جداسازی، شناسایی و بررسی میزان تجزیه زیستی باکتری‏های تجزیه‏کننده‏ آلفانفتول از خاک‏های آلوده به نفت مسجدسلیمان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران، اهواز، ایران

2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران، اهواز، ایران

3 دانشیار شیمی آلی، دانشگاه شهید چمران، اهواز، ایران

4 دانشیار زمین‌شناسی نفت، دانشگاه شهید چمران، اهواز، ایران

چکیده

مقدمه: آلفانفتول، هیدروکربن آروماتیک دوحلقه‏ای، جهش‏زای بالقوه و ترکیبی سمی برای موجودات است. حذف کامل آلاینده‌ها و تولیدنشدن آلاینده‌های ثانویه، سهولت در اجرا و بی‌نیازی از ابزارها و مواد شیمیایی گران‌قیمت از دلایل اهمیت روش‌های اصلاح زیستی نسبت به فناوری‌‏های فیزیکوشیمیایی برای پاکسازی منطقه‏ آلوده هستند.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا محیط پایه نمکی (BSM) تهیه و آلفانفتول، منبع کربن برای رشد باکتری‌ها، با غلظت ppm100 به آن اضافه شد. سپس، نمونه‏های خاک جمع‏آوری‌شده از منطقه آلوده به نفت که منبع باکتری بودند به محیط اضافه و محیط‌ها 6 هفته در انکوباتور گرماگذاری شدند. باکتری‏ها با محیط پایه‏ نمکی آگاردار دولایه‏ با غلظت ppm200 آلفانفتول جداسازی شدند و در مرحله‏ بعد، کارایی جدایه‏ها در حذف آلفانفتول و دیگر هیدروکربن‏های آروماتیک با HPLC بررسی و جدایه‏ برتر شناسایی شد.
نتایج: دو جدایه N1 و N2 با توانایی مصرف آلفانفتول جداسازی و خالص شدند. با آزمون‏های بیوشیمیایی و بر اساس توالی ژن 16S rRNA، جدایه N1 نسبت به جدایه N2 با حذف 5/80 درصد آلفانفتول و کارایی بیشتر در حذف دیگر هیدروکربن‏های آروماتیک، جدایه برتر شناسایی شد و به گونه‏ سودوموناس پوتیدا UW4 تعلق داشت.
بحث و نتیجه‏گیری: جدایه N1 در دمای 30 درجه سانتی‏گراد، اسیدیته 7 و طی 15روز گرماگذاری، 5/80 درصد آلفانفتول با غلظت ppm100را حذف کرد که مقدار درخور توجهی است. با توجه به نتایج، جدایه N1 درشرایط یادشده بخش گسترده‌ای از آلفانفتول را از محیط  BSMحذف می‌کند و در شرایط مشابه، ممکن است بخش چشمگیری از آلفانفتول را از منطقه آلوده حذف کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification α-Naphthol-degrading bacteria from oil-contaminated soils of Masjed-e-Soleyman

نویسندگان [English]

  • Soheil Rahmatabadi 1
  • Mohammad Roayaei Ardakani 2
  • Arash Moradzadegan 3
  • Bahram Alizadeh 4
1 M.Sc. in Microbiology, Shahid Chamran University, Ahwaz, Iran
2 Professor of Microbiology, Shahid Chamran University, Ahwaz, Iran
3 Associate Professor of Organic Chemistry, Shahid Chamran University, Ahvaz, Iran
4 Associate Professor of Oil Geology, Shahid Chamran University, Ahwaz, Iran
چکیده [English]

Introduction: α-Naphthol is a two-ring aromatic hydrocarbon that is a toxic compound for all  organisms in different ecosystems. Bioremediation technology for remediating PAH-contaminated sites has been proposed to be an efficient, economical and versatile alternative compared with physicochemical methods.
Materials and Methods: In this study, the basal salt medium was prepared and then α-Naphthol was added with the concentration of 100ppm. α-Naphthol was a sole source of carbon for the growth of bacteria. Eventually, the medium was inoculated with the soil samples collected from polluted region and incubated for six weeks. Bacteria were isolated using double-layer BSM-agar containing the α-naphthol concentration of 200ppm. The degradation rate of α-naphthol and the other PAHs were determined using HPLC and the effective isolate was finally identified using biochemical and ‏molecular methods.
Results: In this study, two isolates (N1 and N2) were isolated that were able to utilize α-Naphthol as a sole source of carbon. The isolate N1 could degrade α-naph‏thol by 80.5%. Moreover, it was effectively able to degrade the other PAHs than the isolate N2, therefore, it was selected as an efficient isolate. The isolate N1 was identified as Psuedomonas putida UW4 with respect to its 16S rDNA sequence and using biochemical tests.
Discussion and conclusion: The isolate N1 could degrade α-naph‏thol by 80.5% from BSM medium at 30° C, pH 7.0 and the α-naph‏thol concentration of 100ppm in fifteen days of incub‏a‏tion.  According to the results, the isolate N1 can remove a large amount of the α-naph‏thol from BSM medium under the mentioned conditions and it is possible that under a similar situation the isolate N1 can remove a large amount of α-naph‏thol.

کلیدواژه‌ها [English]

  • α-Naph‏thol
  • Psuedomonas putida
  • PAHs
  • Masjed-e-Soleyman

مقدمه

ترکیبات نفتی از مهم‏ترین آلاینده‏های شیمیایی هستند که در چهار گروه آسفالتن‏ها، هتروسیکلیک‏ها، آلیفاتیک و آروماتیک تقسیم‌بند‏ی می‌شوند؛ این ترکیبات از منابع طبیعی و مصنوعی وارد اکوسیستم‏های آبی و خاکی می‌شوند و محیط را آلوده می‏کنند (1 و 2). هیدروکربن‏های آروماتیک، گروه بزرگ و ناهمگنی از ترکیبات آلی غیرقطبی هستند که به‌شکل طبیعی یا بر اثر فعالیت‏های انسانی ازجمله سوختن ناقص ترکیبات آلی مانند زغال سنگ، نفت، گاز و چوب و نیز صنایع پتروشیمی و بر اثر فعالیت‏های پالایش نفت تولید می‏شوند و محیط را آلوده می‌کنند (3 و 4). میانگین نیمه‌عمر هیدروکربن‏های آروماتیک مختلف در خاک و رسوبات از 2 تا 1400 روز است و تا ماه‏ها یا حتی سال‏ها در محیط پایدار می‌مانند. این ترکیبات به‌شدت چربی‌دوست هستند و تمایل دارند که به رسوبات غنی از ترکیبات آلی اتصال و در جانداران تجمع زیستی یابند (5). مطالعه‌های اپیدمیولوژی، شواهد روشنی از آثار سرطان‌زایی هیدروکربن‏های آروماتیک در افراد نشان داده‌اند؛ افراد به روش‌های مختلف (استنشاق، بلع و تماس پوستی) در معرض این ترکیبات قرار می‏گیرند (6) و انتشار، متابولیسم، ذخیره یا دفع این مواد پس از تماس با فرد اتفاق می‏افتد و ممکن است بر سیستم تنفسی، تناسلی و عصبی فرد تأثیر ‌گذارند و سقط جنین و سرطان را موجب شوند (7). آلفانفتول یا 1-هیدروکسی‌نفتالن، هیدروکربنی آروماتیک با دوحلقه‏ بنزنی و محصول اصلی هید‏ر‏و‏کسیلاسیون نفتالن در صنایع شیمی و نفت است که در محیط‌‏زیست از هیدرولیز شیمیایی یا زیست‌شناختی حشره‏کش کارباریل تولید می‏شود و جهش‏زای بالقوه و سمی برای موجودات اکوسیستم‏های مختلف است (8). یکی از روش‌های حذف هیدروکربن‏های آروماتیک از مناطق آلوده، تلقیح منطقه با ریزموجودات تجزیه‏کننده‏ این ترکیبات است (9). اگرچه ممکن است هیدروکربن‏های آروماتیک پس از رهاشدن در محیط‏زیست تحت‏تأثیر اکسیداسیون شیمیایی، فتولیز و تبخیر قرار گیرند و جذب ذرات خاک شوند، تجزیه‏ میکروبی مسیر اصلی تجزیه این هیدروکربن‏ها است(10). ریزموجودات از هیدروکربن‏های آروماتیک برای منبع کربن و انرژی استفاده و محصولاتی نظیر آب و دی‏اکسیدکربن تولید می‏کنند (11). استفاده از فناوری اصلاح زیستی برای پاکسازی منطقه‏ آلوده روشی آسان، باصرفه و مؤثرتر از فناوری‏های فیزیکوشیمیایی است (9).

امروزه با فناوری اصلاح زیستی، ریزموجودات مختلفی برای حذف هیدروکربن‏های آروماتیک از مناطق آلوده جداسازی شده‏اند. بیشتر این ریزموجودات به جنس‌های سودوموناس، آلکالیجنز، مایکو‏‏باکتریوم، رودوکوکوس، استنو‏ترو‏فو‏مو‏ناس، اسفینگو‏موناس، میکروکوکوس، فلاووباکتریوم و برخی قارچ‌ها تعلق دارند (9). بهبود بانک میکروبی (مجموعه ریزموجوداتی که ترکیبات سمی مختلف را تجزیه می‌کنند) در دسترس از منابع میکروبی و اطلاعات برای مدیریت مناسب مناطق آلوده ضروری است (12). آلفانفتول، ترکیبی سمی و جهش‌زاست که حذف آن از محیط ضروری است. از آنجا که باکتری‌های بومی با شرایط محیطی ناحیه سازگار شده‌اند و بهتر از باکتری‌های غیربومی در ناحیه مدنظر رشد می‌کنند، باید از باکتری‌های بومی هر ناحیه برای حذف آلاینده از آن محیط استفاده شود. بنابراین هدف مطالعه حاضر، جداسازی باکتری‏های بومی تجزیه‏کننده آلفانفتول از نمونه‏های خاک آلوده به نفت مسجد سلیمان و بررسی ویژگی‏ها و ارزیابی توانایی آنها برای تجزیه ‏آلفا‏نفتول و استفاده از آنها در ناحیه آلوده مدنظر است.

 

مواد و روش‏ها.

نمونه‏برداری از خاک:نمونه‏برداری ازخاک‏های آلوده به نفت منطقه 9 بهره‌برداری نفت‏ و گاز مسجد سلیمان به آدرس جغرافیایی 31°56'11.00"N و49°18'14.00"E  انجام و از 12 نقطه‏‏ مختلف این منطقه نمونه‏‏برداری شد؛ به این شکل که 3 نمونه خاک 100 گرمی از عمق 10 تا 20 سانتی‏متری هر نقطه به مساحت 1 مترمربع تهیه و با هم مخلوط شدند و مخلوط نمونه‏ها به‌عنوان نمونه‏ واحد برای مطالعه استفاده شد (13).

غنی‏سازی و جداسازی باکتری‏های تجزیه‏کننده‏ آلفانفتول: برای غنی‏سازی باکتری‏های تجزیه‏کننده‏ آلفانفتول و سازش با این ترکیب، از محیط پایه نمکی[1] شامل 8/0 گرم KH2PO4، 2/1 گرم K2HPO4، 1 گرم NH4NO3، 2/0 گرم MgSO4.7H2O، 50 میلی‏گرم FeCl3، 20 میلی‏گرم CaCl2، 1 میلی‏گرم MnSO4 و 2/0 میلی‏گرم Na2MoO4 در حجم کل یک لیتر استفاده شد. آلفانفتول با خلوص 99 درصد از شرکت مرک آلمان تهیه و به‌عنوان تنها منبع کربن در محیط پایه نمکی برای غنی‏سازی استفاده شد؛ از غلظت ‏ppm100 آلفانفتول محلول در استون (5 درصد) در ارلن‏های خالی استریل ریخته و پس از تبخیر حلال، 50 میلی‌لیتر محیط پایه نمکی به هر ارلن اضافه ‏شد. سپس، از 5 گرم نمونه‏ خاک به‌عنوان ماده‏ تلقیحی در محیط پایه نمکی استفاده شد. این مجموعه به مدت 2 هفته در انکوباتور شیکردار با دور rpm150، دمای 30 درجه سانتی‏گراد و تاریکی برای جلوگیری از اکسیداسیون نوری آلفانفتول گرماگذاری و در پایان هفته دوم، همان میزان آلفانفتول به محیط پایه نمکی تازه برای تکمیل‌شدن تجزیه افزوده شد. از 10 درصد کشت غنی‏شده پیشین به‌عنوان ماده تلقیح استفاده ‏و در شرایط یادشده گرماگذاری شد. در تمام مراحل، سه تکرار به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد و مرحله غنی‏سازی سه بار پیش از جداسازی انجام شد (9، 14 و 15). برای جداسازی باکتری‏ها، از محیط پایه نمکی-آگار ‏دولایه‌ای با غلظت ppm200 آلفانفتول در لایه‏ رویی به‌عنوان تنها منبع کربن استفاده شد. در پایان غنی‏سازی، 100 میکرولیتر از رقت‏های تهیه‌شده روی پلیت‏های محیط پایه نمکی-آگار دولایه‏ای پخش و 2 هفته در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری‏ شدند (14).

روش تهیه محیط پایه نمکی-آگار دولایه‏ای: لایه رویی از مخلوط‌کردن 100 میکرولیتر محلول آلفانفتول در استون (8 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) با 4 میلی‏لیتر محیط پایه نمکی آگاردار (1 درصد) تهیه و پس از مخلوط‌شدن، محتویات بسیار سریع به لایه زیرین پلیت محیط پایه نمکی آگاردار 5/1 درصد اضافه شدند (14).

شناسایی جدایه‌ها: ابتدا، جدایه‌ها بر اساس ویژگی‏های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و انجام آزمون‏های بیوشیمیایی همچون رنگ‏آمیزی گرم، آزمون اکسیداز، آزمون کاتالاز، اوره‏آز، احیای نیترات، سیترات، تولید اندول، بررسی حرکت، آزمون O-F، رشد روی محیط مکانکی آگار، ستریمید آگار و تولید سولفیدهیدروژن شناسایی شدند. برای شناسایی دقیق‏تر از روش‏های مولکولی بر مبنای توالی ژن 16S rRNA استفاده و با کیت استخراج ژنوم شرکت سیناژن، ژنوم جدایه‏ مدنظر استخراج شد. سپس ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای عمومی در واکنش PCR تکثیر و محصول واکنش برای تعیین توالی به شرکت ژن فن‌آوران ارسال شد. نتایج با نرم‌افزار بیوادیت مرتب و با برنامه BLAST در پایگاه اینترنتی مرکز ملی اطلاعات فناوری بررسی ‏شدند. درخت فیلوژنتیکی با نرم‌افزار مگا4 رسم شد.

برنامه دمایی واکنش PCR: دناتوراسیون اولیه در دمای 94 درجه‏ سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه و ادامه با 30 چرخه از دناتوراسیون در دمای 94 درجه‏ سانتی‏گراد به مدت 60 ثانیه، اتصال پرایمر در دمای 1/58 درجه سانتی‏گراد به مدت 40 ثانیه و سنتز در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 150 ثانیه و در نهایت سنتز نهایی در دمای 72 درجه‏ سانتی‏گراد به مدت 20 دقیقه. توالی پرایمرهای استفاده‌شده مطابق جدول 1 است (16).

 

جدول 1- توالی پرایمرهای استفاده‌شده در واکنش  PCR

پرایمر رفت

37 باز

5´-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´

FD1

پرایمر برگشت

37 باز

5´-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-3´

Rp1

 

میزان توانایی جدایه‏ها در حذف آلفانفتول: آلفانفتول، تنها منبع کربن با غلظت ppm100 به‌شکل محلول در استون در ارلن‏های خالی استریل ریخته شد. پس از تبخیرشدن استون و ضمن هم‌زدن آرام، 25 میلی‏لیتر محیط پایه نمکی به هر ارلن افزوده ‏شد. از جدایه‌ها در محیط پایه نمکی، سوسپانسیونی با جذب نوری 25/0 در طول موج 600 نانومتر تهیه و 5/2 میلی‏لیتر از این سوسپانسیون به‌عنوان منبع باکتری استفاده ‏شد. کشت‏ها، 15 روز در دمای 30 درجه سانتی‏گراد، rpm150 و تاریکی گرماگذاری ‏شدند. مقادیر معینی از هر نمونه در فاصله‌های 72 ساعته برای استخراج آلفانفتول و آنالیز HPLC برداشته شد ‏و ارلن‏های تلقیح‌نشده، شاهد در نظر گرفته شدند و سه تکرار برای هر جدایه در نظر گرفته شد (9 و 14).

.میزان توانایی جدایه‌ها در تجزیه ‏سایر هیدروکربن‏های آروماتیک چندحلقه‏ای: تجزیه هر یک از هیدروکربن‏های آروماتیک نظیر فلوئورن[2]، آنتراسن[3]، کریزن[4] و آسنفتن[5] با غلظت ppm100 در محیط پایه نمکی به‌عنوان تنها منبع کربن توسط جدایه‏ها طی 15 روز گرماگذاری بررسی شد.

استخراج آلفانفتول از محیط‌کشت جدایه‌ها برای آنالیز کروماتوگرافی: در فواصل زمانی 72 ساعته، 2 میلی‌لیتر از هر نمونه‏ برداشته و با 5 میلی‌لیتر حلال هگزان برای استخراج ترکیب و مخلوط 3 دقیقه ورتکس ‏شد. پس از جداشدن فازها از یکدیگر، فاز آلی برداشته و به ویال‏ تمیزی منتقل ‏شد. پس از تبخیر حلال، عصاره باقیمانده در 1 میلی‏لیتر فاز متحرک HPLC حل و با فیلترهای سرنگی 22/0 میکرومتری از نوع PTFE (مقاوم به حلال) فیلتر و در ویال‏های آماده برای آنالیز در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری‏ شد (17).

آنالیز نمونه‏ها: 100 میکرولیتر از هر نمونه برای آنالیز به HPLC تزریق ‏و پیش از آن، دستگاه با نمونه‏های استاندارد کالیبره شد. فاز متحرک HPLC شامل80:20 (v/v) استونیتریل: آب با سرعت جریان 1 میلی‏لیتر در دقیقه بود. حضور ترکیبات و متابولیت‏های مربوط به آنها در طول موج 254 نانومتر تعیین و در مقایسه با نمونه‏های استاندارد مربوطه شناسایی شد (18). میزان تجزیه ترکیب مدنظر برحسب درصد مطابق رابطه زیر محاسبه شد:

 

R1= میزان ترکیب باقیمانده در نمونه شاهد، R2= میزان ترکیب باقیمانده در نمونه مجهول، T= غلظت اولیه ترکیب مدنظر، D= درصد تجزیه ترکیب (4 و 18)

رسم منحنی رشد جدایه‌ها‏ در حضور آلفانفتول: منحنی رشد جدایه‌ها با روش رقت‏سازی متوالی رسم شد. از غلظت ppm100 آلفانفتول، تنها منبع کربن در محیط پایه نمکی استفاده شد. 5/0 میلی‏لیتر از سوسپانسیون تهیه‌شده برای هر جدایه در بافر فسفات استریل (mM150، 7=pH) با کدورت 6/0 در طول موج 600 نانومتر به‌عنوان منبع باکتری در محیط‌کشت استفاده شد. در نهایت، کشت‏ها در انکوباتور شیکردار با دور rpm150 و دمای 30 درجه‏ سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. سپس، با روش رقت‏سازی (سه تکرار برای هر رقت)، رقت‏های 7-10،8-10 و 9-10 در ساعت صفر و زمان‏های بعدی تهیه و جدایه‌ها روی نوترینت‌آگار کشت و در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. تعداد سلول‏ها هر 24 ساعت یک‌بار به مدت 240 ساعت شمارش‏ و منحنی رشد رسم شد (19 و 20).

 

نتایج

پس از افزودن نمونه‏های خاک به محیط پایه نمکی حاوی غلظت ppm100 آلفانفتول که تنها منبع کربن و انرژی بود و سپس تلقیح روی محیط پایه نمکی-آگار، 2 جدایه باکتریایی (N1 و N2) تجزیه‏‏کننده‏ آلفانفتول جداسازی شدند. نتایج حاصل از HPLC نشان دادند که جدایه‏های N1 و N2، میزان آلفانفتول با غلظت ppm100 در ساعت صفر را به‌ترتیب به ppm5/19 و ppm3/60 در روز پانزدهم کاهش داده‌اند که به‌ترتیب معادل 5/80 و 9/37 درصد تجزیه‏ آلفانفتول طی 15 روز گرماگذاری است. شکل 1، میزان تجزیه آلفانفتول در فواصل زمانی سه روزه طی 15 روز گرماگذاری را نشان می‌دهد؛ با گذشت زمان، میزان آلفانفتول در محیط‌کشت جدایه‏ها در حال کاهش است و بیشترین میزان کاهش در سه روز اول گرماگذاری انجام می‌شود. ثابت‌بودن تقریبی میزان آلفانفتول در محیط شاهد بدون باکتری، نشان‏ می‌دهد که جدایه‏ها در نمونه‌های دارای باکتری، آلفانفتول را مصرف می‌کنند. نتایج آنالیز کروماتوگرافی نمونه‏های سایر هیدروکربن‏های آروماتیک نشان دادند که جدایه‏های N1 و N2 به‌ترتیب 1/50 و 9/19 درصد فلوئورن، 7/30 و 3/9 درصد آنتراسن، 9/15 و 4 درصد کریزن و 10 و 4/6 درصد آسنفتن را طی 15 روز گرماگذاری تجزیه کرده‌اند (شکل 2). منحنی رشد جدایه‏های یادشده با روش رقت‏سازی متوالی رسم شد و با توجه به این منحنی، جدایه N1 رشد بیشتری در حضور آلفانفتول، تنها منبع کربن، داشت. جدایه ‏N1 در ساعت 144 و جدایه ‏N2 در ساعت 120 به بیشترین رشد خود رسیده‌اند و سپس، رشد این جدایه‏ها به تدریج تا ساعت 240 کاهش یافته است (شکل 3).

 شکل 1- منحنی میزان آلفانفتول باقیمانده در محیط‌کشت جدایه‏هایN1، N2 و نمونه شاهد با غلظت اولیه ppm100 آلفانفتول در فواصل سه روزه طی 15 روز گرماگذاری

شکل 2- میزان تجزیه هیدروکربن‏های آروماتیک مختلف توسط جدایه‏های N1 و N2 طی 15 روز گرماگذاری

شکل 3- منحنی رشد جدایه‏های ‏N1 و N2 در محیط پایه نمکی با غلظت ppm100 آلفانفتول، تنها منبع کربن، طی 240 ساعت گرماگذاری

با توجه به اینکه جدایه ‏N1 بیشترین میزان آلفانفتول را تجزیه کرد، جدایه‏ برتر برای شناسایی انتخاب شد. بر اساس آزمایش‏های بیوشیمیایی و ویژگی‌های ریخت‌شناسی مشخص شد که این جدایه، باکتری میله‏ای گرم منفی، کاتالاز مثبت و اکسیداز مثبت است که به جنس سودوموناس تعلق دارد (جدول2). برای شناسایی دقیق‏تر از شناسایی مولکولی بر اساس تکثیر ژن 16S rRNA در واکنش PCR استفاده شد. محصول PCR برای اطمینان از تکثیر ژن 16S rRNA روی ژل آگارز 1 درصد الکترو‏فورز (شکل 4) و برای تعیین توالی به شرکت ژن فن‌آوران ارسال شد. نتایج تعیین توالی با برنامه بلاست بررسی و جدایه مدنظر شناسایی شد؛ بر اساس این، جدایه ‏N1 با 99 درصد تشابه به گونه‏ سودوموناس پوتیدا UW4 تعلق داشت. درخت فیلوژنتیکی این سویه با نرم‌افزار مگا4 رسم شد (شکل 5).

شکل 4- الکتروفورز محصول واکنش PCR ژن16S rRNA  جدایه ‏N1؛ A. لدر 1kb، B. نمونه‏ شاهد مثبت، C. جدایه ‏N1، D. نمونه‏ شاهد منفی (آب مقطر)

 

جدول2- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی جدایه ‏N1

آزمون

جدایه

رنگ گرم

رنگ کلونی

مورفولوژی

اکسیداز

کاتالاز

تشکیل اسپور

حرکت

نیترات

سیترات

آزمون O-F

مکانکی آگار

ستریمید

اوره‏آز

تولیدH2S

تولید اندول

N1

منفی

سفید

باسیل

مثبت

مثبت

منفی

مثبت

منفی

مثبت

O

مثبت

مثبت

مثبت

منفی

منفی

 

شکل 5- درخت فیلوژنتیکی (Neighbor-joining) جدایه ‏N1 بر اساس توالی 16S rRNA

 


بحث و نتیجه‌گیری

غنی‏سازی انتخابی، روند یافتن موجودات سازش‌یافته با آلاینده‏های هیدروکربنی است؛ استفاده از چنین روش‌هایی موجب افزایش نسبت ریزموجودات مصرف‌کننده هیدروکربن در جامعه‌ای هتروتروف و تقویت رشد آنها خواهد شد (21 و 22). برای جداسازی باکتری‏ها، از محیط پایه نمکی-آگار دولایه‏ای استفاده شد و ترکیب آروماتیک در لایه رویی قرار گرفت که لایه‌ای نازک و دارای آگار کمتر بود و جدایه مدنظر به‎آسانی در آن رشد می‌کرد. افزایش غلظت منبع کربنی تا ppm200، حذف جدایه‏هایی را ممکن می‌کند که تحمل غلظت زیادی از ترکیب هدف را ندارند. میزان آگار بیشتر در لایه زیرین موجب حرکت جدایه‏های بی‌هوازی به این لایه می‌شود و از این رو، جداسازی باکتری‏های بی‏هوازی را غیرممکن می‏کند. زنگ[vi] و همکاران از این محیط دولایه ‏برای غربالگری جدایه‌های تجزیه‌کننده پیرن استفاده کردند (14). در پژوهش حاضر، دو جدایه ‏N1 و N2 جداسازی شدند که به‌ترتیب 5/80 و 7/39 درصد آلفانفتول را طی 15 روز گرماگذاری تجزیه می‌کردند. در زمینه حذف زیستی آلفانفتول، مطالعه‌های کمی انجام شده است:

مولینا[vii] و همکاران سویه‏ای متعلق به سودوموناس پوتیدا را جداسازی کردند که قادر به تجزیه 100 درصد آلفانفتول پس از 12 روز گرماگذاری بود (23). حضور مواد مغذی مختلف، حضور سویه‏های‏ متفاوت تجزیه‏کننده و پرامترهایی مانند آنها بر میزان تجزیه زیستی ترکیبات آروماتیک تأثیر می‌گذارد. تجزیه‏پذیری زیستی هیدروکربن‏های آروماتیک چندحلقه‏ای به پیچیدگی ساختار شیمیایی و ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی آنها بستگی دارد (15)؛ انحلال‏پذیری در آب و تبخیرپذیری این هیدروکربن‏ها با افزایش. تعداد حلقه‏های بنزنی آنها‏ به دلیل افزایش هیدروفو‏بیسیتی کاهش می‏یابد و به تجزیه‏ میکروبی مقاوم‌تر می‏شوند(24). در پژوهش حاضر، کریزن با چهار حلقه، آنتراسن، فلوئورن و آسنفتن با سه حلقه‏ آروماتیک در مقایسه با آلفانفتول با دو حلقه‏ آروماتیک به تجزیه‏ زیستی مقاوم‌تر بودند و کریزن با بیشترین تعداد حلقه‏ بنزنی، کمترین میزان تجزیه زیستی را داشت. شفیعی[viii] و همکاران طی پژوهشی، 6 جدایه تجزیه‏کننده هیدروکربن‏های آروماتیک را معرفی کردند که به فرم کنسرسیوم قادر به تجزیه 100 درصد فنانترن، 80 درصد آنتراسن، 60 درصد پیرن، 30 درصد فلوئورن و 20 درصد فلور‏انتین طی 10 روز گرماگذاری بودند؛ در پژوهش حاضر، فلورانتین با بیشترین تعداد حلقه آروماتیک کمترین میزان تجزیه زیستی را داشت (15). رشد تصا‏عدی جدایه‌ها در نتیجه بیشترین غلظت ترکیب هدف در محیط‌کشت رخ می‏دهد و هنگامی ‏که میزان رشد به حدی برسد که میزان ترکیب موجود در محیط آبی تأمین‌‏کننده رشد جدایه‌ها نباشد، رشد تصاعدی متوقف و باکتری وارد فاز سکون می‏شود. در پژوهشی که یعقوب‌زاده[ix] در زمینه حذف زیستی نفتالن انجام داد، بیشترین تعداد کلونی‏ جدایه جداشده در ساعت 144 گزارش شد و پس از آن رشد جدایه کاهش یافت و وارد فاز سکون شد؛ این، با روند رشد جدایه ‏‏N1 در پژوهش حاضر مطابقت دارد (25). جدایه ‏N1، سویه‏ باکتریایی کارا در پژوهش حاضر شناسایی شد و به گونه‏ سودوموناس پوتیدا تعلق دارد. باکتری‏ها، فعال‏ترین عوامل در تجزیه‏ نفت و نخستین تجزیه‏کنندگان آلودگی نفتی در محیط‏زیست هستند؛ چندین باکتری شناخته‌ شده‌اند که منحصر از هیدروکربن‏ها تغذیه می‏کنند (26-28). مطالعه‌ها نشان داده‌اند که برخی از گونه‏های سودو‏موناس‏ به دلیل تولید آنزیم‏های مختلف تجزیه‏کننده و بیوسورفکتانت‏ها برتری ویژه‌ای نسبت به باکتری‏های دیگر در استفاده از هیدروکربن‏ها به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی دارند (29). سورفاکتانت‏ها باعث افزایش انحلال‌پذیری ترکیبات هیدروفوب در آب می‏شوند و ویژگی عمومی آنها، متراکم‌شدن در حدفاصل بین سطوح، کاهش کشش‏ سطحی و تشکیل میسل است (30). گونه‏های مختلفی از سودوموناس‏ها نظیر سودو‏موناس آئروجینوزا، سودوموناس پوتیدا، سودوموناس مندوسیدا، سودوموناس فلورسانس، سودوموناس سپاسیا تجزیه‏کنندگان هیدروکربن‏های آروماتیک چندحلقه‏ای هستند و به‌فراوانی از خاک‏های آلوده به نفت جداسازی شده‏اند.

روش‏های زیستی برای حذف آلاینده‏های هیدروکروبنی نفت از مناطق آلوده به دلیل تولید‌نکردن آلایند‏ه‌های ثانویه، هزینه کمتر و کارایی بیشتر نسبت به روش‌های فیزیکوشیمیایی در کانون توجه هستند. آنچه فرایند اصلاح زیستی را به فرایندی بسیار مهم در عرصه‏ حفاظت محیط‌زیست تبدیل می‏کند، استفاده از ریزموجودات بومی برای منطقه‏ آلوده است. جداسازی و شناسایی باکتری‏های بومی و کارای تجزیه‏کننده‏ هیدروکربن‏های آروماتیک با توجه به ماهیت سرطان‌زای این ترکیبات برای حذف آنها از منطقه آلوده ضروری است. جدایه‏ جداشده در پژوهش حاضر، در زمان کوتاهی میزان زیادی از آلفانفتول را بدون افزودن سورفکتانت سنتزی و ماده اولیه کومتابولیک حذف کرد و شاید میزان تجزیه‏ این ترکیب جهش‌زا با افزایش دوره گرماگذاری افزایش یابد و با کمترین هزینه و بیشترین کارایی از منطقه‏ آلوده پاکسازی شود.



[1]- Basal Salt Medium

[2]- Fluorene

[3]- Anthracene

[4]- Chrysene

[5]- Acenaphthene

[vi]- Zeng

[vii]- Molina

[viii]- Shafiee

[ix]- Yaghoubzadeh

(1)              Partovinia A., Naeempour F. Bioremediation oil hydrocarbons contaminated-soil in slushy phase and the survey of effective parameters. Oil research 2008; 18(58): 3-10.

(2)              Martínkova L., Uhnakova B., Patek M., Nesvera J., Kren V. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus. Environment International 2009; 35: 162-177.

(3)              Lin C., Gan L., Chen Z. L. Biodegradation of naphthalene by strain Bacillus fusiformis (BFN). Journal of Hazardous Materials 2010; 182: 771-777.

(4)              Santos E. C., Jacques R. J. S., Bento F. M., Peralba M. C. R., Selbach P. A., Sa, E. L. S., Camargo F. A. O. Anthracene biodegradation and surface activity by an iron stimulated  Pseudomonas sp. Bioresource Technology 2008; 99: 2644-2649.

(5)              Kathi S., Khan A. B. Phytoremediation approaches to PAH contaminated soil. Indian Journal of Science and Technology 2011; 4(1): 56-63.

(6)              Bayoumi R. A. Bacterial bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons in heavy oil contaminated soil. Journal of Applied Sciences Research 2009; 5(2): 197-211.

(7)               Wick A. F., Haus N. W., Sukkariyah B. F., Haering K. C., Daniels W. L. Remediation of PAH-contaminated soils and sediments: A literature review. Virginia Polytechnic Institute and State University Department of Crop and Soil Environmental Sciences: 2011; 1-102.

(8)               Borraccino R., Kharoune M., Giot R., Agathos S., Nyns E. J., Naveau H. P., Pauss A. Abiotic transformation of catechol and 1-naphthol in aqueous solution influence of environm‏ental factors. Water Research 2001; 35(15): 3729-3737.

 

 

(9)              Zhang G. Y., Ling J. Y., Sun H. B., Luo J., Fan Y. Y., Cui Z. J. Isolation and characterization of a newly isolated polycyclic aromatic hydrocarbons–degrading Janibacter anophelis strain JY11. Journal of Hazardous Materials 2009; 172: 580-586.

(10)          Hadibarata T., Tachibana S., Itoh K. Biodegradation of chrysene, an aromatic hydrocarbon by Polyporus sp. S133 in liquid medium. Journal of Hazardous Materials2009; 164: 911-917.

(11)          Ye J. S., Yin H., Qiang J., Peng H., Qin H. M., Zhang N., He B. Y. Biodegradation of anthracene by Aspergillus fumigatus. Journal of Hazardous Materials 2011; 185: 174-181.

(12)          Ling J., Zhang G., Sun H., Fan Y., Ju J., Zhang C. Isolation and characterization of a novel pyrene-degrading Bacillus vallismortis strain JY3A. Science of the Total Environment 2011; 409: 1994-2000.

(13)          Dias A. C., Andreote F. D., Rigonato J., Fiore M. F., Melo I. S., Araujo W. L. The bacterial diversity in Brazilian non-disturbed mangrove sediment. Antonie Van Leeuwenhoek 2010; 98: 541-51.

(14)          Zeng J., Liu X., Zhang J., Li X. Isolation of polycyclic hydrocarbons degr‏a‏ding Mycobacterium spp. and the degradation in soil. Journal of Hazardous Materials 2010; 183: 718-723.

(15)          Shafiee P., Shojaosadati S. A., Charkhabi A. H. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by aerobic mixed bacterial culture isolated from hydrocarbon polluted soils. Journal Chemistry 2006; 25(3): 73-78.

(16)          Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D. J. 16S ribosomal DNA ampli‏fic‏ati‏o‏n for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 1991; 173(2): 697-703.

(17)          Mohamed T. A., Ahmed D., Mekki L., Amer D. The cacy of an oxidation pond in min‏era‏l‏i‏‏zing some industrial waste products with special reference to fluorene degradation: a case study. Waste Management 1999; 19: 535-540.

(18)          Chupungars K., Rengsamran P., Thaniyavarn S. Polycyclic aromatic hydro‏c‏a‏r‏bons de‏gr‏adation by Agrocybe sp. CU-43 and its fluorene transformation. Internatio‏nal Biodet‏erior‏ation and Biodegradation 2009; 63: 93-99.

(19)          Toledo F. L., Calve C., Rodelas B. J. G. L. Selection and identification of bacte‏ria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities. Systematic and Applied Microbiology 2006; 29: 244-252.

(20)          Tao X. Q, Lu G. N., Dang Z., Yi X. Y., Chen Y. Isolation of phenanthrene-degrading bacteria and characterization of phenanthrene metabolites. Journal of Microbiology and Biotechnolog 2007; 23: 647-654.

(21)          Vincent M. Microbial bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in oily sludge wastes. Journal of Environmental Science and Technology 2011; 1-13.

(22)          Fingerman M., Nagabhushanam R. Bioremediation of aquatic and terrestrial ecosystem. Department of Ecology and Evolutionary Biology. Tulane University New Orleans, Louisiana 70118: Science Publishers; 2005.

(23)          Molina M. C., Gonzalez N., Bautista L. F., Sanz R., Simarro R., Sanchez I., et al. Isolation and genetic identification of PAH degrading bacteria from a microbial consortium. Biodegradation 2009; 20: 789-800.

(24)          Juhasz A. L., Naidu R. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: A review of the microbial degradation of benzo‏[a]pyrene. Inter‏national Biodeterioration and Biodegradation 2000; 45: 57-88.

(25)          Yaghoubzadeh Z. Isolation and evaluation their growth kinetic of positive gram bacteria degrader in southern region of the Caspian sea. Environme‏ntal Sciences 2008; 5(4): 115-122.

(26)          Brooijmans R. J. W., Pastink M. I,. Siezen R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil spill clean-upcrew. Microbial Biotechnology 2009; 2(6): 587-594.

(27)          Yakimov M. M., Timmis K. N., Golyshin P. N. Obligateoil-degrading ma‏‏rine bacteria. Current Opinion in Biotechnology 2007; 18(3): 257-266.

(28)           Rahman K. S. M., Rahman T. J., Kourkoutasa Y., Petsas I., Marchant R., Banat M. I. Enhanced bioremediation of n-alkane in petroleum sludge using bacterial consortium amended with rhamnolipid and micronutrients. Bioresource Technology 2003; 90(2): 159-168.

(29)          Das N., Chandran P. Microbial degradation of petroleum hydrocarbon contam‏ina‏nts: An overview. Biotechnology Research International 2011; 1-13.

(30)          Li J. L., Chen, B. H. Surfactant-mediated biodegradation of polycyclic arom‏a‏t‏i‏c hydrocarbons: Review. Materials 2009; 2: 76-94.