بررسی تنوع ژنتیکی باکتری‌های میله‌ای غیر‌تخمیرکنندۀ مقاوم به فلزهای کادمیوم و مس ‏جداشده از پساب‌های صنعتی با استفاده از نشانگرهای مولکولی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج ، ایران

2 گروه بیوتکنولوژی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: حذف زیستی بهترین روش برای رفع آلودگی‌های ناشی از فلزهای سنگین در پساب‌های صنعتی است و نخستین قدم در این مسیر، شناسایی و طبقه‌بندی ریزموجودات مناسب به‌ویژه باکتری‌های مقاوم به این فلزهاست.‏‏
مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، 17 باکتری گرم منفی غیرتخمیرکننده از پساب‌های صنعتی جداسازی و شناسایی شدند و کمترین غلظت بازدارنده (MIC) آنها نسبت به غلظت‌های مس و کادمیوم ارزیابی شد؛ DNA باکتری‌های یادشده با دو روش CTAB و دلاپورتا استخراج و تنوع ژنتیکی آنها با 7 نشانگر RAPD و 3 نشانگر ISSR بررسی شد. ماتریس تشابه بر اساس ضریب تشابه جاکارد با نرم‌افزار 2.02) NTSYS-pc (Ver برای ژنوتیپ‌ها محاسبه و دندروگرام به روش UPGMA رسم شد.
نتایج: 133 باند با استفاده از 10 نشانگر DNA شناسایی شدند که از این تعداد، 122 باند چندشکل و 11 باند یک‌شکل بودند. این نشانگرها سطح بالایی از چندشکلی را در میان باکتری‌های مطالعه‌شده نشان دادند.
بحث و نتیجه‏گیری: تنوع ژنتیکی حاصل از بررسی توأم نشانگرهای ISSR و RAPD در تجزیۀ خوشه‌ای و دندروگرام رسم‌شده با تنوع ژنتیکی مشاهده‌شده بر اساس مقادیر MIC تطابق زیادی داشت و استفادۀ توأم از هر دو نوع نشانگر برای دسته‌بندی‌های ژنتیکی بر اساس مقاومت به فلزهای مس و کادمیوم دقیق‌تر بود. برای تکمیل نتایج روش خوشه‌ای، تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نیز انجام شد و پلات‌های دو‌بعدی و سه‌بعدی رسم شدند.نتایج مقایسۀ این دو روش نشان‌دهندۀ انتخاب مناسب نشانگرها برای بررسی تنوع ژنتیکی می‌باشد واز بین دو روش، انجام تجزیه خوشه‌ای نوصیه می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Assessing the Genetic Diversity of Isolated Cd and Cu Resistant Non-fermenting Gram-negative Bacilli from Waste Water by Using Molecular Markers

نویسندگان [English]

  • Mohammad Hossein Habibollahi 1
  • Amin Baghizadeh 2
  • Azar Sabokbar 1
1 Department of Microbiology, Karaj Branch, Islamic Azad University, Karaj, Iran
2 Department of Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: One of the best methods to remove pollutions resulted from heavy metals in industrial wastewater is biological removing. The first step in this way is identifying and clustering microorganisms especially, resistant bacteria to these metals.
Material and methods: In this research, 17 non-fermenting gram-negative bacilli were isolated and identified from industrial wastewater. Their MIC was determined by different concentrations of Cu and Cd. With CTAB and Dellaporta, methods were extracted bacterial DNA. Then evaluated genetic diversity by 7 RAPD, 3 ISSR markers. The similarity matrix was calculated by using NTSYS-pc software based on Jaccard’s coefficient for genotypes and dendrogram was drawn in UPGMA method.
Results: 133 bands were identified by using 10 markers that they included 122 polymorphic bands and 11 monomorphic bands. This markers show high level of polymorphism among the bacteria studied.
Discussion and Conclusion: In the study cluster analysis and dendrogram drawn based on RAPD and ISSR markers together, there was a significant match between genetic diversity of markers and genetic diversity based on the MIC values. The combined use of both markers for genetic clustering based on resistance to copper and cadmium was more accurate. Principal component analysis was performed to complete the results of cluster analysis and 2-D, 3-D plots were drawn. The results of comparing these two methods showed that these markers had been properly selected for studying genetic diversity, and it was recommended using cluster analysis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genetic Diversity
  • ‎‏ ‏RAPD
  • ISSR
  • Non-fermenting gram-negative Bacilli
  • Heavy Metals

مقدمه

در دنیای صنعتی امروز، کارخانه‌ها و صنایع بزرگ و کوچک فراوانی در شهرها و حاشیۀ آنها ساخته شده‌اند؛ تولید محصول تنها خروجی این صنایع نیست و پساب‌ها که بسیاری از آنها با محیط‌زیست ناسازگار هستند جزو فراورده‌های آنها به شمار می‌آیند (1). فعالیت‌های صنعتی از یک‌سو و رعایت‌نشدن نکته‌ها و عوامل زیست‌محیطی از سوی دیگر سبب شده‌اند مقادیر زیادی از آلاینده‌ها به محیط‌زیست وارد شوند. فلزهای سنگین یکی از مهم‌ترین آلاینده‌های پایدار و تجزیه‌ناپذیر و از سمی‌ترین آلاینده‌ها در محیط‌زیست به شمار می‌آیند (2). فناوری‌ها و پیشرفت‌های صنعتی مهم‌ترین عوامل ورود مقادیر زیاد فلزهای سمی و سنگین به محیط‌زیست هستند (3 و 4). حدود 80 عنصر از عناصر جدول تناوبی به علت ویژگی‌هایی نظیر چگالی زیاد در گروه فلزهای سنگین و سمی قرار دارند (5). فلزهای سنگین دسته‌ای از فلزها ازجمله سرب، روی، کادمیوم، آرسنیک، جیوه، روی، مس، نیکل و غیره با چگالی سطحی بیش از 5 گرم بر سانتی‌متر‌مکعب هستند (5 و 6). آلودگی فلزهای سنگین به‌طور مستقیم بر ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک و آب‌و‌هوا و از راه ورود به چرخۀ غذایی بر سلامت انسان و سایر جانداران و امنیت زیست‌محیطی تأثیر‌ می‌گذارد (7).

مطالعۀ راههای حذف آلاینده‌ها به‌ویژه فلزهای سنگین بسیار ضروری است. بررسی‌ها نشان داده‌اند روش‌های فیزیکی و شیمیایی دارای محدودیت هستند، ازنظر اقتصادی مقرون‌به‌صرفه نیستند و برای پساب‌های حاوی مواد آلی کمپلکس‌شده با این فلزها نامناسب هستند (8). اگرچه تاکنون روش‌های فیزیکی و شیمیایی فراوانی برای حذف فلزها از پساب‌های صنعتی استفاده شده‌اند، به علت نداشتن کارایی مناسب به‌ویژه در غلظت‌های کم فلزهای سنگین و مشکلات خاص چندان به آنها توجه نشده است (9 و 10).

جذب زیستی[1] روش مناسبی است که برای حذف آلودگی‌ها در غلظت‌های کم با استفاده از ریزموجودات مختلف انجام می‌شود. باکتری‌ها، قارچ‌ها، مخمرها، جلبک‌ها و حتی گیاهان و آبزیان متفاوتی برای جذب زیستی فلزهای سنگین بررسی شده‌اند (3، 11-16).

با‌توجه‌به اهمیت باکتری‌های مقاوم به فلزهای سنگین در جذب و حذف زیستی آلاینده‌ها از محیط، جداسازی، شناسایی و طبقه‌بندی مولکولی این باکتری‌ها ضروری به نظر می‌رسد. پژوهش‌های مولکولی از‌جمله هیبریداسیون DNA و شناسایی بر اساس ژن‌های rRNA مفید اما بسیار وقت‌گیر و گران هستند (17). سایر روش‌ها نظیر پروفایل پلاسمید[2] (18) و پروفایل پروتئین[3] (19) نیز برای طبقه‌بندی استفاده شده‌اند که تفسیر نتایج آنها به دلایل خاصی نظیر وجود‌نداشتن پلاسمید در برخی جنس‌ها و مشاهدۀ باندهای مبهم و بسیار زیاد مشکل است. پژوهش‌های ژنتیکی در راستای طبقه‌بندی و تعیین قرابت ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD[4] و [5]ISSR انجام شده‌اند و به‌طور موفقیت‌آمیزی برای طبقه‌بندی و تعیین ارتباط ژنتیکی ریزموجودات بسیاری نظیر قارچ‌‌ها، ویروس‌ها، باکتری‌ها و ... استفاده می‌شوند (20 و 21).

تفویضی و همکاران با استفاده از 20 نشانگر RAPD به بررسی تنوع ژنتیکی20 لاکتوباسیلوس جدا‌شده از محصول‌های سنتی ایران با RAPD-PCR پرداختند. در مطالعۀ آنها، 19 نشانگر از 20 نشانگر استفاده‌شده دارای باندهای واضح و قابل کدگذاری بودند. پس از کدگذاری در برنامۀ Excel (آفیس، شرکت مایکروسافت[6]) به شکل صفر و یک و تشکیل ماتریس داده‌های اولیه با نرم‌افزار (Ver 2.02e) [7]NTSYS-pc، ماتریس تشابه بر اساس ضریب تشابه جاکارد تشکیل و دسته‌بندی سویه‌ها با روش‌های UPGMA[8] و NJ[9] انجام شد؛ نتایج مقایسۀ دسته‌بندی با دو روش یادشده یکسان و مشابه بودند (17). رایار[10] و همکاران تنوع ژنتیکی و چندشکلی گونه‌های سودوموناس را با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR بررسی کردند. آنها 17 گونه سودوموناس فلورسنت از خاک اطراف ریشۀ گیاهان مختلف مانند برنج و سیب‌زمینی جداسازی کردند و پس از استخراج DNA، تنوع ژنتیکی آنها را با استفاده از 15 نشانگر RAPD و 10 نشانگر ISSR و تشابه را با نرم‌افزار NTSYS-pc (Ver 2.02) و ضریب تشابه جاکارد بررسی و گونه‌ها را با روش UPGMA دسته‌بندی کردند (22). حامید[11] و همکاران به بررسی مولکولی تنوع ژنتیکی سویه‌های سودوموناس جدا‌شده از شیر با استفاده از روش RAPD-PCR پرداختند. آنها با استفاده از محیط‌کشت ستریمایدآگار[12]، 13 سودوموناس از نمونه‌های شیر جداسازی کردند و با آزمون‌های بیوشیمیایی به بررسی باکتری‌های جدا‌شده پرداختند. سپس DNA نمونه‌ها را با روش تغییر‌یافتۀ [13]CTAB استخراج کردند و عمل PCR را با دو نشانگر RAPD شامل OPZ-8 و OPD-20 انجام دادند و محصول‌ها را روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز کردند. سپس، نتایج حضورداشتن یا نداشتن باندهای تشکیل‌شده را در برنامۀ Excel به شکل صفر و یک وارد کردند، دسته‌بندی را با نرم‌افزار NTSYS-pc (Ver 2.02) انجام دادند و دندروگرام را با روش UPGMA برای نمونه‌ها رسم کردند (23).

هدف پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتری‌های گرم منفی غیر‌تخمیرکنندۀ مقاوم به فلزهای مس و کادمیوم از پساب‌های صنعتی، تعیین کمترین غلظت بازدارندۀ رشد (MIC)[14] آنها نسبت به فلزهای یادشده و تعیین قرابت ژنتیکی ژنوتیپ‌ها با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR برای تعیین نقش ژن‌های مقاومت در طبقه‌بندی این باکتری‌هاست.

 

مواد و روش‌ها

جداسازی و شناسایی باکتری‌های مقاوم به مس و کادمیوم: پساب‌های صنعتی حاصل از فعالیت کارخانه‌های صنعتی از‌نظر آلایندگی محیط‌زیست به‌ویژه حضور فلزهای سنگین در آنها مهم و فرایندهای زیست‌پالایی برای رفع این آلاینده‌ها باارزش هستند. در پژوهش حاضر، نمونۀ پساب‌های صنعتی به روش نمونه‌برداری با چنگک[15] (24) از مخازن پساب صنعتی پنج کارخانۀ بزرگ صنعتی در سطح استان کرمان شامل کارخانۀ مس سرچشمۀ رفسنجان، دو کارخانۀ کک‌سازی زرند، کارخانۀ مس شهید باهنر کرمان و کارخانۀ زغال‌شویی زرند جمع‌آوری شدند که همگی حاوی فلزهای سنگین ازجمله مس و کادمیوم بودند. سپس باکتری‌های مقاوم به مس و کادمیوم با استفاده از محیط‌کشت‌های حاوی نمک‌های فلزی سولفات‌مس[16] (25-28) و سولفات‌کادمیوم[17] (29) جداسازی شدند (25 و 26).بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناختی و رنگ‌آمیزی گرم باکتری‌های جدا‌شده انجام شد. جنس باکتری‌ها با آزمون‌های متداول بیوشیمیایی (آزمون‌های اکسیداز، کاتالاز، ایندول، بررسی حرکت، گلوکز، لاکتوز، DNase، احیای نیترات، آرژنین‌دهیدروژناز، لیزین‌دکربوکسیلاز، سیترات، اوره‌آز و ...) مطابق کتاب باکتری‌شناسی سیستماتیک برگی[18] (30) مشخص شد و باکتری‌های مقاوم از جنس‌های باسیلوس و کوکوباسیلوس‌های گرم منفی غیر‌تخمیر‌کنندۀ قندهای گلوکز و لاکتوز مشخص شدند.

تعیین MIC باکتری‌ها نسبت به غلظت‌های متفاوت سولفات‌مس و سولفات‌کادمیوم: برای تعیین MIC باکتری‌ها از محیط‌کشت مایع آبگوشت مغذی استفاده شد (25)؛ به این ترتیب که هر باکتری به‌طور مجزا به محیط‌کشت مایع حاوی غلظت اولیۀ نمک فلزی که از آن جدا شده بود تلقیح و رشد آن پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد بررسی شد. در صورت مشاهدۀ کدورت در لوله، غلظت به شکل پله‌ای (5/0 میلی‌مولار بر لیتر) افزایش یافت و آزمایش دوباره تکرار شد؛ این عمل به‌طور مداوم تا زمانی تکرار شد که رشد و کدورتی در محیط مایع مشاهده نشد و غلظت حاصل، غلظت بازدارندۀ رشد (MIC) در نظر گرفته شد. این عمل با 3 تکرار برای هر نمونه برای نمک‌های فلزی سولفات‌مس و سولفات‌کادمیوم انجام و میانگین غلظت بازدارندۀ رشد (MIC) باکتری‌ها مشخص شد (27، 31 و 32).

استخراج DNA باکتری‌ها: با استفاده از روش‌های CTAB (33 و 34) و دلاپورتا[19] (35 و 36) با اندکی تغییر (افزایش حجم بافر استخراج نسبت به نمونه، افزایش غلظت EDTA، تغییر در مراحل شستشو DNA برای حذف بیشتر ناخالصی‌ها) DNA باکتری‌ها استخراج شد. کمیت و کیفیت DNAهای استخراج‌شده با روش‌های اسپکتروفتومتری و الکتروفورز DNA بررسی شد (37).

واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز[20] و ارزیابی محصول‌های PCR: برای انجام PCR از 10 نشانگر DNA استفاده شد. ازآنجاکه طول نشانگرها و ترتیب بازی آنها بر تکرارپذیری واکنش مؤثر هستند، از 7 نشانگر RAPD و 3 نشانگر ISSR در پژوهش حاضر استفاده شد. نشانگرها از شرکت ماکروژن[21] کرۀ جنوبی تهیه شدند. لیست نشانگرهای استفاده‌شده در جدول 1 آمده است.

ترکیب واکنش PCR برای حجم 25 میکرولیتر شامل 3 میکرولیتر DNA الگو (50 نانوگرم بر میکرولیتر)، 5/1 میکرولیتر MgCl2 (50 میلی‌مولار)، 1 میکرولیتر dNTPs (5/2 میلی‌مولار)، 4/0 میکرولیتر Taq DNA polymerase (5 واحد بر میکرولیتر)، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (شامل Tris-HCl و KCl)، 1 میکرولیتر نشانگر (2 میکرومولار) و 6/15 میکرولیتر آب دیونیزه بود و تکثیر در دستگاه ترموسایکلر گرادیانت[22] انجام شد.

عمل PCR برای هر نمونۀ باکتریایی با استفاده از هر نشانگر به‌طور مجزا انجام شد؛ به این شکل که ابتدا واسرشته‌سازی اولیه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام و به دنبال آن، تکرار 35 چرخه شامل 45 ثانیه واسرشته‌سازی در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد، 1 دقیقه اتصال نشانگر به رشته‌های الگو در دمای خاص آن نشانگر و 2 دقیقه طویل‌سازی و گسترش در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد. در پایان، 35 چرخۀ گسترش نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. عمل PCR در برخی نشانگرها به‌طور تصادفی برای بررسی تکرار‌پذیری باندهای RAPD و ISSR تکرار شد تا وضوح باندها و درستی کار تأیید شود.

فراورده‌های تکثیر‌شده در PCR با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1 درصد جداسازی و به روش رنگ‌آمیزی با اتیدیوم‌بروماید آشکار‌سازی شدند. از نشانگر Ladder 1kb DNA (شرکت سیناکلون) برای بررسی درستی الکتروفورز و مشخص‌شدن اندازۀ قطعه‌ها استفاده شد. ژل‌ها پس از رنگ‌آمیزی و شستشو با آب درون دستگاه Gel Documentation مدل SynGene قرار گرفتند و باندها با اشعۀ UV مشاهده شدند و عکس آنها با دوربین متصل به نرم‌افزار GeneSnap V6.08.04 تهیه شد.

 

جدول 1- ویژگی‌های نشانگرهای استفاده‌شدۀ RAPD و ISSR

نشانگرها

توالی نشانگرها

RAPD

دمای ذوب (درجۀ سانتی‌گراد)

P1

5´-CAGTGCTCTT-3´

30

P2

5´-TCACGCAGTT-3´

30

P3

5´-GACAACAGGA-3´

30

P4

5´-GGGTGGGTAA-3´

32

P5

5´-CCTGGCAATC-3´

32

P6

5´-TGGCCCTCAC-3´

34

P7

5´-ACCCGGTCAC-3´

34

ISSR

P8

5´-GAGAGAGAGAGT-3´

36

P9

5´-GAAGAAGAAGAAGAA-3´

9/37

P10

5´-GAGAGAGAGAGC-3´

38

 

طبقه‌بندی نمونه‌ها: تمام باندهای تشکیل‌شده به‌وسیلۀ 10 نشانگر RAPD و ISSR با نرم‌افزار GeneTools تجزیه‌وتحلیل شدند. عملکرد این نرم‌افزار، تشخیص باندهای واضح برای هر نمونه و مشخص‌کردن باندهای مشترک است؛ ازاین‌رو، باندهای چندشکل ایجاد‌شده متغیر مستقل در نظر گرفته شدند و حضورداشتن باندها با عدد یک و حضورنداشتن باندها با عدد صفر مشخص شد و ماتریسی از اعداد صفر و یک برای نشانگرها در نرم‌افزار Excel تهیه شد. سپس داده‌ها به NTedit بخش ورودی نرم‌افزار NTSYS منتقل شدند. ماتریس تشابه با استفاده از ضریب تشابه جاکارد (38) با نرم‌افزار NTSYS-pc (Ver 2.02) محاسبه و دندروگرام به روش UPGMA رسم شد. ضریب همبستگی کوفنتیک برای بررسی همبستگی بین دندروگرام و ماتریس تشابه محاسبه شد. تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (سه مؤلفۀ اول مؤلفه‌های اصلی در نظر گرفته شدند) انجام شد و پلات‌های دوبعدی و سه‌بعدی حاصل از سه مؤلفۀ اول رسم شدند.

 

نتایج

در پژوهش حاضر، 31 باکتری از پساب‌های صنعتی جداسازی شدند و پس از بررسی مقاومت آنها نسبت به غلظت‌های مختلف مس و کادمیوم و انجام آزمون‌های بیوشیمیایی، 17 باکتری مقاوم از جنس‌های باسیلوس و کوکوباسیلوس گرم منفی غیر‌تخمیرکننده بر اساس آزمون‌های متداول بیوشیمیایی (مطابق جدول 2) شناسایی شدند. باکتری‌ها از جنس‌های سودوموناس، آلکالیژنز، آسینتوباکتر، آکرموباکتر و استنوتروفوموناس بودند. آزمون‌های بیشتری برای بررسی جنس‌ها و حتی شناسایی گونه‌ها در برخی نمونه‌ها انجام شدند؛ برای نمونه، آزمون‌های اسکولین و مالتوز در جنس استنوتروفوموناس انجام شدند و استنوتروفوموناس مالتوفیلا قادر به اکسید‌کردن مالتوز و اسکولین مثبت شناسایی شد. آزمون گزیلوز برای جنس آکرموباکتر انجام و آکرموباکتر گزیلوزاکسیدانس مشخص شد. آزمون‌های اختصاصی در سایر جنس‌ها نیز برای تأیید جنس و در صورت امکان شناسایی گونه‌ها انجام شدند.

 

باکتری‌های منتخب از مکان‌های صنعتی کارخانۀ مس سرچشمۀ رفسنجان (A)، کارخانه‌های کک‌سازی زرند (C)، کارخانۀ مس شهید باهنر کرمان (D)، کارخانۀ زغال‌شویی زرند (E) جداسازی و شناسایی شدند. این باکتری‌ها شامل (1)A2، (2)A4، (3)A6، (4)A8، (5)A9، (6)C1، (7)C2، (8)C3، (9)C4، (10)C5، (11)C6، (12)D1، (13)D2، (14)E1، (15)E2، (16)E4 و (17)E5 بودند و MIC آنها با 3 تکرار برای هر باکتری اندازه‌گیری شد. مکان، جنس و میانگین MIC باکتری‌های جدا‌‌شده نسبت به فلزهای مس و کادمیوم در جدول 3 آمده است.

مقایسۀ دو روش CTAB و دلاپورتا در استخراج DNA باکتری‌ها: خالص و سالم‌بودن DNAهای استخراج‌شده برای انجام PCR با نشانگرهای RAPD و ISSR مهم است؛ ازاین‌رو، پس از رقیق‌سازی DNAهای استخراج‌شده به روش‌های CTAB و دلاپورتا، غلظت آنها برای هر نمونۀ باکتریایی با دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری و سلامت وکیفیت آنها روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. OD260/280های حاصل از دستگاه اسپکتروفتومتری برای DNAهای استخراج‌شده با روش CTAB بین 6/0 تا 2 (میانگین=1/1) و با روش دلاپورتا بین 5/1 تا 2 (میانگین= 8/1) بود. باندهای تشکیل‌شدۀ حاصل از الکتروفورز برای هر نمونۀ DNA استخراج‌شده در بالای ژل آگارز حاصل از روش دلاپورتا به شکل لکۀ پررنگ‌تری نسبت به CTAB ظاهر شدند؛ بنابراین در پژوهش حاضر، روش دلاپورتا ازنظر کمیت و کیفیت DNA نسبت به روش CTAB مناسب‌تر بود و درنهایت، DNAهایی برای انجام آزمون‌های PCR انتخاب شدند که ازنظر اسپکتروفتومتری (OD260/280بین 8/1 تا 2) مناسب بودند و باند پررنگی در بالای ژل آگارز تشکیل دادند.

 

 

جدول 2- ویژگی‌های بیوشیمیایی متداول برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی غیر‌تخمیر‌کننده

ویژگی‌ها

Pseudomonas spp.

Alcaligenes spp.

Acinetobacter spp.

Achromobacter spp.

Stenotrophomonas spp.

Gram staining

-

-

-

-

-

KOH

+

+

+

+

+

TSI

ALK/ALK

ALK/ALK

ALK/ALK

ALK/ALK

ALK/ALK

Indole

-

-

-

-

-

OF Glucose

Oxidative

-

Oxidative

Oxidative

-

Glucose

-

-

-

-

-

Lactose

-

-

-

-

-

Oxidase

+

+

-

+

-

Catalase

+

+

+

+

+

NaCl 6.5%

-

-

-

+/-

-

Motility

+

+

-

+

+

DNase

-

-

-

+/-

+

Nitrate reduction

+

-

-

+

+/-

Citrate

+

+

+

+

+/-

Arginine dehydrogenase

+

-

-

-

-

Lysine decarboxylase

-

-

-

-

+

Gelatinase

+

+/-

-

-

+

Urease

+

-

-

+/-

+/-

-. نتیجۀ منفی، +. نتیجۀ مثبت، -/+. در برخی گونه‌ها مثبت و در برخی گونه‌ها منفی، ALK. قلیایی، Oxidative. اکسید‌کنندۀ قند

جدول 3- مکان، جنس و میانگین MIC باکتری‌های جدا‌شده نسبت به فلزهای مس و کادمیوم

مکان نمونه‌گیری

باکتری

(شمارۀ باکتری)

MIC

میلی‌مولار بر لیتر CuSO4.5H2O

MIC

میلی‌مولار بر لیتر CdSO4.8H2O

جنس ها

 

کارخانۀ مس سرچشمۀ رفسنجان (A)

کارخانۀ های کک‌سازی زرند(C)

کارخانۀ مس شهید باهنر کرمان (D)

کارخانۀ زغال‌شویی زرند (E)

A2(1)

A4(2)

A6(3)

A9(5)

333/6

333/8

167/8

833/5

667/6

667/6

5/6

333/4

Pseudomonas sp.

Pseudomonas sp.

Pseudomonas sp.

Pseudomonas sp.

A8(4)

C1(6)

C6(11)

333/8

667/7

333/6

833/6

667/6

6

Alcaligenes denitrificans

Alcaligenes faecalis

Alcaligenes sp.

C2(7)

C4(9)

C5(10)

E1(14)

833/6

8

833/6

333/4

333/5

5/6

333/6

333/4

Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter lwoffii

Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter lwoffii

C3(8)

D1(12)

D2(13)

167/8

667/6

333/5

667/6

6

333/4

Achromobacter xylosoxidans

Achromobacter sp.

Achromobacter sp.

E2(15)

E4(16)

E5(17)

167/4

667/4

333/4

5

6

667/5

sp. Stenotrophomonas

sp. Stenotrophomonas

Stenotrophomonas maltophilia

 


.تجزیه‌وتحلیل باندهای حاصل از نشانگرهای RAPD و ISSR: باندهای واضح و روشنی با انجام عمل PCR با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR (یادشده در جدول 1) روی 17 ژنوتیپ باکتریایی حاصل شدند. درکل، 95 باند از 7 نشانگر RAPD تشکیل شدند که 86 باند (5/90 درصد) چندشکل و 9 باند (5/9 درصد) یک‌شکل بودند. 3 نشانگر ISSR استفاده‌شده وضوح باند و چندشکلی مناسبی داشتند و درکل، 38 باند تشکیل دادند که 36 باند (7/94 درصد) چندشکلی و 2 باند (3/5 درصد) یک‌شکل بودند (جدول 4). در مجموع، 10 نشانگر DNA بررسی‌شده، 133 باند (با میانگین 3/13 باند به ازای هر نشانگر) ایجاد کردند که از این تعداد، 122 باند چندشکل (با میانگین 2/12 باند به ازای هر نشانگر) و 11 باند یک‌شکل (با میانگین 1/1 باند به ازای هر نشانگر) بودند که سطح بالای چندشکلی در میان نمونه‌های مطالعه‌شده را نشان می‌دهد. کمترین باندهای چندشکل به نشانگر P4 و بیشترین باندهای چندشکل به نشانگرهای P2 و P5 مربوط بودند. نمونه‌ای از باندهای تشکیل‌شده روی ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1 درصد با استفاده از نشانگر P4 برای 17 ژنوتیپ باکتریایی در شکل 1 نمایش داده شده است.

دندروگرام‌ها بر اساس ضریب تشابه جاکارد و طبق الگوریتم UPGMA به‌طور جداگانه برای نشانگرهای مولکولی RAPD (شکل 2) و ISSR (شکل 3) و به شکل توأم برای این نشانگرها (شکل 4) رسم و نتایج تجزیۀ خوشه‌ای ژنوتیپ باکتری‌ها بررسی شدند.

دامنۀ تشابه ژنتیکی دندروگرام‌های رسم‌شده برای نشانگر RAPD بین 23/0 تا 82/0، برای ISSR بین 27/0 تا 9/0، برای دو نشانگر به شکل توأم بین 27/0 تا 84/0 و ضریب همبستگی کوفنتیک به‌ترتیب 901/0=r، 79/0=r و 88/0=r بود (شکل‌های 2تا 4).

 

جدول 4- مقایسۀ نشانگرهای RAPD و ISSR در 17 ژنوتیپ باکتریایی

شاخص‌ها

ISSR

RAPD

تعداد نشانگرها

3

7

تعداد کل باندها

38

95

تعداد قطعه‌های چندشکل

36

86

درصد باندهای چندشکل

7/94

5/90

 

 

شکل 1- باندهای تشکیل‌شده روی ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1 درصد با استفاده از نشانگر P4 مربوط به 17 ژنوتیپ باکتریایی (شمارۀ چاهک نشان‌دهندۀ شمارۀ باکتری مطابق جدول 3 است، M نشان‌دهندۀ نشانگر وزنی 1kb DNA Ladder است)

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از تجزیۀ خوشه‌ای 17 ژنوتیپ باکتریایی با 7 نشانگر RAPD با روش UPGMA

 

شکل 3- دندروگرام حاصل از تجزیۀ خوشه‌ای 17 ژنوتیپ باکتریایی با 3 نشانگر ISSR با روش UPGMA

 

 

شکل 4- دندروگرام حاصل از تجزیۀ خوشه‌ای 17 ژنوتیپ باکتریایی با نشانگرهای RAPD و ISSR با روش UPGMA

 

نتایج تجزیۀ خوشه‌ای در سطح تشابه 38/0 باعث گروه‌بندی‌های مختلفی شدند که در شکل‌های 2 تا 4 مشاهده می‌شوند. همان‌طور که مشخص است سه باکتری 1، 2 و 3 (A2، A4 و A6) با MIC یکسان (6/6 میلی‌مولار بر لیتر) برای سولفات‌کادمیوم و MIC به‌ترتیب 3/6، 3/8 و 1/8 میلی‌مولار بر لیتر برای سولفات‌مس بیشترین تشابه ژنتیکی را در سه دندروگرام رسم‌شده داشتند. این باکتری‌ها گونه‌های مختلف جنس سودوموناس جدا‌شده از پساب صنعتی کارخانۀ مس سرچشمۀ رفسنجان بودند که در یک گروه دسته‌بندی شده‌اند. گفتنی است باکتری 5 (A9) از جنس سودوموناس با MIC برابر 3/4 و 8/5 میلی‌مولار بر لیتر به‌ترتیب برای سولفات‌کادمیوم و سولفات‌مس در فاصلۀ ژنتیکی نزدیکی با سه باکتری A2، A4 و A6 قرار گرفت که کارایی زیاد نشانگرها را در دسته‌بندی ژنوتیپ‌ها بر اساس مقادیر MIC نشان می‌دهد. جنس‌های سودوموناس‌، آلکالیژنز و آسینتوباکتر در گروه اول هر سه دندروگرام رسم‌شده قرار گرفتند که باکتری‌های جدا‌شده از دو مکان متفاوت کارخانۀ مس سرچشمۀ رفسنجان (A) و کارخانه‌های کک‌سازی زرند (C) بودند؛ MIC آنها برای سولفات‌کادمیوم بین 5/4 تا 5/6 میلی‌مولار بر لیتر و برای سولفات‌مس بین 6 تا 8 میلی‌مولار بر لیتر بود که دسته‌بندی جنس‌های مختلف در یک گروه بر اساس تشابه مقادیر MIC آنها را نشان می‌دهد.

باکتری‌های 4 و 8 (A8 و C3) از جنس‌های آلکالیژنز و آکرموباکتر با MIC بیش از 6 میلی‌مولار بر لیتر برای سولفات‌کادمیوم و بیش از 8 میلی‌مولار بر لیتر برای سولفات‌مس مقاوم‌ترین ژنوتیپ‌ها نسبت به سولفات‌مس و سولفات‌کادمیوم بودند و در یک گروه دسته‌بندی شدند. باکتری‌های 16 و 17 (E4 و E5) از جنس‌ استنوتروفوموناس با کمترین مقادیر MIC برای سولفات‌کادمیوم و سولفات‌مس در یک گروه قرار گرفتند. باکتری 14 (E1) از جنس آسینتوباکتر با MIC برابر 3/4 میلی‌مولار بر لیتر برای سولفات‌مس و سولفات‌‌کادمیوم در فاصلۀ ژنتیکی دورتری نسبت به سایر آسینتوباکترهای C2، C4 و C5 با MIC بیش از 6 میلی‌مولار بر لیتر برای سولفات‌کادمیوم و سولفات‌مس قرار گرفته است؛ این گروه‌بندی‌ها نشان می‌دهند تنوع ژنتیکی حاصل از نشانگرهای مولکولی با تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌ها بر اساس مقادیر MIC مطابقت به‌نسبت زیادی دارد. این گروه‌بندی‌ها در دندروگرام حاصل از تجزیۀ خوشه‌ای 17 ژنوتیپ باکتریایی با هر دو نشانگر RAPD و ISSR باهم نسبت به دسته‌بندی دو دندروگرام RAPD و ISSR به‌طور جداگانه بهتر و واضح‌تر مشاهده می‌شود و کارایی زیاد این نشانگرها در دسته‌بندی ژنوتیپ‌ها بر اساس مقاومت آنها در برابر غلظت‌های مختلف فلزهای سنگین ازجمله مس و کادمیوم را نشان می‌دهد.

برای یافتن دیدگاه بهتری دربارۀ فاصله‌های ژنتیکی بین نمونه‌ها و مشاهدۀ فاصله‌های ژنتیکی بین آنها به شکل چند‌بعدی و تکمیل نتایج روش تجزیۀ کلاستر، تجزیه به مؤلفه‌های اصلی برای دو نشانگر RAPD و ISSR به شکل توأم انجام شد. مؤلفۀ اصلی اول 93/14 درصد، مؤلفۀ اصلی دوم 24/10 درصد و مؤلفۀ اصلی سوم 13/9 درصد تغییرات ژنتیکی را توجیه کردند. پلات دو‌بعدی و سه‌بعدی حاصل از تغییرات ژنتیکی شناسایی‌شده با نشانگرها نیز رسم شد (شکل‌های 5 و 6). با‌توجه‌به اینکه سه مؤلفۀ اول در مجموع 3/34 درصد کل تغییرات را توجیه کردند و نتایج تجزیه به مؤلفه‌های اصلی در پلات‌های دو‌بعدی و سه‌بعدی با نتایج تجزیۀ خوشه‌ای یکسان نشدند، انتخاب نشانگرها برای بررسی تنوع ژنتیکی مناسب است و در مقایسۀ این روش‌ها، روش تجزیۀ خوشه‌ای توصیه می‌شود.

 

 

شکل 5- پلات دو‌بعدی حاصل از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی 17 ژنوتیپ باکتریایی با نشانگرهای RAPD و ISSR

 

شکل 6- پلات سه‌بعدی حاصل از تجزیۀ به مؤلفه‌های اصلی 17 ژنوتیپ باکتریایی با نشانگرهای RAPD و ISSR

 

بحث و نتیجه‌گیری.

امروزه، آلودگی ناشی از مناطق صنعتی مشکل جدی زیست‌محیطی محسوب می‌شود؛ زیرا سرعت ورود فاضلاب‌های صنعتی به محیط افزایش یافته است و بیشتر این پساب‌ها حاوی مواد سمی به‌ویژه فلزهای سنگین هستند (39). کنترل آلودگی فلزهای سمی و سنگین مانند مس و کادمیوم از نگرانی‌های عمدۀ کارشناسان محیط‌زیست و جوامع علمی است. ریزموجودات ازجمله باکتری‌ها برای جذب زیستی فلزهای سنگین مطالعه شده‌اند (40). گونه‌های متفاوتی از ریزموجودات مقاوم به فلزهای سنگین در پژوهش‌های انجام‌شده دربارۀ خاک و پساب‌های آلوده در مناطق مختلف شناسایی شده‌اند که این عناصر را جذب و از محیط حذف می‌کنند. باکتری‌هایی از جنس‌های سودوموناس‌، باسیلوس‌، آلکالیژنز، کورینه‌باکتریوم‌، آکرموباکتر، آسینتوباکتر و غیره نسبت به غلظت زیاد فلزهای سنگین ازجمله مس و کادمیوم مقاومت زیادی دارند (40-42). با‌توجه‌به اهمیت ریزموجودات به‌ویژه باکتری‌ها برای حذف فلزهای سنگین از محیط‌زیست، جداسازی، شناسایی و طبقه‌بندی آنها ضروری است. در پژوهش حاضر، گروهی از باکتری‌ها شامل باکتری‌های گرم منفی غیر‌تخمیر‌کنندۀ مقاوم به فلزهای مس و کادمیوم برای بررسی ژنتیکی و دسته‌بندی فیلوژنیک با نشانگرهای RAPD و ISSR از پساب پنج کارخانۀ صنعتی استان کرمان جداسازی شدند تا نقش ژن‌های مقاومت در طبقه‌بندی آنها بررسی شود. باکتری‌ها به پنج جنس سودوموناس، آلکالیژنز، آسینتوباکتر، آکرموباکتر و استنوتروفوموناس تعلق داشتند.

حامید و همکاران از بافر Tris HCl، NaCl، SDS و EDTA و محلول فنل‌کلروفرم (روشی مشابه با روش CTAB) برای استخراج DNA باکتری‌های سودوموناس جداسازی‌شده از شیر استفاده کردند (23). فاطیما و همکاران از روش مشابهی با روش هریک[xxiii] و همکاران استفاده کردند؛ ترکیبات استفاده‌شده در این روش مشابه روش‌های CTAB و دلاپورتا بودند (43). استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR، راه ساده‌ای برای بررسی سریع چندشکلی DNA است که با مقدار کم DNA نمونه انجام‌پذیر است و به اطلاعات دربارۀ توالی DNA نیازی نیست (23). رایار و همکاران به مقایسۀ کارایی نسبی دو نشانگر RAPD و ISSR در ارزیابی پلی‌مورفیسم DNA و تنوع ژنتیکی در گونه‌های سودوموناس فلورسنت پرداختند؛ به این شکل که پس از جداسازی 17 باکتری از خاک‌های ریزوسفری اطراف ریشۀ گیاهان آلوده، DNA باکتری‌ها را استخراج و آنها را با 25 نشانگر (15 نشانگر RAPD و 10نشانگر ISSR) با روش PCR ارزیابی کردند. پس از تجزیه‌وتحلیل داده‌ها با نرم‌افزار NTSYS-pc (Ver 2.11) مشاهده کردند در نشانگرهای RAPD، 147 باند از 222 باند تشکیل‌شده چندشکلی (85/63 درصد) داشتند و ضریب تشابه 11/0 تا 73/0 بود و در نشانگرهای ISSR، 105 باند از 134 باند چندشکلی (9/77 درصد) داشتند و ضریب تشابه 38/0 تا 81/0 بود. تجزیه‌وتحلیل خوشه‌ای نشان داد هر دو نشانگر RAPD و ISSR به‌طور کارایی سطح بالای چندشکلی را بین 17 نمونه سودوموناس مشخص می‌کنند و نشانگرهای ISSR کمی بهتر از RAPD هستند و ترکیبی از دو روش بهتر است و اطلاعات جامع‌تری از تجزیه‌وتحلیل ژنتیکی در اختیار قرار می‌دهد (22). تفویضی و همکاران به بررسی تنوع ژنتیکی لاکتوباسیلوس‌های جدا‌شده از محصول‌های لبنی سنتی ایران با استفاده از نشانگرهای RAPD پرداختند. 19 نشانگر از 20 نشانگر استفاده‌شده در پژوهش آنها باندهای مناسب و قابل کدگذاری داشتند و تعداد کل باندها به‌وسیلۀ کل نشانگرها 225 عدد بود که 219 باند چندشکل، 6 باند مشترک و 63 باند اختصاصی بودند. نتایج تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار NTSYS-pc و ماتریس تشابه بر اساس ضریب جاکارد برای ژنوتیپ‌ها محاسبه شدند. دسته‌بندی سویه‌ها با روش‌های UPGMA و NJ انجام شد و نتایج یکسان و مشابهی از مقایسۀ دو روش حاصل شدند (17). در پژوهش حاضر، برای ارزیابی نزدیکی ژنتیکی و تنوع زیستی باکتری‌های گرم منفی غیر‌تخمیر‌کنندۀ مقاوم به فلزهای مس و کادمیوم جدا‌شده از پساب‌های صنعتی، از دو نشانگر RAPD و ISSR به‌طور جداگانه و توأم استفاده و ماتریس تشابه با استفاده از ضریب تشابه جاکارد به کمک نرم‌افزار NTSYS-pc محاسبه و دندروگرام با استفاده از روش UPGMA رسم شد. سطح بالای (7/94 درصد) چندشکلی مشاهده‌شده در نشانگرهای ISSR در مقایسه با نشانگرهای RAPD (5/90 درصد) کارایی بیشتر نشانگرهای ISSR را در بیان چندشکلی نشان می‌دهد؛ هرچند با‌توجه‌به کارایی نزدیک به هم و ویژگی‌های منحصر‌به‌فرد هریک از نشانگرها به‌طور جداگانه و اینکه هریک قسمت خاصی از ژنوم را هدف قرار می‌دهند (22) و مطابقت زیاد تنوع ژنتیکی حاصل از نشانگرها در بررسی تجزیۀ کلاستر و دندروگرام رسم‌شده بر اساس هر دو نشانگر RAPD و ISSR با تنوع ژنتیکی بر اساس مقادیر MIC، استفادۀ توأم هر دو نوع نشانگر برای بررسی‌های ژنتیکی بهتر است و نتایج معتبرتری را در اختیار می‌گذارد.

راوی کومار[xxiv] و همکاران به بررسی ویژگی‌ها و تعیین رابطۀ فیلوژنیک 45 باکتری ویبریوکلرا بیماری‌زا و غیربیماری‌زای تهیه‌شده از مرکز بین‌المللی پژوهش‌های بیماری‌ اسهال بنگلادش با استفاده از روش‌های ERIC-PCR[xxv] و ISSR-PCR پرداختند. بررسی آنها نشان داد دندروگرام رسم‌شده با استفاده از داده‌های ERIC-PCR شبیه داده‌های ISSR-PCR است و دسته‌بندی گونه‌های بیماری‌زا و غیر‌بیماری‌زا در روش ISSR-PCR بادقت بیشتری انجام می‌شود؛ بنابراین، آنها روش ISSR-PCR را ابزار کارآمدی برای طبقه‌بندی فیلوژنیک ژنوم‌های پروکاریوت‌ها در تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا معرفی کردند (44). فاطیما و همکاران در بررسی تنوع ژنتیکی 7 باکتری زانتوموناس از چهار گونۀ مختلف با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR به‌طور جداگانه، درجۀ بالایی از چندشکلی را در هر نمونه گزارش کردند. آنها دندروگرام حاصل از تجزیۀ خوشه‌ای 7 ژنوتیپ را به روش UPGMA برای دو نشانگر RAPD و ISSR با هم رسم و سطح تنوع ژنتیکی را در محدودۀ 29/29/0 تا 100/0 محاسبه کردند که بیشترین شباهت به دو گونۀ جدا‌شده از مکان‌های مختلف مربوط بود و ممکن است این شباهت به دلیل بیماری‌زابودن آنها باشد. آنها در پژوهش خود نشان دادند دسته‌بندی ژنوتیپ‌های زانتوموناس با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR به‌طور عمده بر اساس معیارهای بیماری‌زایی و نه توزیع جغرافیایی آنها انجام می‌شود (43). در پژوهش حاضر نیز دسته‌بندی ژنوتیپ‌ها با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR به‌طور عمده بر اساس مقاومت آنها نسبت به فلزهای مس و کادمیوم انجام شد و ژنوتیپ‌هایی در یک گروه قرار گرفتند که مقاومت یکسان داشتند (حتی از جنس‌های مختلف و جداشده از مکان‌های مختلف)؛ علاوه‌براین، زیادبودن چندشکلی بین باکتری‌های گرم منفی غیرتخمیر‌کنندۀ مقاوم به فلزهای مس و کادمیوم، تنوع ژنتیکی زیاد این باکتری‌ها را نشان‌ می‌دهد. قرار‌گیری باکتری‌های مقاوم و دارای MIC مشابه در کنار هم نیز قابلیت این نشانگرها در بررسی نزدیکی ژنتیکی نمونه‌ها باتوجه‌به ژن‌های مقاومت و کارایی استفاده از این روش برای دسته‌بندی سایر باکتری‌های جدا‌شده و مقاوم به فلزهای سنگین را نشان می‌دهد تا با دسته‌بندی آنها، زمینۀ مناسبی برای بررسی‌های ژنتیکی و انجام فرایندهای شناسایی و انتقال ژن‌های مقاومت فراهم شود.

 

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از کارشناسان بخش آزمایشگاه زیست‌فناوری دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفتۀ کرمان، سرکار خانم فرهمند و سرکار خانم کیانی و همکاری صمیمانۀ سرکار خانم افروشته در انجام مراحل پژوهش حاضر تشکر می‌کنند.



[1]- Bio-sorption

[2]- Plasmid profiling

[3]- Protein profiling

[4]- Random Amplified Polymorphic DNA

[5]- Inter Simple Sequence Repeats

[6]- Microsoft Office Excel

[7]- Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

[8]- Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

[9]- Neighbor Joining

[10]- Rayar

[11]- Hameed

[12]- Cetrimide agar

[13]- Cetyl trimethylammonium bromide

[14]- Minimum Inhibitory Concentration

[15]- Grab sampling

[16]- CuSO4.5H2O

[17]- CdSO4.8H2O

[18]- Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology

[19]- Dellaporta

[20]- Polymerase Chain Reaction

[21]- Macrogen

[22]- Eppendorf Mastercycler gradient

[xxiii]- Herrick

[xxiv]- Ravi Kumar

[xxv]- Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR

References

(1)              Wu B., Wang G., Wu J., Fu Q., Liu C. Sources of heavy metals in surface sediments and an ecological risk assessment from two adjacent plateau reservoirs. PLoS ONE 2014; 9(7): e102101.

(2)              Balkhair KS., Ashraf MA. Field accumulation risks of heavy metals in soil and vegetable crop irrigated with sewage water in western region of Saudi Arabia. Saudi Journal of Biological Sciences 2016; 23(1): 32-44.

(3)              Meizhen T., Junfeng C., Yannan S., Yanru T., Yuling L. The absorpstion and scavenging ability of a bacillus in heavy metal contaminated soils (Pb, Zn and Cr). African Journal of Enviromental Science and Technology 2014; 8(8): 476-481.

(4)              Dixit R., Wasiullah, Malaviya D., Pandiyan K., Singh UB., Sahu A., et al. Bioremediation of heavy metals from soil and aquatic environment: An overview of principles and criteria of fundamental processes. Sustainability 2015; 7(2): 2189-2212.

(5)              Simiary F., Nazemi A., Nasrolahi A. Isolation and molecular identification of nickel and cadmium resistant bacteria from Guilan industrial wastewater. Biotechnological Journal of Enviromental Microbiology 2012; 6(2): 43-49.

(6)              Sharma B., Singh S., Siddiqi NJ. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. BioMed Research International 2014; 2014: 640754.

(7)              Boisson J., Ruttens A., Mench M., Vangronsveld J. Evaluation of hydroxyapatite as a metal immobilizing soil additive for the remediation of polluted soils. Part 1. Influence of hydroxyapatite on metal exchangeability in soil, plant growth and plant metal accumulation. Environmental Pollution 1999; 104(2): 225-233.

(8)              Malik A. Metal bioremediation through growing cells. Environment International. 2004; 30(4): 261-278.

(9)              Ahmady-Asbchin S., Andres Y., Gerente C., Cloirec PL. Biosorption of Cu(II) from aqueous solution by Fucus serratus: surface characterization and sorption mechanisms. Bioresource Technology 2008; 99(14): 6150-6155.

 

(10)          Vijayaraghavan K., Yun YS. Bacterial biosorbents and biosorption. Biotechnology Advances2008; 26(3): 266-291.

(11)          Sud D., Mahajan G., Kaur MP. Agricultural waste material as potential adsorbent for sequestering heavy metal ions from aqueous solutions- a review. Bioresource Technology 2008; 99(14): 6017-6027.

(12)          Abou-Shanab RA., van Berkum P., Angle JS. Heavy metal resistance and genotypic analysis of metal resistance genes in gram-positive and gram-negative bacteria present in Ni-rich serpentine soil and in the rhizosphere of Alyssum murale. Chemosphere 2007; 68(2): 360-367.

(13)          Rengaraj S., Moon SH., Sivabalan R., Arabindoo B., Murugesan V. Removal of phenol from aqueous solution and resin manufacturing industry wastewater using an agricultural waste: rubber seed coat. Journal of Hazardous Materials2002; 89(2-3): 185-196.

(14)          Sari A., Tuzen M. Biosorption of cadmium (II) from aqueous solution by red algae (Ceramium virgatum):Equilibrium, kinetic and thermodynamic studies. Journal of Hazardous Materials 2008; 157: 448-454.

(15)          Zhang Y., Liu W., Xu M., Zheng F., Zhao M. Study of the mechanisms of Cu2+ biosorption by ethanol/caustic-pretreated baker's yeast biomass. Journal of Hazardous Materials 2010; 178(1-3): 1085-1093.

(16)          Zhang X., Su H., Tan T., Xiao G. Study of thermodynamics and dynamics of removing Cu(II) by biosorption membrane of Penicillium biomass. Journal of Hazardous Materials2011; 193:1-9.

(17)          Tafvizi F., Tajabadi ebrahimi M., Heydari Nasrabadi M., Bahrami H. Detection of genetic diversity of lactobacillus species isolated from different traditional dairy products by RAPD markers. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal 2011; 1(3): 33-42.

(18)          Tannock GW. Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics. International Dairy Journal 1998; 8(5-6): 527-533.

(19)          Sauer S., Freiwald A., Maier T., Kube M., Reinhardt R., Kostrzewa M., et al. Classification and identification of bacteria by mass spectrometry and computational analysis. PLoS ONE 2008; 3(7): e2843.

(20)          Tymon AM., Pell JK. ISSR, ERIC and RAPD techniques to detect genetic diversity in the aphid pathogen Pandora neoaphidis. Mycological Research 2005; 109(3): 285-293.

(21)          Williams JG., Hanafey MK., Rafalski JA., Tingey SV. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers. Methods in Enzymology 1993; 218: 704-740.

(22)          Rayar JK., Arif M., Singh US. Relative efficiency of RAPD and ISSR markers in assessment of DNA polymorphism and genetic diversity among Pseudomonas strains. African Journal of Biotechnology 2015; 14(13): 1097-1106.

(23)          Hameed AM., Malla S., Kumar RS. Molecular characterization of Pseudomonas sp. isolated from milk samples by using RAPD-PCR. European Journal of Experimental Biology 2014; 4(4): 78-84.

(24)          Berardesco G., Dyhrman S., Gallagher E., Shiaris MP. Spatial and temporal variation of phenanthrene-degrading bacteria in intertidal sediments. Applied and Environmental Microbiology 1998; 64(7): 2560-2565.

(25)          Ansari MI., Malik A. Biosorption of nickel and cadmium by metal resistant bacterial isolates from agricultural soil irrigated with industrial wastewater. Bioresource Technology 2007; 98(16): 3149-3153.

(26)          Andreazza R., Pieniz S., Okeke BC., Camargo FAO. Evaluation of copper resistant bacteria from vineyard soils and mining waste for copper biosorption. Brazilian Journal of Microbiology 2011; 42: 66-74.

(27)          Shakoori AR., Muneer B. Copper-resistant bacteria from industerial effluents and their role in remediation of heavy metals in wastwater. Folia Microbiologica2002; 47(1): 43-50.

(28)          Orell Á., Remonsellez F., Arancibia R., Jerez Guevara C. Molecular characterization of copper and cadmium resistance determinants in the biomining thermoacidophilic archaeon Sulfolobus metallicus. Archaea 2013; 2013: 1-16.

(29)          Chauhan M., Solanki M. Isolation of cadmium resistant bacteria for environmental clean-up. International Journal of Pharmaceutical Research (IJPR) 2015; 7(4): 29-33.

(30)          Goodfellow M., Kämpfer P., Busse HJ., Trujillo ME., Suzuki KI., Ludwig W., et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed. USA: Springer; 2012.

(31)          Kafilzadeh F., Moghtaderi Y., Rezaeian Jahromi A. Isolation and identification of cadmium-resistant bacteria in Soltan Abad river sediments and determination of tolerance of bacteria through MIC and MBC. European Journal of Expermental Biology 2013; 3(5): 268-273.

(32)          Khan Z., Nisar MA., Hussain SZ., Arshad MN. Cadmium resistance mechanism in Escherichia coli P4 and its potential use to bioremediate environmental cadmium. Applied Microbiology and Biotechnology 2015; 99(24): 10745-10757.

(33)          Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Current Protocols in Molecular Biology Chapter 2: Unit 2.4. 2001.

(34)          Doyle J. DNA protocols for plants In: Hewitt GM., Johnston AWB., Young JPW., editors. Molecular Techniques in Taxonomy. Berlin, Heidelberg: Springer; 1991: 283-293.

(35)          Weigel D., Glazebrook J. Dellaporta miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harbor Protocols 2009; 2009(3): pdb.prot5178.

(36)          Dellaporta SL., Wood J., Hicks JB. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1983; 1(4): 19-21.

(37)          Arjmand Qahestani R., Tavassolian I., Mohammadi Nezhad Q. Evaluation of genetic diversity in 25 Iranian pistachio genotypes using ISSR markers. Journal of Agricultural Biotechnology. 2015; 7(3): 1-18.

(38)          Jaccard P. New research on the floral distribution. Bulletin de la Société vaudoise des sciences naturelles 1908; 44: 223-270.

(39)          Vieira RH., Volesky B. Biosorption: a solution to pollution? International microbiology: the official journal of the Spanish Society for Microbiology 2000; 3(1): 17-24.

(40)          Hassan SH., Abskharon RN., El-Rab SM., Shoreit AA. Isolation, characterization of heavy metal resistant strain of Pseudomonas aeruginosa isolated from polluted sites in Assiut city, Egypt. Journal of Basic Microbiology 2008; 48(3): 168-176.

(41)          Naz N., Young HK., Ahmed N., Gadd GM. Cadmium accumulation and DNA homology with metal resistance genes in sulfate-reducing bacteria. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71(8): 4610-4618.

(42)          Shakeri S., Yaghoobi MM., Rabbani Khorasgani M., Soltani Nezhad S. Isolation of Zinc Oxide (ZnO) nanoparticles resistant Pseudomonas strains from soil and investigation of Zinc resistance genes. Biological Journal of Microorganism 2014; 3(11): 99-108.

(43)          Fatima S., Bajwa R., Anjum T., Saleem Z. Assessment of genetic diversity among different indigenous Xanthomonas isolates via RAPD and ISSR. Archives of Biological Sciences 2012; 64(1): 307-319.

(44)          Ravi Kumar A., Sathish V., Balakrish Nair G., Nagaraju J. Genetic characterization of Vibrio cholerae strains by inter simple sequence repeat-PCR. FEMS Microbiology Letters 2007; 272(2): 251-258.