در غلظت‌های زیاد نمک به‌طور درخور توجهی کاهش می‌یابد (5). همۀ جدایه‌هایی که در پژوهش حاضر لاکتوباسیلوس پلانتاروم شناسایی شدند رشد درخور توجهی (برابر با شاهد) در غلظت 5/6 درصد نمک داشتند و فقط جدایۀ در این محیط رشد ضعیفی از خود نشان داد (5)؛ همچنین این باکتری‌ها مقاومت خوبی در محیط‌های اسیدی و حاوی صفرا از خود نشان دادند که نشان‌دهندۀ توانایی بقای آنها در محیط اسیدی معده و روده هنگام گرسنگی است. به‌طور‌کلی، مقایسه و تطابق نتایج مطالعه‌های مختلف در زمینۀ مقاومت به اسید و صفرا به‌سختی امکان‌پذیر است. علت‌های مختلفی مانند تفاوت در نوع سویه‌های آزمایش‌شده، میزان حساسیت به شرایط اسیدی و نمک صفراوی در باکتری‌های آزمایش‌شده و تفاوت در شرایط آزمایش (ازنظر محیط‌کشت و مواد استفاده‌شده) باعث شده است ارزیابی چنین معیارهایی حتی در سویه‌های تجارتی نیز متفاوت باشد (18). در مطالعه‌های انجام‌شده، لاکتوباسیلوس پلانتاروم در میان گونه‌های مختلف لاکتوباسیلوس عادت‌پذیرترین گونه شناخته شده است؛ ژنوم بزرگ و توانایی آنزیمی قوی باعث شده است لاکتوباسیلوس پلانتاروم در منابع زیستی متفاوت حضور داشته باشد (5).

مقاومت این باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک، باکتری‌های فوق را گزینۀ مناسبی برای مطالعه و استفاده در بخش سلامت و پزشکی مطرح می‌کند.باکتری‌های پروبیوتیکی که توانایی مقاومت به داروهای استفاده‌شده در درمان‌ها به‌ویژه عفونت‌های گوارشی را داشته باشند گزینه‌های مناسبی برای استفاده در حفظ فلور میکروبی افراد دریافت‌کنندۀ آنتی‌بیوتیک هستند؛ هر‌چند بررسی‌ها نشان داده‌اند به‌علت احتمال انتقال مقاومت به باکتری‌های بیماری‌زا، تمام باکتری‌های پروبیوتیک گزینۀ مناسبی برای این منظور نیستند. در لیست پیش‌بینی معتبر ایمنی QPS (Qualified Presumption of Safety) که ادارۀ ایمنی غذایی اروپا EFSA (European Food Safety Authority) منتشر کرده است لاکتوباسیلوس پلانتاروم یکی از ریزموجودات بی‌خطر و مفید گزارش شده است (29).

پژوهش حاضر نشان می‌دهد ریزوسفر برنج منبعی طبیعی برای جداسازی لاکتوباسیلوس پلانتاروم است. این باکتری توانایی زیادی برای تحمل شرایط نامساعد دارد و به نظر می‌رسد گزینۀ مناسبی برای مطالعه به‌عنوان پروبیوتیک مناسب باشد.



[1]- probiotic

[2]- Lilly

[3]- Stillwell

[4]- Plant Growth Promoting Bacteria

[5]- Plant probiotic Bacteria

[6]- Haas

[7]- picard

[8]- Yeild Incresing Bacteria

[9]- Bioremediation, Rhizoremediation, Phytoremediation

[10]- Phytostimulation

[11]- Recombinase A

[12]- de Man, Rogosa and Sharpe

[13]- oxgall

[14]- Cebeci

[15]- Murray

[16]- Thompson

[17]- Torriani

[18]- Amplicon

[19]- Techne

[20]- Green viwer

[21]- Gel document

[22]- Bergey

[xxiii]- De Vries

(1)              Shah NP. Functional cultures and health benefits. International Journal of Dairy Science 2007; 17: 1262-1277.

(2)              Ahmadzadeh M. Biological control of plant diseases. Tehran: Tehran University Press; 2013.

(3)              Haas D., Defago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nature Reviews Microbiology 2005; 3: 307-319.

(4)              Picard C., Bosco M. Genotypic and phenotypic diversity in populations of plant-probiotic Pseudomonas spp. colonizing roots. Naturwissenschaften 2008; 95:1-16.

(5)              De Vries MC., Vaughan EE., Kleerebezema M., de Vosa WM. Lactobacillus plantarum survival, functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract. International Dairy Journal 2006; 16(9): 1018-1028.

(6)              Sornplang P., Piyadeatsoontorn S. Probiotic isolates from unconventional sources: a review. Journal of Animal Science and Technology 2016; 58: 1-11.

(7)              Kamruzzaman M., Khatun S., Islam SMN., Haque MA. Characterization of some rhizospheric bacteria and their plant growth promoting potentialities in nutrient stress environment. International Journal of Innovative Science, Engineering & Technology 2015; 2(9): 805-819.

(8)              Islam MT., Hossain MM. Plant probiotics in phosphorus nutrition in crops, with special reference to rice In: Maheshwari D. K., editor. Bacteria in Agrobiology: Plant Probiotics. Berlin-Heidelberg: Springer; 2012: 325-363.

(9)              Ruiza D., Agaras B., de Werrab P., Wall LG., Valverd C. Characterization and screening of plant probiotic traits of bacteria isolated from rice seeds cultivated in Argentina. The Journal of Microbiology 2011; 49(6): 902-912.

(10)          Fhoula I., Najjari A., Turki Y., Jaballah S., Boudabous A., Ouzari H. Diversity and Antimicrobial Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Rhizosphere of Olive Trees and Desert Truffles of Tunisia. BioMed Research International 2013; 1-14.

(11)          Rigobelo EC. Probiotics. Brazil:UNESP Univercity Estadual Paulista; 2012.

(12)          Breidenbach B., Pump J., Dumont MG. Microbial community structure in the rhizosphere of rice plants. Frontiersin Microbiology 2016; (6): 1-12.

(13)          Hemati Farsani M., Ghezelbash M., Darbani SMR., Eslami Majd A., Soltanolkotabi M. Determination of trace elements in some types of iranian rice using laser induced breakdown spectroscopy. Journal of Mazandaran University Medical Sciences 2014; 24(118): 24-32.

(14)          Rahimi GH., Kolahchi Z., Charkhabi A. Uptake and translocation of some heavy metals by rice crop (Oryza sativa) in paddy soils. Agriculture (Pol'nohospodárstvo) 2018; 63(4): 163-175.

(15)          Torriani S., Felis GE., Dellaglio F. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus and L. paraplantarum by rec A gene sequence analysis and multiplex PCR assay with rec A gene derived primers. Applied and Environmental Microbiology2001; 67: 3454-3459.

(16)          Dworkin MM., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer KH., Stackebrandt E. The Prokaryotes. 3rd ed. New York: Springer; 2006.

 

(17)          Kandler O., Weiss N. Genus Lactobacillus In: Sneath P.H.A., Halt J., Nair NS., Sharpe ME. editors. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 8thed. Baltimore: Williams and Wilkins; 1986: 1216- 1225.

(18)          Succi M., Tremonte P., Reale A., Sorrentino E., Grazia L., Pacifico S. Bile salts and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese. FEMS Microbiology Letters 2005; 244: 129-137.

(19)          Yavuzdurmaz H. Isolation characterization and determination of probiotic properties of Lactic Acid Bacteria from human milk (Masters Thesis). Izmir Institute of Technology: School of engineering and science; 2007.

(20)          Gueimonde M., Sánchez B., de los Reyes-Gavilán CG., Margolles A. Antibiotic resistance in probiotic bacteria. Frontiers in Microbiology2013; 4: 202.

(21)          Cebeci A., Gurakan C. Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains. Food Microbiology 2003; 20: 511-518.

(22)          Melvin P., Weinstein, MD. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. Clinical and laboratory standards institute. USA: Wayne; 2017.

(23)          Murray MG., Thompson WF. Rapid isolation of high molecular wright plant DNA. Nucleic Research 1980; 8: 4321-4325.

(24)          Rivera-Espinoza Y., Gallardo-Navarro Y. Non-dairy probiotic products. Food Microbiology 2010; 27: 1-11.

(25)          Song D., Hayek S., Ibrahim S. Recent application of probiotics in food and agricultural science In: Rigobelo EC. editor. Immunology and microbiologyProbiotics”. London, United Kingdom: INTECH Publisher; 2012: 123-141.

(26)          Esmaeili T., Emami ZD., Ahadi AM., Shahanipour K., Shafighi M. Identification of lactobacillus plantarum isolated from olive by PCR-RFLP method. Journal of Microbiological Biotechnology, Islamic Azad University 2012; 4(12): 21-28.

(27)          Lashni E., Soltan Dalal MM., Davoud Abadi A. The beneficial effects of probiotic bacteria isolated from breast milk. The second national conference on the health of milk from production to consumption and its nutritional importance, Food and Drug Administration, University of Medical Sciences, Tehran, Iran; 2014.

(28)          Tanasupawat S., Suzuki KI., EzakiT., Kozaki M. Characterization and identification of Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum strains from fermented foods in Thailand. Journal of General and Applied Microbiology 1992; 38(2): 121-134.

BIOHAZ. Update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 7: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2017. EFSA Journal 2018; 16(1): 5131.