اثر افزودن اکسید‌روی بر رفتار آنتی‌باکتریال داربست کامپوزیتی هیدروکسی‌آپاتیت-پلی‌لاکتیک‌کوگلایکولیک‌اسید برای کاربردهای مهندسی بافت استخوان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه مهندسی بافت، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران

2 استادیار بیوشیمی، گروه بیوشیمی، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران

3 استادیار شیمی، گروه شیمی، واحد نجف آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، نجف آباد، ایران

چکیده

مقدمه: عفونت پس از عمل جراحی یکی از معضلات کاشت داربست‌های استخوانی است که به‌طور معمول با تجویز آنتی‌بیوتیک‌ها درمان می‌شود. این درمان به‌علت خون‌رسانی ضعیف به بافت استخوان با غلظت‌های زیاد دارو انجام و به مشکلات کبدی و کلیوی منجر می‌شود.
مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، اثر افزودن اکسیدروی (ZnO) بر رفتار آنتی‌باکتریال داربست کامپوزیتی هیدروکسی‌آپاتیت-پلی‌لاکتیک‌کوگلایکولیک‌اسید ارزیابی شد. کامپوزیت تولیدی با پراش اشعه ایکس، میکروسکوپ الکترونی روبشی مجهز به آنالیز عنصری و طیف‌سنجی فروسرخ مشخصه‌یابی شد. دو سویه باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس (ATTC 25922) و گرم منفی اشریشیاکلی (ATTC 25923) برای آزمون آنتی‌باکتریال داربست تولیدی استفاده شدند.
نتایج: نتایج نشان دادند که داربست کامپوزیتی هیدروکسی‌آپاتیت-پلی‌لاکتیک‌کوگلایکولیک‌اسید‌ در محیط‌کشت باکتری‌ها هاله‌ رشدنکردن ایجاد نکرد ولی اصلاح سطح داربست با اکسیدروی باعث ایجاد هاله‌ رشدنکردن 12 و 20 میلی‌متری به‌ترتیب برای باکتری‌های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس شد.
بحث و نتیجه‏گیری: این مطالعه نشان داد که افزودن عامل ضد‌باکتریایی به داربست‌های کاربردی در حوزه مهندسی بافت استخوان می‌تواند راه‌حل مناسبی برای جلوگیری از رشد عفونت در محل کاشت داربست باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of Zinc Oxide Addition on Antibacterial Behavior of Hydroxyapatite-Poly lactic-co-glycolic acid Scaffold for Bone Tissue Engineering Applications

نویسندگان [English]

  • Narges Abotalebi 1
  • Elahe Poorazizi 2
  • Hossein Abbas tabar ahangar 3
1 M.Sc. Student, Department of Tissue Engineering, Najafabad Branch, Islamic Azad University, Najafabad, Iran
2 Assistant Professor of Biochemistry, Department of Biochemistry, Najafabad Branch, Islamic Azad University, Najafabad, Iran
3 Assistant Professor of Chemistry, Department of Chemistry, Najafabad Branch, Islamic Azad University, Najafabad, Iran
چکیده [English]

Introduction: Infection after the surgery is one of the problems of bone scaffolds implants which is normally treated by systemic administration of antibiotics. But due to the poor blood circulation in bone tissue, large antibiotic doses are needed which lead to further drawbacks to renal and hepatic systems.
Material and method: In this study, the effect of zinc oxide addition on antibacterial behavior of hydroxyapatite- Poly lactic-co-glycolic acid scaffold was evaluated. The synthesized composite was characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy equipped with elemental analysis and Fourier transform infrared spectra. In order to determine the antibacterial activity of the fabricated scaffold, Staphylococcus aureus (ATTC 25922) and Escherichia coli (ATTC 25923) were used as test microorganisms.
Results: The results showed that Hydroxyapatite- Poly lactic-co-glycolic acid scaffold did not make inhibition zone in culture medium but the modification of Hydroxyapatite- Poly lactic-co-glycolic acid scaffold’s surface by zinc oxide particles caused Hydroxyapatite- Poly lactic-co-glycolic acid- zinc oxide scaffold to have antibacterial inhibition zone of 12 and 20 mm for Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively.
Discussion and conclusion: This study revealed that the addition of antibacterial agent to applicable bone tissue engineering scaffolds could be considered as an appropriate way to prevent the growth of infection at the scaffold site. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bone Tissue Engineering
  • Antibacterial
  • Zinc Oxide
  • Hydroxyapatite
  • Escherichia coli
  • Staphylococcus aureus

مقدمه

با توجه به افزایش جمعیت کشورهای مختلف در دهه‌های اخیر، بیماری‌های استخوانی بیش از گذشته در جمعیت میانسال و کهنسال دیده می‌شوند. استفاده از پیوند اتوژنیک و آلوژنیک برای درمان نقص‌های ساختمانی تاریخچه طولانی دارد؛ اگرچه پیوند اتوژنیک عملکرد بهتری درباره زیست‌سازگاری و سایر عامل‌ها دارد، به عمل جراحی دوم برای دریافت بافت اهداکننده نیاز است. در پیوند آلوژنیک نیز خطر عفونت و پس‌زدن وجود دارد و حتی ممکن است باعث انتقال بیماری شود و بر کیفیت زندگی تأثیر گذارد. پیوند استخوان با داربست‌هایی که از زیست‌مواد طبیعی و مصنوعی ساخته می‌شوند مانند فلزات، سرامیک‌ها، پلیمرها و کامپوزیت‌ها روشی تأییدشده برای غلبه‌کردن بر این مشکلات است. از آنجا که بافت استخوان به‌شکل طبیعی شامل نانوکامپوزیت سرامیکی (کلسیم‌فسفات)-پلیمری (کلاژن) است، استفاده از کامپوزیت‌ها برای تولید داربست استخوانی با ویژگی‌های مکانیکی مناسب ضروری است (1 و 2).

هیدروکسی-آپاتیت (HAp)[1] با فرمول شیمیایی Ca10(PO4)6(OH)2 درجه زیادی از پایداری شیمیایی و زیست‌سازگاری در محیط فیزیولوژیک بدن دارد و به‌طور گسترده به‌عنوان پرکننده نقص‌های استخوانی استفاده می‌شود. با وجود این، استفاده از این ماده در داربست‌های مهندسی بافت استخوان به‌شکل مستقل محدود شده است زیرا این زیست‌سرامیک استحکام کششی ضعیفی دارد (3). در برابر زیست‌سرامیک‌ها، زیست‌پلیمرها مطرح می‌شوند که انواع زیست‌سازگار آنها انعطاف‌پذیر هستند و به‌آسانی تغییر شکل می‌دهند.

از معروف‌ترین و پرکاربردترین پلیمرهای زیست‌تخریب و زیست‌سازگار در مهندسی بافت و سیستم‌های رهایش دارو ترکیب دو پلیمر لاکتیک‌اسید (PLA)[2] و گلایکولیک‌اسید (PGA)[3] یعنی کوپلیمر پلی‌لاکتیک‌کوگلایکولیک‌اسید[4] (PLGA) است؛ این کوپلیمر با نسبت‌های مختلفی از PLA و PGA و با وزن‌های مولکولی مختلف در دسترس و تأییدشده سازمان غذا و داروی آمریکا FDA)) است. به‌علت ویژگی‌های منحصربه‌فرد از جمله زیست‌سازگاری، ویژگی‌های فیزیکی و مکانیکی خوب و زیست‌تخریب‌پذیری، این زیست‌ماده برای مهندسان بافت و پژوهشگران درخور توجه ویژه است (4). یکی از مشکلات کاشت داربست‌های استخوانی، عفونت پس از عمل جراحی است و چنانچه این عفونت‌ها به‌شکل مناسب درمان نشوند، به مشکلی جدی تبدیل شده و عمل جراحی دوم را در پی خواهند داشت. به‌طور معمول، پزشکان پس از کاشت داربست استخوانی، داروهای آنتی‌بیوتیک تجویز می‌کنند ولی چون خون‌رسانی به بافت استخوان ضعیف است، غلظت‌های زیادی از دارو نیاز است که باعث مسمومیت دارویی و مشکلات کبدی-کلیوی می‌شود (5). یکی از راهکارهای مؤثر جایگزین که توجه پژوهشگران را جلب کرده، استفاده از عوامل آنتی‌باکتریال معدنی در داربست‌های استخوانی است؛ این عوامل قادرند از رشد باکتری به‌شکل موضعی در محل کاشتنی جلوگیری کنند (6).

در سال‌های اخیر، اثر افزودن یون‌های نقره، مس و روی بر رفتار آنتی‌باکتریال HAp بررسی شده است. همچنین، ماتسوموتو[5] و همکاران اثر افزودن یون‌های مس (Cu)، نقره (Ag) و روی (Zn) به ترکیب بتاتری‌کلسیم‌فسفات (TCP) و رفتار آنتی‌باکتریال آن را بررسی کردند؛ نتایج، نشان دادند که از نظر آنتی‌باکتریالی کامپوزیت‌های AgCu-TCP و AgZn-TCP فعال‌تر از کامپوزیت Ag-TCP هستند (7). دلیما[6] و همکاران نیز اثر افزودن یون‌های دو ظرفیتی Pb2+، Cu2+، Mg2+، Co2+ و Zn2+ را بر رفتار زیستی HAp بررسی کردند (8). ژائو[7] و همکاران در سال 2011، فعالیت آنتی‌باکتریال نانوکامپوزیت مس جایگزین‌شده در HAp پلی‌یورتان را در برابر باکتری‌های اشریشیاکلی[8] و استافیلوکوکوس اورئوس[9] بررسی کردند؛ نتایج نشان دادند که فعالیت آنتی‌باکتریال نانوکامپوزیت یادشده در حضور یون مس بهبود یافت (9). هدف پژوهش حاضر، ساخت داربست کامپوزیتی HAp-PLGA لایه نشانی‌شده با اکسیدروی (ZnO) و بررسی رفتار آنتی‌باکتریال ZnO روی این داربست برای کاربرد در مهندسی بافت استخوان است. نوآوری این پژوهش، پوشش‌دهی کامپوزیت HAp-PLGA با ZnO و بررسی ویژگی‌های آنتی‌باکتریال آن در برابر دو سویه باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس برای نخستین بار است.

 

مواد و روش‌ها

مواد: HAp طبیعی از استخوان ران گوساله تهیه شد. نیترات‌روی شش‌آبه (Zn(NO3)2.6H2O)، کربوکسی‌متیل‌سلولز و پلی‌لاکتیک‌کوگلایکولیک‌اسید از کمپانی سیگما-آلدریچ (آمریکا) و سدیم‌تری‌پلی‌فسفات (Na5P3O10) با درصد خلوص بیش از 94 درصد، سدیم‌هیدروکسید با خلوص 85 درصد، سیتریک‌اسید و دی‌کلرو‌متان از کمپانی مرک (آلمان) خریداری شدند.

تهیه داربست PLGA-HAp-ZnO:

تهیه پودر HAp: در پژوهش حاضر، HAp طبیعی از منبع زیستی استخوان ران گوساله تهیه‌ شد. ابتدا قسمت‌های اسفنجی استخوان، مغز استخوان و تکه‌های گوشت و چربی از قسمت متراکم استخوان جدا و سپس، با مشعل به قسمت متراکم استخوان حرارت مستقیم داده شد تا ترکیبات آلی سوخته و از آن خارج شوند. ماده حاصل به‌علت داشتن کربن ناشی از سوختن، سیاه‌ شد؛ برای خارج‌کردن این کربن سیاه‌، استخوان به مدت 2 ساعت درون کوره الکتریکی با دمای 1200 درجه سانتی‌گراد در مجاورت هوا حرارت داده شد و سپس، استخوان سیاه‌رنگ به استخوان سفیدرنگ و طی فرایند بالمیل، پودر سفیدرنگ تبدیل شد (10).

ساخت داربست PLGA: برای ساخت داربست HAp-PLGA از اسفنج پلی‌یورتان (PU)[10]، پودر تهیه‌شده HAp، کربوکسی‌متیل‌سلولز و سدیم‌تری‌فسفات استفاده شد. ابتدا، اسفنج‌های پلی‌یورتان در ابعاد 1×1×1 سانتی‌متر بریده شدند. برای ساخت هر داربست، 1/0 گرم سدیم‌تری‌پلی‌فسفات در 10میلی‌لیتر آب جوش حل و سپس روی آن نایلون کشیده و کنار گذاشته شد. 10 میلی‌لیتر آب مقطر به‌ مدت 5 دقیقه با همزن مغناطیسی گرم و سپس به‌آرامی 1 گرم پودر HAp تهیه‌شده به آن اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، 3/0گرم کربوکسی‌متیل‌سلولز کم‌کم به این محلول اضافه شد و مواد 20 دقیقه با هم مخلوط شدند؛ به این محلول از سدیم‌تری‌پلی‌فسفات حل‌شده در آب به‌اندازه‌ای اضافه شد که محلول قوام مناسبی داشته‌ باشد. سپس، 1 قطعه اسفنج پلی‌یورتان درون محلول حاصل غوطه‌ور و 24 ساعت درون آون با دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد تا خشک شود. قطعه اسفنج پلی‌یورتان خشک‌شده به مدت 2 ساعت و با نرخ سرعت گرم‌شدن 2 درجه بر دقیقه در دمای 600 درجه سانتی‌گراد درون کوره الکتریکی قرار گرفت و 1 ساعت در این دما نگه داشته شد، دوباره با همان نرخ سرعت گرم‌شدن به دمای 1200 درجه سانتی‌گراد رسید و 1 ساعت در این دما نگه داشته شد و سپس به دمای محیط رسید. داربست تولیدی به محلول PLGA (1 گرم PLGA در 15 میلی‌لیتر دی‌کلرومتان) اضافه و 1 دقیقه درون محلول غوطه‌ور شد. پس از آن، نمونه به کمک قیف بوخنر و در خلأ صاف شد تا ذرات PLGA داخل منافذ داربست وارد شوند. دوباره داربست 30 ثانیه در محلول PLGA قرار گرفت تا پوشش‌دهی کامل شود. داربست پوشش ‌داده‌ شده 2 ساعت درون آون و در دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت تا خشک شود. گفتنی است که برای استریل‌کردن داربست تهیه‌شده، ابتدا داربست درون پتری‌دیش استریل‌شده‌ قرار داده شد و سپس شش وجه داربست، 20 دقیقه زیر هود لمینار با اشعه UV استریل شدند (10).

تهیه ZnO و اصلاح داربست با آن: برای تولید ZnO، دو محلول A و B تهیه شدند: محلول A: 4/2گرم نیترات‌‌روی شش‌آبه در 30 میلی‌لیتر آب مقطر حل و سپس برای کنترل اندازه ذرات، 2 گرم سیتریک‌اسید به آن اضافه و 5 دقیقه روی همزن مغناطیسی قرار داده شد. محلول B: 6/3 گرم سود در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل و به‌وسیله بورت قطره‌قطره به محلول A افزوده شد. سپس، ذرات ZnO با سانتریفیوژ جداسازی شدند. ZnO حاصل با آب مقطر شستشو و 24 ساعت در دمای 70 تا 80 درجه سانتی‌گراد درون آون خشک شد. برای حذف کامل سیتریک‌اسید، به مدت 4 ساعت درون کوره الکتریکی و دمای 500 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت (11 و 12).

آماده‌سازی داربست اصلاح‌شده با ذرات ZnO در شرایط استریل و زیرهود لمینار انجام شد. برای هر داربست، 1/0 گرم پودر ZnO در 5 میلی‌لیتر آب مقطر درون لوله آزمایش غوطه‌ور شد و سپس، داربست HAp پوشش داده‌ شده با PLGA درون محلول قرار گرفت. سپس، لوله‌ها با پنبه مسدود شدند و 24 ساعت درون آون با دمای 50 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.

آماده‌سازی محیط‌کشت باکتری‌ها و آزمون آنتی‌باکتریال: از سویه‌های باکتری‌های گرم منفی اشریشیا کلی (ATTC 25923) و گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس (ATTC 25922) برای بررسی ویژگی‌های آنتی‌باکتریال داربست تولیدی استفاده شد. این باکتری‌ها پیش از استفاده در شرایط هوازی و در محیط مولرهینتون براث[11]، 24ساعت در دمای 37درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. پس از کشت 24ساعته باکتری‌ها، غلظتی معادل استاندارد نیم مک فارلند تهیه و به‌کمک سواپ استریل روی پلیت حاوی محیط‌کشت مولرهینتون آگار کشت خطی یکنواخت داده شد. برای خروج رطوبت، داربست‌های‌ HAp-PLGA حاوی و فاقد ZnO زیر هود لمینار قرار گرفتند و با پنس استریل به درون پتری‌دیش‌های کشت مولرهینتون آگار (پتری‌دیش حاوی کشت باکتری اشریشیاکلی و پتری‌دیش حاوی کشت باکتری استافیلوکوکوس اورئوس) منتقل شدند. پس از انتقال، اندکی با پنس به داربست‌ها فشار وارد شد تا ا درون محیط کشت مولرهینتون آگار ثابت شوند. در پایان، پتری‌دیش‌های کشت مولرهینتون آگار و داربست‌های ثابت‌شده درون آنها 18 ساعت درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.

ریخت‌شناسی داربست‌ها: ریخت‌شناسی و ساختار داربست‌های کامپوزیتی HAp-PLGA-ZnO و HAp-PLGA با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM, Philips ESEMXL30) مجهز به آنالیز عنصری (EDS) بررسی شد. همچنین، اندازه تخلخل‌ داربست‌های تهیه‌شده با نرم افزار Digi mizer اندازه‌گیری شد.

پراش پرتو ایکس: ترکیب فازی داربست HAp-PLGA-ZnO با پراش اشعه ایکس (XRD) مدل Philips TW3710 بررسی شد.

طیف‌سنجی FTIR: طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه مدل JASCO6300 برای شناسایی و تعیین گروه‌های عاملی و پیوندهای داربست‌های تهیه‌شده استفاده شد.

 

نتایج

بررسی ریخت‌شناسی داربست‌ها: شکل 1- الف و ب به‌ترتیب تصاویر SEM همراه با آنالیز عنصری (EDS) داربست‌های کامپوزیتی HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO را نشان می‌دهد. در شکل 1- الف، داربست کامپوزیتی HAp-PLGA دارای سطوح ناهموار همراه با تخلخل است. پس از فرایند لایه‌نشانی کامپوزیت HAp-PLGA با ZnO، این ذرات به‌شکل ذرات بلوری روی سطح کامپوزیت HAp-PLGA مشاهده می‌شوند (شکل 1- ب). نتایج نشان دادند که میانگین اندازه منافذ برای داربست‌های HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO به‌ترتیب برابر 365 و 332 میکرومتر است. نتایج آنالیز عنصری داربست HAp-PLGA در شکل 1- الف، حضور عناصر کلسیم، فسفر و کربن را در این داربست تأیید می‌کند و این عناصر به‌ترتیب به ساختارهای HAp و PLGA نسبت داده می‌شوند. با مقایسه تصاویر آنالیز عنصری داربست HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO، حضور قله‌های عنصر Zn در تصویر آنالیز عنصری داربست HAp-PLGA-ZnO (شکل (1- ب) به‌وضوح دیده می‌شود. از تصاویر SEM همراه با آنالیز عنصری (EDS) داربست‌های کامپوزیتی HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO می‌توان نتیجه گرفت که ZnO با موفقیت سطح داربست HAp-PLGA را اصلاح کرده است.

بررسی الگوی پراش اشعه ایکس (XRD): پراش اشعه X نمونه‌های HAp، ZnO و HAp-PLGA-ZnO به‌ترتیب در شکل 2- الف، ب و ج ارائه شده است. HAp، بسیار بلوری است و قله‌هایی با شدت θ2 مساوی ˚26، ˚32، ˚40، ˚46 و ˚49 نشان داده است که این قله‌ها با کارت JCPDS به شماره 0432-009 مربوط به الگوی پراش اشعه ایکس HAp مطابقت دارند. همان‌طور که در شکل 2- ب دیده می‌شود، ZnO قله‌های تیزی در موقعیت‌های θ2 مساوی ˚31، ˚34، ˚36، ˚47، ˚56، ˚62 و˚67 دارد که ماهیت بلوری ZnO را نشان می‌دهد (13). داربست کامپوزیتی HAp-PLGA-ZnO تمام قله‌های ویژه ZnO و HAp را نشان می‌دهد (شکل 2- ج) که ماهیت بلوری این داربست کامپوزیتی را تأیید می‌کند. همچنین دو قله موجود در داربست کامپوزیتی HAp-PLGA-ZnO واقع در موقعیت‌های θ2 مساوی ˚36 و ˚47 به‎ترتیب نماینده صفحات بلورینه (1 0 1) و (2 0 1) مربوط به ZnO هستند و با کارت JCPDS شماره 0888-003 مربوط به الگوی پراش اشعه ایکس ZnO تطابق دارند. کاهش شدت قله‌های داربست کامپوزیتیHAp-PLGA-ZnO نسبت به قله‌های ZnO و HAp خالص، کاهش درجه تبلور این داربست کامپوزیتی را با توجه به ترکیب PLGA آمورف نشان می‌دهد.

شکل 1- تصاویر SEM داربست‌های الف. HAp-PLGA، ب. HAp-PLGA-ZnO

شکل 2- الگوی پراش اشعه ایکس الف. HAp، ب. ZnO، ج HAp-PLGA-ZnO


بررسی طیف‌سنجی فروسرخ (FTIR): طیف‌سنجی FTIR برای توصیف گروه‌های عاملی HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO انجام شد (شکل 3). به‌طور معمول، FTIR برای ارزیابی بیشتر شیمی سطح و ویژگی‌های مواد استفاده می‌شود (14). در طیف FTIR مربوط به HAp-PLGA، چند باند ویژه PLGA در cm-1 1033 (C-O کششی)، cm-1 1458 (اتیل-CH2)، cm-1 1769 (کربونیل کششی)، cm-12851 -CH) کششی) و cm-1 3566 (-OHکششی) بهوضوح دیده می‌شوند. همچنین، HAp پنج باند مادون قرمز مهم واقع در cm-1 576، cm-1 601، cm-1 631، cm-1 1033 و cm-1 3566 را نشان می‌دهد. در میان این باندها، دو باند در cm-1 3566 و cm-1 631 مشاهده می‌شوند که به پیوند هیدروژنی یون OH به‌ترتیب در حالت کششی و آزاد متعلق هستند. علاوه بر این، گروه‌های cm-1 1033، cm-1 601 و cm-1 576 ناشی از گروه‌های فسفات هم دیده می‌شوند. در طیف FTIR داربست کامپوزیتی HAp-PLGA-ZnO، تمام باندهای ویژه HAp-PLGA مشاهده شدند (15). تنها تفاوت بین طیف FTIR داربست HAp-PLGA-ZnO و HAp-PLGA، حضور قله‌‌های موقعیت cm-1 2940 و cm-1 2991 متعلق به گروه‌های آلکان CH کششی و قله‌های cm-1 1609 و cm-1 1376 به‌ترتیب مربوط به باند کششی نامتقارن و متقارن ZnO است. حضور این گروه‌ها در طیف FTIR مربوط به داربست HAp-PLGA-ZnO، وجود اکسیدروی را در داربست HAp-PLGA تأیید می‌کند.

شکل 3- طیف FTIR کامپوزیت‌های HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO

 بررسی رفتار آنتی‌باکتریال داربست‌ها: شکل 4، نتایج آزمون آنتی‌باکتریال داربست کامپوزیتی HAp-PLGA حاوی و فاقد اکسیدروی را نشان می‌دهد. در این پژوهش، دو سویه باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس برای ارزیابی رفتار آنتی‌باکتریال داربست‌ها انتخاب شدند.

 استافیلوکوکوس اورئوس باکتری گرم مثبت، بی‌هوازی اختیاری و یکی از شایع‌ترین باکتری‌های بیماری‌زاست که با تولید رنگدانه طلایی کاروتنوئیدی به‌نام استافیلوزانتین، کلنی‌های زردرنگی ایجاد می‌کند. این رنگدانه در بیماری‌زایی نقش دارد زیرا به‌عنوان ماده آنتی‌اکسیدان عمل کرده و موجب در امان‌ماندن باکتری در برابر رادیکال‌های آزاد اکسیژنی می‌شود که سیستم ایمنی (گلبول‌های سفید) میزبان برای کشتن باکتری‌ها تولید می‌کنند. این باکتری، گستره وسیعی از عفونت‌های ساده پوستی (مانند جوشدانه، کورک، کفگیرک، گل‌مژه و آبسه) تا بیماری‌های خطرناک‌تری (مانند پنومونی، مننژیت، استئومیلیت، اندوکاردیت، سندرم شوک سمی و سپتی‌سمی) را ایجاد می‌کند. استافیلوکوکوس اورئوس یکی از پنج عامل شایع ایجاد‌کننده عفونت‌های بیمارستانی به‌ویژه عفونت‌های زخم پس از جراحی است (14). اشریشیاکلی که به باسیل معروف است، باکتری گرم منفی، متحرک، هوازی بی‌هوازی اختیاری (با قابلیت رشد در دو محیط) است. باکتری اشریشیا کلی، در حالت عادی در دستگاه گوارش انسان زندگی می‌کند و معمولاً بیماری‌زا نیست ولی گونه‌های خاصی از این باکتری در شرایط خاص می‌توانند بیماری‌های مختلفی ایجاد کنند (16).

همان‌طور که در شکل 4، مشاهده می‌شود، داربست کامپوزیتی HAp-PLGA در محیط‌کشت باکتری‌های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس، هاله رشدنکردن ایجاد نکرده است ولی هاله‌ رشدنکردن در اطراف داربست کامپوزیتی HAp-PLGA-ZnO در محیط‌کشت باکتری‌های اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس به‌وضوح دیده می‌شود. قطر هاله‌ رشدنکردن در محیط‌کشت باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس به‌ترتیب برابر 12 و 20 میلی‌متر است.

شکل 4- تصویر داربست HAp-PLGA و HAp-PLGA-ZnO در حضور باکتریهای اشریشیا کلی (E) و استافیلوکوکوس اورئوس (S)

 

نتایج آزمون آنتی‌باکتریال نشان می‌دهند که باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس در برابر داربست کامپوزیتی HAp-PLGA دارای ZnO مقاومت کمتری نسبت به باکتری‌های اشرشیا کلی دارند. ردی[xii] و همکاران نیز رفتار آنتی‌باکتریال ZnO را در برابر دو رده باکتری‌های گرم مثبت و منفی ارزیابی کردند و نتایج نشان دادندکه قطر هاله‌ رشدنکردن باکتری‌های گرم مثبت بیشتر از باکتری‌های گرم منفی است (17). دلیل مقاومت بیشتر باکتری‌های گرم منفی به ذرات ZnO را می‌توان به غشای خارجی، ساختار دیواره سلولی، فیزیولوژی سلول و متابولیسم این باکتری‌ها نسبت داد. اگرچه تاکنون مکانیسم دقیق عملکرد نانوذرات ZnO در برابر باکتری‌ها و روند اساسی اثر ضدباکتریایی این ترکیب روشن نشده ‌است، اختلال در غشای سلول و تنش اکسیداتیو در کمپیلوباکتر مکانیسم‌های رفتار آنتی‌باکتریال این ترکیب گزارش شده‌اند که ناشی از تولید مولکول‌های فعال حاوی اکسیژن مانند H2O2، OH- و O2-2 است (18).

 

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر، داربست کامپوزیتی HAp-PLGA حاوی و فاقد اکسیدروی تولید و مشخصه‌یابی شد. همچنین اثر افزودن ZnO بر رفتار آنتی‌باکتریال این داربست بررسی شد. تصاویر SEM، توزیع همگن ذرات ZnO بر سطح داربست HAp-PLGA را پس از فرآیند لایه‌نشانی تأیید کردند. نتایج آزمون آنتی‌باکتریال نشان دادند که داربست HAp-PLGA در محیط‌کشت باکتری اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس، هاله رشدنکردن ایجاد نکرد. پس از لایه‌نشانی ZnO روی داربست HAp-PLGA و قراردادن این داربست در محیط‌کشت باکتری‌ها، ویژگی آنتی‌باکتریال مشاهده شد و قطر هاله‌ رشدنکردن برای باکتری‌های استافیلوکوکوس ارئوس و اشریشیا کلی بهترتیب برابر 20 و 12 میلی‌متر اندازه‌گیری شد. با توجه به بیشتر بودن قطر هاله رشدنکردن استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به اشریشیا کلی می‌توان نتیجه گرفت که باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به باکتری اشریشیا کلی مقاومت کمتری در برابر داربست HAp-PLGA-ZnO دارد. در نهایت، ZnO ، لایه‌نشانی داربست HAp-PLGA را با موفقیت انجام داد و تأثیر عامل آنتی‌باکتریال ZnO روی داربست HAp-PLGA تأیید شد.



[1]- Hydroxyapatite

[2]- Lactic acid

[3]- Glycolic acid

[4]- Poly lactic-co-glycolic acid

[5]- Matsumoto

[6]- De Lima

[7]- Zhao

[8]- Escherichia coli

[9]- Staphylococcus aureus

[10]- Polyurethane

[11]- Muller-Hinton Broth

[xii]- Reddy

(1)              Vallet-Regi M. Bio-ceramics with clinical applications. New York: John Wiley & Sons Inc.; 2014.

(2)              Itokazu M., Yang W., Aoki T., Ohara A., Kato N. Synthesis of antibiotic-loaded interporous hydroxyapatite blocks by vacuum method and in vitro drug release testing. Biomaterials 1998; 19(7): 817-9.

(3)              Öner M., Yetiz E., Ay E., Uysal U. Ibuprofen release from porous hydroxyapatite tablets. Ceramics International 2011; 37(7): 2117-25.

(4)              He D., Dong W., Tang S., Wei J., Liu Z., Gu X., et al. Tissue engineering scaffolds of mesoporous magnesium silicate and poly (ε-caprolactone)–poly (ethylene glycol)–poly (ε-caprolactone) composite. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2014; 25(6): 1415-24.

(5)              Arcos D., Vallet-Regí M. Bioceramics for drug delivery. Acta Materialia 2013; 61(3): 890-911.

 

 

(6)              Xie Y., He Y., Irwin PL., Jin T., Shi X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and environmental microbiology 2011; 77(7): 2325-31.

(7)              Matsumoto N., Sato K., Yoshida K., Hashimoto K., Toda Y. Preparation and characterization of β-tricalcium phosphate co-doped with monovalent and divalent antibacterial metal ions. Acta biomaterialia 2009; 5(8): 3157-64.

(8)              de Lima IR., Alves GG., Soriano CA., Campaneli AP., Gasparoto TH., Schnaider Ramos E., et al. Understanding the impact of divalent cation substitution on hydroxyapatite: an in vitro multiparametric study on biocompatibility. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2011; 98(3): 351-8.

(9)              Zhao CX., Zhang WD., Mai AP., Huang XM., Ouyang YS. Synthesis and characterization of waterborne polyurethane/Cu (II)-loaded hydroxyapatite nanocomposites with antibacterial activity. Journal of nanoscience and nanotechnology 2011; 11(8): 6779-87.

(10)          Ooi CY., Hamdi M., Ramesh S. Properties of hydroxyapatite produced by annealing of bovine bone. Ceramics international 2007; 33(7): 1171-7.

(11)          Chen C., Liu P., Lu C. Synthesis and characterization of nano-sized ZnO powders by direct precipitation method. Chemical Engineering Journal 2008; 144(3): 509-13.

(12)          Wahab R., Ansari SG., Kim YS., Dar MA., Shin HS. Synthesis and characterization of hydrozincite and its conversion into zinc oxide nanoparticles. Journal of Alloys and Compounds 2008; 461(1): 66-71.

(13)          Khan YM., Katti DS., Laurencin CT. Novel polymer‐synthesized ceramic composite–based system for bone repair: An in vitro evaluation. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2004; 69(4): 728-37.

(14)          Manzano M., Aina V., Arean CO., Balas F., Cauda V., Colilla M., et al. Studies on MCM-41 mesoporous silica for drug delivery: effect of particle morphology and amine functionalization. Chemical Engineering Journal 2008; 137(1): 30-7.

(15)          Hassanzadeh-Tabrizi SA., Bigham A., Rafienia M. Surfactant-assisted sol–gel synthesis of forsterite nanoparticles as a novel drug delivery system. Materials Science and Engineering: C. 2016; 58 (4): 737-41.

(16)          Høiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S., Ciofu O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International journal of antimicrobial agents 2010; 35(4): 322-32.

(17)          Reddy KM., Feris K., Bell J., Wingett DG., Hanley C., Punnoose A. Selective toxicity of zinc oxide nanoparticles to prokaryotic and eukaryotic systems. Applied physics letters 2007; 90(21): 213-902.

(18)          Sirelkhatim A., Mahmud S., Seeni A., Kaus NH., Ann LC., Bakhori SK., et al. Review on zinc oxide nanoparticles: antibacterial activity and toxicity mechanism. Nano-Micro Letters 2015; 7(3): 219-42.