تغییر در بیان ژن‌های ‏ahpF‏ و ‏tviA‏ در ‏Salmonella enterica PTCC 1230‎‏ ناشی از تنش‌های ‏اسمزی و اکسیداتیو با روش ‏Real-Time PCR

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی سلولی‌مولکولی، دانشکدۀ علوم پایه، ‌‌دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ‌‌ایران

2 گروه میکروبیولوژی ، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ایران

چکیده

مقدمه: سالمونلا یکی از اعضای خانوادۀ انتروباکتریاسه است که باعث ایجاد بیماری‌های عفونی در انسان و حیوانات می‌شود. این باکتری بیماری‌هایی نظیر تب روده‌ای (تیفوئید)، باکتریمی، انتروکولیت و سالمونلوز ایجاد می‌کند که امروزه معضل بهداشتی در جهان محسوب می‌شوند. هدف بررسی و مطالعۀ حاضر، ارزیابی تغییرات ناشی از تنش‌های اسمزی و اکسیداتیو بر بیان ژن‌های tviAو ahpF در سالمونلا انتریکا PTCC 1230 است.
مواد و روش‏‏ها: برای اعمال تنش اسمزی، باکتری در معرض غلظت‌های 6، 8، 10، 12 و 14 درصد وزنی/حجمی سدیم‌کلراید قرار گرفت و برای اعمال تنش اکسیداتیو از غلظت‌های 1200، 2400، 4800، 6000 و 7200 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه استفاده شد. میزان کمّی تغییر بیان ژن‌های tviAو ahpFبا Real-Time PCR اندازه‌گیری شد.
نتایج: غلظت‌های 14 و 10 درصد سدیم‌کلراید و غلظت‌های 7200 و 6000 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه بیشترین اثر را روی رشد سالمونلا انتریکا PTCC 1230 داشتند. میزان بیان ژن ahpFدر غلظت 7200 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه نسبت به شرایط 6000 پی‌پی‌ام و ژن مرجع (16S rRNA) به‌ترتیب 8/1 و 5/2 برابر افزایش یافت. همچنین بیان ژن tviA در غلظت 14 درصد سدیم‌کلراید نسبت به غلظت 10 درصد و ژن مرجع (16S rRNA) به‌ترتیب 3/1 و 5/1 برابر افزایش یافت.
بحث و نتیجه‏گیری: در پژوهش حاضر، میزان تغییر بیان ژن‌های tviA و ahpF در شرایط تنش‌های اسمزی و اکسیداتیو در باکتری سالمونلا انتریکا PTCC 1230 با روش Real-Time PCR بررسی شد. با‌توجه‌به نتایج، مشخص شد بیان ژن‌هایahpF و tviA در شرایط تنش افزایش می‌یابد و بررسی پاسخ سایر ژن‌ها به تنش‌های محیطی پیشنهاد می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Changes in ahpF and tviA genes expression in Salmonella enterica PTCC 1230upon osmotic and oxidative stress using Real-Time PCR

نویسندگان [English]

  • Mohammad Faezi Ghasemi 1
  • Hossein Zahmatkesh Zakariaei 2
1 Associate Professor, Head Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Basic Sciences-Lahijan Branch-Lahijan/Iran
2 MSc of Microbiology, Lahijan Branch- Islamic Azad University, Lahijan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Salmonella is a member of the Enterobacteriaceaefamily causing infectious disease in human and animals. The diseases caused by this bacterium are typhoid, bacteremia, enterocolitis, salmonellosis which are a health problem worldwide. The aim of this study was to evaluate the changes in expression of ahpF and tviAgenes in Salmonella enterica PTCC 1230 exposed to osmotic and oxidative stresses.
Materials and Methods: For osmotic stress, S.enterica PTCC 1230 was subjected to 6, 8, 10, 12, and 14% (W/V) NaCl concentrations and for the oxidative stress, H2O2at concentrations of 1200, 2400, 4800, 6000 and 7200 ppm were used.  Change in expression of ahpF and tviA genes were quantified using Real-time PCR method.
Results:Based on the obtained results, NaCl at concentrations of 14% and 10% and H2O2atconcentrations of 7200 (ppm) and 6000 (ppm) had maximum effects on the bacterial growth, respectively. In concentration of 7200 ppm, the expression of ahpFgene increased about 1.8 and 2.5-fold more thanH2O2at 6000 ppm concentration and reference gene (16S rRNA).Also, in 14% (W/V) sodium chloride concentration  the expression of tviAgene increased about1.3 and 1.5 fold more than 10% and the reference gene (16S rRNA), respectively. 
Discussion and Conclusion:In this study, changes in expression level of ahpF and tviAgenes upon oxidation and osmotic stresses were studied in Salmonella entericaPTCC 1230. The overall results of this study showed that the expression level of both ahpF and tviAgenes were increased in stress condition and we recommend the study of the other genes incorporate in responses to environmental stresses.  

کلیدواژه‌ها [English]

  • Osmotic stress
  • Oxidative stress
  • tviA gene
  • ahpF gene
  • Salmonella enterica PTCC 1230
  • Real-Time PCR

مقدمه

سالمونلا باکتری میله‌ای‌شکل، گرم منفی، بی‌هوازی اختیاری به طول 2 تا 5 میکرون و عرض 5/0 تا 5/1 میکرون، متحرک و دارای تاژک‌های پری‌تریش[1] است (1). جنس سالمونلا به دو گونه تقسیم می‌شود: سالمونلا انتریکا[2] و سالمونلا بونگوری[3]. سالمونلا انتریکا شامل شش زیرگونه است که عبارتند از: زیرگونۀ انتریکا[4] (زیرگونۀ I)، زیرگونۀ سالامائی[5] (زیرگونۀ II)، زیرگونۀ آریزونی[6] (زیرگونۀ IIIa)، زیرگونۀ دیاریزونی[7] (زیرگونۀ IIIb)، زیرگونۀ هوتنی[8] (زیرگونۀ IV) و زیرگونۀ ایندیکا[9] (زیرگونه VI) که بر اساس ویژگی‌های بیوشیمیایی و نتایج هیبریداسیون DNA-DNA شناسایی شده‌اند (2). پاسخ به تنش در باکتری‌ها دارای اهمیت ویژه‌ای است؛ زیرا زیستگاه آنها در معرض تغییرات مداوم درجه‌حرارت، فشار اسمزی و در‌دسترس‌بودن مواد مغذی قرار دارد؛ برای نمونه، مقدار فعالیت آبی موجود در یک ماده شاخصی برای رشد باکتری در نظر گرفته می‌شود و این فعالیت آبی در محدودۀ صفر (بدون آب دردسترس) تا یک (آب خالص) تعیین می‌شود. فعالیت آبی کم به‌طور طبیعی برای حفظ مواد غذایی از فساد و رشد عوامل بیماری‌زا استفاده می‌شود؛ در نتیجه، باکتری‌ها سیستم‌های تکامل‌یافته‌ای ایجاد کرده‌اند که به آنها اجازه می‌دهد با تغییرات فعالیت آبی محیط‌زیست سازگار شوند. یون‌های پتاسیم[10] و گلوتامات[11] (حلال‌های یونی[12]) و گلایسین[13]، بتائین[14]، ترهالوز[15] و پرولین[16] (حلال‌های غیریونی[17]) مهم‌ترین حلال‌های سازگار با سلول‌های باکتری هستند. اعضای خانوادۀ انتروباکتریاسه[18] گلوتامات و ترهالوز را سنتز می‌کنند و پتاسیم، گلایسین، بتائین و پرولین را از محیط خارج دریافت می‌کنند. تجمع پتاسیم هنگام تنش اسمزی طی پاسخ‌های اولیه اتفاق می‌افتد و سپس با افزایش سنتز گلوتامات همراه می‌شود تا حالت خنثی و پایداری الکترون را در سیتوپلاسم حفظ کند و انباشته‌شدن سایر حلال‌های سازگار مانند گلایسین، بتائین، پرولین و ترهالوز در پی آن رخ می‌دهد. به نظر می‌رسد دمای محیط بر سازوکارهای[19] تجمع حلال‌ها تأثیر می‌گذارد؛ زیرا گزارش شده است تجمع ترهالوز در دمای بیشتر (45 درجۀ سانتی‌گراد) در سالمونلا تیفی‌موریوم[20] افزایش می‌یابد (3). تداخل در تعادل بین تولید زیست‌محیطی گونه‌های اکسیژن فعال[21] (ROS) ازجمله هیدروکسیل (OH-) و پراکسیدهیدروژن (H2O2) و توانایی سیستم‌های زیستی در شناسایی و رفع آنها تنش اکسیداتیو گفته می‌شود. رادیکال‌های بسیار واکنش‌پذیر اکسیژن باعث آسیب اکسیداتیو ماکرومولکول‌ها، پروتئین‌ها، چربی‌ها و DNA می‌شوند که به از‌دست‌رفتن عملکرد، افزایش میزان جهش‌زایی و درنهایت مرگ سلول منجر می‌شود. موجودات زنده دارای سازوکارهای مختلفی در برابر تنش اکسیداتیو هستند که از مهم‌ترین آنها آنزیم‌های کاتالاز[22] و سوپراکسید‌دیسموتاز[23]، پروتئین‌های کوچکی مانند تیوردوکسین[24] و گلوتاردوکسین [25] و نیز مولکول‌هایی شبیه گلوتانین[26] هستند. دو تنظیم‌کنندۀ عمدۀ رونویسی (OxyR و SoxRS) پاسخ ژنتیکی باکتری‌ها در برابر تنش اکسیداتیو را کنترل می‌کنند (4).

ژن‌های ahpکدکنندۀ دو پروتئین هستند که در مجموع، آنزیم آلکیل‌هیدروپراکسید‌ردوکتاز[27] را می‌سازند. حذف ژن ahpدر باکتری‌های اشریشیا کلی و سالمونلا تیفی‌موریوم موجب افزایش حساسیت در برابر پراکسید‌هیدروژن و کشته‌شدن آنها می‌شود (5). آنزیم آلکیل‌هیدروپراکسید‌ردوکتاز و ژن کد‌کنندۀ آن (ahp) در باکتروئیدس فراژیلیس[28] شناسایی شده است. دو قسمت ahp شامل ahpC و ahpFروی یک اپرون قرار دارند و جهش‌یافته‌هایی از این باکتری که ژن‌های ahpCFرا ندارند نسبت به نژاد‌های جهش‌نیافته دارای حساسیت بیشتری به شرایط رشد، جهش‌زا و پراکسیدها هستند (6). همچنین ژن ahpCپروتئین ahpC را در باکتری باسیلوس سوبتلیس[29] کد می‌کند که پروتئین تنش عمومی در پاسخ به حرارت، نمک و ورود باکتری به فاز رشد ثابت است (7). جایگاه ahp در باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم حاوی دو ژن ahpC و ahpF است که به‌ترتیب دو پروتئین C22 و F52a را کد می‌کنند. پروتئین C22 دارای 183 آمینواسید با وزن مولکولی 699/20 دالتون است. پروتئین F52a از 521 آمینو‌اسید طویل تشکیل شده و دارای وزن مولکولی 959/55 دالتون است. توالی آمینواسید پروتئین F52a شباهت زیادی به مولکول تیوردوکسین‌ردوکتاز دارد (8). ژن OxyR تنظیم‌کنندۀ ژن‌های دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی مانند katG (کدکنندۀ کاتالاز)، gor (کدکنندۀ گلوتاتیون‌ردوکتاز) و ahpC-ahpF (کدکنندۀ آلکیل‌هیدروپراکسیدردوکتاز) است که در برابر شوک اکسیداتیو بیان می‌شوند. ژن ahpF در باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم در برابر شوک گرمایی به‌شکل وابسته به OxyR القا می‌شود اما ژنahpF کلون‌شده در باکتری اشریشیا کلی[30]نمی‌تواند در این باکتری یا هنگام ورود به سالمونلا بیان شود (5).

تهاجم سالمونلا تیفی‌موریوم به عوامل تهاجمی مختلف شامل ترشح پروتئین‌های تهاجمی، فلاژله، حرکت و آنتی‌ژن کپسولی Vi بستگی دارد. جایگاه‌های کروموزومی viaA و viaB بیان آنتی‌ژن کپسولی Vi را کنترل می‌کنند. ژن‌های موجود در جایگاه viaB در سالمونلاها شامل ژن‌های tviA، tviB، tviC، tviD، tviE، vexA، vexB، vexC، vexD وvexE هستند (9) که tviB، tviC، tviD و tviEژن‌های ساختاری برای آنتی‌ژن محسوب می‌شوند. تجزیه‌وتحلیل توالی پروتئین نشان می‌دهد ژن tviB یک دهیدروژناز[31]، ژن tviCیک اپیمراز[32]، ژن tviD آنزیم سیتوکروم 450[33]p و ژن tviE یک گلیکوزیل‌ترانسفراز[34] را کد می‌کنند.ژن‌های tviB و tviC یک پلیمر خطی متشکل از ان-استیل‌گالاکتوز‌آمین‌ارونات[35] را کد می‌کنند (10). ژن‌های vexA، vexB و vexCپروتئین‌هایی را کد می‌کنند کهدر انتقال آنتی‌ژن به سطح سلول باکتری دخالت دارند و محکم‌شدن آنتی‌ژن به سطح سلول باکتری به پروتئین vexEوابسته است. ژن tviA نقش تنظیمی برای بیان آنتی‌ژن Vi دارد و اختلال ژن tviA در کروموزوم سالمونلا به‌شدت موجب کاهش بیان آنتی‌ژن Vi می‌شود. مشخص شده است بیان ژن tviA در پاسخ به شرایط اسمزی بالااتفاق می‌افتد (9). ازآنجاکه اطلاعات چندانی در زمینۀ میزان کمّی بیان ژن‌های اصلی مسئول پاسخ به تنش‌های اکسیداتیو و اسمزی در سالمونلاها وجود ندارد، هدف مطالعۀ حاضر ارزیابی تغییرات کمّی ناشی از تنش‌های اسمزی و اکسیداتیو بر بیان ژن‌های tviA و ahpF در سالمونلا انتریکا PTCC 1230 است.

مواد و روش‌ها

ویال لیوفیلیزۀ سالمونلا انتریکا PTCC 1230 از مرکز کلکسیون باکتری‌های صنعتی عفونی سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران تهیه شد. ویال لیوفیلیزۀ باکتری در محیط آگار خون‌دار[36] در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 24 ساعت کشت داده شد و سپس به محیط آگارمغذی منتقل و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجۀسانتی‌گراد گرماگذاری شد.

رسم منحنی رشد:برای رسم منحنی رشد سالمونلا انتریکا PTCC 1230، ابتدا سوسپانسیون باکتریایی با کدورت معادل نیم مک‌فارلند از کشت آگارمغذی تهیه شد و 300 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه‌شده به ارلن 100 میلی‌لیتری حاوی 75 میلی‌لیتر محیط آبگوشت‌مغذی[37] تلقیح شد؛ سپس ارلن حاوی باکتری به‌مدت 20 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد روی دستگاه شیکر انکوباتور با چرخش 150 دوردردقیقه قرار گرفت. جذب نوری[38] نمونه در فواصل یک‌ساعته با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر خوانده و منحنی رشد باکتری رسم شد.

آماده‌سازی سالمونلا انتریکا PTCC 1230 برای بررسی تنش: 300 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی با کدورت نیم مک‌فارلند در دو ارلن 100 میلی‌لیتری حاوی 75 میلی‌لیتر آبگوشت‌مغذی تلقیح شد و گرماگذاری در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 9 ساعت تا رسیدن رشد باکتری به میانۀ فاز نمایی ادامه یافت؛ سپس 6 میلی‌لیتر از هر ارلن به داخل 6 میکروتیوب ریخته شد (در مجموع 12 میکروتیوب که هریک حاوی 1 میلی‌لیتر محیط یادشده بودند). برای دستیابی به جمعیت همگن باکتریایی، میکروتیوب‌ها به‌مدت نیم ساعت در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد با چرخش8000 دوردردقیقه سانتریفیوژ وسلول‌های باقیمانده با محلول نمک فسفات بافری[39] (PBS) شستشو شدند.

اعمال تنش اسمزی: برای القای تنش اسمزی با غلظت‌های 6، 8، 10، 12 و 14 درصد (وزنی/حجمی) نمک سدیم‌کلراید، در 6 لولۀ آزمایش 5 میلی‌لیتر محیط آبگوشت‌مغذی ریخته شد و سپس به 5 لوله به‌ترتیب 3/0، 4/0، 5/0، 6/0 و 7/0گرم نمک اضافه شد و یک لوله بدون اضافه‌کردن نمک محیط شاهد در نظر گرفته شد. سلول‌های باکتری حاصل از مرحلۀ پیش به میزان حجمی یکسان (معادل 100 میکرولیتر) با غلظت‌های مختلف سدیم‌کلراید صفر، 6، 8، 10، 12 و 14 درصد مجاور و به مدت دو ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد روی دستگاه شیکر انکوباتور با چرخش 150 دوردردقیقه قرار گرفتند. برای به‌دست‌آوردن سلول‌ها، سانتریفیوژ در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد با چرخش 8000 دوردردقیقه به‌مدت نیم ساعت انجام و رسوب باکتری با محلول نمک فسفات بافری (PBS) شستشو شد. 100 میکرولیتر بقایای سلولی باقیمانده از سانتریفیوژ در ارلن‌های حاوی 75 میلی‌لیتر آبگوشت‌مغذی تلقیح و گرماگذاری به‌مدت 18 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد. جذب نوری نمونه‌ها در فواصل یک‌ساعته با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر خوانده شد (11).

اعمال تنش اکسیداتیو:آب‌اکسیژنه با غلظت‌های صفر (شاهد)، 1200، 2400، 4800، 6000 و 7200 پی‌پی‌ام برای القای تنش اکسیداتیو استفاده شد. سلول‌های باکتریایی حاصل از مرحلۀ قبل به میزان حجمی یکسان (معادل 100 میکرولیتر) در مجاورت غلظت‌های مختلف آب‌اکسیژنه به‌مدت 2 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد روی دستگاه شیکر انکوباتور با چرخش 150 دوردردقیقه قرار گرفتند. پس‌از 2 ساعت، سانتریفیوژ در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد و چرخش 8000 دوردردقیقه به‌مدت نیم ساعت انجام و رسوب باکتری با محلول نمک فسفات بافری (PBS) شستشو شد. 100 میکرولیتر بقایای سلولی حاصل از سانتریفیوژ در ارلن‌های حاوی 75 میلی‌لیتر مایع مغذی تلقیح و گرماگذاری در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد. جذب نوری نمونه‌ها در فواصل یک‌ساعته با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر خوانده شد (11).

.انتخاب قطعه‌های ژنی و تهیه آغازگر[40]های مناسب:در مطالعۀ حاضر، ژن‌های tviA و ahpF ژن هدف و ژن 16S rRNA ژن مرجع انتخاب شدند. طراحی آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی برای این سه ژن یادشده بر اساس توالی موجود در پایگاه داده های NCBI[41] انجام شد (11).

 

 

جدول 1- توالی آغازگرهای طراحی‌شده برای ژن‌های هدف و مرجع

نام ژن

نوع الیگو

ترتیب توالی

دمای ذوب

(درجۀ سانتی‌گراد)

درصد GC

طول آغازگر (جفت باز)

tviA

جلویی

5'-TCCTGAAGCTCTTCCATACC-3'

3/55

50

20

tviA

برگشتی

5'-TTCGATGCGGCAACAT-3'

1/53

50

16

ahpF

جلویی

5'-AGCTCAGGGCTTACCTTG-3'

2/55

6/55

18

ahpF

برگشتی

5'-GGAAAGACGGCTTGC-3'

9/50

60

15

16S rRNA

جلویی

5'-ATCCAACCGCAGGTTC-3'

53

56

16

16S rRNA

برگشتی

5'-TGCCACGGTGAATACG-3'

50

56

16

 


آماده‌سازی آغازگرها (رقیق‌سازی):رقیق‌سازی آغازگرهای لیوفیلیزه tviA-F، tviA-R، ahpF-F و ahpF-R برای رسیدن استوک اصلی به غلظت 100 پیکومولار بر میکرولیتر یا 100 میکرومولار به‌ترتیب با افزودن 5/112، 6/131، 6/120 و 6/135 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز[xlii] انجام شد. سپس استوک کاری به غلظت 10 میکرومولار با افزودن 45 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز به 5 میکرولیتر از استوک اصلی هر آغازگر تهیه شد.

استخراج RNA: استخراج RNA با استفاده از کیت (Favorgen BiotecCrop., Taiwan) و به روش سمبورک (12) طبق مراحل زیر انجام شد: ابتدا نمونه‌ها به‌مدت 2 دقیقه با چرخش 12000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند؛ پس‌از دور‌ریختن مایع رویی، 100 میکرولیتر محلول واکنش لیزوزیم به هر نمونه اضافه و به‌خوبی با پیپت ادغام شد؛ نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد حرارت داده شدند؛ 350 میکرولیتر RB Buffer به هر نمونه اضافه شد؛ پس‌از انجام سانتریفیوژ، 400 میکرولیتر از فاز رویی به میکروتیوب انتقال یافت و اتانول 70 درصد با حجم مساوی به آن اضافه شد و به کمک همزن با یکدیگر ادغام شدند؛ برای هر نمونه یک عدد RB Mini Column در لوله‌های Collection tube گرفت و پس‌از‌آن، 750 میکرولیتر محلول حاصل از مراحل قبل به ستون RB انتقال یافت و به‌مدت 5/1 دقیقه با چرخش 12000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد؛ پس‌از دورریختن مایع رویی، 500 میکرولیتر Wash Buffer1 اضافه و سانتریفیوژ انجام شد؛ پس‌از دورریختن مایع رویی، 750 میکرولیتر Wash Buffer2 اضافه شد و پس‌از سانتریفیوژ و دورریختن مایع رویی، ستون RB برای خشک‌شدن کامل در Collection tube جدید قرار گرفت و به‌مدت 5/3 دقیقه با چرخش 12000 دور‌در‌دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد؛ ستون RB درون Elution tube قرار گرفت و 50 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز در مرکز ستون RB افزوده شد؛ پس‌از گذشت یک دقیقه، سانتریفیوژ به‌مدت 5/1 دقیقه با چرخش 12000 دوردردقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد انجام و RNA در دمای منفی 70 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.

سنتز cDNA: به این منظور از کیت (یکتا تجهیز آزما، ایران) طبق دستورعمل شرکت سازنده استفاده شد. ابتدا رقیق‌سازی آغازگر‌های لیوفیلیزه (dt) Oligo و Random Hexamer به‌ترتیب با افزودن 96/60 و 48/184 میکرولیتر آب تیمار‌شده با دی‌اتیل‌پیروکربنات[xliii] انجام شد. مخلوط RNA-primer با حجم کل 4/13 میکرولیتر شامل 4/9 میکرولیتر آب تیمار‌شده با دی‌اتیل‌پیروکربنات، 2 میکرولیتر RNA، 1 میکرولیتر (dt) Oligo و 1 میکرولیتر Random Hexamer آماده و به‌مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد در ترموسایکلر گرماگذاری شد. مخلوط سنتز cDNA با حجم کل 5/6 میکرولیتر شامل 4 میکرولیتر first-strand buffer، 1 میکرولیتر dNTPs، 1 میکرولیتر M-MLV و 5/0 میکرولیتر RNasin آماده و به مخلوط RNA-primer اضافه شد؛ سپس به‌مدت 1 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد برای Random Hexamer و 30 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی‌گراد برای (dt) Oligo در بنماری گرماگذاری شد. برای پایان‌دادن به واکنش، نمونه به‌مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد در ترموسایکلر گرماگذاری و در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.

واکنش Real-Time PCR:واکنش Real-Time PCR در دستگاه مدل EcoTM Real-Time (شرکت ایلومینا[xliv]، آمریکا) انجام شد. برای واکنش تکثیری درون هر چاهک از پلیت 48خانه‌ای، مخلوطی به حجم 20 میکرولیتر متشکل از 10 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز، 6 میکرولیتر مخلوط واکنشی سایبرگرین[xlv]، 2 میکرولیتر DNA الگو و 1 میکرولیتر آغازگرهای اختصاصی هر ژن تهیه شد. برنامۀ زمانی و دمایی واکنش در سه مرحله انجام شد: مرحلۀ اول در یک چرخه به‌منظور فعال‌سازی آنزیم تک‌پلیمراز شروع داغ[xlvi] و واسرشت‌سازی اولیۀ [xlvii]DNA الگو در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه؛ مرحلۀ دوم به‌شکل متناوب طی40 چرخه واسرشت‌سازی در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 ثانیه و اتصال[xlviii] و گسترش[xlix] در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه؛ مرحلۀ سوم اعمال چرخه با دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 15 ثانیه، 60 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 15ثانیه به‌منظور رسم منحنی.

 

نتایج.

شکل 1 منحنی رشد سالمونلا انتریکا را در محیط مایع مغذی نشان می‌دهد. با‌توجه‌به شکل، زمان فاز نمایی رشد از ساعت 2 شروع و تا ساعت 14 ادامه می‌یابد؛ بنابراین امکان بررسی آثار تنش‌های اسمزی و اکسیداتیو در این محدودۀ زمانی وجود دارد.

شکل 3 بیان ژن ahpF را در حضور تنش اکسیداتیو نشان می‌دهد. میزان ct بیان این ژن در شرایط تنش اکسیداتیو7200 پی‌پی‌ام برابر عدد 9 است که نسبت به ct بیان این ژن در معرض غلظت 6000 پی‌پی‌ام و ct بیان ژن مرجع به‌ترتیب 8/1 و 5/2 برابر بیشتر است.

 

شکل 1- منحنی رشد سالمونلا انتریکا PTCC 1230 در محیط‌کشت مایع مغذی

 

 

شکل 2- منحنی استاندارد غلظت cD NA برای Real-time PCR

 

 

شکل 3- بیان ژن ahpFدر حضور تنش اکسیداتیو

 

شکل 4 بیان ژن tviA را در حضور تنش اسمزی نشان می‌دهد. با‌توجه‌به شکل، میزان ct بیان این ژن در شرایط تنش 14درصد سدیم‌کلراید برابر عدد 10 است که نسبت به شرایط تنش 10 درصد و ژن مرجع به‌ترتیب 3/1 و 5/1 برابر بیشتر است.

شکل 5 مقایسۀ بیان ژن‌های ahpF و tviAنسبت به ژن مرجع 16S rRNA را نشان می‌دهد. این مقایسه حاصل تقسیم مقدار عددی ct ژن هدف بر ct ژن مرجع است.

 

 

شکل 4- بیان ژن tviA در حضور تنش اسمزی

 

 

شکل 5- مقایسۀ بیان ژن‌های ahpF و tviAنسبت به ژن مرجع 16SrRNA انحراف معیار SD± با P value=0.009 است.

 

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، میزان تغییر بیان ژن‌های tviA و ahpF در باکتری سالمونلا انتریکا PTCC 1230 ناشی از تنش‌های اسمزی و اکسیداتیو با روش Real-Time PCR بررسی شد. با‌توجه‌به شکل 1 فاز نمایی رشد از ساعت 2 آغاز شد و تا ساعت 14 ادامه یافت؛ ساعت 9 منحنی رشد، نیمه‌فاز نمایی برای بررسی اثر شرایط تنش انتخاب شد. برای بررسی میزان بیان ژن‌ها بر اساس میزان cDNA ساخته‌شده از روی mRNA در Real-time PCR از منحنی استاندارد (شکل 2) استفاده شد. میزان ct برای بیان ژن ahpFدر غلظت 7200 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه برابر عدد 9 و برای غلظت 6000 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه و ژن مرجع به‌ترتیب 17و 25 بود. ازآنجاکه هرچه میزان عددی ct کمتر باشد میزان بیان بیشتر است، بیشترین میزان بیان ژن ahpF در غلظت 7200 پی‌پی‌ام آب‌اکسیژنه مشاهده می‌شود (شکل 3).

در سالمونلا انتریکا PTCC 1230 بیان ژن tviA که در اصل نقش تنظیمی برای بیان آنتی‌ژن Vi کپسولی دارد در شرایط افزایش تنش اسمزی افزایش می‌یابد و اختلال در بیان این ژن موجب حساسیت در برابر فشار اسمزی می‌شود. بر اساس نتایج پژوهش حاضر، بیان ژن tviA پس‌از اعمال تنش اسمزی افزایش یافت. میزان عددیct  به‌دست آمده در شرایط 14 و 10 درصد سدیم‌کلراید به‌ترتیب 10 و 13 است که این میزان بیان نسبت به ژن مرجع به‌ترتیب 5/1 و 3/1 برابر بیشتر است (شکل 4). شکل 5 مقایسۀ بیان ژن‌های ahpF و tviAنسبت به ژن مرجع 16S rRNAرا در باکتری سالمونلا انتریکا PTCC 1230 نشان می‌دهد. این مقایسه بر اساس تقسیم ct به‌دست‌آمده برای ژن هدف بر ct ژن مرجع طی انجام واکنش انجام شد که با نتایج منحنی‌های بیان Real-time PCR بر خط آستانه مطابقت دارد. اسپنسر[l]و کوگوما[li]در سال 1991 پاسخ تنش اکسیداتیو در سالمونلا تیفی‌موریوم را بررسی کردند. نتایج بررسی آنها نشان دادند بیان ژن‌های katG و ahpF در این باکتری در شرایط تنش اکسیداتیو افزایش می‌یابد و بسیاری از راه‌های متابولیسمی -نه همۀ آنها- در نتیجۀ تنش اکسیداتیو تغییر می‌کنند (5).

هکر[lii] و همکاران در سال 1996 پاسخ‌های تنش اکسیداتیو را در باسیلوس سوبتیلیس بررسی کردند. نتایج بیان 3 تا 4 برابری mRNA ژن آلکیل‌هیدروپراکسید را پس‌از تنش گرما، نمک یا گرسنگی گلوکز و بیان 20 برابری آن را در شرایط تنش اکسیداتیو نشان داد (7).

میاموتو[liii] و همکاران در سال 2005 سالمونلا انتریتیدیس[liv] آسیب‌دیده با تنش گرمایی را مطالعه کردند. نتایج آنها نشان دادند بیان 19 ژن مرتبط با گرما clpB، clpX، degP، dnaJ، fkpA، ftsJ، gapA،hflB، hslJ، hslU، hslV، htpG، htrA، lon، mopA، mopB، mreB، rpoE و ppiD و 12 ژن مرتبط با تنش اکسیداتیو ahpC، ahpF، fldB، fur، grxA، dinF، katG، mutM، recA، soxR، trxC و zwf در سلول‌های بهبود‌یافته افزایش می‌یابد (13).

فونگسیسای[lv] و همکاران در سال 2007 بیان ژن htrBرا بررسی کردند که در سالمونلا تیفی‌موریوم و کمپیلوباکتر ژژونی[lvi]در شرایط سخت بیان می‌شود. نتایج آنها نشان دادند این ژن نقش اساسی در پاسخ به شرایط نامساعد بر عهده دارد و حذف آن در نتیجۀ جهش برای باکتری کشنده است (14).

ازاکی[lvii] و همکاران در سال 2007 بیان ژن در سالمونلا انتریکا سرووار تیفی را طی تنش اسمزی بالا بررسی کردند. نتایج آنها نشان دادند پس‌از تنش اسمزی میزان بیان 10 ژن مرتبط با آنتی‌ژن بیماری‌زایی (tviA، tviB، tviC، tviD،tviE، vexA، vexB، vexC، vexD و vexE) به‌وضوح کاهش می‌یابد و میزان بیان این ژن‌ها در شرایط اسمزی پایین 3 تا 10 برابر بیشتر از شرایط اسمزی بالا است. نتایج یادشده نشان دادند تمام ژن‌های بیماری‌زا بلافاصله پس‌از تغییر اسمزی تغییر می‌کنند (15). زینمین[lviii] و همکاران در سال 2010 بیان ژن tviAدر سالمونلا انتریکا سرووار تیفی را در شرایط تنش اسمزی بالا بررسی کردند. نتایج آنها نشان دادند بیان این ژن در شرایط افزایش تنش اسمزی سرکوب می‌شود (16).

در پژوهش حاضر بیان ژن tviAدر حضور غلظت‌های زیاد نمک افزایش یافت و با‌توجه‌به اینکه مدت تیمار سویۀ باکتری با غلظت‌های مختلف نمک 2 ساعت بود به نظر می‌رسد این زمان موجب افزایش میزان بیان ژن tviAدر باکتری سالمونلا انتریکا PTCC 1230 شود.

کاسترزینسکا[lix] و همکاران در سال 2015 تأثیر تنش اکسیداتیو بر بیان ژن تولیدکنندۀ شیگاتوکسین را در سویه‌های اشریشیا کلی (STEC) O157:H7 و non-O157 بررسی کردند. بر اساس نتایج آنها بیان این ژن در بسیاری از سویه‌ها کاهش یافت، stx1و stx2به‌طور درخور توجهی در اشریشیا کلی (STEC) O157:H7 بیان شدند و سایر سویه‌ها افزایش ناچیزی در بیان stx1نشان دادند (17).

سیرسات[lx] و همکاران در سال 2015 بیان ژن مرتبط با شوک حرارتی را در سالمونلا تیفی‌موریوم در شرایط تنش حرارتی 48 درجۀ سانتی‌گراد بررسی کردند؛ نتایج آنها نشان دادند بیان ژن‌های rpoE، rpoS و rpoHافزایش می‌یابد (18). با‌توجه‌به نتایج پژوهش حاضر بیان دو ژن ahpFو tviAدر شرایط تنش‌های اکسیداتیو و اسمزی افزایش می‌یابد و بررسی در زمینۀ ژن‌های دیگر در پاسخ به تنش‌های محیطی پیشنهاد می‌شود.

 

سپاسگزاری

از حمایت‌های حوزۀ معاونت پ‍‍‍ژوهش و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان و سرکار خانم دکتر محدثه محسن‌پور برای یاری‌های ارزنده‌شان طی پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌شود.



[1]- Peritrichous flagella

[2]- Salmonella enterica

[3]- Salmonella bongori

[4]- enterica

[5]- salamae

[6]- arizonae

[7]- diarizonae

[8]- houtenae

[9]- indica

[10]- Potassiumions (K+)

[11]- glutamate

[12]- Ionic solutes

[13]- Glycine

[14]- Betaine

[15]- Trehalose

[16]- Proline

[17]- Non ionic solutes

[18]- Enterobacteriaceae family

[19]- Mechanism

[20]- Salmonella typhimurium

[21]- Reactive oxygen species

[22]- Catalase

[23]- Superoxide dismutase

[24]- Thioredoxin

[25]- Glutaredoxin

[26]- Glutathione

[27]- Alkyl hydroperoxide reductase

[28]- Bacteroidesfragilis

[29]- Bacillus subtilis

[30]- Escherichia coli

[31]- Dehydrogenase

[32]- Epimerase

[33]- Cytochrome P450

[34]- Glycosyltransferases

[35]- N-Acetylgalactosamineuronate

[36]- Blood agar

[37]- Nutrient Broth

[38]- Optical Density

[39]- phosphate buffered saline solution

[40]- Primer

[41]- National Center for Biotechnology Information

[xlii]- Water, nuclease-free

[xliii]- DEPC Water

[xliv]- Illumina

[xlv]- SYBER Green Mastermix

[xlvi]- Hot start Taq polymerase

[xlvii]- Initial Denaturation

[xlviii]- Anneal

[xlix]- Extend

[l]- Spencer

[li]- Kogoma

[lii]- Hecker

[liii]- Miyamoto

[liv]- Salmonella enteritidis

[lv]- Phongsisay

[lvi]- Campylobacter jejuni

[lvii]- Ezaki

[lviii]- Xinmin

[lix]- Kostrzynska

[lx]- Sirsat

References

(1)              Andino A., Hanning I. Salmonella enterica: survival, colonization, and virulence differences among serovars. The Scientific World Journal 2015; 1-17.

(2)              Dieckmann R., Helmuth R., Erhard M., Malorny B. Rapid classification and identification of Salmonellae at the species and subspecies levels by whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology 2008; 74(24): 7767-7778.

(3)              Capozzi V., Fiocco D., Amodio ML., Gallone A., Spano G. Bacterial stressors in minimally processed food. International Journal of Molecular Sciences 2009; 10: 3076-3105.

(4)              Kashmiri ZN., Mankar SA. Free radicals and oxidative stress in bacteria. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 2014; 3(9): 34-40.

(5)              Spencer F., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiological Reviews 1991; 55(4): 561-585.

(6)              Rocha E., Smith J. Role of the alkyl hydroperoxide reductase (ahpCF) gene in oxidative stress defense of the obligate anaerobe Bacteroides fragilis. Journal of Bacteriology 1999; 181(18): 5701-5710.

(7)              Antelmann H., Engelmann S., Schmid R., Hecker M. General and oxidative stress responses in Bacillus subtilis: cloning, expression, and mutation of the alkyl hydroperoxide reductase operon. Journal of Bacteriology 1996; 178(22): 6571-6578.

(8)              Tartaglia L., Storz S., Brodsky M., Lai A., Ames M. Alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium. The Journal of Biological Chemistry 1990; 265(18): 10535-10540.

 

(9)              Virlogeux I., Waxin H., Ecobichon C., Popoff M. Role of the viaB locus in synthesis, transport and expression of Salmonella typhi Vi antigen. Microbiology 1995; 141: 3039-3047.

(10)          Zhang H., Zhou Y., Bao H., Liu W. Vi antigen biosynthesis in Salmonella typhi: characterization of UDP-N-acetylglucosamine C-6 dehydrogenase (TviB) and UDP-N-acetylglucosaminuronic acid C-4 epimerase (TviC). Biochemistry 2006; 45(26): 8163-8173.

(11)          Ghasemi MF., Moslem MN., Mirpour M. Effect of environmental stresses on growth pattern, biofilm formation and biochemical characteristics of Mycobacterium marinum CCUG20998. Zahedan Journal of Research in Medical Sciences 2016; 18(9): e2664.

(12)          Sambrook J., Rusell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 2011.

(13)          Kobayashi H., Miyamoto T., Hashimoto Y., Kiriki M., Motomatsu A., Honjoh K., et al. Identification of factors involved in recovery of heat-injured Salmonella Enteritidis. Journal of Food Protection 2005; .68(5): 932-941.

(14)          Phongsisay V., Perera V., Fry B. Expression of the htrB gene is essential for responsiveness of Salmonella typhimurium and Campylobacter jejuni to harsh environments. Microbiology 2007; 153: 254-62.

(15)          Huang X., Xu H., Sun X., Ohkusu K., Kawamura T., Ezaki T. Genome-wide scan of the gene expression kinetics of Salmonella enterica Serovar Typhi during hyperosmotic stress. International Journal of Molecular Sciences 2007; 8: 116-135.

(16)          Xinmin X., Anping L., Hong D., Xiumei S., Haifang Z., Shungao X., et al. Expression of tviA is transiently repressed by Hfq in Salmonella enterica serovar Typhi at hyperosmotic stress. Microbial Pathogenesis 2010; 49: 54-57.

(17)          Mei G., Tang J., Carey C., Bach S., Kostrzynska M. The effect of oxidative stress on gene expression of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157:H7 and non-O157 serotypes. International Journal of Food Microbiology 2015; 215: 7-15.

(18)          Sirsat S., Baker C., Park S., Muthaiyan A., Dowd S., Ricke S. Transcriptomic response of Salmonella Typhimurium heat shock gene expression under thermal stress at 48 °C. Journal of Food Research 2015; 4(5): 51-56.