مقایسه عوامل رشد، ترکیب شیمیایی، پروفایل اسیدهای چرب، مقدار کلروفیل و کاروتن کل دو گونه جلبکی سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار اکولوژی آبزیان، پژوهشکده مطالعه‌های دریاچه ارومیه، دانشگاه ارومیه، ایران

2 دانشجوی دکتری تکثیر و پرورش آبزیان، پژوهشکده آرتمیا و آبزی‌پروری، دانشگاه ارومیه، ایران

چکیده

مقدمه: جلبک‌ها سرشار از مواد معدنی، ویتامین و دیگر مواد مغذی هستند و برای تولید انواع مختلف مواد خام مفید استفاده می‌شوند. از این رو، روش‌های مختلفی برای افزایش تولید به کار برده می‌شوند.
مواد و روش‏‏ها: تـأثیر دی‌اکسید‌کربن با غلظت 10 درصد بر عوامل رشد، ترکیب شیمیایی، پروفایل اسیدهای چرب، مقدار کلروفیل و کاروتن کل دو گونه جلبکی سندسموس آبلیکوس (Scenedesmus obliquusهماتوکوکوس پلوویالیس (Haematocuccus pluvialis) بررسی و مقایسه شد.
نتایج: بر اساس نتایج، مقدار پروتئین تولیدشده در جلبک سندسموس به‌مراتب بیشتر از هماتوکوکوس پلوویالیس و به‌ترتیب برابر 79/16 و 16/9 درصد بود (05/0P<). بر عکس، میزان چربی کل تولیدشده در هماتوکوکوس پلوویالیس نسبت به سندسموس آبلیکوس بیشتر بود (05/0>P). همچنین مقادیر اسیدهای چرب اشباع تولیدشده در هماتوکوکوس پلوویالیس به‌طور معناداری بیشتر از سندسموس آبلیکوس بودند و به‌ترتیب 93/30 و 51/23 درصد اندازه‌گیری شدند (05/0>P). مقدار کلروفیل a و کاروتن کل در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس به‌طور معناداری بیشتر از سندسموس آبلیکوس اندازه‌گیری شد (05/0>P). در انتهای روز 20 پرورش، مقدار توده زیستی بیشتری در جلبک سندسموس آبلیکوس نسبت به هماتوکوکوس پلوویالیس تولید شده بود (05/0>P).
بحث و نتیجه‏گیری: وجود گاز دی‌اکسید‌کربن در محیط سبب شد سندسموس آبلیکوس از این شرایط برای تولید توده زیستی کل بیشتر (18/0 گرم بر لیتر وزن خشک) استفاده کند، هرچند تفاوت معناداری در مقدار توده زیستی کل با جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس (17/0 گرم بر لیتر وزن خشک) مشاهده نشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Comparison of growth factors, chemical composition, fatty acid profiles, chlorophyll content and total carotene of Scenedesmus obliqus and Hematococcus pluvialis

نویسندگان [English]

  • Behrooz Atashbar 1
  • Saeid Vahdat 2
1 Assistant Professor of Aquatic Ecology, Department of Ecology and Resource assessment, Urmia Lake Research Institute, Urmia University, Iran
2 Ph.D. student of Aquaculture, Department of Biology and Aquaculture, Artemia and Aquaculture Research Institute, Urmia University, Iran
چکیده [English]

Introduction:The algae are rich in minerals, vitamins, and in other nutrients and they are cultivated in order to produce valuable raw materials.
Materials and methods: In this regard, the effect of 10% carbon dioxide concentration on growth factors, chemical composition, fatty acids profile, chlorophyll and carotene of two species Scenedesmus oblique and Haematocuccus pluvialis were studied.
Results: Based on the results, the protein content was significantly higher in the S. oblique compared to the H. pluvialis (16.79% and 9.16%, respectively) (P<0.05). In contrast, the total lipid production was significantly higher in the H. pluvialis compared to the S. oblique (P<0.05). The saturated fatty acids percentage was significantly higher in the H. pluvialis in comparison to S. oblique (30.93% and 23.51%, respectively) (P<0.05). Also, the amount of chlorophyll a and total carotene was measured in the H. pluvialis significantly higher than the S. oblique (P<0.05). At the end of 20 days of the cultivation, the amount of biomass in the H. pluvialis was significantly higher than that produced at S. oblique (P<0.05).
Discussion and conclusion: Although the presence of CO2 caused S.obliquus use the conditions for more production of biomass (0.18 g.L-1 DW), significant difference in biomass with H.pluvialis (0.17 g.L-1 DW) was not observed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Carbon dioxide
  • Haematocuccus pluvialis
  • Scenedesmus oblique Fatty acid profile and Chlorophyll

مقدمه

ریزجلبک‌ها بیشترین سرعت رشد را در بین گیاهان کره زمین دارند و رشد آنها حدود 10 تا 15 بار سریع‌تر از گیاهان خشکی‌زی است و مقادیر دی‌اکسیدکربن بیشتری را تثبیت می‌کنند (1). همچنین جلبک‌ها در پسآب‌ها رشد می‌کنند و مشکلات آلودگی آب‌ها را کاهش می‌دهند (2). توده زیستی که ریزجلبک‌ها تولید می‌کنند به محصولات باارزش بسیاری مانند سوخت‌های زیستی، مواد افزودنی غذایی، محصولات بهداشتی، مواد آرایشی و ... تبدیل می‌شوند و این، توانایی زیاد ریزجلبک‌ها در کاهش دی‌اکسیدکربن را نشان می‌دهد (3).

نور، دما، دی‌اکسید‌کربن، اسیدیته، اکسیژن، شوری، مواد غذایی و مواد سمی موجود در محیط از عوامل محیطی غیرزنده و باکتری‌ها، قارچ‌ها، ویروس‌ها و رقابت با دیگر جلبک‌ها از عوامل محیطی زنده مؤثر بر رشد ریزجلبک‌ها هستند (4). رشد، بازدهی و تولید توده زیستی در ریزجلبک‌ها تابعی از شدت نور و طول دوره روشنایی/تاریکی محیط است (5). اگرچه شدت نور در محیط‌های طبیعی به‌طور متناوب تغییر می‌کند و ویژگی‌های آن در طول روز ثابت نیستند و بر ترکیب شیمیایی جلبک‌ها تأثیر می‌گذارند، عامل محدودکننده‌ای در محیط‌های باز مانند استخرها محسوب نمی‌شود (5). جذب موثر گاز دی‌اکسید‌کربن توسط ریزجلبک‌ها و همچنین تولید چربی، محتوای چربی (از نظر اسیدهای چرب) و مقاومت به سطوح مختلف دی‌اکسید‌کربن (6 و 7) به ارزیابی‌های وسیعی نیاز دارند.

هماتوکوکوس پلوویالیس، جلبکی تک‌سلولی، دوتاژکی و سبزرنگ است که در شرایط شدت نور کم (8 و 9) و محیط اشباع از مواد مغذی (10) به‌شکل بهینه رشد می‌کند. مطالعه‌های بسیاری درباره ساخت و فعالیت‌های زیستی اسیدهای چرب و آستاگزانتین در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس انجام شده‌ است (10-13). همچنین، در بررسی‌های گوکسان و کیک (2011)[1] (14) درباره عوامل رشد، مقدار کلروفیل و کاروتنوئید، این عوامل متأثر از شدت و دوره نوری، محیط‌کشت و مدت زمان هوادهی بودند.

جلبک سندسموس انواع مختلف سوخت‌های زیستی مانند بیوهیدروژن، بیودیزل، بیواتانول و ذره‌های سوختی را تولید می‌کند، هرچند بیشتر پژوهش‌ها درباره استفاده از سندسموس برای تولید بیودیزل بوده است (15). همچنین، این جلبک آمونیاک و فسفر را از محیط حذف می‌کند (16) و در آبزی‌پروری، برای تغذیه موجودات غذایی زنده‌ای استفاده می‌شود که ماهیان مصرف می‌کنند. این جلبک با کوددهی استخرهای خاکی ماهیان گرمابی رشد می‌کند و لارو ماهیان و ماهیان فیتوپلانکتون‌خوار آن را استفاده می‌کنند (17) اسیدهای چرب با زنجیره C16-C18 رایج‌ترین ترکیبات اسید چرب لازم برای استفاده در صنعت بیودیزل هستند (18). بررسی‌ها نشان داده‌اند سرعت رشد، ترکیب شیمیایی، پروفایل اسیدچرب و تولید کارتنوئید در این جلبک متأثر از عوامل محیطی هستند (19 و 20).

سالانه افزایش 5/6 درصدی گاز دی‌اکسیدکربن در اتمسفر به افزایش آلودگی و گرمایش جهانی منجر می‌شود (21) و از این رو، پژوهش‌های بسیاری با هدف بررسی توانایی حذف زیستی دی‌اکسید‌کربن از اتمسفر انجام شده‌اند (22 و 23). همچنین آثار افزایشی غلظت این گاز روی ترکیب شیمیایی، رشد، پروفایل اسیدهای چرب جلبک‌ها بررسی شده‌ است (6). در پژوهش حاضر، تأثیر گاز دی‌اکسیدکربن بر شاخص‌های رشد، اسیدهای چرب و ترکیب شیمیایی دو گونه مختلف جلبک Scenedesmus obliquusوHaematocuccus pluvialis مطالعه شده است.

 

مواد و روش‌ها

کشت جلبک:استوک خالص جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس و سندسموس آبلیکوس از پژوهشکده مطالعه‌های دریاچه ارومیه، دانشگاه ارومیه، ایران تهیه و پرورش جلبک در ظرف‌های 200 لیتری و با استفاده از محیط‌کشت 3NBBM انجام شد (24). ذخیره‌سازی ابتدایی جلبک در ظرف‌ها با تراکم 104×5 سلول در میلی‌لیتر (مقدار توده زیستی جلبک‌های هماتوکوکوس و سندسموس به‌ترتیب برابر 0041/0 و 0042/0 میلی‌گرم بر لیتر بود) انجام شد. شرایط اولیه پرورش برای هر دو گونه جلبک به‌ترتیب عبارتند از: اسیدیته 5/8، دما 1±21 درجه سانتی‌گراد، نور سرد با شدت نوری 3500 لوکس، دوره نوری 24 ساعت روشنایی. تمام تیمارها، روزانه 12 ساعت در معرض گاز دی‌اکسید‌کربن 10 درصد قرار داده شدند. هر یک از ظرف‌ها با پیپت فیلتردار، شدید و مستمر هوادهی شد (مقدار هوادهی برابر 758 میلی‌لیتر در دقیقه بود). هر روز دما، اسیدیته، تراکم سلولی و غلظت جلبکی در محیط‌های پرورشی اندازه‌گیری شدند. برای هر گونه جلبکی، سه تکرارانجام شد.

اندازه‌گیری رشد سلولی:تراکم سلول جلبکی با اندازه‌گیری تراکم بهینه (OD570) انجام شد. نمونه‌های غلیظ (بیشتر از یک) رقیق‌‌‌سازی شدند تا در محدوده 1/0 تا 0/1 قرار گیرند. رابطه بین OD570 و توده زیستی از رابطه‌های زیر محاسبه شد:

رابطه 1:

Biomass (g.L-1) Scenedesmus =0.34 * OD570nm – 0.0146 R2 = 0.990

Biomass (g.L-1) Haematococcus = 0.156 * OD570nm + 0.0061 R2 = 994

بازدهی توده زیستی (گرم بر لیتر در روز) از اختلاف غلظت توده زیستی (گرم بر لیتر) تقسیم بر محدوده زمانی مشخص (روز) براساس رابطه 2 محاسبه شد (25):

رابطه 2:

Ps (g.L-1.d-1) = (X1 – X0) / (T1 – T0)

نرخ رشد ویژه (d-1) از رابطه 3 محاسبه شد:

رابطه 3:

μ = (ln X1 – ln X0) / (T1 – T0)

همچنین مقدار تقسیم بر روز و مدت زمان دو برابر شدن از رابطه‌های 4 و 5 محاسبه شدند:

رابطه 4:

Divisions per day (day-1)= μ/0.6931

رابطه 5:

Generation time (h-1) = 0.6931/ μ

X1 و X0 به‌ترتیب غلظت توده زیستی (گرم بر لیتر) در روزهای T1 و T0 هستند (26).

بازدهی میزان تثبیت دی‌اکسید‌کربن از اندازه‌گیری مقدار دی‌اکسید‌کربنی که ریزجلبک مصرف می‌کند و رابطه 6 محاسبه شد:

رابطه 6:

P Co2 (g l-1d-1) = 1.88 × Ps

Ps بازدهی توده زیستی بر حسب گرم بر لیتر است (27).

اندازه‌گیری چربی کل و خاکستر: برای اندازه‌گیری مقدار چربی کل و مقدار خاکستر به‌ترتیب از روش سوکسله و روش سوزاندن نمونه‌های وزن‌شده در کوره الکتریکی با دمای 550 درجه سانتی‌گراد برای مدت 6 ساعت استفاده شد (28).

آنالیز اسید چرب:برای اندازه‌گیری اسید چرب، مقدار 100 تا 200 میلی‌گرم از هر نمونه جلبکی درون ظرف شیشه‌ای دردار ریخته شد. 1 میلی‌لیتر از محلولی شامل H2SO4 5/2 درصد و متانول 98 درصد به هر ظرف نمونه اضافه (1/40 v/v) و مدت 1 ساعت در دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. پس از سردشدن در دمای اتاق، 500 میکرولیتر هگزان با 5/1 میلی‌لیتر NaCl 9/0 درصد (w/v) مخلوط و به نمونه اضافه شد تا اسید چرب متیل استر استخراج شود (FAME). سپس، نمونه 10 دقیقه با 4000 دور در دقیقه سانتریوفیوژ (Sigma 8k) و بخش رویی محلول (شامل هگزان-FAME) جداسازی و برای تعیین پروفایل اسید چرب به دستگاه گاز کروماتوگرافی (Agilent 7890A) تزریق شد (29).

تعیین مقدار محتوای پروتئینی:برای اندازه‌‎گیری محتوای پروتئینی از روش اسلوکمبی[2] و همکاران استفاده شد. مقدار 5 میلی‌گرم جلبک فریزدرای‌شده در 2/0 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید (TSA) 24 درصد (w/v) مخلوط و هم زده شد. مخلوط حاصل 15 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون و سپس در دمای اتاق خنک شد. سپس، 600 میکرولیتر آب کاملاً خالص به مخلوط اضافه و محلول همگن حاصل 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور g15000 سانتریوفیوژ و محلول رویی آن دور ریخته شد. مواد ته‌نشین‌شده هر ظرف در 5/0 میلی‌لیتر واکنش‌گر لوری به حالت سوسپانسیون درآمدند و 3 ساعت در دمای 55 درجه سانتی‌گراد داخل انکوباتور قرار داده شدند. نمونه‌ها پس از خنک‌شدن در دمای اتاق، برای مدت زمان 20 دقیقه (در دمای اتاق) با دور g15000 سانتریوفیوژ و محلول رویی آنها نگه داشته شد. سپس محلول رویی 30 دقیقه در محلول لوری ریخته و میزان جذب هر نمونه در طول موج 600 نانومتر خوانده شد (30).

اندازه‌گیری مقدار کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتن کل:مقدار 50 میلی‌لیتر محیط پرورش با فیلتر واتمن (DP 150) آبی‌رنگ فیلتر و سپس نمونه وزن شد. برای استخراج رنگدانه، 50 میلی‌لیتر استون 100 درصد به ازای هر گرم ماده اضافه شد. سپس نمونه به مدت 1 دقیقه با 1000 دور بر دقیقه همگن و محلول حاصل از فیلتر واتمن آبی عبور داده شد و سپس 10 دقیقه با 2500 دور در دقیقه سانتریوفیوژ (Sigma 8K) شد. میزان جذب نوری محلول‌ رویی حاصل از هر نمونه با دستگاه اسپکتوفتومتر (Camspec M330) و در طول موج های 662، 645 و 470 خوانده شد. از رابطه‌های زیر برای محاسبه کاروتن کل هر نمونه استفاده شد.

Ca= 11.75A662 – 2.350A645

Cb= 18.61A645 – 3.960A662

Cc= 1000A470 – 2.270Ca – 81.4Cb /227

Ca مقدار کلروفیل a، Cb مقدار کلروفیل b و Ccمقدار کاروتن کل برحسب میکروگرم بر گرم وزن تر هستند (31).

تجزیه و تحلیل آماری:نرمال‌بودن پراکنش تمام داده‌ها با آزمون کولموگروف-اسمیرنوف بررسی شد. داده‌ها به‌شکل تحلیل واریانس یک‌طرفه بررسی شدند و از آزمون توکی (Tukey) در سطح 5 درصد برای معناداربودن عوامل استفاده شد. محاسبه داده‌ها و ترسیم نمودارها با بسته نرم‌افزاری SPSS (نسخه 22) و Excel (نسخه 2013) انجام شد.

 

نتایج

بر اساس عوامل رشدی که در جدول 1 دیده می‌شوند، نرخ رشد ویژه، تقسیم سلولی روزانه، زمان تولیدمثل، بازدهی میزان تثبیت دی‌اکسیدکربن، مقدار کل توده زیستی و بازدهی توده زیستی در دوره پرورش سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس در غلظت 10 درصد گاز دی‌اکسید‌کربن از نظر آماری تفاوت معناداری با یکدیگر ندارند (05/0P>) (جدول 1).

 

جدول 1- مقادیر عوامل رشدی (تکرار±StD) در جلبک های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس. حروف یکسان، نبود اختلاف معنادار در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

عوامل رشد

هماتوکوکوس پلوویالیس

سندسموس آبلیکوس

نرخ رشد ویژه (روز)

a00/0±17/0

a00/0±18/0

تقسیم شدن در روز (روز)

a00/0±25/0

a00/0±26/0

زمان تولید مثل (ساعت)

a06/0±98/3

a06/0±91/3

بازدهی میزان تثبیت کربن دی اکسید (میلی‌گرم بر لیتر در روز)

a08/1±43/15

a33/1±46/16

مقدار کل توده زیستی خشک (گرم بر لیتر)

a01/0±17/0

a01/0±18/0

بازدهی توده زیستی (گرم بر لیتر در روز)

a00/0±008/0

a00/0±009/0

 

 

تحلیل محتوای پروتئینی نشان داد مقدار پروتئین موجود در سندسموس آبلیکوس به‌مراتب بیشتر از هماتوکوکوس پلوویالیس (05/0P<) و به ترتیب برابر 79/16 و 16/9 درصد است. میزان چربی تولیدشده در هماتوکوکوس پلوویالیس نیز مقدار بیشتری را نسبت به سندسموس آبلیکوس نشان داد (05/0P<). مقدار خاکستر دو گونه جلبکی تفاوت معناداری نسبت به یکدیگر نشان ندادند (05/0P>) (جدول 2).

 

جدول 2- مقادیر ترکیبات شیمیایی (تکرار±StD) جلبک‌های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس. حروف یکسان، نبود اختلاف معنادار در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

هماتوکوکوس پلوویالیس

سندسموس آبلیکوس

ترکیب شیمیایی

b52/0±16/9

a61/0±79/16

پروتئین (درصد)

a52/0±01/16

b35/0±68/11

چربی (درصد)

a40/0±95/6

a44/0±14/6

خاکستر (درصد)

 

اسید چرب استئاریک (0: 18C) بیشترین مقدار را در دو گونه جلبک کشت‌یافته نشان داد و برای جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس بیشتر از سندسموس آبلیکوس بود. اسیدهای چرب اشباع، بیشترین مقدار را در بین سایر اسیدهای چرب نشان دادند و این مقدار در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس و جلبک سندسموس آبلیکوس به‌ترتیب برابر با 93/30 و 51/23 درصد بود و تفاوت معناداری نسبت به یکدیگر داشتند (05/0P<) (جدول 3).

 

جدول 3- پروفایل اسیدهای چرب بر حسب درصد (تکرار±StD) جلبک های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس. حروف یکسان، نبود اختلاف معنادار در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

اسیدچرب

سندسموس آبلیکوس

هماتوکوکوس پلوویالیس

C١۴:٠

18/0±98/0

01/0±58/0

C١۴:١

26/0±50/1

46/0±92/0

C١6:٠

48/0±06/2

12/0±89/2

C١۶:١

07/0±92/0

02/0±38/1

C١8:٠

18/4±42/17

49/2±42/23

C١٨:١

08/0±94/1

14/0±15/1

C١٨:٣n۶

07/2±48/6

07/0±48/5

C١٨:٣n٣

63/1±69/6

24/1±33/7

C20:٠

00/0±46/0

00/0±83/0

C٢٠:۴n۶

02/0±31/0

04/0±48/0

C٢٠: ۵n٣

03/0±75/0

04/0±34/0

C22:٠

22/0±94/1

00/0±37/1

C24:٠

03/0±65/0

04/0±84/1

C٢۴:١

00/0±48/1

01/0±61/1

SFA

b09/5±51/23

a66/2±93/30

MUFA

a41/0±84/5

a63/0±06/5

PUFA

a75/3±23/14

a39/1±63/13

سایر اسیدهای چرب

25/0±42/56

32/5±38/50

مقدار کلروفیل a در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس به‌طور معناداری بیشتر از سندسموس آبلیکوس بود (05/0P<) ولی مقدار کلروفیل b در جلبک سندسموس آبلیکوس مقدار بیشتری را نسبت به هماتوکوکوس پلوویالیس نشان داد (05/0P<). براساس نتایج، مقدار کاروتن کل در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس به‌طور معناداری بیشتر از جلبک سندسموس آبلیکوس بود (05/0P<) (جدول 4).

با توجه به نتایج، میزان اسیدیته محیط‌های پرورش هر دو جلبک با گذشت زمان کاهش می‌یابد، هرچند این روند کاهشی اسیدیته از روز دهم به بعد با افزایش مقدار توده زیستی با شیب کمتری ادامه می‌یابد (شکل 1).

 

جدول 4- مقادیر کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتن کل (تکرار±StD) جلبک های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس. حروف یکسان، نبود اختلاف معنادار در سطح P<0.05 را نشان می‌دهند.

نوع رنگدانه‌ها

هماتوکوکوس پلوویالیس

سندسموس آبلیکوس

کلروفیل a (میکروگرم در گرم وزن تر)

b62/1±65/65

a28/0±05/61

کلروفیل b (میکروگرم درگرم وزن تر)

a25/1±99/24

b46/1±00/38

کاروتن کل (میکروگرم در گرم وزن تر)

b70/1±34/748

a17/6±63/238

 

 

شکل 1- میانگین روند تغییرات اسیدیته (pH) طی مدت 20 روز از پرورش

از روز دهم به بعد، مقدار توده زیستی هر دو گونه جلبک افزایش یافت و در انتهای روز بیستم، مقدار توده زیستی تولیدی در جلبک سندسموس آبلیکوس تقریباً برابر جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس بود (05/0P>) (شکل 2).

هر دو گونه از روز دهم به بعد با کاهش سرعت تقسیم سلولی روبه‌رو شدند که علت آن، افزایش تعداد سلول‌ها در محیط پرورشی بود؛ با وجود این، تعداد سلول‌های جلبک سندسموس آبلیکوس به طور معناداری بیشتر از هماتوکوکوس پلوویالیس بود (05/0P<) (شکل 3).

  

شکل 2- میانگین روند تغییرات غلظت توده زیستی طی مدت 20 روز از زمان پرورش

  

شکل 3- میانگین روند تغییرات تعداد سلول طی مدت 20 روز از زمان پرورش

بحث و نتیجه‌گیری

رشد ریزجلبک‌ها به تأمین دی‌اکسیدکربن (منبع کربن) وابسته است و فراهم‌کردن گاز دی‌اکسیدکربن به تنظیم اسیدیته محیط پرورشی کمک می‌کند (32). همچنین، وجود منبع کربن (دی‌اکسید‌کربن) در محیط، رشد را افزایش می‌دهد و غلظت آن برای هر گونه متفاوت است. پژوهش‌های پیشین نشان داده‌اند استفاده از منابع کربن‌دار در پرورش جلبک به‌طور معناداری بر رشد ریزجلبک‌ها تأثیر می‌گذارد (33 و 34). برای رسیدن به عملکرد رشد بهتر ریزجلبک‌ها، غلظت گاز دی‌اکسید‌کربن باید در محدوده مناسبی قرار گیرد (35).

در مدت زمان 24 روز پرورش Scenedesmus dimorphus، نرخ رشد ویژه، مقدار چربی و بازدهی توده زیستی با افزایش دی‌اکسید‌کربن تا سطح 15 درصد افزایش یافت (36). در مطالعه حاضر نیز غلظت 10 درصد گاز دی‌اکسیدکربن برای دو گونه جلبک سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس نشان داد عوامل نرخ رشد ویژه، تقسیم سلولی در روز، زمان تولید مثل و بازدهی میزان تثبیت دی‌اکسیدکربن یکسان عمل کرده‌اند. در برخی پژوهش‌های پیشین بیان شده مقدار گاز دی‌اکسید‌کربن بیش از 5 درصد برای سلول جلبکی مضر و بازدارنده است و در جلبک Nannochloropsis oculata باعث جلوگیری از رشد سلول می‌شود (37). برخی جلبک‌ها مانند S.obliquus در مقادیر بیش از 6 درصد رشد می‌کنند و حتی در مقدار 18 درصد گاز دی‌اکسید‌کربن به بیشترین توده زیستی می‌رسند (38). مقدار گاز دی‌اکسید‌کربنی که وارد محیط پرورش می‌شود، باعث اختلاط محیط، پراکندگی جلبک‌ها، در دسترس قرار‌دادن مواد مغذی برای سلول‌ها و همچنین جذب دی‌اکسید‌کربن می‌شود که سایه‌اندازی ریزجلبک‌ها روی خودشان را کاهش می‌دهد (39). پرورش S. dimorphus برای مدت 25 روز در غلظت‌های 5، 10 و 15 درصد نشان داد غلظت 15 درصد دی‌اکسیدکربن، مقدار توده زیستی را تا 6/1 گرم بر لیتر افزایش می‌دهد (36). مقدار توده زیستی تولیدی با غلظت 15 درصد دی‌اکسیدکربن پس از 14 روز پرورش، حدود 1490میلی‌گرم بر لیتر برای Scenedesmus sp. (40) و 1570 میلی‌گرم بر لیتر برای S. dimorphus (41) گزارش شده است. مطالعه حاضر نشان داد پس از 20 روز از زمان پرورش با 10 درصد دی‌اکسیدکربن، مقدار کل توده زیستی خشک برای جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس و برای سندسموس آبلیکوس به‌ترتیب برابر 17/0 و 18/0 گرم بر لیتر بوده است. یکی از تفاوت‌ها در مقدار توده زیستی تولیدی در مطالعه حاضر با مطالعه‌های پیشین، مدت زمان قرار‌گرفتن جلبک‌ها در معرض گاز دی‌اکسیدکربن است که این زمان در مطالعه حاضر 12 ساعت در روز بود. همچنین روند تغییرات توده زیستی نشان دادند تولید توده زیستی از روز دهم به بعد با شیب بیشتری انجام شده است (شکل 2)؛ این امر با کاهش هم‌زمان شیب اسیدیته به سمت عدد 6 از روز دهم همراه بود و رابطه تولید توده زیستی با اسیدیته را نشان می‌دهد؛ در اسیدیته‌های کم (اسیدی)، مقدار گاز دی‌اکسید‌کربن بیشتری در محیط برای استفاده جلبک‌ها وجود دارد. همچنین با توجه به تعداد زیاد سلول‌های جلبک‌های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس در انتهای دوره آزمایش (شکل 3)، شاید اندازه سلول‌ها کاهش یافته است و از این رو جلبک‌ها توده زیستی کمتری تولید کرده‌اند.

پروتئین، چربی و کربوهیدرات مواد اصلی سلولی شناخته شده‌اند و فتوسنتز در ریزجلبک‌ها این مواد را برای سلول فراهم و انرژی را برای ساخت این سه نوع ماکرو‌مولکول مصرف می‌کند (42). وانگ[iii] و همکاران گزارش کردند با افزایش غلظت دی‌اکسید‌کربن تا سطح 30 درصد، محتوای پروتئینی جلبک افزایش می‌یابد ولی بیشترین محتوای پروتئینی در غلظت 10 درصد مشاهده می‌شود. همان‌طور که مطالعه‌های پیشین وانگ و همکاران، تولدو-سروانتس[iv] و همکاران، پاراکاش رای[v] (43) و همکاران، سانکار[vi] (44) و همکاران و مطالعه حاضر نشان می‌دهند، پرورش گونه‌های جلبکی مختلف در شرایط محیطی یکسان (دوره نوری، شدت نوری، محیط‌کشت، وجود دی‌اکسیدکربن)، غلظت‌های متفاوت توده زیستی، پروتئین، چربی، کربوهیدرات و .... را تولید می‌کند. جلبک سندسموس آبلیکوس در غلظت 10 درصد دی‌اکسیدکربن، پروتئین بیشتر و چربی کمتری را نسبت به جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس تولید کرد. مطالعه‌های پیشین نشان داده‌اند ریزجلبک‌ها در اثر تنش‌های محیطی مانند کمبود نیتروژن به تولید ترکیبات غنی از انرژی مانند چربی و کربوهیدرات تمایل دارند (45 و 46). شدت نور زیاد در جلبک‌هایی که اتوتروفی فتوسنتز می‌کنند، سرعت رشد و تثبیت مقدار دی‌اکسیدکربن را متأثر و در ترکیب بیوشیمیایی ریزجلبک‌ها (مانند چربی و کربوهیدرات) تغییر ایجاد می‌کند (47). ریزجلبک‌ها، چربی‌ها را بسیار بیشتر از کربوهیدرات‌ها می‌سازند (48) و مقدار چربی در جلبک‌های مختلف، متفاوت و شرایط محیطی مختلف بر محتوای چربی جلبک اثرگذار است. سارات چاندار[vii] و همکاران دریافتند با افزایش غلظت گاز دی‌اکسید‌کربن تا سطح 10 درصد، مقدار چربی افزایش می‌یابد و افزایش غلظت دی‌اکسید‌کربن بیش از 10 درصد بر مقدار چربی S. obtusus اثر افزایشی معناداری ندارد. همچنین مودیما[viii] و همکاران (49) گزارش کردند مقدار چربی با افزایش غلظت دی‌اکسید‌کربن تا سطح 5 درصد افزایش می‌یابد و افزایش غلظت دی‌اکسید‌کربن تا 15 درصد، کاهش مقدار چربی را نشان می‌دهد. تأمین گاز دی‌اکسید‌کربن در محیط پرورش S. obtususو C. vulgaris تغییری در ترکیب اسید چرب نشان نداده است (50 و 51). مقدار 5 درصد گاز دی‌اکسیدکربن در S. obtusiusculus باعث انباشتگی چربی تا 7/55 درصد وزن خشک می‌شود (22) که این مقدار بیش از مقدار 5/2 درصد دی‌اکسیدکربن استفاده‌شده برای S. obliquus (4/22 درصد چربی) در شرایط نبود نیتروژن است (46). واهیدین[ix] و همکاران (52) گزارش کردند بیشترین مقدار چربی (3/31 درصد) در جلبک Nannochlorropsis، در دوره نوری 16:8 (تاریکی: روشنایی) ایجاد می‌شود و این مقدار به‌طور معناداری از انباشتگی چربی در دوره‌های نوری 24:0 و 12:12 کمتر است. با توجه به نتایج این آزمایش، عوامل مختلف محیطی بر مقدار اسیدهای چرب اشباع (SFA)، اسیدهای چرب غیراشباع تک (MUFA) و اسیدهای چرب غیراشباع چندگانه (PUFA) در گونه‌های جلبکی مختلف تأثیر می‌گذارند. ماندوترا[x] و همکاران (53) گزارش کردند افزایش شدت نور تا 6000 لوکس باعث افزایش مقدار اسیدهای چرب اشباع (SFA) در S. abundans می‌شود، درحالی­که افزایش مقدار فسفر تا 60 میلی‌گرم در لیتر موجب تولید بیشترین مقدار MUFA شد و بیشترین مقدار PUFA در اسیدیته 9 مشاهده شد. در زمان استفاده از غلظت 10 درصد گاز دی‌اکسیدکربن، مقدار اسیدهای چرب اشباع (SFA) در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس به‌طور معناداری بیشتر از سندسموس آبلیکوس بود و پاسخ جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس را به این شرایط نشان می‌دهد. همچنین اسیدهای چرب غیراشباع تک (MUFA) و چندگانه (PUFA) مقادیر تقریباً یکسانی را در دو گونه جلبکی نشان دادند. بر اساس پژوهش‌های انجام‌شده، عوامل متنوع محیطی (مانند نور، مواد مغذی و دما) بر پروفایل چربی‌های ریزجلبک‌ها اثر می‌گذارند (54). به نظر می‌رسد سطوح زیاد گاز دی‌اکسید‌کربن (5 تا 20 درصد) شرایط مناسبی را برای انباشتن مقادیر زیاد اسیدهای چرب اشباع مانند C16:0 و C14:0 به‌ویژه در جلبک سندسموس فراهم می‌کند (25). در مطالعه حاضر، مقدار اسیدچرب C14:0 در هر دو گونه جلبکی به‌عنوان یکی از کمترین اسیدهای چرب موجود شناسایی شد و اسید چرب C16:0 نیز مقادیر بیشتری را در هر دو گونه نشان نداد؛ این با مطالعه تانگ[xi] و همکاران هم‌خوانی ندارد. مقدار 10 درصد گاز دی‌اکسید‌کربن برای پرورش S. obliquus،پروفایل اسید چرب به‌نسبت ساده‌ای دارد که C16:0 و C18:1 از گروه‌های اصلی اسیدهای چرب هستند (27). اسیدهای چرب با زنجیره C16-C18 رایج‌ترین ترکیب‌های اسید چرب برای استفاده در صنعت بیودیزل هستند (18). پروفایل اسید چرب تحلیل‌شده نشان داد مجموع مقادیر اسیدهای چرب C16-C18 در هر دو گونه جلبکی سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس از گروه‌های اصلی اسیدهای چرب بودند و به‌ترتیب 51/35 و 65/41 درصد کل اسیدهای چرب را شامل شدند. تحلیل اسید چرب S. obtususدر محیط‌کشت Fogg’s نشان داده است اسیدهای چرب C16-C18 تا 85/88 درصد ترکیبات کل اسید چرب را شامل می‌شوند (43) و با نتایج مطالعه حاضر مطابقت ندارد.

مقاومت و رشد بیشتر S. dimorphus در شرایط گاز دی‌اکسیدکربن زیاد (15% v/v) سبب شد این گونه، نمونه مناسبی برای حذف زیستی دی‌اکسیدکربنی در نظر گرفته شود که سوخت های فسیلی تولید می‌کنند (55). در مطالعه حاضر نیز رشد و تکثیر زیاد جلبک‌های سندسموس آبلیکوس و هماتوکوکوس پلوویالیس در غلظت 10 درصد گاز دی‌اکسیدکربن، این دوگونه جلبکی را برای حذف زیستی گاز دی‌اکسید کربن حاصل از سوخت‌های فسیلی مناسب نشان می‌دهد.

تعیین مقدار سطوح رنگدانه در جلبک‌ها از عوامل محدودکننده مانند نور شدید، کمبود نیتروژن و محدودیت مواد مغذی متأثر است (56 و 57). در مطالعه‌های پیشین گزارش شده مقدار کلروفیل a به مقدار رنگدانه‌های موجود وابسته و تقریباً در تمام گروه‌های جلبکی یکسان است، اما کلروفیل b و c تغییرپذیر هستند. مقدار کاروتن به گونه جلبکی و شرایط زیستی محیط بستگی دارد و افزایش در مقدار کاروتن به هنگام تنش‌های محیطی دیده می‌شود (58-60). با توجه به نتایج مربوط به رنگدانه، جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس مقدار کلروفیل a بیشتری (در حدود 4 میکروگرم بر گرم وزن تر) را نسبت به سندسموس آبلیکوس داشت و این مقدار برای کلروفیل b برعکس بود؛ این موضوع نشان می‌دهد وجود گاز دی‌اکسیدکربن در محیط سبب استفاده سندسموس آبلیکوس از شرایط موجود برای تولید کلروفیل b بیشتر (38 میکروگرم بر گرم وزن تر) و همچنین توده زیستی کل (18/0 گرم بر لیتر وزن خشک) شده است ولی تفاوت معناداری در مقدار توده زیستی کل با جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس (17/0 گرم بر لیتر وزن خشک) دیده نشد. مقدار کاروتن کل به‌طور معناداری در جلبک هماتوکوکوس پلوویالیس بیشتر از سندسموس آبلیکوس بود و توانایی این ریزجلبک برای تولید آستاگزانتین (تا 4 درصد وزن خشک سلول) در شرایط تنش را نشان می‌دهد (61-63) و شاید وجود گاز دی‌اکسیدکربن سبب تحریک این جلبک برای تولید رنگدانه در سلول‌ها شده است.



[1]- Göksan and Kihc

[2]- Slocombe

[iii]- Wang

[iv]- Toledo-Cervantes

[v]- Prakash Rai

[vi]- Sankar

[vii]- Sarat Chandra

[viii]- Mudimu

[ix]- Wahidin

[x]- Mandotra

[xi]- Tang

Chen CY., Yeh KL., Aisyah R., Lee DJ., Chang JS. Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microalgae for biodiesel production: a critical review. Bioresource Technology 2011; 102(1): 71-81.

(2) Kim GY., Yun YM., Shin HS., Kim HS., Han, JI. Scenedesmus-based treatment of nitrogen and phosphorus from effluent of anaerobic digester and bio-oil production. Bioresource Technology 2015; 196(1): 235-240.

(3) Ho SH., Chen CY., Chang JS. Perspectives on microalgal CO2-emission mitigation systems– A review. Biotechnology Advance 2011; 29(2):189-198.

(4) Moheimani NR. The culture of Coccolithophorid algae for carbon dioxidebioremediation, PhD Thesis. Perth: Murdoch Uni; 2005.

(5) Richmond A., Globbelaar JU. Factors affecting the output rate of Spirulina platensis with reference to mass cultivation. Biomass 1986; 10(4): 253-261.

(6) Yoo C., Jun SY., Lee JY., Ahn CY., Oh HM. Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide. Bioresource Technology 2010; 101(1): S71-S74.

(7) Matsumoto H., Hamasaki A., Sioji N., Ikuta Y. Influence of CO2, SO2 and NO in flue gas on microalgae productivity. Journal of Chemistry Energy Japan 1997; 30(4): 620-624.

(8) Harker M., Tsavalos AJ., Young, AJ. Use of response surface methodology to optimize carotenogenesis in the microalga, Haematococcus pluvialis. Journal of Applied Phycology 1995; 7(4): 399-406.

(9) Fan L., Vonshak A., Boussiba S. Effect of temperature and irradiance on growth of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae). Journal of. Phycology 1994; 30(5): 829-833.

(10) Cifuentes AS., Gonzalez MA., Vargas S., Hoeneisen M., Gonzalez N. Optimization of biomass, total carotenoids and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Nevada, USA) under laboratory conditions. Biological Resource 2003; 36(3): 343-357.

(11) Zhekisheva M., Boussiba S., Khozin-Goldberg I., Zarka, A., Cohen, Z. Accumulation of oleic acid in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated with that of astaxanthin esters. Journal of Phycology 2002; 38(2): 325-331.

(12) Zhekisheva M., Zarka A., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S. Inhibition of astaxanthin synthesis under high irradiance does not abolish triacylglycerol accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae). Journal of Phycology 2005; 41(4):819-826.

(13) García-Malea López MC., Brindley C., Del Rio E., Acien FG., Fernandez JM., Molina E. Modelling of growth and accumulation of carotenoids in Haematococcus pluvialis as a function of irradiance and nutrients supply. Biochemistry Energy Journal 2005; 26(2): 107-114.

(14) Göksan TAKI., Kihc C. Growth Characteristics of the Alga Haematococcus pluvialis Flotow as Affected by Nitrogen Source, Vitamin, Light and Aeration. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 2011; 11(1): 377-383.

 

(15) Logan C., Sims R. Production and harvesting of microalgae for wastewater treatment, biofuels, and bioproducts. Biotechnology advances 2011; 29(6): 686-702.

(16) Gonzalez LE., Canizares RO., Baena S. Efficiency of ammonia and phosphorus removal from a Colombian agroindustrial wastewater by the microalgae Chlorella vulgaris and Scenedesmus dimorphus. Bioresource Technology 1997; 60(3): 259-262.

(17) Faridpak F. Operating instructions reproduction and culture warm water fish. Aquatic scientific publications 2012; 6: 308 (in Persian).

(18) Knothe G. Improving biodiesel fuel properties by modifying fatty ester composition. Energy Environmental Science 2009; 2(3): 759-66.

(19) Pirastru L., Darwish M., Chu FL., Perreault F., Sirois L., Sleno L., Popovic, R. Carotenoid production and change of photosynthetic functions in Scenedesmus sp. exposed to nitrogen limitation and acetate treatment. Journal of Applied Phycology 2012; 24(1): 117-124.

(20) Orosa M., Torres E., Fidalgo P., Abalde J. Production and analysis of secondary carotenoids in green algae. Journal of Applied Phycology 2000; 12(3): 553-556.

(21) CDIAC Carbon Dioxide Information Analysis Center. Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy, Oak Ridge, Tenn., U.S.A 2011; doi: 10.3334/CDIAC/ 00001_V2011. http://cdiac.ornl.gov/trends/emis/ prelim_2009_2010_estimates.html.

(22) Toledo-Cervantes A., Morales M., Novelo E., Revah S. Carbon dioxide fixation and lipid storage by Scenedesmus obtusiusculus. Bioresource Technology 2013; 130(4): 652-658.

(23) Jacob-Lopes E., Revah S., Hernandez S., Shirai K., Franco TT. Development of operational strategies to remove carbon dioxide in photobioreactors. Chemistry Energy Journal 2009; 153(1): 120-126.

(24) Bischoff HW., Bold HC. Phycological studies. IV. Some soil algae from enchanted rock and related algal species. University Texas Publication 1963; 63(18): 1-95.

 (25) Tang D., Han W., Li P., Miao  X., Zhong, J. CO2 biofixation and fatty acid composition of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa in response to different CO2 levels. Bioresource Technology 2011; 102(3): 3071-3076.

(26) Guillard RRL. Division rates In: Stein JR., editor. Handbook of Physiological Methods: Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge, Cambridge University Press;1973: 289-312.

(27) Ho S., Chen W., Chang, J. Scenedesmus obliquus CNW-N as a potential candidate for CO2 mitigation and biodiesel production. Bioresource Technology 2010; 101(22): 8725-8730.

(28) A.O.A.C. International Official methods of analysis of AOAC International. AOAC International 2005.

(29) Miquel M., Browse J. Arabidopsis mutants deficient in polyunsaturated fatty acid synthesis: Biochemical and genetic characterization of a plant oleoyl-phosphatidylcholine desaturase. Journal Biology Chemistry 1992; 267(25): 1502-1509.

(30) Slocombe SP., Ross M., Thomas N., McNeill S., Stanley MS. A rapid and general method for measurement of protein in micro-algal biomass. Bioresource Technology 2013; 129(3): 51-57.

(31) Dere S., Gunes T., Sivaci R. Spectrophotometric Determination of Chlorophyll - A, B and Total Carotenoid Contents of Some Algae Species Using Different Solvents. Turkish Journal of Botany 1998; 22(1): 13-17.

(32) Brown LM. Uptake of carbon dioxide from flue Gas by microalgae. Energy Convers Management 1996; 37(6): 1363-1367.

(33) Kong WB., Yang H., Cao YT., Song H., Hua SF., Xia CG. Effect of glycerol and glucose on the enhancement of biomass, lipid and soluble carbohydrate production by Chlorella vulgaris in mixotrophic culture. Food Technology Biotechnology 2012; 51(4): 62-69.

(34) Wang H., Fu R., Pei GA. study on lipid production of the mixotrophic microalgae Phaeodactylum tricornutumon various carbon sources. African Journal of Microbiology Resource 2012; 6(1): 1041-1047.

(35) Rados S., Vaclav B., Frantisek D. CO2 balance in industrial cultivation of algae. Arch Hydrobiology 1975; 46(12): 297-310.

(36) Vidyashankar S., Deviprasad K., Chauhan VS., Ravishankar GA., Sarada R. Selection and evaluation of CO2 tolerant indigenous microalga Scenedesmus dimorphus for unsaturated fatty acid rich lipid production under different culture conditions. Bioresource Technology 2013; 144(2): 28-37.

(37) Chiu S., Kao C., Tsai M., Ong S., Chen C., Lin C. Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2 aeration. Bioresource Technology 2009; 100(2): 833-838.

(38) Morais MG., Costa JAV. Biofixation of carbon dioxide fixation by Spirulina sp. and Scenedesmus obliquus cultivated in three-stage serial tubular photobioreactor. Journal of Biotechnology 2007a; 129(3): 439-445.

(39) Ugwu CU., Aoyagi H., Uchiyama H. Photobioreactors for mass cultivation of algae. Bioresource Technology. 2008; 99(10): 4021-4028.

(40) Tripathi R., Singh J., Thakur, IS. Characterization of microalga Scenedesmus sp. ISTGA1 for potential CO2 sequestration and biodiesel production. Renewable Energy 2015; 74(8): 774-781.

(41) Basu S., Roy AS., Mohanty K., Ghoshal AK. Enhanced CO2 sequestration by a novel microalga: Scenedesmus obliquus SA1 isolated from bio-diversity hot-spot region of Assam. India. Bioresource Technology 2013; 143(32): 369-377.

(42) Liu W., Huang Z., Li P., Xia J., Chen B. Formation of triacylglycerol in Nitzschia closterium f. minutissima under nitrogen limitation and possible physiological and biochemical mechanisms. Journal. Experience. Marin Biology Ecology 2012; 418(4): 24-29.

(43) Prakash Rai M. and Shivani Gupta. Effect of media composition and light supply on biomass, lipid content and FAME profile for quality biofuel production from Scenedesmus abundans. Journal of Energy Conversion and Management 2016 (In press).

(44) Sankar V., Daniel DK., Krastanov A. Carbon dioxide fixation by Chlorella minutissima batch cultures in a Stirred tank bioreactor. Biotechnology and Biotechnological Equipment 2011; 25(3): 2468-2476.

(45) Siaut M., Cuine S., Cagnon C., Fessler B., Nguyen M., Carrier P., et al. Oil accumulation in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii: characterization, variability between common laboratory strains and relationship with starch reserves. BMC Biotechnology 2011; 11(1): 1-7.

(46) Ho SH., Chen CY., Chang, JS. Effect of light intensity and nitrogen starvation on CO2 fixation and lipid/carbohydrate production of an indigenous microalga Scenedesmus obliquus CNW-N. Bioresource Technology 2012a; 113(2): 244-252.

(47) Chrismadha T., Borowitzka MA. Effects of cell density and irradiance on growth, proximate composition and eicosapentaenoic acid production of Phaeodactylum tricornutum growth in a tubular photobioreactor. Journal of Applied Phycology 1994; 6(3): 67-74.

(48) Bellou S., Aggelis G. Biochemical activities in Chlorella sp. and Nannochloropsis salina during lipid and sugar synthesis in a lab-scale open pond simulating reactor. Journal Biotechnology 2012; 164 (2): 318-329.

(49) Sarat Chandra T., Deepak RS., Maneesh Kumar M., Mukherji S., Chauhan VS., Sarada R., et al. Evaluation of indigenous fresh water microalga Scenedesmus obtusus for feed and fuel applications: Effect of carbon dioxide, light and nutrient sources on growth and biochemical characteristics. Bioresource Technology 2016; 207(7): 430-439.

(50) Mudimu O., Rybalka N., Bauersachs T., Friedl T., Schulz R. Influence of different CO2 concentrations on microalgae growth, a-tocopherol content and fatty acid composition. Geomicrobiology Journal 2015; 32(3): 291-303.

(51) Anjos M., Fernandes BD., Vicente AA., Teixeira JA., Dragone, G. Optimization of CO2 bio-mitigation by Chlorella vulgaris. Bioresource Technology 2013; 139(7): 149-154.

(52) Wahidin S., Irdis A., Shaleh SRM. The influence of light intensity and photoperiod on the growth and lipid content of microalgae Nannochloropsis sp. Bioresource Technology 2013; 129(5): 7-11.

(53) Mandotra SK., Kumar P., Suseela MR., Nayaka S., Ramteke PW. Evaluation of fatty acid profile and biodiesel properties of microalga Scenedesmus abundans under the influence of phosphorus, pH and light intensities. Bioresource Technology 2016; 201(1): 222-229.

(54) Thompson GA. Lipids and membrane function in green algae. Lipids and Lipid Metabolism 1996; 130(4):17-45.

(55) Sakai N., Sakamoto Y., Kishimoto N., Chihara M., Karube, I. Chlorella strains from hot springs tolerant to high temperature and high CO2. Energy Convers Management 1995; 36(6): 693-696.

(56) Collier JL., Grossman AR. Chlorosis induced by nutrient deprivation in Synechocccus sp. Journal of Bacteriology 1992; 174(7): 4718-4726.

(57) Greene RM., Gerder RJ., Falkowski PG. Effect of iron limitation on photosyntesis in a Marine Diatom. Limnology Oceanography 1991; 36(9): 1772-1782.

(58) Martin JH., Gordon RM., Fiztwater SE. The case for iron. Limnology and Oceanography 1991; 36(8): 1793-1803.

(59) Grung MF., D’souza, ML., Borowitzka M. Algal Carotenoids 1. Secondary Carotenoids. Journal of Applied Phycology 1992; 4(2): 165-171.

(60) Donkin P. Ketocarotenoid biosynthesis by Haematococcus La-custris. Phytochemistry 1976; 15(2): 711-715.

(61) Lemoine Y., Schoefs B. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress. Photosynthetic Resource 2010; 106(1-2): 155-177.

(62) Boussiba S. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: cellular physiology and stress response. Physiology Plantarum 2000; 108(2): 111-117.

(63) Li Y., Sommerfeld M., Chen F., Hu Q. Consumption of oxygen by astaxanthin biosynthesis: a protective mechanism against oxidative stress in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae). Journal of Plant Physiology 2008; 165(17): 1783-1797.