وقوع سویه‌های وروتوکسیژن باکتری اشریشیا کلی در مدفوع گاو و مقاومت آنتی‌بیوتیکی آنها در گاوداری‌های اطراف شهرکرد

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی، پژوهشکده بیماری های مشترک، دانشگاه شهرکرد، ایران

2 دکتر عمومی دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: رنگ‌های به‌طور معمول اشریشیا کلی در فلور میکروبی روده حیوانات خونگرم وجود دارد و از راه مدفوع در محیط پراکنده و موجب آلودگی آب، خاک و در نتیجه میوه و سبزیجات میشود .سویه‌های اشریشیا کلی انتروهموراژیک، گروهی از بیماری‌زاهای غذازاد و تهدیدی برای سلامت عمومی هستند و باعث بروز اسهال خونی و سندروم اورمیک همولیتیک (HUS) می‌شوند. هدف مطالعه حاضر، جداسازی و شناسایی سروتیپ O157: H7 و سایر سویه‌های وروتوکسیژن و جستجوی ژنهای حدت (stx2، stx1، eaeAو rfbE) در کشت سوآب مدفوعی گاو با استفاده از آزمون واکنش زنجیرهای پلیمراز در منطقه شهرکرد است.‏‏
مواد و روش‏‏ها: در بهار و تابستان 1394، 400 نمونه سوآب مدفوعی از گاوهای منطقه شهرکرد جمعآوری و به آزمایشگاه میکروب‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهرکرد منتقل شدند. پس از انجام مراحل کشت، آزمون‌های میکروبی و بیوشیمیایی برای جداسازی باکتری E.coli انجام شدند. از آزمون PCR برای تشخیص سروتیپ O157: H7 و جدایه‌های وروتوکسیژنیک با شناسایی ژن های rfbE، stx1، stx2 و eaeA استفاده شد. برای تعیین الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی جدایه‌های وروتوکسیژن، آزمون آنتی‌بیوگرام برای برخی آنتی‌بیوتیک‌های رایج انجام شد.
نتایج: سروتیپ O157:H7 از هیچیک از نمونههای آزمون‌شده جدا نشد، اگرچه نتایج PCR نشان دادند که از تعداد 384 سویه جداشده، 104 جدایه (27 درصد) حاوی ژن stx1، 36 جدایه (37/9 درصد) حاوی ژن stx2 و 16 جدایه (16/4 درصد) حاوی هر دو ژن بودند و ژن eaeAدر 280 جدایه (91/72 درصد) وجود داشت. از میان سویه‌های وروتوکسیژنیک، مقاومت آنتیبیوتیکی نسبت به آنتیبیوتیکهای تتراسایکلین (1/87 درصد)، آمپی‌سیلین (62/51 درصد)، سفتاکسیم (38/48 درصد)، جنتامایسین (81/25 درصد)، سیپروفلوکساسین(22/3 درصد) و سولفامتوکسازول (22/3 درصد) مشاهده شد.
بحث و نتیجه‏گیری: اگرچه سروتیپ O157:H7 در مدفوع گاوها وجود نداشت، سایر جدایههای وروتوکسیژن از مدفوع گاو در محیط پراکنده می‌شوند و نسبت به برخی از آنتیبیوتیکهای رایج مقاومت زیادی نشان می‌دهند و بنابراین خطر جدی برای بهداشت انسان محسوب می‌شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Occurrence of verotoxigenic E.coli in cow feces and antimicrobial resistance of the isolates in cattle farms in Shahrekord area

نویسندگان [English]

  • Mojtaba Bonyadian 1
  • Hamdallah Moshtaghi 1
  • Parvin Behroozi 2
1 Associated professor of Food Microbiology, department of food quality control, institute of zoonoses research, Shahrekord University, ShahrekordIran
2 Graduated in DVM, ShahrekordUniversity, Shahrekord, Iran,
چکیده [English]

Introduction:Escherichia coli is a common bacterium in the intestinal microflora of warm-blooded animals. They are routinely shed into the environment through feces and can contaminate water and soil, and, consequently fruits and vegetables .Enterohemorrhagic E. coli strains are recently emerged group of food-borne pathogens that are a significant public health threat. This group causes bloody diarrhea and hemolytic uremic syndrome (HUS), and the disease is prevalent in developed countries. The purpose of this study was to isolate and identify the E.coli O157: H7 and other verotoxigenic ones and major virulence genes (rfbE, eaeA, stx1, stx2) in fecal swab samples by PCR in Shahrekord area.
Materials and methods: In Spring and Summer 2015, 400 cow fecal swab samples were collected from farms in Shahrekord area. Bacteriological and biochemical examinations were done for detection of E.coli. PCR assay was done for identification of O157:H7 serotype and other verotoxigenic E. coli using rfbE, eae, stx1 and stx2 genes.
Results: E. coli O157:H7 was not detected in any strains tested. But PCR showed that out of 384 E.coli strain, 104(27/08%) isolates carried stx1 gene, 36(9/37%) carried stx2 gene and 16 (4.16%) carried both stx1 and stx2 genes. Intimin (eaeA) gene was detected in 280(72/91%) of the isolates. Among verotoxigenic strain antibiotic resistance to Tetracycline 87/1%, Ampiciline 51/62%, Cefotaxime 48/38%, Gentamycin 25/81%,, Ciprofeloxacin 3/22% and Sulfamethoxazol 3/22% were observed.
Discussion and conclusion: According to the results, although the serotype O157: H7 did not isolate from the feces of cattle but other verotoxigenic strains that showed high resistance  to antibiotic were isolated so it is a risk for human health.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Verotoxigenic Escherichia coli
  • cow
  • feces
  • PCR

مقدمه.

اشرشیا کلی باکتری گرم منفی و میلهای‌‌شکل از خانواده انتروباکتریاسه است که به‌طور شایع در بخش تحتانی روده حیوانات خونگرم یافت میشود. در بین حیوانات، نشخوارکنندگان به‌ویژه گاو و گوسفند مهمترین مخزن این باکتری هستند و نقش مهمی در اپیدمیولوژی عفونت‌های انسانی ایفا می‌کنند. انسان، بز، خوک، بوقلمون، جوجه و غاز نیز مخازن باکتری هستند (1). مخاط ناحیه رکتوآنال بهترین شرایط را برای کلونیزه‌شدن و تکثیر باکتری فراهم میکند و میزان درگیری مخاط رکتوم بسته به تفاوت‌های فردی از حیوانی به حیوان دیگر متفاوت است. بنابراین، مدفوع از مهمترین منابع پخش باکتری در محیط و ایجاد عفونت‌های غذازاد محسوب میشود (2). اشریشیا کلی انتروهموراژیک (Enterohemohrrogic E.coli) یکی از پاتوژن‌های مهم مشترک است که در انسان موجب اسهال‌های شدید (کولیت هموراژیک) و گاهی سندروم اورمیک همولیتیک میشود. نشخوارکنندگان، مخزن اصلی EHEC هستند و آلودگی انسان به‌شکل مسقیم و غیرمستقیم از راه تماس با مدفوع و به‌ویژه مدفوع گاو رخ میدهد (3 و 4). اشریشیا کلیO157:H7 مهمترین سروتیپ در گروه EHEC است که نقش بسزایی در شیوع بیماری‌های ناشی از اشریشیا کلی دارد. مطالعه‌های انجام‌شده شیوع صفر تا 7/15 درصدی باکتری را در مدفوع نشان می‌دهند. میزان آلودگی مدفوع گاو به این پاتوژن، 51/0 درصد در ایران (5)، 7/15 درصد در انگلستان (6)، 6/13 درصد در ترکیه (7)، 6/8 درصد دراسکاتلند (8) و 1/11 درصد در هلند (9) گزارش شده است. برخی EHECها سموم شیگا تولید میکنند و به همین علت، اشریشیا کلی مولد سموم شیگا (STEC) شناخته میشوند. شیگاتوکسینهای اشرشیا کلی از دو سم Stx1 و Stx2 تشکیل شده‌اند (10)‌‌ و وجودداشتن یا نداشتن این توکسین‌ها در بیماری‌زایی باکتری بسیار مؤثر است. اینتیمین و انتروهمولایزین از دیگر عوامل بیماری‌زایی مهم در اشریشیا کلی هستند. اینتیمین، پروتئین غشای خارجی است که ژن کروموزومی eaeA آن را کد میکند و پروتئین ضروری برای ایجاد ضایعات A/E روی سلول‌های اپی‌تلیال نواحی گاستروانتریتی است (11). شیوع سویه‌های وروتوکسیژن و ژن eaeبه‌ترتیب 26 و 29 درصد در اسپانیا (12)، 79/88 و 3/73 درصد در فرانسه (13) و شیوع Stx،3/24 درصد در آمریکا(14) و 5 تا 93/34 درصد در ایران (15 و 16) گزارش شده است. با توجه به اهمیت سویه‌های وروتوکسی‍‍ژن در بهداشت انسانی و همچنین بیماری‌زایی این سویه‌ها در گوساله‌های شیرخوار و نظر به اینکه تاکنون مطالعهای روی میزان آلودگی مدفوع گاوها به سروتیپ‌های یادشده در شهرکرد انجام نشده، مطالعه حاضر برای ارزیابی میزان وفور این سویه‌ها و همچنین حضور چند عامل حدت باکتری شامل Stx1، Stx2و اینتیمین در مدفوع گاو‌های این منطقه طراحی شده است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

جمع‌آوری نمونه: در مطالعه حاضر، تعداد 400 نمونه سوآب مدفوعی از گاوهای مبتلا به اسهال در گاوداری‌های اطراف شهرکرد تهیه و سریع در لوله استریل و مجاورت یخ به آزمایشگاه میکروب‌شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهرکرد منتقل و آزمون‌های لازم برای جداسازی باکتری اشریشیا کلی انجام شدند.

جداسازی اشریشیا کلی: برای جداسازی باکتری اشریشیا کلی،سوآب‌های مدفوعی مستقیم روی محیط مککانکی آگار کشت شدند و پس از 18 تا 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در 37 درجه سانتی‌گراد، آزمون‌های تأیید تشخیصی شامل کشت در محیط افتراقی EMB، آزمون حرکت، اندول، سیترات، MR و VP روی کلونی‌های مشکوک (کلونی تک صورتی) انجام شدند (17). سپس نمونه‌هایی که در محیط EMB، کلونی‌های با جلای سبز فلزی تولید کردند و حرکت مثبت، اندول مثبت، سیترات منفی، MR مثبت، VP منفی بودند به‌عنوان باکتری اشریشیا کلی برای آزمون واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) در محیط TSB (مرک، آلمان) کشت و پس از 18 تا 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در 37 درجه سانتی‌گراد، در یخچال نگهداری شدند.

آزمون PCR: آزمون PCR برای بررسی وجود ژن‌های کدکننده سروتیپ O157:H7 و همچنین وجود ژن‌های کدکننده تعدادی عوامل حدت (stx1، stx2 و eae) باکتری اشریشیا کلی با استفاده از پرایمرهای سنتزشده شرکت سیناژن (18) روی نمونههای مشکوک انجام شد (جدول 1). در این آزمون، باکتری E.coliO157:H7 تهیه‌شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران شاهد مثبت و آب مقطر استریل شاهد منفی بود.

آزمون PCR: آزمون PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 10 میکرولیتر Master Mix Red (شرکت سیناژن)، 12 میکرولیتر آب مقطر، 5/0 میکرولیتر پرایمر F، 5/0 میکرولیتر پرایمر R با غلظت 10 میکرومولار و 2 میکرولیتر DNA (استخراج DNA با کیت تهیه‌شده از شرکت سیناژن) تهیه شد و برای اجرای سیکل حرارتی (جدول 2) داخل دستگاه ترموسایکلر (Biorad, USA) قرار گرفت (12).

 

 

جدول 1- پرایمرهای استفاده‌شده در آزمون PCR (تهیه‌شده از شرکت سیناژن)

Anielingtempreture

Fragment(bp)

Oligonucleotid sequence (5́-3́)

Primer

Gene

58

259

CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG

O157F

rfbE

TTG CCT ATG TAC AGC TAA TCC

O157R

64

302

CGC TGA ATG TCA TTC GCT CTGC

VT1F

stx1

CGT GGT ATA GCT ACT GTC ACC

VT1R

64

516

CTT CGG TAT TCC TAT TCC CGG

VT2F

stx2

CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC

VT2R

58

775

GGA ACG GCA GAG GTT AAT CTG CAG

eaeF

eaeA

GGC GCT CAT CAT AGT CTT TC

eaeR

 

جدول 2- برنامه حرارتی مربوط به هر پرایمر

ساخت پایان

تعداد سیکل

طویل‌شدن

اتصال

واسرشت

واسرشت اولیه

پرایمر

C˚72

35

C˚72

C˚60

92˚C

C˚94

VT1

4 دقیقه

45 ثانیه

45 ثانیه

45 ثانیه

4 دقیقه

C˚72

30

C˚72

C˚61

C˚92

C˚94

VT2

4 دقیقه

45 ثانیه

45 ثانیه

45 ثانیه

4 دقیقه

C˚72

30

C˚72

C˚57

C˚94

C˚94

Eae

4 دقیقه

45 ثانیه

45 ثانیه

45 ثانیه

4 دقیقه

C˚72

30

C˚72

C˚55

C˚94

C˚94

O157

4 دقیقه

40 ثانیه

40 ثانیه

30 ثانیه

3 دقیقه


الکتروفورز: الکتروفورز با استفاده از ژل دارای غلظت 5/1 درصد، جریان برق 100 ولت، به میزان 10 میلی‌آمپر به مدت 45 دقیقه انجام شد. برای رنگ آمیزی ژل از Safe Red (سیناژن) و برای خواندن از دستگاه ترانس لومیناتور UV (UV Tech, Canada) استفاده شد.

آنتیبیوگرام: آزمون حساسیت آنتیبیوتیکی برای آنتی‌بیوتیک‌های رایج در درمان عفونت‌های گوارشی دام یا انسان با استفاده از روش استاندارد دیسک دیفیوژن (Diffiusion Disc) روی سویه‌های وروتوکسیژنیک جداشده انجام شد (19). به این منظور، از نمونه‌های وروتوکسیژنیک در محیط TSB، کشت تازه تهیه و 18 ساعت در دمای C˚37 سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد تا غلظت 5/0 مکفارلند حاصل شود. سپس باکتری با سوآب استریل آغشته به محیط، متراکم در محیط مولر هینتون آگار کشت داده شد و دیسک‌های آنتیبیوتیک با فاصله مناسب از یکدیگر در محیط‌کشت قرار گرفتند و به مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. سپس، قطر هاله ممانعت رشد حاصل از هر دیسک با خط‌کش اندازه‌گیری و با جدول‌های موجود مقایسه شد. آنتیبیوتیکهای استفاده‌شده عبارتند از: جنتامایسین (10میکروگرم)، سفتاکسیم (30 میکروگرم)، سولفامتوکسازول (25 میکروگرم)، تتراسایکلین (30 میکروگرم)، سیپروفلوکساسین (5 میکروگرم) و آمپی‌سیلین (10 میکروگرم).

 

نتایج.

. از 400 نمونه مدفوع آزمایش‌شده، 384 جدایه اشریشیا کلی تشخیص داده شدند و برای آزمون PCR خالص‌سازی شدند. با توجه به نتایج آزمون PCR و مندرجات جدول 3، از 384 باکتری اشریشیا کلی جداشده از مدفوع، هیچ‌یک از جدایه‌ها سروتیپ O157: H7 نبودند (شکل 2) هرچند سایر سویههای دارای ژنهای وروتوکسین شناسایی شدند و36 نمونه (37/9 درصد) ژن کدکننده توکسین Stx2، 104 نمونه (27 درصد) ژن کدکننده توکسین Stx1 و 16 نمونه (16/4 درصد) هر دو ژن را داشتند (شکل‌های1، 2 و 3). همچنین 280 نمونه (91/72 درصد) حاوی ژن eae بودند که از اینتعداد، 72 نمونه (75/18 درصد) حاوی ژن stx1، 24 نمونه (25/6 درصد) حاوی ژن stx2و 16 نمونه (12/4 درصد) حاوی هر دو ژن stx1و stx2بودند (شکل 4).

 

 

جدول 3- نتایج جستجوی ژنهای حدت در باکتری‌های E. coli جداشده از مدفوع گاو

 

E.coli

 

STEC

E.coli

O157:H7

stx1

stx2

stx1,2

eaeA

eaeA stx1

eaeA   stx2

eaeA,stx1 stx2

تعداد

384

124

0

104

36

16

280

72

24

16

درصد

96

29/32

0

27

37/9

16/4

91/72

75/18

25/6

16/4

 

 

شکل 1- نتیجه PCR اشریشیا کلیجداشده از مدفوع گاو با استفاده از پرایمر O157: 259 bp،

L: مارکر وزن مولکولی، +: شاهد مثبت، -: شاهد منفی

 

 

شکل 2- نتیجه PCR اشریشیا کلی جداشده از مدفوع گاو با استفاده از پرایمر VT2: 516bp،

L: مارکر وزن مولکولی، +: شاهد مثبت، -: شاهد منفی، ستونهای 55 و 52 دارای ژن کدکننده Stx2

 

 

شکل 3- نتیجه PCR اشریشیا کلی جداشده از مدفوع گاو با استفاده از پرایمر VT1: 302 bp،

L: مارکر وزن مولکولی، +: شاهد مثبت، -: شاهد منفی، ستون‌های 87، 85، 88، 89 و 90 حاوی ژن کدکننده Stx1 (ستون‌های 88 و 90 باند ضعیف دارند)

 

شکل 4- نتیجه  PCR اشریشیا کلی جداشده از مدفوع گاو با استفاده از پرایمر eae: 775 pb

L: مارکر وزن مولکولی، +: شاهد مثبت، -: شاهد منفی، ستونهای 61-62-65-67-68-70-71-72-75-76-77-78 واجد ژن eae هستند.

 


نتایج آنتیبیوگرام: با توجه به نتایج آنتیبیوگرام، مقاومت نسبت به آنتیبیوتیکهای جنتامایسین (80/25 درصد)، سفتاکسیم (38/48 درصد)، تتراسایکلین (09/87 درصد)، آمپی‌سیلین (62/51 درصد)، سیپروفلوکساسین (22/3 درصد) و سولفامتوکسازول (22/3 درصد) مشاهده شد (جدول 4).

 

 

جدول 4- نتایج حاصل از آنتیبیوگرام سویههای وروتوکسیژنیک

آنتی بیوتیک

کد دیسک

مقاوم

متوسط

نیمه‌حساس

حساس

تعداد

درصد

تعداد

درصد

تعداد

درصد

تعداد

درصد

Gentamycin

GM 10

8

8/28

10

25/32

-

-

13

93/41

Cefotaxime

CTX 30

15

4/48

-

-

16

62/51

-

-

Tetracycline

TE 30

27

87

4

9/12

-

-

-

-

Ampicilin

AM 10

16

6/51

-

-

-

-

15

38/48

Ciprofloxacin

CP 5

1

22/3

28

32/90

-

-

2

45/6

Sulfamethoxa

zol

SXT

1

22/3

2

45/6

-

-

28

32/90

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

پژوهش‌ها نشان میدهند که گاو، مخزن اصلی سروتیپO157:H7  و دیگر سویههای اشریشیا کلی است. البته درصد شیوع این سروتیپ در دامهای نوزاد به‌ویژه گوسالههای اسهالی و در درجه بعد گاوهای اسهالی به‌شکل چشمگیری بیشتر از گاوهای سالم است. در مطالعه حاضر، سروتیپ O157:H7 در نمونه‌های اشریشیا کلی جداشده یافت نشد. در مطالعهای که اسدیان و همکاران (1385) در شهرکرد روی 102 نمونه مدفوعی گوسالههای اسهالی و 16 نمونه مدفوعی گوسالههای سالم انجام دادند، از 35 نمونه مشکوک به اشریشیا کلی O157:H7، 6 نمونه (14/17 درصد)  سروتیپ O157:H7 شناخته شدند، همچنین فراوانی سویههای وروتوکسیژنیک، 9/10 درصد گزارش شد (20). همچنین شیرانی و همکاران در مطالعه خود نشان دادند که 5 درصد جدایه‌های اشریشیا کلی جداشده از گوساله‌های اسهالی حاوی ژن‌های stx2، stx1 و eae بودند (16). از نتایج مطالعه‌های پیشین به نظر میرسد که بیشتر حیوانات سالم آزمون‌شده از نظر سروتیپ O157:H7 منفی بودهاند (6). با وجود این، درصد شیوع این سروتیپ در مناطق مختلف از 1/0 تا 62 درصد تخمین زده شده است (9 و 21). در مطالعه‌هایی که در آمریکا و اروپا انجام شده‌اند، میزان آلودگی از صفر تا بیش از 10 درصد گزارش شده است (8 و 14). این تفاوت در میزان آلودگی به دلایل مختلفی روی می‌دهد؛ برای نمونه، در مطالعهای که در شمال انگلستان انجام شد با تخمین شیوع 7/15 درصدی این باکتری نتیجه‌گیری شد که شیوع سروتیپ O157:H7 در تابستان و بهار (ماههای گرم سال) بیشتر از فصل‌های سرد سال است (22). در مطالعه Aslantas و همکاران در ترکیه نیز شیوع باکتری، 6/13 درصد و بیشترین شیوع در جولای و نوامبر و کمترین شیوع در فوریه گزارش شد (7). در مطالعه سامی و همکاران (2006) در ایران روی مدفوع گاوهای جمع‌آوری‌شده از مزارع مختلف شیراز، شیوع O157:H7 در 975 نمونه جمعآوری‌شده تنها 51/0 درصد گزارش شد (5). در دیگر مطالعه‌های انجام‌شده نیز با توجه به تعداد نمونه‌های تهیه‌شده، زمان تهیه نمونه‌ها، سالم یا اسهالی‌بودن حیوانات آزمون‌شده، روش‌های استفاده‌شده برای اجرای آزمون و نحوه نمونهگیری، میزان شیوع سروتیپ O157:H7 در مکان‌ها و سال‌های مختلف متفاوت بوده است. برای نمونه، مطالعه‌ها در سال‌های 1998 و 1999 شیوع 1 تا 4 درصد را در آلمان و انگلستان نشان میدهند (8 و 9)، در حالی که در سال 2009 شیوع این سروتیپ در اسکاتلند، 6/8 درصد گزارش شد (23). در مطالعه دیگری که Omisakin و همکاران (2002) در انگلستان انجام دادند، شیوع باکتری در 589 نمونه جمع‌آوری‌شده از رکتوم گاو‌ها پیش از کشتار طی ماه مه تا جولای، 5/7 درصد گزارش شد (24). در سایر مطالعه‌های انجام‌شده در مناطق مختلف نیز میزان شیوع سروتیپ O157:H7 از صفر تا 7/15 درصد مشاهده شده است (5، 8، 25-29). با توجه به اینکه شهرکرد از مناطق سرد و کوهستانی کشور است و نمونهگیری در بهار انجام شد و سایر مطالعه‌های انجام شده در ایران (5، 17 و 19) نیز میزان زیاد آلودگی را نشان نداده‌‌اند، وجودنداشتن سروتیپ O157:H7 در مطالعه حاضر توجیه‌پذیر است. اگرچه سویه O157:H7 وجود نداشت، سایر سویه‌های تولید‌کننده وروتوکسین از نمونه‌های آزمون‌شده جدا شدند. شیوع ژن‌های stx در مطالعه حاضر، 29/32 درصد تخمین زده شد؛ تقریباً مشابه آنچه تهمتن و همکاران (2010) گزارش کردند و از 40 نمونه تهیه‌شده، 93/34 درصد نمونه‌ها حاوی ژن‌های stx، 42/53 درصد حاوی ژن stx2 و 27/10 درصد حاوی stx1 بودند و مشخص شد که فصل در شیوع سویههای واجد ژنهای تولید‌کننده شیگاتوکسین دخالت دارد، در فصل گرم 28/24 تا 9/40 درصد از می تا آگوست (در ایران) و در زمستان 96/8 تا 11/11 درصد در شیوع ژنها تفاوت وجود دارد. همچنین شیوع سروتیپ O157:H7 را 57/3 درصد گزارش کردند (15). مطالعه  Blancoو همکاران (2002) در اسپانیا نشان داد که از تعداد 514 STEC جدا‌شده از گاوهای اسهالی و سالم، 20 درصد حاوی ژن stx1، 54 درصد حاوی ژن stx2و 26 درصد حاوی هر دو ژن و 29 درصد حاوی ژن eaeA بودند (12)؛ در حالی که در مطالعه حاضر، شیوع ژن stx1، 27 درصد و شیوع ژن stx2، 37/9 درصد است. در مطالعه Bibbal و همکاران (2014) در فرانسه ، شیوع ژن‌های eaeA و stx، به‌ترتیب 3/73 و 79/88 درصد برآورد شد (13). در مطالعه حاضر نیز 91/72 درصد جدایه‌ها حاوی ژن eaeA بودند. اطلاعات مشخصی درباره نسبت stx1 و stx2 در انسان و حیوان و ارتباط آن با بیماری HUS در ایران وجود ندارد. بیشتر مشاهده‌ها نشان می‌دهند ژن stx2 نسبت به ژن stx1 خطرناکتر است و برخی مطالعه‌ها نیز نشان می‌دهند که به‌احتمال سویه‌های حاوی ژن stx2 نسبت به سویه‌های حاوی stx1 و حتی stx1,2بیماری‌زاتر هستند. همچنین پژوهش‌ها اثبات کرده‌اند که stx2 400 برابر از stx1 سمیتر است (2). در مطالعه اصلانی و همکاران در تهران، در سویه‌های STEC، شیوع ژن stx2، 96 درصد و ژن stx1، 5/3 درصد بود و ژن eaeAاز هیچ سویهای جدا نشد (17).

همان‌گونه که در پیشینه پژوهش اشاره شد، الگوی منظمی در شیوع ژن‌های حدت این باکتری مشاهده نشده ولی ژن stx2 در بیشتر اوقات در سروتیپ O157:H7 موجود بوده است. با توجه به مطالعه حاضر مدفوع گاو‌ها به سروتیپ O157:H7 آلوده نیست ولی سایر جدایه‌های وروتوکسیژن از مدفوع گاو در محیط پراکنده می‌شوند و نسبت به آنتیبیوتیک‌های رایج ‌نسبتاً مقاوم هستند. در مطالعه حاضر، مقاومت آنتیبیوتیکی نسبت به آنتیبیوتیک‌های تتراسایکلین، آمپیسیلین، سفوتاکسیم و جنتامایسین به‌ترتیب 09/87، 62/51، 38/48 و 80/25 درصد مشاهده شد. در سایر مطالعه‌های انجام‌شده نیز نتایج تقریباً مشابهی یافت شد و بر اساس مطالعه‌های منتشر‌شده، مقاومت‌های چند‌گانه میکروبی به‌شکل گستردهای در جدایه‌های اشریشیا کلی دام‌ها ازجمله گاو مشاهده میشود. در مطالعه روی حساسیت 48 جدایه گاوی STEC نسبت به آنتیبیوتیک‌های مختلف از‌جمله سولفانامید، آمپیسیلین و جنتامایسین، مقاومت آنتیبیوتیکی مشاهده شد (30). بهزادیان‌نژاد و همکاران در مطالعه خود روی اشریشیاکلی بجز O157 جدا‌شده از گاو بیان کردند که تمام جدایه‌ها دارای مقاومت‌های چند‌گانه نسبت به دو یا چند آنتیبیوتیک شامل آمپیسیلین (29 درصد)، اریترومایسین (38 درصد)، پلیمیکسین-ب (2 درصد)، تتراسایکلین (26 درصد)، سولفامتاکسازول (29 درصد) و جنتامایسین (6 درصد) هستند (10). در مطالعه مولانا و همکاران بیان شد که مقاومت آنتیبیوتیکی نسبت به آنتیبیوتیکهای در دسترس مانند آمپیسیلین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین و کوتریموکسازول بسیار شایع است در حالیکه مقاومت نسبت به عواملی که تنها در بیمارستانها به کار برده میشوند مانند جنتامایسین، سیپروفلوکساسین و نسل سوم سفالوسپورینها بسیار کمتر است. در این مطالعه، مقاومت نسبت به آمپیسیلین (96 درصد)، سفالوتین (68 درصد)، آمیکاسین (16 درصد)، جنتامایسین (27 درصد) و کوتریموکسازول (51 درصد) گزارش شد (31).

بر اساس نتایج مطالعه حاضر، اگرچه سروتیپ O157:H7 درمدفوع گاوها وجود نداشت، سایرجدایه‌های وروتوکسیژن از مدفوع گاو در محیط پراکنده می‌شوند، نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های رایج مقاوم هستند و بهداشت انسان را تهدید می‌کنند.

سپاسگزاری: مطالعه حاضر با حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه شهرکرد انجام شده است و نویسندگان مراتب قدردانی خود را ابراز می‌کنند.

 

(1)              Synge B., Paiba G. Verocytotoxin producing E. coli O157. Veterinary Research 2000; 147: 27.

(2)              Sheng H., Davis MA., Knecht MJ., Hovde CJ. Rectal administration of Escherichia Coli O157:H7 Novel model for colonization of ruminants. Applied and Environmental Microbiology 2004; 70(8): 4588-4595.

(3)              McNeilly TM., Naylor SW., Mahajan A., Mitchell MC., McAteer S., Deane D., et al. Escherichia Coli O157:H7 in cattle following systemic mucosal immunization with purified H7 flagellin. Infection and Immunity 2008; 76: 2594-2602.

(4)              Lejeune J., Besser T., Rice D. Longitudinal study of fecal shedding of Escherichia coli O157:H7 in food lot cattle: predominance and persistence of specific clonal type despite massive cattle population turnover. Applied and Environment Microbiology 2004; 70(1): 377-384.

(5)              Sami M., Firouzi R., Shekarforoush SS. Prevalence of Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in Shiraz, Iran by immunomgnetic separation and multiplex PCR. Iranian Journal of Veterinary Research 2007; 8(4): 319-324.

(6)              Chapman PA., Siddons CA., Cerdan AT., Harkin MA. A 1-year study of Escherichia coli O157:H7 in cattle, sheep pigs and poultry. Epidemiology and Infection 1997; 119: 245-250.

(7)              Aslantas O., Erdogan S., Cantekin Z., Gulact I., Evrendilek, GA. Isolation and characterization of verocytotoxin-producing E. coli O157 from Turkish cattle. International Journal of Food Microbiology 2006; 106: 338-342.

(8)              Paiba GA., Gibbens SJS., Pascoe JW., Kidd SA., Byrne C., Ryan JBM., et al. Fecal shedding of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in cattle and sheep at slaughter in Great Britain. Veterinary Research 2002; 150: 593-598.

(9)              Heuvelink AE., Biggelaar F., Boer E., Herbes RG., Melchers WJG., Monnens LAH. Isolation and characterization of verotxin-producing Echerichia coli O157:H7 strain from Dutch cattle and sheep. Journal of Clinical Microbiology 1998; 36(4): 878-882.

(10)          Behzadian nejad G., Zahraie salehi T., Mazaherienejad far R., Shams N., Shirani D. Prevalence of virulence genes stx1, ehxA, stx2 in non O157 E. coli isolated from cattle and determination of antibiotic resistance of the isolates. Journal of Veterinary Research 2011; 4: 331-335.

(11)          Madic J., Garam1 C., Vingadassalon N., Oswald E., Fach P., Jamet E., et al. Simplex and multiplex real-time PCR assays for the detection of flagellar (H-antigen) fliC alleles and intimin (eae) variants associated with enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) serotypes O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28 and O157:H7. Applied and Environmental Microbiology 2010; 109: 1696-1705.

(12)          Blanco M., Blanco JE., Mora A., Dahbi G., Alonso MP.,González A., et al. Serotypes, virulence genes and intimin types of shiga toxin (Verotoxin)-Producing Escherichia coli isolates from Cattle in Spain and identification of a new intimin variant gene (eae-ξ). Journal of Clinical Microbiology 2004; 42(2): 645-651.

(13)          Bibbal D., Loukiadis E., Kérourédan M., Garam CP., Ferre F., Cartier P., et al. Intimin gene (eae) subtype-based real-time PCR strategy for specific detection of shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H8, and O145:H28 in Cattle Feces. Applied and Environmental Microbiology 2014; 80(3): 1177-1184.

(14)          Bosilevac GM., Koohmaraie M. Prevalence and characterization of non-O157 shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from Commercial Ground Beef in the United States. Applied and Environmental Microbiology 2011; 77(6): 2103-2112.

 

(15)          Tahamtan Y., Hayati M., Namavari MM. Prevalence and distribution of the stx1,stx2 gene in shiga toxin producing E.coli (STEC) isolation from cattle. Iranian Journal of Microbiology 2010; 2(1): 8-13.

(16)          Shahrani M., Safarpoor Dehkordi F. and Momtaz H. Characterization of Escherichia coli virulence genes, pathotypes and antibiotic resistance properties in diarrheic calves in Iran. Biological Research 2014; 47: 28.

(17)          Alehashem S., Aghajani R., Dara M. Microbiology, 1th ed, Vol. 2, Ayandesazan Publication; 1987, 506-507.

(18)          Aslani MM., Bouzari S. Characterization of virulence genes of non- O157 shiga toxin- producing Escherichia coli isolates from Tow provinces of Iran. Japanese Journal of Infection Diseases 2009; 62: 16-19.

(19)          CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, Approved standard-Ninth Edition (M2-A9). Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015.

(20)          Asadian F. Study on verotoxigenic and enterotoxigenic E. coli in cattle faeces affected diarrhea in Shahrekord. DVM thesis. Shahrekord: Shahrekord univ; 2006: 97-102.

(21)          Jackson SG., Goodbrand RB., Jahnson RP., Odorico VG., Alives D., Rahn K., et al. Escherichia coli O157:H7 diarrhea associated with well water and infected cattle on an Ontario farm. Epidemiology and Infection 1998; 120: 17-20.

(22)          Chapman PA., Siddons CA., Wright P., Norman P., Fox J., Crick E. Cattle as a source of verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 infection in man. Epidemiology and Infection 1993; 111: 439-447.

(23)          Reinstein S., Fox T., Shi X., Alam MJ., Renter DJ., Nagaraja TG. Prevalence of Escherichia coli O157:H7 in organically and naturally raised beef cattle. Applied and Environmental Microbiology 2009; 75(16): 5421-5423.

(24)          Omisakin F., Mcrae M., Ogden ID., Strachan NJC. Concentration and prevalence of Escherichia coli O157:H7 in cattle feces at slaughter. Applied and Environmental Microbiology 2003; 69(5): 2444-2447.

(25)          Gansheroff LJ., Brien AD. Escherichia coli O157:H7 in beef cattle presented for slaughter in the U.S.: higher prevalence rates than previously estimated. Journal of Clinical Microbiology 2000; 97: 2959-2961.

(26)          Christopher J., Mckendrick I., Mckechnie C., McKechnie C., Fenlon D., Naylor SW., et al. Rectal carriage enterohemorragic Escherichia coli O157:H7 in slaughtered cattle. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71(1): 93-97.

(27)          Johnsen G., Wasteson Y., Heir E., Berget OI., Herikstad H. Escherichia coli O157:H7 in feces from cattle, sheep and pigs in the Southwest part of Norway during 1998 and 1999. International Journal of Food Microbiology 2001; 65: 193-200.

(28)          Laven RA., Ashmore A., Stewart CS. Escherichia coli in the rumen and colon of slaughter cattle, with particular reference to E. coli O157. The Veterinary Journal 2003; 165: 78-83.

(29)          Armstrong GL., Hollingsworth J., Morris J. Emerging foodborne pathogens: Escherichia coli O157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the developed world. Epidemiology 1996; 18: 29-51.

(30)          Kargar M., Daneshvar M., Homayun M. Monitoring of virulence markers and antibiotic resistance of shiga- toxin producing E. coli isolated from meats in Tehran. Tebe Junoob 2012; 2: 766-83.

(31)          Molana Z., Shahande Z., Hajiahmad M. Influence of heat on antibiotic resistance of S. aureus and E. coli. Journal of Medical Sciences University of Babul 2006; 4: 26-31.