شناسایی برخی جدایه‌های سیانوباکتریایی پارک ملی خبر کرمان با روش‌های کلاسیک و ‏مولکولی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 1دانشجوی دکترا، گروه میکروبیولوژی ،دانشگاه الزهرا(س)، تهران، ایران 2مربی، گروه میکروبیولوژی دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بناب، ایران

2 دانشیار ،گروه میکروبیولوژی، دانشگاه الزهرا(س)، تهران، ایران

3 دانشیار ، گروه ژنتیک، دانشگاه الزهرا(س)، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: پارک ملی خبر یکی از ذخیره‌گاه‌های طبیعی بسیار باارزش کشور است که تاکنون تنوع میکروبی آن بررسی نشده است. سیانوباکتری‌ها ازجمله موجودات زنده‌ای هستند که در بیشتر اکوسیستم‌های خاکی و آبی وجود دارند و برخی مواد معدنی عامل محدودکنندۀ رشد این موجودات هستند. هدف پژوهش حاضر، بررسی حضور و شناسایی سیانوباکتری‌های موجود در خاک‌های مناطق دست‌خورده و دست‌نخورده در دو منطقۀ استپ سرد و گرم پارک خبر با استفاده از روش‌های کلاسیک و مولکولی است.
مواد و روش‏‏ها: از 32 نمونۀ مختلف خاک پارک خبر که در فصل پاییز نمونه‌برداری شده بودند در محیط  BG11کشت داده شد و جداسازی سیانوباکتری‌ها با استفاده از واکشت‌های متعدد انجام شد؛ سپس کلنی‌های خالص ازنظر ریخت‌شناسی با استفاده از کلید‌های شناسایی معتبر بررسی شدند. شناسایی مولکولی جدایه‌های یادشده با استفاده از تکثیر و تعیین توالی ژنوم ناحیۀ gene 16S rRNA انجام شد. ویژگی‌های خاک مناطق یادشده ازنظر فیزیکی و شیمیایی تجزیه‌وتحلیل شدند.
نتایج: نتایج بررسی نشان دادند نوع بافت خاک لوم- شنی، میانگین میزان هدایت الکتریکی 12/99 میکروزیمنس بر سانتی‌متر و میانگین اسیدیتۀ خاک 29/8 است. جدایه‌های سیانوباکتری‌ها متعلق به جنس‌های Chroococcidiopsis sp.، Leptolyngbya sp.، Nodularia sp. و Synechococcus sp. بودند. نتایج تعیین توالیDNA  با بانک‌های اطلاعاتی NCBI مقایسه و نتایج آن هم‌تراز (Blast) شد.
بحث و نتیجه‏گیری: پژوهش حاضر نشان داد تنوع و تعداد سیانوباکتری‌های موجود در مناطق بیابانی به عوامل مختلفی ازجمله شرایط آب‌و‌هوایی، میزان رطوبت، مقدار تابش نور جذب‌شده بر سطح و دمای منطقه بستگی دارد. نتایج شناسایی مولکولی نتایج ریخت‌شناسی را تأیید کردند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identification of some Cyanobacterial Isolates of Khabr National Park of ‎Kerman using Classic and Molecular Methods ‎

نویسندگان [English]

  • zahra hojjati 1
  • Parisa Mohammadi 2
  • Ezat Asgarani 3
1 1 Ph.D Student of Microbiology, Alzahra University, Tehran, Iran 2Instructor of Microbiology, Islamic Azad University, Bonab, Iran
2 Associate Professor of Microbiology,Alzahra University,Tehran,Iran
3 Associate Professor of Genetics, Alzahra University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Khabr national park is one of the invaluable natural sources in our country and its microbial variety has not been investigated. Cyanobacteria are of those organisms that are present in all terrestrial and water ecosystems and some minerals are limiting factors in their growth. The goal of this study is to investigate the present cyanobacteria in the soils of the grazed and non-grazed plots in two cold and hot steppes of Khabr Park in the autumn season by means of classic and molecular methods.
Materials and Methods: 32 different regions of Khabr Park were sampled in autumn and were cultured in BG11 medium. Isolation of cyanobacteria was conducted by various sub-cultures. Then the pure colonies were morphologically studied by valid taxonomic keys. Molecular identification of mentioned isolates was performed by amplification and sequencing of 16srRNA gene. The features of mentioned soils were analyzed physically and chemically.
Results: The results showed that for the soil texture of sandy loam, the average electrical conductivity was 99.12 µSiemens/cm and the average acidity of soil was 8.29. The isolates of Cyanobacteria belonged to Chroococcidiopsis, Leptolyngbya, Synechococcus, Nodularia. The results of DNA sequencing were compared to NCBI and its results were subjected to BLAST alignment.
Discussion and conclusion: The present work revealed that the variety and the number of the Cyanobacteria in this desert area are dependent on different parameters such as weather, humidity, source of nutrients, the amount of light absorbed by the surface and the temperature. The results of molecular identification validated the results of morphological tests.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Khabr National Park
  • Cyanobacteria
  • 16srRNA gene‎

مقدمه.

بیابان‌ها بیش از یک‌پنجم خشکی‌های زمین را پوشانده‌اند و ازنظر اقلیمی بسیار گرم‌و‌خشک و یا بسیار سرد‌و‌خشک هستند. وسعت بیابان‌ها در ایران حدود 340 هزار کیلومترمربع و کمتر از یک‌پنجم کل مساحت آن است. پارک ملی خبر در جنوب شهر بافت استان کرمان و در ʹN28°25 تا ʹN28°59 عرض شمالی و ʹE56°02 تا ʹE56°39 طول شرقی واقع شده است. مساحت این منطقه حدود 149934 هکتار است و در سال 1379 با عنوان پارک ملى ثبت شده است (1).

پژوهش‌های اخیر نشان می‌دهند اکوسیستم‌های بیابانی نسبتاً پیچیده و ازنظر زیستی غنی هستند (2). بیابان‌ها به‌طور شگفت‌آوری حیات گیاهان و جانوران متنوع را حمایت می‌کنند و حتی برخی تاکسون‌های نیازمند به رطوبت مانند جلبک‌ها، خزه‌ها، سرخس‌ها، جانوران سخت‌پوست و تعدادی گونۀ سمندر و دوزیست در بیابان‌ها گزارش شده‌اند. پوشش گیاهی و اجتماعات گیاهی در سرزمین‌های بیابانی و خشک حساس هستند و معمولاً اصلاح آنها به دلایلی مشکل است؛ برای نمونه، خاک‌های این مناطق اغلب هوموس کمی دارند، میزان مواد مغذی به‌ویژه فسفر این مناطق کم است و تغییرات و نوسانات دمای فصلی و سالانه زیاد است. پوسته‌های زیستی خاک در مناطق بیابانی و خشک اهمیت ویژه‌ای دارند؛ پوسته‌های زیستی متشکل از جلبک‌ها، سیانوباکتری‌ها، سرخس‌ها، جگرواش‌ها، قارچ‌ها و گل‌سنگ‌ها هستند که چند میلی‌متر بالایی سطح خاک را در اکوسیستم‌های خشک و نیمه‌خشک سراسر دنیا می‌پوشانند و یکی از مهم‌ترین اجزای زندۀ این نواحی هستند (3). این موجودات اجتماع زندۀ ویژه‌ای تشکیل می‌دهند که آثار شدیدی ازجمله فرسایش خاک، زهکشی، پالایش، تنفس خاک، تثبیت نیتروژن و عملکرد گیاهان آوندی بر فرایندهای کلیدی اکوسیستم‌های یادشده دارد (4 و 5). سیانوباکتری‌ها موجودات بسیار کوچکی هستند که اندازۀ آنها از چند میکرون بیشتر نمی‌شود، تولیدمثل آنها به روش غیرجنسی و تقسیم دوتایی است و در برخی موارد با تولید هورموگونیوم تکثیر می‌شوند و دارای کلروفیل a و فتواتوتروف هستند. سیانوباکتری‌ها ازنظر تولید اکسیژن در آب‌های شیرین و شور و ازنظر تثبیت نیتروژن به‌ویژه در آب‌های کم‌نیتروژن اهمیت بسیاری دارند و نیتروژن حاصل از فعالیت آنها نقش مهمی در چرخۀ پروتئین‌سازی چنین اکوسیستم‌هایی ایفا می‌کند. سیانوباکتری‌ها بیشتر در محیط‌های خنثی یا قلیایی رشد می‌کنند و رشد آنها در محیط‌های اسیدی محدود می‌شود. چهار جنس Stichococcus، Nostoc، Anabaena وOscillatoriaاز مهم‌ترین سیانوباکتری‌ها در طبیعت محسوب می‌شوند (6-9)؛ ازاین‌رو در گام نخست برای شناخت تنوع ریزموجودات پارک ملی خبر کرمان، جدایه‌های سیانوباکتریایی که یکی از مؤثرترین گروه‌های میکروبی این مناطق هستند با روش‌های کلاسیک و مولکولی شناسایی شدند.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری خاک از دو منطقۀ استپی سرد و گرم و دست‌خورده و دست‌‌‌نخورده و از عمق صفر تا 15 سانتی‌متری سطح خاک در فصل پاییز انجام شد. سه ویژگی بافت خاک، اسیدیته و هدایت الکتریکی خاک که دارای اهمیت ویژه است در نمونه‌های خاک بررسی شدند.

سنجش برخی ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک

اسیدیتۀ خاک: ابتدا میزان 20 گرم خاک گذرانده‌شده از الک 2 ‌‌میلی‌متری وزن شد و 50 میلی‌لیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت 2 ساعت روی شیکر با سرعت ×g 200 تکان داده شد؛ سپس اسیدیتۀ نمونه‌های خاک با استفاده از pHمتر اندازه‌گیری شد.

بافت خاک: 50 گرم خاک الک‌شده به 20 میلی‌لیتر پلی‌فسفات‌سدیم 10 درصد و 50 میلی‌لیتر آب مقطر افزوده شد و پس‌از هم‌زدن، محلول به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای اتاق نگهداری شد. در مرحلۀ بعد، پس‌از افزودن 300 میلی‌لیتر آب مقطر و 5 دقیقه مخلوط‌کردن با همزن برقی، محلول به استوانۀ مدرج یک لیتری منتقل و با آب مقطر به حجم 1 لیتر رسانده شد. چگالی پس‌از گذشت زمان‌های 40 ثانیه و 2 ساعت با چگالی‌سنج خوانده شد. درصد خاک رس و خاک لوم از دو رابطۀ زیر محاسبه شد:

درصد رس=(2×چگالی 40 ثانیه)+2/0×(68-دمای 40 ثانیه)

درصد لوم=(2×چگالی 2 ساعت)+2/0×(68-دمای 2 ساعت)

مجموع دو عدد حاصل از عدد 100 کم شد تا درصد شن معلوم شود:

درصد شن=(رس+لوم)–100

درنهایت، بافت خاک با استفاده از مثلث خاک مشخص شد.

هدایت الکتریکی خاک: ابتدا از خاک، گل اشباع و سپس عصاره از گل اشباع تهیه شد. میزان هدایت ‌الکتریکی محلول با کمک الکترود هدایت‌سنج خوانده و تعیین شد.

روش کشت سیانوباکتری‌های خاک:پس‌از تهیۀ رقت‌های متوالی از خاک،نمونه‌ها در شرایط استریل روی محیط‌کشت جامد BG-11 حاوی 5/1گرم NaNO3، 7/1 گرم NaHCO3، 31 میلی‌گرم K2HPO4، 75 میلی‌گرم MgSO4.7H20، 36 میلی‌گرم CaCl2 .H20، 20 میلی‌گرم Na2CO3، 6 میلی‌گرم Citric Acid، 6 میلی‌گرم Ferric Ammonium Citrate، 1 میلی‌گرم EDTA، 86/2 میلی‌گرم H3BO3، 81/1 میلی‌گرم Mn2Cl2.4H20، 220 میکروگرم ZnS04.H20، 390 گرم Na2MoO4.2H20، 80 میکروگرم CuSO4.H20 و 40 CoCl2.6H20 کشت داده شدند (10) و در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد و روشنایی 2500 لوکس در دوره‌های 16 ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. دو هفته گرماگذاری برای جداسازی جدایه‌ها انجام شد و کلنی‌های قابل‌مشاهده واکشت شدند. برای جلوگیری از رشد قارچ‌ها رقت 1/0 گرم ‌بر‌ لیتر آنتی‌بیوتیک‌های نیستاتین و سیکلوهگزامید به محیط‌های کشت اضافه شد. ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایه‌ها مانند کوکوئیدی یا رشته‌ای‌بودن، وجود انشعابات، نوع انشعابات، توانایی تشکیل هتروسیست و تولید هورموگونیوم با استفاده از کلیدهای شناسایی تعیین شدند (11-13).

روش مولکولی: شناسایی مولکولی با تکثیر و تعیین توالی ژنوم ناحیۀ 16S rRNA و به کمک پرایمرهای اختصاصی سیانوباکتری‌ها انجام شد. پرایمر آغازگر رو به جلو CYA359F 5’(GGG GAA TYT TCC GCA ATG GG)3’ و پرایمر معکوس CYA781R مخلوط هم‌مولار توالی‌های زیر بودند (14-16).

CYA781R (a) 5’(GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CAT T)3’

CYA781R (b) 5’(GAC TAC AGG GGT ATC TAA TCC CTT T) 3’

 

روش استخراج DNA:استخراجDNA به‌طور دستی انجام شد؛ به این منظور، تودۀ سلولی با انجام سانتریفیوژ از محیط‌کشت مایع جمع‌آوری شد و سپس به میکروتیوب حاوی این توده، 400 میکرولیتر محلول بافر استخراج 100 میلی‌مولار Tris/HCl، 20 میلی‌مولار EDTA، 5/2 درصد (وزنی/حجمی) CTAB، 4/1 مولار NaCl، 2/0 درصد (حجمی/حجمی) مرکاپتواتانول با اسیدیتۀ 8 افزوده و نمونه به‌مدت 15 دقیقه در فریزر منفی 70 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. سوسپانسیون حاصل به‌مدت 30 دقیقه در دمای 60‌ درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد و سپس، استخراج DNA با افزودن حجم برابری از کلروفرم انجام شد. پس‌از افزودن کلروفرم، نمونه به‌آرامی مخلوط و به‌مدت 6 دقیقه در ×g 5000 سانتریفیوژ شد. فاز آبی به میکروتیوب جدید منتقل و هم‌حجم آن ایزوپروپانول اضافه شد. توده با سانتریفیوژ به‌مدت 5 دقیقه در×g  10000 جمع‌آوری و به تودۀ حاصل 400 میکرولیتر آب مقطر استریل افزوده شد؛ سپس به سوسپانسیون حاصل به‌ترتیب 1/0 برابر حجم استات‌سدیم 3 مولار و 2 برابر حجم اتانول اضافه شد. رسوب DNA با سانتریفیوژ به‌مدت 5 دقیقه در دور ×g 10000 جمع‌آوری و سپس زیر هود خشک شد؛ DNA استخراج‌شده به 20 میکرولیتر آب دوبار تقطیر استریل وارد و در فریزر منفی 20 نگهداری شد.

سنجش غلظت DNA:ابتدا دستگاه نانودراپ با آب مقطر استریل کالیبره شد. سپس جذب 1 میکرولیتر DNA استخراج‌شده در طول‌ موج 260 نانومتر خوانده و غلظت آن بر حسب نانوگرم بر میکرولیتر محاسبه شد.

شناسایی مولکولی جدایه‌ها با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز:(PCR) واکنش PCR در حجم 50 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر بافرx) PCR 10(، 5/1 میکرولیتر ) MgCl2 50 میلی‌مولار)، 1 میکرولیتر از هریک از پرایمرها، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taqپلیمراز، 5/0 میکرولیتر dNTP (50 میلی‌مولار)، 4 میکرولیترDNA  الگو و 5/36 میکرولیتر آب مقطر استریل انجام شد.

برنامه زمانی PCR: مراحل واسرشتی اولیه در 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 4 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشتی در 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه، اتصال در 64 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و طویل‌شدن در 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و مرحلۀ طویل‌شدن نهایی در 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه انجام شد.

روش الکتروفورز: 10 میکرولیتر از هر محصول PCR همراه با 2 میکرولیتر لودینگ‌بافر (x6) به چاهک ژل آگارز 5/1 درصد حاوی رنگ سایبرگلد اضافه شد و الکتروفورز به‌مدت 45 دقیقه با ولتاژ 70 ولت انجام شد. تصویر ژل آگارز با دستگاه ژل‌داک (Ebox Vx5) مشاهده و تصویربرداری شد.

تعیین توالی DNA:محصولات PCR برای تعیین توالی به شرکت Sequetech (شرکت پیشگام) ارسال شدند. تعیین توالی با روش Exome Sequencing .(Next Generation Sequencing- NGS)- Fragment Analysis-sanger انجام شد.

 

نتایج

ویژگی‌های اقلیمی منطقۀ مطالعه‌شده: ویژگی‌های اقلیمی منطقۀ پارک ملی خبر با استفاده از اطلاعات سامانۀ ادارۀ هواشناسی جمع‌آوری شدند (جدول 1). ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خاک مطابق بخش مواد و روش‌ها تعیین و نتایج در جدول 2 ارائه شدند.

 

جدول 1- ویژگی‌های اقلیمی منطقۀ مطالعه‌شده

میانگین ماهانۀ متوسط دمای روزانه بر حسب درجۀ سانتی‌گراد

01/15

میانگین رطوبت نسبی بر حسب درصد

14/39

مجموع بارندگی ماهانه بر حسب میلی‌‌متر

43/247

 

جدول 2- نتایج تعیین ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خاک منطقۀ استپی در فصل پاییز

منطقۀ استپی

گرم دست‌خورده

گرم دست‌نخورده

سرد دست‌خورده

سرد دست‌نخورده

بافت خاک

لوم شنی

لوم شنی

لوم شنی

لوم شنی

هدایت الکتریکی خاک

61/96

26/100

63/96

51/103

اسیدیتۀ خاک

3/8

31/8

28/8

27/8

 


نتایج شناسایی جدایه‌های سیانوباکتریایی: جدایه‌ها بر اساس مشاهده‌های میکروسکوپی (شکل 1) و به کمک کلیدهای شناسایی (جدول 3) بررسی و گونه‌های Nodularia، Synechococcus، Leptolyngbya، Chroococcidiopsis شناساییشدند.

 

 

الف

   

ب

   

ج

   

د

   

ه

   

ی

   

شکل 1- تصاویر میکروسکوپی و ماکروسکوپی سیانوباکتری‌های شناسایی‌شده. الف. جدایۀ 22،Chroococcidiopsis ؛ ب. جدایۀ 21، Leptolyngbya؛ ج. جدایۀ 23، Synechococcus، د. جدایۀ 29،Nodularia ؛ ه. جدایۀ 26،Chroococcidiopsis ؛ ی. جدایۀ 28،Chroococcidiopsis


 

جدول 3- سیانوباکتری‌های استخراج‌شده از منطقۀ استپی در فصل پاییز

جنس سیانوباکتری

کد محل نمونه‌برداری

نوع استپی

نوع منطقه

ویژگی‌های ریخت‌شناسی

Leptolyngbya

21

گرم

دست‌خورده

رشته‌ای، بدون انشعاب، غلاف‌دار، دارای هورموگونیوم، بدون هتروسیست، اندازۀ سلول‌ها حدود 5/0 تا 3 میکرومتر

Chroococcidiopsis

22

گرم

دست‌‌نخورده

مشاهدۀ سلول‌ها معمولاً به‌شکل دو، سه یا چهارتایی و محصور‌شده در یک غلاف، بیشتر سلول‌ها مشابه، کم‌وبیش دارای شکل کروی یکنواخت

Synechococcus

23

گرم

دست‌خورده

سلول‌ها کروی‌شکل، تک‌سلولی، بدون هتروسیست، اندازۀ سلول‌ها 8/0 تا 5/1 میکرومتر

Chroococcidiopsis

26

گرم

دست‌نخورده

مشاهدۀ سلول‌ها معمولاً به‌شکل دو، سه یا چهارتایی و محصور‌شده در یک غلاف، بیشتر سلول‌ها مشابه، کم‌وبیش دارای شکل کروی یکنواخت

Chroococcidiopsis

28

گرم

دست‌نخورده

مشاهدۀ سلول‌ها معمولاً به‌شکل دو، سه یا چهارتایی و محصور‌شده در یک غلاف، بیشتر سلول‌ها مشابه، کم‌وبیش دارای شکل کروی یکنواخت

Nodularia

29

گرم

دست‌نخورده

تریکوم‌ها مستقیم، سلول‌ها بیضوی، کروی یا سیلندری‌شکل، مشاهدۀ هتروسیست

 

 


.نتایج بررسی کمّی و کیفی DNA استخراج‌‌شده از سیانوباکتری‌ها: برای بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج‌شده از دستگاه نانودراپ استفاده شد و نتایج در جدول 4 ارائه شدند.

 

 

جدول 4- نتایج بررسی کمّی و کیفی DNA استخراج‌شده از سیانوباکتری‌ها

شمارۀ نمونه

غلظت (نانوگرم‌برمیکرولیتر)

A260

A280

A260/280

A260/230

26

830

90/23

9/13

71/1

6/0

29

8/217

356/4

134/2

04/2

34/1

23

9/306

168/6

99/2

07/2

70/1

28

9/225

518/4

290/2

97/1

05/1

21

4/307

148/6

416/3

80/1

98/0

22

3/229

585/4

556/2

79/1

80/0

 


نتایج مربوط به PCR:تصاویر ژل‌های ارائه‌شده در شکل 2 طول توالی تکثیر‌شده توسط پرایمر آغازگر رو به جلو CYA359F و پرایمر معکوس CYA781R را نشان می‌دهند.

 

 

 

430 bp

   4      3            2          1         1           1        1

ب  الف

شکل 2- الف. باندها محصولات PCR ژن 16S rRNA سیانوباکتریایی را نشان می‌دهند که حدود 430 جفت‌باز طول دارند و از راست به چپ به‌ترتیب عبارتند از: 1. محصول PCR سیانوباکتریایی با غلظت‌های مختلف، 2. نشانگر، 3. شاهد مثبت، 4. شاهد منفی. ب. تصویر شاخص وزن مولکولی استفاده‌شده

 


نتایج تعیین توالی DNA:نتایج تعیین توالی محصولات PCR پس‌از دریافت با نرم‌افزار BioEdit بررسی و بخش‌های نامنظم توالی به کمک کروماتوگرام حذف شدند؛ به‌این‌ترتیب، ویرایش توالی‌ها انجام شد. توالی‌ها از طریق سامانۀ GenBank[1] و بانک اطلاعاتی NCBI مقایسه و هم‌تراز شدند (17). از میان 100 توالی مقایسه‌شده برای هر نمونه، توالی‌های ابتدایی بر اساس اولویت تشابه با نمونۀ موجود مقایسه شدند. جدول 5 نتایج شناسایی تعدادی از جدایه‌ها را با‌توجه‌به نتایج مولکولی نشان می‌دهد.

 

 

جدول 5- نتایج مولکولی برخی از جدایه‌های سیانوباکتری

پیوست

درصد سایت مشابه

درصد هم‌پوشانی

بهترین همخوانی بلاست

ریخت‌شناسی

آغازگر (R)

پرایمر (F)

کد سایت

JQ927348

99

100

Nodularia.sp

Cyanobacteria

CYA781 R(a), (b)

Cya359

29

MF467540.1

99

99

Chroococcidiopsis sp.

Cyanobacteria

CYA781 R(a), (b)

Cya359

26

MF467540.1

99

99

Chroococcidiopsis sp.

Cyanobacteria

CYA781 R(a), (b)

Cya359

28

Q51767

98

100

Leptolyngbya.sp

Cyanobacteria

CYA781 R(a), (b)

Cya359

21

AY274622

99

94

Synechococcus sp.

Cyanobacteria

CYA781 R(a), (b)

Cya359

23

 


 

 

بحث و نتیجه‌گیری

پارک‌های ملی اهمیت بسیاری در حفظ ذخایر طبیعی حیات وحش، حفظ خاک و گیاهان، تنوع زیستی و حفاظت از تغییرات ژنتیکی دارند؛ در این حفاظت، مجموعۀ پیچیده‌ای از فرایندهای بوم‌شناختی و ژنتیکی به‌طور دائم سبب تکامل جمعیت‌های سازگار با مناطق یادشده می‌شوند که نقش بسزایی در این اکوسیستم‌ها دارند. در بررسی حاضر همان‌گونه که انتظار می‌رفت تعداد سیانوباکتری کمتری از خاک‌های بیابانی در مقایسه با اکوسیستم‌های آبی جدا شد که ناشی از وضعیت خاص آب‌وهوای منطقه است. جنس‌های جداشده از خاک پارک خبر کرمان در فصل پاییز در منطقۀ استپی گرم Leptolyngbya Synechococcus، Chroococcidiopsisو Nodularia بودند. تنوع و تعداد سیانوباکتری‌های موجود در مناطق بیابانی به عوامل مختلفی مانند شرایط اقلیمی، میزان رطوبت، مقدار تابش نور جذب‌شده بر سطح، دمای منطقه، جنس مواد تشکیل‌دهندۀ خاک بیابان مطالعه‌شده، میزان پذیرش سطحی مواد تشکیل‌دهندۀ منطقه بستگی دارد. مطالعۀ جوامع میکروبی و شناسایی ریزموجودات زیستگاه‌های مناطق بیابانی سرد و گرم باتوجه‌به محدودیت‌های رشد در آن مناطق بسیار مهم است (18). پژوهشگران پی برده‌اند اغلب جنس Chroococcidiopsis در شرایط خشک و در زیستگاه میکروبی شور به‌شکل اندولیتیکی زندگی می‌کند. جعفری و همکاران برخی ویژگی‌های پوسته‌های خاکی و خاک‌های غیرپوسته‌ای را در منطقۀ آلاگل در شمال استان گلستان مقایسه و گزارش کرده‌اند پوسته‌های زیستی نقش مهمی در حفاظت و شیمی خاک دارند (19). همچنین سیانوباکتری Chroococcidiopsis sp. ازجمله سیانوباکتری‌های غالب بیابان‌هایی مانند دره‌های خشک در قطب جنوب، کویر آتاکاما در شیلی و کویر موجیو در کالیفرنیا گزارش شده است (20). تأثیر تثبیت نیتروژن سیانوباکتریایی بر بازده حذف نیتروژن شناخته شده است (21). این سیانوباکتری‌ها نسبت به خشک‌شدن، پرتوهای یونیزه‌کننده و تابش اشعۀ ماورابنفش فوق‌العاده مقاوم هستند. در پژوهش حاضر، 8/42 درصد جدایه‌های سیانوباکتریایی به جنس Chroococcidiopsis تعلق داشتند. نتایج نشان می‌دهند منطقۀ گرم دست‌نخورده در فصل پاییز بیشترین تعداد جدایه‌های سیانوباکتریایی را دارد و دمای کم فصل پاییز و سایر تنش‌ها دلیل جدانشدن سیانوباکتری‌ها از مناطق سرد دست‌نخورده هستند؛ برای نمونه آب منجمد ازنظر زیستی برای موجودات زنده در دسترس نیست. مطالعه‌های چندانی دربارۀ دست‌خوردگی خاک مناطق بیابانی انجام نشده است (22). پژوهش‌های انجام‌شده دربارۀ خاک دست‌خوردۀ مناطق جنگلی نشان می‌دهند دست‌خوردگی بافت خاک و پوشش گیاهی ممکن است به کاهش جمعیت میکروبی منجر شود. پژوهشگران نشان داده‌اند تنوع جمعیت گیاهی خاک با تغییر ترکیب جمعیت میکروبی تغییر می‌کند و تغییر جمعیت گیاهی ممکن است در اثر چرای دام نیز رخ دهد (23)؛ علاوه‌براین، پژوهشگران نشان داده‌اند دما و رطوبت بر رشد جمعیت‌های میکروبی خاک تأثیر می‌گذارند و از عوامل غیرزندۀ کنترل‌کنندۀ تنفس خاک‌های بیابانی هستند (24). همان‌طور که گزارش شده است درصد کمی از ریزموجودات اکوسیستم‌های خاکی کشت‌پذیر هستند و تعداد کم جدایه‌های حاصل از نمونه‌های خاک تأییدی بر این ادعاست. برخی ریزموجودات توانایی رشد روی محیط‌های کشت مصنوعی را ندارند و متأسفانه همیشه تعدادی از جدایه‌ها طی فرایند کشت از دست می‌روند. از سوی دیگر، گاهی روش‌های کلاسیک امکان شناسایی سیانوباکتری‌ها را به‌خوبی امکان‌پذیر نمی‌کنند و بنابراین شناسایی برخی گونه‌ها به روش مولکولی انجام می‌شود. حیدری و همکاران جدایه‌های سیانوباکتری‌های چهار منطقۀ گرم ایران را با تعیین توالی ژنوم ناحیۀ  16S rRNAبه کمک روش PCR شناسایی کردند و نتایج شناسایی مولکولی آنها بر روش‌های کلاسیک ریخت‌شناختی منطبق بود و تعیین توالی ژنومی اطلاعات لازم برای جداسازی تاکسون‌های مطالعه‌شده بر اساس روش‌های ریخت‌شناسی را تأیید کرد (25 و 26). اساس تجزیه‌و‌تحلیل فیلوژنتیکی با استفاده از تعیین توالی ژن 16S rRNAبر مشاهده‌های مورفولوژیکی مبتنی است (27). در مطالعه‌ای دیگر مشخص شده است ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خاک مانند هدایت الکتریکی، بافت و اسیدیته بر تنوع و فراوانی سیانوباکتری‌های خاک بیابان سرد لاداک در هند مؤثر هستند. همچنین پژوهشگران نشان داده‌اند سیانوباکتری‌های رشته‌ای به‌ویژه جنس‌های Phormidium و Leptolyngbya از بیشتر خاک زمین‌های شمال ویکتوریا جدا شده‌اند (28 و 29). در پژوهش حاضر نتیجه گرفته شد در بافت لوم- شنی خاک بیابان بیشتر جنس Chroococcidiopsis و به‌ندرت انواع رشته‌ای سیانوباکتری یافت می‌شوند؛ بنابراین، اغلب سیانوباکتری‌های جدا‌شده از مناطق بیابانی به‌علت شرایط الیگوتروفی به‌شکل کروی با پوشش غشای ضخیم هستند تا با افزایش نسبت سطح به حجم باکتری‌ها، سطح تماس آنها با مواد آلی و معدنی محیط افزایش یابد. سیانوباکتری‌ها برای غلبه‌کردن بر محیط‌‌های الیگوتروف از راهکارهای متنوع فیزیولوژیکی، ریخت‌شناختی و اکولوژیکی برای دستیابی به ظرفیت بهینۀ تثبیت نیتروژن، فتوسنتز، تجزیه و جداسازی عناصر غذایی مانند فسفر و آهن بهره می‌برند. حضور این ریزموجودات در محیط‌های سخت خشک و نیمه‌خشک سازگاری درخور توجه اکوفیزیولوژیکی و توانایی زیاد تطابق با عوامل محیطی تغییریافتۀ اکوسیستم‌های بیابانی را نشان می‌دهد. از خاک منطقۀ استپی گرم و سرد پارک حفاظت‌شدۀ خبر که در فصل پاییز نمونه‌گیری شده بود تعدادی سیانوباکتری جدا شد که عبارتند از جنس‌های: Chroococcidiopsis، Leptolyngbya، Synechococcus و Nodularia و باتوجه‌به اینکه نمونه‌برداری از مناطق مختلف گرم و سرد انجام شد، سیانوباکتری‌ای از مناطق سرد دست‌خورده و دست‌نخورده جدا نشد. جنس Chroococcidiopsisاز سه محل منطقۀ گرم جدا شد.

پژوهش حاضر نشان داد تنوع و تعداد سیانوباکتری‌های موجود در مناطق بیابانی در منطقۀ گرم و دست‌نخورده بیشتر از منطقۀ گرم و دست‌خورده است و شرایط آب‌و‌هوایی، میزان رطوبت، مقدار تابش نور جذب‌شده بر سطح، دمای حضور مواد مغذی مختلف، مواد آلی، کربن آلی، نیتروژن، فسفر و پتاسیم و تغییرات جزیی اسیدیته در این امر دخیل هستند. نتایج مولکولی پژوهش حاضر نتایج شناسایی ریخت‌شناختی را تأیید کردند و باتوجه‌به نقش این دسته موجودات پیشنهاد می‌شود از آنها در تغییر و اصلاح بافت خاک و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی آن استفاده شود.

سپاسگزاری

نویسندگان مقالۀ حاضر از کارشناس محترم آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی دکتر سپهر، سرکار خانم مریم یوسفی و خانم مریم تیموری دانشجوی دکتری میکروبیولوژی که زحمت نمونه‌برداری از خاک‌های منطقه خبر کرمان را بر عهده داشتند تشکر می‌کنند. پژوهش حاضر با حمایت معاونت محترم پژوهشی دانشگاه و پژوهانۀ کد D96/3/125 در آزمایشگاه ملی میکروبیولوژی انجام شد.

(1)              Bahrami M. Desert and desertification in Iran. Geophysical Research Abstracts 2009; 11: 1745.

(2)              Polis GA. Complex trophic interactions in deserts: an empirical critique of food-web theory. The American Naturalist journal 1991; 123-155.

(3)              Belnap J., Lange OL. Biological soil crusts: structure, function and management. Ecological Studies 2003; 471-479.

(4)              Belknap J. The potential roles of biological soil crusts in dry land hydrologic cycles. Hydrological processes 2006; 20(15): 3159-3178.

(5)              Alexander RW., Calvo A. The influence of lichens on slope processes in some Spanish badlands. Geomorphology 1990; 385-398.

(6)              Sethi SK., Samad LK., Adhikary SP. Cyanobacteria and micro-algae in biological crusts on soil and sub-aerial habitats of eastern and north eastern region of India. Journal of the Phycological Society2012; 42(1): 1-9.

(7)              Koijam L., Devi SD., Singh OA., Tiwari ON., Singh MR. Modern characteristic features of cyanobacteria with special emphasis on reproduction and thallus structure. The Journal of Plant Reproductive Biology 2009; 1(1): 53-57.

(8)              Luuc RM., Olav M., Skulberg O., and Hans U. Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public health consequences, monitoring and management In: Ingrid C., Jamie B. editors. Cyanobacteria in the Environment. London and New York: Spon E and FN; 1999.

(9)              Ortega Calvo JJ., Hernandez Marine M., Saiz Jimenez C. Biodeterioration of building materials by cyanobacteria and algae. International Biodeterioration 1991; 28(2): 165-185.

(10)          Andersen RA. Algal culturing techniques. 1st ed. Amsterdam: Elsevier; 2005.

(11)             Bellinger EG., Sigee DC. Freshwater Algae Identification and Use as Bioindicators. 1st ed. New York: John Wiley and Sons, Inc.; 2010.

(12)             Wehr JD., Armonk YF. Freshwater Algae of North America: Ecology and Classification. 2nd ed. Academic Press: Cambridge, Massachusetts; 2015.

(13)             Prescott GW. Algae of the western great lakes area. Dubuque and Iowa: Wm. C. Brown Company Publishers; 1970.

(14)          Chand T., Pankaj D., Arora K. Evaluation of potential of molecular and physical techniques in studying biodeterioration. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2012; 11: 71-104.

(15)          Karen L., Vidalia HA. Surface analysis and materials characterization for the study of biodeterioration and weathering effects on cultural property. International Biodeterioration and Biodegradation 2009; 63(7): 813-822.

(16)          Nubel U., Garcia-pichel F., Muyzer G. PCR Primers to Amplify 16S rRNA Genes from Cyanobacteria. Applied and Environmental Microbiology 2009; 63: 3327-3332.

 

(17)          Zhang Z., Schwartz S., Wagner L., Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology 2000; 7(1-2): 203-214.

(18)          Wierzchos J., Ascaso C., McKay CP. Endolithic Cyanobacteria in halite rocks from the hyperarid core of the Atacama Desert. Astrobiology Journal 2006; 6: 1-8.

(19)          Jafari MA., Tavili N., Zargham Gh.A., Heshmati M.A., Zare hahouki S., Shirzadian H. et al. Comparing some properties of crusted and uncrusted soils in alagol region of Iran. Pakistan Journal Nutrition 2004; 3: 273-277.

(20)          Daniela B., Mickael B., Heather DS., Christopher PM. Cyanobacteria from extreme deserts to space. Advances in Microbiology 2013; 3: 80-86.

(21)          Xiaodong Z., Xin J., Liang Y., Jinzhi W., Xiaoming K., Lijuan C. Cyanobacterial nitrogen fixation influences the nitrogen removal efficiency in a constructed wetland. Water Journal 2017; 9: 865.

(22)          Devi HR., Dkhar MS. Comparative study on soil fungal diversity of mawphlang sacred grove and disturbed forest north East India.Indian Journal of Scientific Research and Technology 2014; 2(5): 64-72.

(23)          Carney KM., Matson PA. The influence of tropical plant diversity and composition on soil microbial communities. Microbial Ecology 2006; 52(2): 226-238.

(24)          Nonzom S., Sumbali G. Fate of mitosporic soil fungi in cold deserts. American International Journal of Research in Formal, Applied & Natural Sciences 2015; 2328-3777.

(25)          Heidari F., Riahi H., Yousefzadi M., Shariatmadari Z. Morphological and phylogenetic diversity of cyanobacteria in four hot springs of Iran. The Iranian Journal of Botany 2013;19(2): 162-172.

(26)          Rehakova K., Johansen J., Casamatta D., Xuesong L., Vincent J. Morphological and molecular characterization of selected desert soil cyanobacteria : three species new to science including Mojavia pulchra gen .et sp. Nov. Phycologia 2007; 46(5): 481-502.

(27)          27-Xuan H., Shinpei S., Shoichiro S. Unexpected high diversity of terrestrial Cyanobacteria from the campus of the university of the Ryukyus, Okinawa, Japan. Microorganisms journal 2017; 5: 69.

(28)          Oinam G., Singh KO., Tiwari ON. An account of morphological and biochemical characterization of some heterocystous cyanobacteria (nostocalean) of NE region of India falling under Indo-Burma biodiversity hotspots. Biosience Biotechnology Research Communication 2010; 3(1): 26-32.

(29)          Li Z., Brand J. Leptolyngbya nodulosa. sp. nov. (Oscillatoriaceae), a subtropical marine cyanobacterium that produces a unique multicellular structure. Phycologia Journal 2007; 46(4): 396-401.