مطالعه جدایه‌های باکتری‌های کیتینولایتیک از خاک و کاربرد آنها علیه قارچ بیمارگر Alternaria alternata در شرایط آزمایشگاه

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه و مرکز تحقیقات زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین (ع)، تهران، ایران

2 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه امام خمینی قزوین، قزوین، ایران

3 دانشیار بیوتکنولوژی، دانشکده فنی مهندسی، دانشگاه امام خمینی قزوین، قزوین، ایران

4 دانشیار گیاه پزشکی، دانشگاه علوم کشاورزی گرگان، گرگان، ایران

5 تهران-تهرانپارس-انتهای اتوبان شهید بابایی-دانشگاه جامع امام حسین (ع)-موقعیت امام صادق (ع)-گروه و مرکز تحقیقات زیست شناسی

چکیده

مقدمه: کنترل زیستی در کشاورزی پایدار، روش جایگزین درخور توجهی برای کنترل بیماری‌های مختلف گیاهی به‌ویژه قارچ‌های بیمارگر خاکزی است که بیشترین خسارت اقتصادی را به محصولات کشاورزی در دنیا وارد می‌کنند. هر یک از گونه‌های باکتری خاکزی، ویژگی‌ها و توانایی‌های منحصر‌به‌فردی فرد دارند. قارچ Alternariasp.دارای سموم ویژه میزبانان گیاهی است که به بیماری در آنان منجر می‌شوند. در سال‌های اخیر در سراسر جهان، کنترل زیستی بیماری‌های قارچی در انواع محصولات کشاورزی با استفاده از قارچ‌ها و باکتری‌‌های آنتاگونیست خاکزی انجام شده است. برخی جدایه‌های باکتریایی تولیدکننده آنزیم کیتیناز با بیمارگرهای قارچی مبارزه می‌کنند.
مواد و روش‏‏ها: با هدف یافتن آنتاگونیست مولد کیتیناز علیه قارچ Alternaria alternata، غربال‌گری باکتری‌های خاکزی مولد آنزیم کیتیناز با نمونه‌برداری از خاک‌های زراعی و شهری چند منطقه استان قزوین انجام شد.
نتایج: در پژوهش حاضر، پنج جدایه مختلف باکتری کیتینولایتیک یافت شدند؛ دو جدایه Pseudomonas nitroreducens در شرایط آزمایشگاهی و یک جدایه (AHH4) توانایی مبارزه علیه قارچ بیمارگر Alternaria sp.را در شرایط مزرعه داشتند. وجود غلظت‌های زیاد باکتری (05/0OD600و بیشتر)، رشد قارچ A. alternataرا کامل متوقف کرد.
بحث و نتیجه‏گیری: از بین جدایه‌های بررسی‌شده، جدایه P. nitroreducens AHH4به‌طور مؤثری از فعالیت این قارچ در شرایط آزمایشگاهی و نیز در شرایط گلخانه‌ای جلوگیری و از رشد قارچ در نمونه‌های بررسی‌شده ممانعت کرد. بنابراین، باکتری کیتینولایتیک P. nitroreducens Strain AHH4به‌طور کارآمدی توانایی بازدارندگی از رشد قارچ A. alternata را دارد و رشد قارچ A. alternata در حضور غلظت‌های زیاد باکتری (05/0OD600 و بیشتر) کامل متوقف می‌شود. جدایه AHH4 با شماره دسترسی KR905055 در پایگاه NCBI/DDBJ/EMBL ثبت شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The study of soil chitinolytic bacterial strains and their use against fungal pathogen Alternaria alternata in vitro

نویسندگان [English]

  • hosein honari 1
  • Amin alborzian dehsheikh 2
  • Ramin Hosseini 3
  • Mohammadreza akbari 1
  • Seyed ismail razavi 4
  • Seyed masih e'temad aubi 5
5 تهران-تهرانپارس-انتهای اتوبان شهید بابایی-دانشگاه جامع امام حسین (ع)-موقعیت امام صادق (ع)-گروه و مرکز تحقیقات زیست شناسی
چکیده [English]

Introduction: In sustainable agriculture, biological control is an important alternative to control various plant diseases, in particular, pathogenic fungus that causes the most economic damage to agricultural products in the world. Each soil species bacterium has unique specified features and abilities. Alternaria sp has specific herbal poisons that lead to diseases in them. Biological control of fungal diseases in agricultural products across the world has been done in recent years using fungi and soil antagonist bacteria. Some bacterial isolates that produce chitinase enzymes fight with fungal pathogens.
Materials and Methods: To achieve an antagonist chitinolytic bacteria against Alternaria alternata fungal, screening soil species bacterium that produce chitinase of some urban and agriculture soil samples of Qazvin were carried out.
Results: In this study, five different strain of chitinolytic bacteria were found, two strains of Pseudomonas nitroreducens in vitro and one strain (AHH4), they had the ability to destroying fungal pathogen Alternaria sp in the farm. as the presence of high concentrations (0/05 OD600 and above) of the bacteria, A. alternata fungus growth stopped completely.
Discussion and conclusion: However, one of them, P. nitroreducens (AHH4) could control the fungusat in vitro and invivo and inhibit the growth of fungus. So P. nitroreducens (AHH4) chitinolytic bacteria has efficiently effect on inhibit A. alternata fungal growth. As the presence of high concentrations (0/05 OD600 and above) of the bacteria A. alternata fungus growth stopped completely. The isolate AHH4 was submitted to NCBI/DDBJ/EMBL as KR905055 accession number.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biological control
  • Chitinolytic
  • Chitinase
  • Alternaria alternata

مقدمه.

کیتین پس از سلولز، دومین پلی‌ساکارید فراوان در طبیعت است که در اسکلت خارجی حشره‌ها، دیواره سلولی قارچ‌ها، مخمرها، جلبک‌ها و ساختارهای داخلی برخی جانوران وجود دارد. کیتین ساختاری از β-1,4 ساکارید بدون شاخه با اتصال‌های واحدهای –Nاستیل‌گلوکز‌آمین است. سلولاز و کیتیناز ساختارهای مشابهی دارند به‌طوری که کمیته نام‌گذاری بین‌المللی بیوشیمی و زیست مولکولی[1] این دو آنزیم را به‌شکل موازی نام‌گذاری کرده است (سلولاز: اندو-1و 4‌بتا-گلوکاناز[2] EC 3.2.1.4 و کیتیناز: بتا-ان‌استیل‌هگزوسامینیداز[3]EC 3.21.52)(1).

کیتینازها، آنزیم‌هایی هستند که در چرخه کربن و نیتروژن اکوسیستم مشارکت دارند. کیتین و کیتینولایتیک‌آنزیم‌ها برای کاربردهای فناوری به‌ویژه کنترل بیمارگرهای مزارع کشاورزی اهمیت بسیاری دارند. کیتینازهای گیاهی برخلاف کیتینازهای قارچی فقط بر نوک هیف‌های قارچ بیمارگر تأثیر می‌گذارند و ساختارهای سخت کیتینی را تجزیه نمی‌کنند. همچنین، این آنزیم‌ها به‌تنهایی آثار ضد قارچی ضعیفی دارند و تنها بر گونه‌های محدودی از قارچ‌ها مؤثر هستند. از سوی دیگر، بررسی‌ها نشان داده‌اند که تمام بیمارگرهای دارای کیتین در دیواره نسبت به کیتینازهای قارچ حساس هستند و غلظت‌های زیاد این کیتینازها برای گیاهان سمی نیست (2). از آنزیم‌های کیتینازی در زمینه‌های مختلفی استفاده می‌شود، ازجمله کنترل زیستی بیمای‌های گیاهی (3 و 4)، تهیه مواد دارویی (5 و 6)، زیست‌فناوری (7) و تولید حشره‌کش‌ها (8). به‌طور کلی کیتینازهای قارچی به دو دسته اندوکیتینازها و اگزوکیتینازها تقسیم می‌شوند که از میان آنها، کیتیناز 42 کیلو دالتونی نسبت به سایر کیتینازها مانند کیتیناز 33 و 37 کیلو دالتونی و اگزوکیتینازها نقش مؤثرتری در تجزیه کیتین موجود در دیواره قارچ‌ها دارند (2 و 4).

خانواده Pseudomonaceae پروکاریوت هوازی گرم منفی و جزو گاماپروتئوباکتری‌ها هستند. لیم و همکاران[4]، باکتری Pseudomonas stutzeri را باکتری ضد قارچ Fusarium solani معرفی کردند (9). باکتری یادشده رشد هیف‌های قارچی را در ریشه‌های گیاهی کنترل می‌کند و آنها دریافتند که آنزیم‌های کیتیناز خارج سلولی P. stutzeri باعث این عمل و لیزشدن میسلیوم قارچ در ریزوسفر گیاه می‌شوند. باکتری Pseudomonas aeruginosa پروتئین‌های خارج سلولی بسیاری را به محیط ترشح می‌کند. ژن ChiC، کد‌کننده آنزیم کیتینازی است که در این گونه شناسایی شده است و این ژن، پروتئینی با 483 آمینواسید را کد می‌کند که در قسمت N-terminal آن پپتید علامت وجود ندارد. این پروتئین همولوگ آنزیم‌های یافت‌شده در Serratia marcescens، Vibrio harveyi و Bacillus circulans است. باکتری P. aeruginosaبه‌طور معمول آلوده‌کننده زخم و سوختگی‌های پوست معرفی می‌شود که با در نظر گرفتن آنزیم کیتیناز، درمان‌کننده زخم است (10). ویوات و همکاران[5]، ژن آنزیم کیتیناز باکتری‎های Aeromonas hydrophila وPseudomonas maltophila (CTS) را برای افزایش فعالیت آفت‌کشی به باکتری Bacillus thuringiensisمنتقل کردند و موفق به بیان آن شدند (11).

Alternaria sp.، جنسی از قارچ آسکومیست و جزو قارچ‌های فرصت‌طلب است که در دسته فئوهیفومیستا قرار می‌گیرد. این قارچ باعث ایجاد فعالیت‌های حساسیتی شایع در انسان می‌شود و به‌طور کلی، کنیدی‌های آن باعث بروز نشانه‌های مرتبط با مشکلات تنفسی می‌شوند. همچنین عوارضی شامل رینیت آلرژیک (تب یونجه)، آسم، پنومونی را باعث می‌شود. مطالعه‌های متعدد نشان داده‌اند که Alternaria sp. باعث عفونت ناخن نیز می‌شود و گونه‌های Alternaria sp. بیمارگرهای گیاهی بزرگی شناخته‌ شده‌اند که در طبیعت بسیار شایع هستند و در گردوغبار منازل به‌وفور یافت می‌شوند. همچنین بیماری ناشی از قارچ آلترناریا به‌ندرت در بذر چاودار مشاهده می‌شود. Alternaria sp.، یکی از مهم‌ترین گندروهای قارچی در بذر، دانه، کاه، برگ‌ها و میوه‌های در حال فساد و گوشت‌های نمک‌سود‌نشده است. این قارچ ساختار رویشی و زایشی دارد و میسلیوم‌های رنگی ایجاد می‌کند. قارچ Alternaria sp. حاوی سموم ویژه میزبانان گیاهی است که به بیماری در آنان منجر می‌شود. در سال‌های اخیر، کنترل زیستی بیماری‌های قارچی در انواع محصولات کشاورزی با استفاده از قارچ‌ها و باکتری‌های آنتاگونیست خاکزی در سراسر جهان انجام شده است (12-14). کنترل زیستی، راهکار جایگزین سموم شیمیایی گوناگون برای کنترل بیماری‌های گیاهی است (15).

با هدف یافتن آنتاگونیست مولد کیتیناز علیه قارچ یادشده، غربال‌گری باکتری‌های خاکزی مولد آنزیم کیتیناز با نمونه‌برداری از خاک‌های زراعی و شهری چند منطقه در استان قزوین انجام شد.

 

مواد و روشها

جداسازی باکتریهای کیتینولایتیک:برای نمونه‌برداری و خالص‌سازی باکتری از خاک، پنج نمونه خاک مرطوب تا عمق 10 سانتی‌متری از پنج منطقه مختلف شهر قزوین و مزارع کشاورزی اطراف آن تهیه شدند. نمونه‌های خاک به روش رقیق‌سازی متوالی با آب گندزدایی‌شده به رقت 1-10تا 6-10 درآمدند. 1 میلی‌لیتر از هر نمونه روی محیط‌کشت ویژه جداسازی اکتینومیست[6] (ا.ج.ا) (Himedia M490) حاوی 4 گرم بر لیتر کیتین (کلوییدی‌شده) به‌عنوان منبع کربن و ماده اصلی گزینش، 5/2 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک ریفامپیسین[7] (فرمنتاز)[8] به‌عنوان ماده جلوگیری‌کننده از رشد سایر باکتری‌ها و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر آمفوتریسین ب.[9] (TC019) به‌عنوان ماده قارچ‌کش ریخته و با پخش آن در سطح پتری‌دیش در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و شرایط تاریکی گرما‌گذاری و پس از هفت روز، نمونه‌ها بررسی شدند (16). باکتری‌های تولید‌کننده کیتیناز، محیط اطراف خود را از کیتین تهی می‌کنند و به‌شکل هاله‌های شفاف روی پلیت ظاهر می‌شوند. علاوه بر آزمون کیتیناز، شناسایی باکتری‌ها از روی توالی ژن حفظ‌شده 16S rRNA انجام شد. نشان داده شده است که توالی ژن 16S rRNA در یک جدایه با نزدیک‌ترین همسایگان، حداقل 97 درصد شباهت دارد و یک گونه محسوب می‌شوند (17).

تهیه کیتین کلوییدی:برای استفاده از کیتین (Chitin Himedia RM1356) جامد در محیط‌کشت، ابتدا به‌شکل کلویید درآورده شد. در پژوهش حاضر، از روش هسو و همکاران[10] برای تهیه کیتین کلوییدال استفاده شد. ابتدا 4 گرم کیتین به‌شکل پودر جامد به 60 میلی‌لیتر کلریدریک‌اسید غلیظ اضافه و به مدت 1 ساعت با سرعت rpm120 هم زده شد تا کامل حل شود. سپس 200 میلی‌لیتر آب خالص گندزدایی‌شده (دمای 4 درجه سانتی‌گراد) به محلول اضافه شد تا کیتین کلوییدی رسوب کند. کیتین کلوییدی با کاغذ صافی آزمایشگاهی استریل فیلتر و با آب گندزدایی‌شده شسته شد تا به اسیدیته 5/3 رسید (18).

استخراج DNA ژنومی:روش کومار و همکاران[11]برای استخراج DNA از باکتری‌ها استفاده شد (19). حدود 20 میلی‌لیتر باکتری رشد‌کرده روی محیط‌کشت ا.ج.ا، میکروسانتریفیوژ شد (دمای 4 درجه سانتی‌گراد و 14000 دور بر دقیقه برای 2 دقیقه) و یک پلیت باکتری با وزن 200 میلی‌گرم حاصل شد. پلیت تهیه‌شده در 5/0 میلی‌لیتر بافر TE حاوی 50 میلی‌مولار Tris-Hcl (Merck) و 25 میلی‌مولار Na-EDTA (Fluka) هر کدام با اسیدیته 8 و 1/0 درصد PVP (Merck)) کامل‌شده با 20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر لیزوزیم (فرمنتاز) حل شد. تیوب‌ها 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرما‌گذاری شدند و سپس به آنها، 20 میکرولیتر SDS 10 درصد و 20 میکرولیتر پروتئیناز k (25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) اضافه شد (Bioneer). تیوب‌ها 30 دقیقه در دمای 55 درجه سانتی‌گراد گرما‌گذاری شدند و سپس هم‌حجم محلول، از محلول کلروفرم: ایزوآمیل‌الکل (v/v 24 :1) به تیوب‌ها اضافه شد. سپس محلول با سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و دور rpm14000 برای 2 دقیقه رسوب داده شد و مایع رویی به تیوب استریل جدید منتقل شد. سانتریفیوژ با دمای 4 درجه سانتی‌گراد و دور rpm14000 برای 5 دقیقه انجام و DNA رسوب داده شد. مایع رویی دور ریخته و رسوب DNA با 500 میکرولیتر الکل 70 درصد شسته شد. دوباره سانتریفیوژ با دمای 4 درجه سانتی‌گراد و rpm14000 به مدت 2 دقیقه انجام و الکل دور ریخته شد. پلت DNA در دمای اتاق خشک شد و سپس با توجه به مقدار رسوب، پلت DNA در 50 میکرولیتر بافر TE (اسیدیته8) حاوی 20 میکرولیتر بر میلی‌لیتر آنزیم RNase A-DNase І free (فرمنتاز) حل شد. پس از حل‌شدن، تیوب‌ها برچسب زده و در فریزر منفی 20 درجه ذخیره شدند.پس از استخراج DNA، از هر نمونه 3 میکرولیتر DNA استخراج و با دستگاه الکتروفورز افقی ژل آگارز 8/0 درصد بررسی شد (20).

واکنش PCRبرای تکثیر ژن 16S rRNA:برای انجام واکنش از آغازگر طراحی‌شده جهانی برای این ژن استفاده شد؛ ویزبرگ و همکاران[12] این آغازگر را طراحی کرده‌اند (21). توالی آغازگرها و ویژگی‌های آنها در جدول 1 دیده می‌شوند. در تمام آزمایش‌ها از مستر میکس X2 حاوی آنزیم Taq پلیمراز محصول شرکت سیناژن[13] در واکنش‌های PCR استفاده شد.

دماها و زمان‌های اعمال‌شده برای انجام واکنش PCR به‌ترتیب زیر تنظیم شدند: ابتدا 3 دقیقه دمای 94 درجه سانتی‌گراد (دمای واسرشته‌سازی اولیه)، 30 ثانیه دمای 94 درجه سانتی‌گراد (دمای واسرشته‌سازی)، 1 دقیقه دمای 54 درجه سانتی‌گراد (دمای اتصال آغازگرها) و 1 دقیقه و 30 ثانیه دمای 72 درجه سانتی‌گراد (دمای تکثیر) در هر چرخه و دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه (دمای تکثیر نهایی). محصولات واکنش PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد با ولتاژ 90 به مدت 1 ساعت بررسی شدند.

خالص‌سازی محصول PCR و توالی‌یابی قطعه 16S rRNA:به منظور آماده‌سازی و ارسال نمونه‌های تکثیر‌شده برای توالی‌یابی، ابتدا محصولات PCR با استفاده از کیت خالص‌سازی محصولPCR [14] (AccuPrep-Bioneer، کره جنوبی) طبق دستورعمل شرکت سازنده خالص شدند. نمونه‌ها در دو جهت رفت و برگشت و با روش دای‌داکسی‌ریبونوکلئوتید[15]، توالی‌یابی و در پایگاه NCBI در قسمت BLAST جنس و گونه با بیشترین شباهت به هر توالی بررسی شدند.

 

جدول 1- ویژگی‌های آغازگرهای تکثیرکننده ژن 16S rRNA

نام آغازگر

توالی نوکلئوتیدی

تعداد نوکلئوتید

دمای اتصال

طول قطعه (Kb)

27f

5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

20

C° 54

5/1

1525r

5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3'

17

C° 54

 

بررسی اثر باکتری‌های کیتینولایتیک بر قارچ Alternaria alternata در شرایط آزمایشگاه:قارچ بیمارگر A. alternataکه یکی از بیمارگرهای سیب‌زمینی است، از دانشکده گیاه‌پزشکی دانشگاه تهران (پردیس کشاورزی، کرج، ایران) تهیه و محیط سیب‌زمینی دکستروز آگار[16] (اس.دی.آ) (Merck) برای حفظ و نگهداری آن استفاده شد. برای بررسی اثر آزمایشگاهی باکتری‌های کیتینولایتیک بر قارچ A. alternata، ابتدا قارچ A. alternata به‌شکل چمنی (کشت یکنواخت در سطح پلیت) روی محیط‌کشت جامد کشت شد و سپس جدایه‌های مختلف باکتری‌های کیتینولایتیک به‌شکل نقطه‌ای کشت شدند. سپس، پلیت‌ها در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و تاریکی گرماگذاری و تا دو هفته بررسی شدند. در آزمایش دیگری، رقت‌های مختلف (005/0، 05/0 و 5/0 OD600) باکتری‌های کیتینولایتیک مخلوط با قارچ A. alternata کشت شدند. برای این منظور، تمام باکتری‌ها به‌شکل نقطه‌ای و قارچ بیماری‌زای آلترناریا به‌شکل چمنی روی پلیت کشت داده شدند..

بررسی اثر باکتری‌های کیتینولایتیک بر قارچ A. alternate:برای بررسی آثار باکتری‌های کیتینولایتیک روی غده سیب‌زمینی، ابتدا غده‌ها 3 ساعت با آب روان شسته و سپس، 1 ساعت در محلول 1 درصد هیپوکلریت‌سدیم غرق شدند. پس از آن، غده‌ها با آب گندزدایی‌شده شسته و برای آزمایش آماده شدند. در این مرحله، شیارهایی به عمق 1 تا 3 میلی‌متر با تیغ جراحی گندزدایی‌شده روی غده‌‌ها ایجاد شدند و سپس، غده‌ها با قارچ A. alternata تلقیح و به‌عنوان تیمار شاهد مثبت ارزیابی شدند. غده‌هایی تلقیح‌شده با باکتری‌های کیتینولایتیک به‌عنوان تیمار اصلی ارزیابی شدند. تمام تیمارها در دمای اتاق و تاریکی نگهداری و طی مدت چهار هفته بررسی شدند. ویژگی جدایه‌ها به‌شکل قارچ ایستایی بوده است.

 

نتایج.

خالص‌سازی و شناسایی باکتری از خاک:با کشت نمونه‌های خاک، تنوع ظاهری زیادی مشاهده شد (شکل 1 و 2). بررسی‌ها از طریق توالی‌یابی قطعه 16S rRNA نشان داده‌اند که چهار واکشت متوالی از پرگنه‌ها به خلوص کامل جدایه‌ها منجر می‌شود (22). نتایج توالی‌یابی قطعه‌های 16S rRNAپس از بررسی اولیه، مرتب و در پایگاه NCBI در بخش BLAST برای تعیین شبیه‌ترین قطعه 16S rRNAبررسی شدند. قطعه‌های 16S rRNAهر جدایه با درجه شباهت حداقل 97 درصد به نزدیک‌ترین گونه هم‌ردیف شدند. نشان داده شده است که توالی ژن 16S rRNAدر یک جدایه با نزدیک‌ترین، همسایگان حداقل 97 درصد شباهت دارد و یک گونه محسوب می‌شوند (16). بنابراین، باکتری‌های حاصل عبارت بودند از: Pseudomonas sp.، Aeromonas hydrophilaو Pseudomonas nitroreducens و Acinetobacter sp..

 

استخراج DNA:DNA باکتری با روش استخراج یادشده به‌خوبی استخراج و در نهایت، DNA کافی برای انجام واکنش PCR حاصل شد. غلظت DNA خالص‌شده حاصل 245 نانوگرم بر میکرولیتر است. برای هر واکنش 25 و 200 میکرولیتری PCR به‌ترتیب از 100 و 1000 نانوگرم DNA استفاده شد. شکل 3، DNA استخراج‌شده روی ژل آگارز 8 درصد را نشان می‌دهد.

شکل 1- باکتری‌های کیتینولایتیک. هاله شفاف بر اثر هیدرولیز کیتین کلوییدی در محیط ایجاد می‌شود. نتایج پس از رشد در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و تاریکی به مدت 7 روز و دایره‌های قرمز‌رنگ، پرگنه‌های باکتری کیتینولایتیک را نشان می‌دهند.

 

 شکل 2- باندهای DNA استخراج‌شده از چهار نمونه باکتری کیتینولایتیک: 1. Pseudomonassp.، 2. Aeromonashydrophila، 3. Pseudomonasnitroreducens، 4. P. nitroreducens، 5. Acinetobactersp... M: نشانگر DNA (1kb).

 

تکثیر و توالی‌یابی قطعه 16S rRNA: واکنش PCR با استفاده از DNA استخراج‌شده و طبق شرایط یادشده انجام شد. واکنش در مقدار 25 و نیز 200 میکرولیتر به‌خوبی پیش رفت و قطعه با اندازه مدنظر تکثیر شد (شکل 4). باند‌های 16S rRNAبا اندازه 5/1 کیلوباز[17]، کیفیت خوبی روی ژل آگارز 8/0 درصد نشان دادند. باند تکثیرشده، تک باند و وضوح بسیار خوبی داشت و نیازی به استخراج از ژل نبود. واکنش PCR با حجم 200 میکرولیتر انجام شد و باندها در این حالت نیز کیفیت خوبی داشتند.

 

شکل 3- مقایسه توالی آمینواسیدی آنزیم کیتیناز P. nitroreducens با چند آنزیم هومولوگ در گونه باکتری خانواده اکتینومیست و استرپتومایسس. توالی‌ها، شباهت‌های بسیاری نشان دادند، به‌طوری که حداقل شباهت بین P. nitroreducens و Streptomyces durhamensis 42 درصد بود. خط قرمز، محل قرارگیری دمین کاتالیتیک را نشان می‌دهد. باکس قرمزرنگ جایگاه فعال را نشان می‌دهد که کامل حفظ‌شده باقیمانده است. آنزیم کیتیناز از باکتری‌های P. nitroreducens(WP_028689291.1)، Nocardiopsis prasina (BAC45251.1)، Streptacidiphilus jeojiense (WP_030257847.1) و Streptomyces durhamensis(WP_031167453.1) مقایسه شدند.

 

شکل 4- قطعه 16S rRNA تکثیرشده از باکتری 1. Pseudomonassp،2. Aeromonashydrophila،3. P. nitroreducens،4. P. nitroreducens، 5. Acinetobactersp. :M نشانگر DNA (1kb).

 

بررسی اثر باکتری‌های کیتینولایتیک بر قارچ A. alternata در شرایط آزمایشگاه:پس از یافتن باکتری‌های کیتینولایتیک (شکل 5)، آزمایش‌های بعدی برای بررسی آثار این جدایه‌ها بر عامل بیمارگر گیاهی A. alternata انجام شدند. نتایج در تمام آزمایش‌ها برای اطمینان تا 28 روز بررسی شدند، هرچند نتایج پس از گذشت 6 روز تا روز پایان ثابت ماندند (شکل 6). بررسی‌ها نشان دادند که در بین پنج جدایه، تنها جدایه‌های Pseudomonas nitroreducens رشد قارچ را تاحدی محدود می‌کنند (شکل 7). اثر کشت هم‌‌زمان باکتری P. nitroreducens به‌شکل مخلوط با قارچ A. alternata نشان داد که در حضور غلظت‌های زیاد این باکتری (05/0OD600 و بیشتر)، رشد قارچ A. alternata کامل متوقف می‌شود (شکل 8).

شکل 5- باکتری‌های کیتینولایتیک. هاله شفاف بر اثر هیدرولیز کیتین کلوییدی در محیط ایجاد می‌شود. نتایج پس از رشد در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و تاریکی به مدت 4 روز

 

شکل 6- اثر باکتری‌های کیتینولایتیک روی قارچ بیمارگر Alternaria sp.. پرگنه باکتری‌های 11 (P. nitroreducens AHH4)و 12 (P. nitroreducens AHH3)توانایی رقابت با قارچ را داشته‌اند و تا حدودی آن را عقب رانده‌اند. آ. نتیجه پس از 6 روز، ب. نتیجه پس از 28 روز

شکل 7- نمودار اثر باکتری‌های کیتینولایتیک روی قارچ بیمارگر Alternaria sp.. پرگنه باکتری‌های 11 (P. nitroreducens AHH4)و 12 (P. nitroreducens AHH3). محور افقی زمان بر حسب روز و محور عمودی قطر هاله مهاری بر حسب میلی‌متر است.

شکل 8- اثر کشت مخلوط باکتری‌های کیتینولایتیک با قارچ بیمارگر Alternaria sp.. باکتری‌ها باعث رشدنکردن بیمارگر شده‌اند (نتایج پس از 14 روز). غلظت‌های مختلفی از باکتری استفاده شد: 1. غلظت 5/0OD600، 2. غلظت 05/0OD600 و 3. غلظت 005/0OD600.

بررسی اثر باکتری‌های کیتینولایتیک بر قارچ A. alternata در شرایط مزرعه:در مرحله پیش باکتری کیتینو لایتیک Pseudomonas nitroreducens AHH4، عامل ضد A. alternata شناسایی شد و در این مرحله کشت و به‌شکل محلول در آب روی غده‌ها تیمار شد. نتایج، کنترل کامل بیماری را روی غده‌های تلقیح‌شده با A. alternata نشان دادند (شکل 9).

شکل 9- اثر باکتری‌های کیتینولایتیک روی غده‌های سیب‌زمینی در شرایط مزرعه. 1. نمونه شاهد ( بدون باکتری کیتینولایتیک و قارچ A. alternata)، 2. نمونه تیمارشده با قارچ بیماری‌زای A. alternata و رشد این قارچ مشاهده می‌شود، 3. نمونه تیمارشده با قارچ بیماری‌زای A. alternate و باکتری‌های کیتینولایتیک و باکتری‌های کیتینولایتیک از رشد قارچ A. alternata جلوگیری کرده‌اند.

 

بحث و نتیجه‌گیری

تاکنون چندین سویه باکتری و قارچ با توانایی کیتینولایتیک شناسایی شده‌اند؛ ازجمله Serratia mercescensبرای کنترلSclerotium rolfsii(23)، Paenibacillus illinoisensis علیه Rhizoctonia solani Kuhn(24) وTrichoderma harzianumبرای کنترلBotrytis cinerea (25). همچنین، تعدادی از ژن‌های کیتیناز متعلق به گونه‌های مختلف Streptomycesمانند S. coelicolo (26)، S. griseus (27) و S. olivaceoviridis(28) جداسازی و ویژگی‌های آنها تعیین شده‌اند. طی پژوهشی، ژن این آنزیم (ChiC) به‌شکل نوترکیب در گیاه برنج با پروموتور CaMV 35S کلون شد و برنج‌های تراریخت از رشد قارچ Magnaporthe grisea عامل بیماری بلاست جلوگیری کردند.

باکتری Pseudomonas stutzeri، باکتری ضد قارچ Fusarium solani شناخته می‌شود و رشد هیف‌های قارچی را در ریشه‌های گیاهی کنترل می‌کند. آنزیم‌های کیتیناز خارج سلولی P. stutzeri، باعث این عمل و نیز لیزشدن میسلیوم قارچ در ریزوسفر[xviii] گیاه می‌شوند. ژن ChiC، کدکننده آنزیم کیتینازی است که در این گونه شناسایی شده است. ویوات و همکاران، ژن آنزیم کیتیناز باکتری‌های Aeromonas hydrophila وPseudomonas maltophila (CTS) را برای افزایش فعالیت آفت‌کشی به باکتری Bacillus thuringiensisمنتقل و پروتئین مدنظر را تولید کردند (11).

روبرت و همکاران[xix]، کیتینازهای گیاهی را برای فعالیت ضدقارچی و ویژگی آنزیم‌ها مطالعه کردند. طبق این مطالعه‌ها، کیتینازهای جداشده از دانه گندم، جو و ذرت به‌عنوان اندو-کیتیناز عمل می‌کنند و مانع رشد هیف‌ها می‌شوند (29). همچنین مشاهده شده است که گسترش کندتر بیماری توسط Sclerotium rolfsiiروی دانه‌های لوبیا در حضورSerratia marcescens با فعالیت شدید کیتینازی رخ می‌دهد. شاپیرا و همکاران[xx] نیز ژن کیتیناز S. marcescens را در E. coli کلون کردند و آماده‌سازی کیتیناز به‌طور مؤثری بیماری ایجادشده توسط S. rolfsiiدر لوبیا وR. solaniدر پنبه را در شرایط گلخانه کاهش داد (30).

در ابتدای کار برای جداسازی باکتری کیتینولایتیک از آنتی‌بیوتیک Rifampicin به‌عنوان ماده جلوگیری‌کننده از رشد سایر باکتری‌ها و Amphotericin B به‌عنوان ماده قارچ‌کش استفاده شد. برای گزینش اکتینومیست‌ها و جلوگیری از رشد سایر باکتری‌هایی که نمی‌توانند از کیتین استفاده کنند، به‌جای گلیسرول در محیط‌کشت Actinomycete isolation agar فقط از کیتین کلوییدال (منبع کربن) استفاده شد.

اکتینومیست‌ها، باکتری‌هایی هستند که شباهت بسیاری به قارچ‌ها دارند. سرده‌های این خانواده مانند استرپتومایسس و نوکاردیا منابع عظیمی برای تولید انواع آنتی‌بیوتیک‌هایی هستند که در پزشکی و گیاه‌پزشکی استفاده‌ می‌شوند. امروزه، باکتری‌های استرپتومایسس و نوکاردیا در مراکز پژوهشی از خاک و به‌ویژه خاک‌های قلیایی (دارای اسیدیته 7 تا 9) غربال می‌شوند. سپس با تعیین قدرت ضد میکروبی و آزمایش تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی، گونه‌ها و سویه‌های قوی از نظر تولید مواد ضد میکروبی انتخاب و چنانچه ماده مؤثر ضد میکروبی روی جمعیت داوطلب انسانی تأیید شود، به بازار مصرف معرفی می‌شود (31 و 32). در ادامه، قطعه 16S rRNAتکثیر‌شده و نتایج توالی‌یابی قطعه‌های 16S rRNAپس از بررسی اولیه، مرتب و در پایگاه NCBI در بخش BLAST برای تعیین شبیه‌ترین قطعه 16S rRNA بررسی شدند. قطعه 16S rRNA تمام باکتری‌ها با شباهت حداقل 97 درصد به جنس یا گونه‌های ثبت‌شده در پایگاه موجود بود. بر اساس نتایج بدویی دلفارد و همکاران[xxi] ال- آسپاراژیناز نوترکیب تعیین توالی شد و نتایج همردیفی نشان می دهد که توالی پیشنهادی اسید آمینه ایی شباهت بالایی با ال- آسپاراژینازهای سایر سودوموناس ایروجینوزها در حدود 99 درصد دارد(33) .در نهایت، با بررسی آثار باکتری‌های کیتینولایتیک در شرایط آزمایشگاهی نشان داده شد که در حضور غلظت‌های زیاد (05/0OD600 و بیشتر)، رشد قارچ A. alternata کامل متوقف می‌شود. همچنین، این جدایه از بیماری غده سیب‌زمینی در شرایط مزرعه توسط قارچ بیمارگر جلوگیری کرد و بنابراین باکتری کیتینولایتیک P. nitroreducens Strain AHH4 به‌طور کارآمدی توانایی بازدارندگی رشد قارچ A. alternata را دارد. با انجام مطالعه‌های تکمیلی و دست‌ورزی مناسب، سویه بسیار امیدبخش (P. nitroreducens) برای کنترل بیماری‌های قارچی معرفی می‌شود.



[1]- IUBMB

[2]- Endo-1,4-b-glucanase

[3]- b-N-Acetylhexosaminidase

[4]- Lim

[5]- Wiwat

[6]- Actinomycete isolation agar  

[7]- Rifampicin

[8]- Fermentas

[9]- Amphotericin B

[10]- Hsu

[11]- Kumar

[12]- Weisburg

[13]- CinnaGen

[14]- AccuPrep Gel purification Kit

[15]- Dideoxyribonucleotide

[16]- Potato Dextrose Agar

[17]- Kb

[xviii]- Rhizosphere

[xix]- Roberts

[xx]- Shapira

 

(1) Hamid R., Khan MA., Ahmad M., Ahmad MM., Abdin MZ., Musarrat J., et al. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2013; 5: 21-29.

 

 

 (2) Lorito M., Harman GE., Hayes CK., Broadway RM., Tronsmo A., Woo SL., et al. Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum; Antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology 1993; 83: 302-307.

(3) Haran S., Shickler H., Chet I. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biocontrol activity of Trichoderma harzianum. Microbiology 1996; 142: 2321-2331.

(4) Limon MC., Lora JM., Garcia I., De la Cruz J., Liobell A., Benitez Tet al. Primary structure and expression pattern of the 33-kDa chitinase gene from the mycoparasitic fungus - Trichoderma harzianum. Current. Genetic 1995; 28: 478-483.

(5) De la Vega H., Specht CA., Liu Y., Robbins PW. Chitinases are a muti-gene family in Aedes, Anopheles and Drosophila. Insect Molecular Biology 1998; 7: 233-239.

(6) Wen CM., Tseng CS., Cheng CY., Li YK. Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus sp. NCTU2. Biotechnology and Applied Biochemistry 2002; 35: 213-219.

(7)Revah-Moiseev S., Carroad A. Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to single-cell protein. Biotechnology and Bioengineeing 1981; 23: 1067-1078.

(8) Herrera-Estrella A., Chet I. Chitinases in biological control. Experientia. Supplementum 1999; 87: 171-184.

(9) Lim HS., Kim YS., Kim SD. Pseudomonas stutzeri YPL-1 Genetic Transformation and Antifungal Mechanism against Fusarium solani, an Agent of Plant Root Rot. American Society for Microbiology 1990; 57: 510-516.

(10) Folders J., Jon A., Marc SR., Leendert C., Van L., Jan T., Wilbert B. Characterization of Pseudomonas aeruginosa Chitinase, a Gradually Secreted Protein. Journal of Bacteriology 2001; 183: 7044-7052.

(11) Wiwat C., Lertcanawanichakul M., Siwayapram P., Pantuwatana S., Bhumiratana A. Expression of chitinase-encoding genes from Aeromonas hydrophila and Pseudomonas maltophila in Bacillus thuringiensis spp. isrealiensis. Gene. 1996; 179: 119-126.

(12) Leemann M., Den Ouden FM., Van Pelt JA., Cornelissen C., Matamala GA., Akker PAHM., Schippers B. Suppression of Fusarium wilt of radish by co-noculation of fluorescent Pseudomonas spp. and root-colonizing fungi. European Journal of Plant Pathology 1996; 102: 21-31.

(13) Lemanceau P., Bakker PAHM., Dekogel WJ., Alabouvette C., Schippers B. Effect of pseudobactin 358 production by Pseudomonas putida WCS358 on suppression of Fusarium wilt of carnations by nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47. Biocontrol Science and Technology 1992; 58: 2978-2982.

(14) Raaijmarkers JM., Leeman M., Van Oorschot MMP., Van Der Sluis I., Schippers B., Bakker PAHM. Dose-response relationships in biological control of Fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp. Phytopathology 1995; 85:1075-1081.

(15) Dehnad A., Esmaili E., Solouki M. Isolation and molecular identification chitinase-producing Streptomyces strains and examination of their in-vitro antagonistic effects. Biological Journal of Microorganism 2015; 4(15): 123-134.

(16) Semedol LTA., Linhares RC., Gomes GP., Manfi CS., Alviano LF., Linhares R. Isolation and characterization of actinomycetes from Brazilian tropical soils. Microbiological research 2001; 155: 291-299.

(17) Petti CA. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing. Clinical infectious diseases 2007; 44: 1108-1114.

(18) Hsu SC., Lockwood JL. Powdered chitin agar as a selective medium for enumeration of actinomycetes in water and soil. Applied Microbiology 1975; 29: 422-426.

(19) Kumar V., Alpana B., Omprakash G., Gajraj SB. An improved method for isolation of genomic DNA from filamentous actinomycetes. Journal of Sciences Engineering and Technology Management 2010; 2: 10-13.

(20) Sambrook J., Russell DW., editors. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

(21) Weisburg WG., Barns SM., Pelletier DA., Lane DJ. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of bacteriology1991; 173: 697-703.

(22) Benson S. Microbiological Applications, Laboratory Manual, 8th ed. The McGraw−Hill Science/Engineering/Math; 2001.

(23)Ordentlich A., Elad Y., Chet I. The role of chitinase of Serratia mercesens in biocontrol of Sclerotium rolfsii. Journal of Phytopathology 1988; 78: 84-88.

(24) Jung WJ., An KN., Jin YL., Park RD., Lim KT., Kim KY., et al. Biological control of damping-off caused by Rhizoctonia solani using chitinaseproducing Paenibacillus illinoisensis KJA-424. Soil Biology & Biochemistry 2003; 35: 1261-1264.

(25) Tronsmo A. Biological and integrated controls of Botrtis cinerea on apple with Trichoderma harzianum. Biological Control 1991; 1: 59-62.

(26) Saito A., Fujii T., Yoneyama T., Redenbach M., Ohno T., Watanable T., et al. High-multiplicity of chitinase genes in Streptomyces coelicolor A3 (2) Biosci. Biotechnology, and Biochemistry 1999; 63(4): 710-718.

(27) Ohno T., Aemand S., Hata T., Nikiadou N., Henrissat B., Mitsutomi M., et al. A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037. Journal of Bacteriology 1996; 178: 5065-5070.

(28) Blaak H., Schnellmann J., Walter S., Henrissat B., Schrempf H. Characteristics of an exochitinase from Streptomyces olivaceoviridis, its corresponding gene, putative protein domains and relationship to other chitinases. European Journal of Biochemistry 1993; 214: 659-669.

(29) Roberts WA., Selitrennikoff CP. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity. Microbiology 1988; 134: 169-176.

(30) Shapira R., Ordentlich A., Chet I., Oppenheim AB. Control of plant disease by chitinase expressed from cloned DNA in Escherichia coli. Phytopathology 1989; 79: 1246-1249.

(31) Ghai R., McMahon KD., Rodriguez-Valera F. Breaking a paradigm: cosmopolitan and abundant freshwater actinobacteria are low GC. Environmental Microbiology Reports. 2012; 4(1): 29–35.

(32) Servin JA, Herbold CW, Skophammer RG, Lake JA. Evidence excluding the root of the tree of life from the actinobacteria. Molecular Biology and Evolution 2008; 25(1): 1-4.

(33) Badoei-dalfard A, Karami Z, Ramezani-pour N. Gene sequencing, cloning, and expression of the recombinant L- Asparaginase of Pseudomonas aeruginosa SN4 strain in Escherichia coli. Biological Journal of Microorganism 2016; 4 (16) :11- 20.