واکسن پرتوتابی‌شده بیماری ویروسی تب برفکی تایپ آسیا-1 و ارزیابی پاسخ ایمنی در خوکچه هندی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار ویروس شناسی، پژوهشکده کشاورزی هسته‌ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، ایران

3 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، ایران

4 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، ایران

5 پژوهشکده کشاورزی هسته‌ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای، ایران

چکیده

مقدمه: بیماری تب برفکی یکی از بیماری‌های حاد ویروسی است که موجب بیماری گونه‌های مختلف حیوانات زوج‌سم و وحوش می‌شود. ویروس عامل بیماری به خانواده پیکورناویریده و جنس آفتوویروس تعلق دارد. هدف پژوهش حاضر، ساخت رادیوواکسن بیماری تب برفکی تایپ آسیا-1 با استفاده از پرتوی گاما و ارزیابی پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی در خوکچه‌های هندی واکسینه‌شده است.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 تکثیر و در دوزهای مختلف پرتوی گاما پرتوتابی شد. سپس با منحنی دوز/پایندگی، فاکتور ارزشD10  و دوز مطلوب غیرفعال‌سازی ویروس به‌ترتیب 69/7 و50 کیلوگری محاسبه شدند. ویژگی‌های آنتی‌ژنیک ویروس پرتوتابی‌شده و شاهد به روش ثبوت کمپلمان مقایسه و بی‌ضرری واکسن با استفاده از چهار پاساژ کور متوالی تأیید شد. در مراحل بعد، ویروس غیرفعال‌شده با ادجوانت هیدروکسیدآلومینیوم فرموله و به‌عنوان رادیوواکسن استفاده شد. پاسخ‌های ایمنی در سه گروه خوکچه هندی واکسینه‌شده با رادیوواکسن، واکسن رایج و بافر فسفات (شاهد) بررسی شدند.
نتایج: نتایج نشان دادند تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده در گروه‌های رادیوواکسن و واکسن رایج نسبت به گروه شاهد افزایش معناداری (P<0.05) داشته و میزان تولید آنتی‌بادی در دو گروه رادیوواکسن و واکسن رایج نسبت به یکدیگر اختلاف معناداری نداشته است (P>0.05). بررسی تکثیر لنفوسیت‌های طحال با آزمون MTT نشان داد که افزایش تکثیر لنفوسیت‌های T در گروه‌های رادیوواکسن و واکسن رایج مشابه و این افزایش نسبت به گروه شاهد معنادار (P<0.05) است.
بحث و نتیجه‏گیری: رادیوواکسن تهیه‌شده در پژوهش حاضر، پاسخ ایمنی هومورال و سلولی مناسبی در خوکچه هندی ایجاد کرد و در پژوهش‌های آتی برای واکسیناسیون گوساله، میزبان اصلی این بیماری، استفاده‌شدنی است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

FMD virus type Asia-1 irradiated vaccine and evaluation of immune response on guinea-pig model

نویسندگان [English]

  • Farahnaz Motamedi-Sedeh 1
  • Homayoon Mahravani 2
  • Mojgan Javadi 3
  • Naser Harzandi 4
  • Sayed Kamalodin Shafaei 5
1 Associate professor of Virology, Nuclear Agriculture Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Tehran, Iran
2 Associate professor of Microbiology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Karaj, Iran
3 M.Sc. student of Microbiology, Islamic Azad University, Karaj Branch, Iran
4 Assistant professor of Microbiology, Islamic Azad University, Karaj Branch, Iran
5 Nuclear Agriculture Research Center, Institute of Nuclear Science and Technology, Iran
چکیده [English]

Introduction: Foot and Mouth Disease (FMD) is the most contagious disease in cloven-hoofed animals which causes a lot of economical losses. FMD virus belongs to Picornaviridae family and Aphthovirus genus. The aim of the study is evaluation of humoral and cellular immune responses triggered by a Gamma-irradiated FMD vaccine in the guinea-pig model.
Materials and Methods: FMD virus type Asia-1 was multiplied on BHK21 cell line and irradiated by gamma ray in different doses. According  to dose/survival curve, D10 value and optimum dose of virus inactivation were calculated 7.69 and 50 kGy, respectively. Antigenic characteristic of irradiated and un-irradiated virus samples were evaluated by complement fixation test (CF test) and safety test was done by four blind passages cell culture on IBRS2 cell line. The inactivated virus sample was formulated as Radio- vaccine and immune responses were evaluated in three groups of ginea-pigs; the first group Radio-vaccine, the second group conventional vaccine and the last one was negative control.
Results: The results of neutralizing antibody titration for two vaccinated groups were significant (P<0.05), but between Radio-vaccine and conventional vaccine was no significant. The increase in splenocyte multiplication for two vaccinated groups by MTT test was significant (P<0.05).
Discussion and conclusion: The Gamma irradiated inactivated FMD type Asia-1 vaccine is a good candidate for immunization of guinea-pig without the problems such as residue, virus escape and etc. And it can use for vaccination of cattle in the future.

کلیدواژه‌ها [English]

  • FMD virus
  • Gamma irradiation
  • Vaccine
  • Immune Response

مقدمه.

بیماری تب برفکی یکی از بیماری‌های حاد ویروسی است که موجب بیماری گونه‌های مختلف حیوانات زوج‌سم و وحوش می‌شود. در بین نشخوارکنندگان اهلی، نخست گاو و سپس گوسفند و بز به این بیماری حساس هستند. این بیماری در بیشتر بخش‌های دنیا و حداقل در 70 گونه از حیوانات وحشی گزارش شده است و سرعت انتشار سریع آن موجب خسارت‌های بسیاری به شیر، گوشت و سایر محصولات دامی می‌شود (1). این ویروس هفت سروتایپ دارد که سه سروتایپ آن (A، O و Asia 1) در ایران رایج و از خانواده پیکورناویریده هستند و شش جنس آفتوویروس، اینترویروس‌، کاردیوویروس، رینوویروس‌، هپارناویروس‌ و پارچوویروس دارد. این خانواده ویروسی،کسپید بیست‌وجهی و ژنوم RNA تک‌رشته‌ای خطی، مثبت با اندازه 5/7 تا 5/8 کیلوجفت باز[1] دارد (2). پرتوهای یون‌ساز گاما و ایکس که برای غیرفعال‏سازی ریزموجودات استفاده می‌شوند، پرتوهای الکترومغناطیسی با طول موج کوتاه و قدرت نفوذ زیاد هستند. مطالعات درباره ویروس‌ها نشان داده‌اند که عفونت‌زایی ویروس‌ها با پرتوتابی از بین می‌رود ولی آنتی‌ژنسیتی آنها بدون تغییر می‌ماند (3 و 4). فرسکورا و همکاران در سال 1973 مشاهده کردند که ویروس FMD type C لیوفیلیزه که با پرتوی گاما غیرفعال‌شده، ویژگی آنتی‌ژنسیتی خود را طبق آزمون ثبوت کمپلمان کاملاً حفظ کرده است (5). مورتون و همکاران در سال 1970، واکسن غیرفعال بیماری انسفالیت اسبی ونزولایی (VEE) را به روش پرتوتابی گاما با دوزهای 8 تا 10 میلیون راد تهیه کردند که ویژگی ایمونولوژیک زیادی برای موش‏ها و خوکچه‏های هندی نشان داد. همچنین خوکچه‏های هندی در آزمون چلنج زنده ماندند و میزان آنتی‌بادی خنثی‌کننده در خوکچه‏های هندی و خرگوش افزایش داشت. این یافته‌ها نشان دادند که پرتوهای یون‌ساز در تهیه واکسن غیرفعال VEE بسیار مؤثر هستند (6). واکسنی که امروزه برای تب برفکی استفاده می‌شود، واکسن غیرفعال‌شده با اتیلن ایمین همراه با ادجوانت هیدروکسیدآلومینیوم است؛ این واکسن معایبی ازجمله نیمه‌عمر کوتاه، باقیماند‌های توکسیک و آلرژیک در واکسن، احتمال فرار ذره‌های ویروسی از تیمار با مواد شیمیایی و طولانی‌بودن زمان غیرفعال‌سازی ویروس دارد. بنابراین هدف پژوهش حاضر، ساخت رادیوواکسن بیماری تب برفکی تایپ آسیا-1 با استفاده از پرتوی گاما و واکسیناسیون خوکچه‌های هندی و در نهایت، ارزیابی پاسخ‌های ایمنی هومورال و سلولی ایجادشده در خوکچه‌های هندی واکسینه‌شده است (7 و 8). با توجه به خسارت‌های اقتصادی زیاد بیماری تب برفکی به صنعت دامداری در کشور و سایر کشورهای منطقه ازجمله کاهش شیر، گوشت و پشم حیوانات آلوده، روند تقاضا برای واکسن ایمن و مؤثر این بیماری رو به افزایش است. با توجه به کاهش مدت زمان غیرفعال‌سازی ویروس به چند دقیقه در فرایند تولید واکسن پرتوتابی، توانایی سیستم تولید واکسن افزایش می‌یابد. همچنین، با در نظر گرفتن قدرت نفوذ بسیار زیاد پرتوی گاما که فقط دیوار سربی قادر به ممانعت از نفوذ آن است، هیچ ذره ویروسی زنده در واکسن باقی نمی‌ماند؛ این در حالی است که در روش غیرفعال‌سازی ویروس با موادشیمیایی، احتمال فرار ذره‌های ویروسی از تیمار با ماده شیمیایی وجود دارد. بنابراین، امید است که روش پرتوتابی در آینده برای تولید صنعتی این واکسن استفاده شود.

‏‏مواد و روش‏ها.

ویروس: در پژوهش حاضر، از ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1[2] استفاده شد که مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی از ایران جداسازی کرده است. پس از تکثیر ویروس در کشت سلولی رده پایدار IBRS2 و جمع‌آوری آن، سانتریفوژ با دور کم برای جداسازی ذره‌های سلولی پاره‌شده از سوسپانسیون ویروسی انجام و سپس، تیتراسیون ویروس به روش دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد[3] انجام شد. استوک ویروسی تهیه‌شده در ویال‌های استریل به حجم 5 میلی‌لیتر تقسیم و در فریزر منفی 70 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (9 و 10).

دوزیمتری و پرتوتابی: سیستم پرتودهنده گامای استفاده‌شده در پژوهش حاضر به پژوهشکده کاربرد پرتوها و شرکت ام دی اس نوردین[4] کشور کانادا مربوط است، نرخ دوز این سیستم و اکتیویته آن به‌ترتیب ثانیه/گری 8/4 و 20469 کوری ‎است. دوزیمتری با روش فریک[5] طبق استاندارد دوزیمتری فریک شماره E 1026–04e انجام شد. ویال‌های حاوی 5 میلی‌لیتر ویروس منجمد به همراه یخ خشک با دوزهای 10، 20، 25، 30، 40، 35، 45 و 50 کیلوگری پرتوی گاما پرتوتابی شدند و سه تکرار برای هر دوز پرتوتابی انجام شد (10-13).

تیتراسیون ویروس‌های پرتوتابی‌شده و محاسبه دوز غیرفعال‌سازی: پس از پرتوتابی نمونه‌های ویروسی با دوزهای مختلف پرتوی گاما، تیتراسیون ویروسی به همان روش دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد انجام و منحنی دوز/پایندگی با نرم‌افزار Origin6.1 رسم شد. با رابطه بهترین خطی که بر این نمودار منطبق می‌شود، فاکتور ارزش[6] D10 (دوزی از پرتوی گاما بر حسب کیلوگری که جمعیت ویروسی را یک سیکل لگاریتمی کاهش می‌دهد) محاسبه و سپس دوز مطلوب غیرفعال‌سازی کامل ویروس با در نظر گرفتن تیتر اولیه آن محاسبه شد (1-13).

آزمون بی‌ضرری و بررسی ویژگی‌های آنتی‌ژنیک ویروس پرتوتابی‌شده: برای تأیید غیرفعال‌سازی کامل ویروس پرتوتابی‌شده با دوز مطلوب و انجام آزمون بی‌ضرری واکسن غیرفعال‌شده، نمونه‌های ویروسی پرتوتابی‌شده در سه دوز 40، 45 و 50 کیلوگری و هر کدام دو تکرار در کشت سلولی تک‌لایه رده سلولی پایدار کلیه بچه هامستر[7] کشت داده شدند. پس از 48 ساعت، در صورت مشاهده‌نشدن آثار تخریب سلولی (CPE)، از سوسپانسیون آنها تا چهار پاساژ متوالی روی سلول‌های BHK21 کشت داده و هر پاساژ، 48 ساعت از نظر نشانه‌های تخریب سلولی بررسی شد. برای بررسی ویژگی‌های آنتی‌ژنیک ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به ویروس شاهد از آزمون ثبوت کمپلمان استفاده شد. در این آزمون، از سیستم همولیتیک که شامل گلبول قرمز گوسفند شسته‌شده و آنتی‌بادی ضد آن است و آنتی‌بادی ضدویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 و سریال رقت آنتی‌ژن ویروسی پرتوتابی‌شده و نشده استفاده شد (13 و 14).

فرمولاسیون واکسن: پس از تأیید غیرفعال‌سازی کامل ویروس توسط پرتوی گاما و حفظ ویژگی آنتی‌ژنیک ویروس پرتوتابی‌شده، 50 میلی‌لیتر ویروس غیرفعال‌شده به روش پرتوتابی و روش رایج غیرفعال‏سازی (اتیلن ایمین) با تیتر مشخص (5/108 دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد در میلی‌لیتر[8]) همراه با ادجوانت ژل هیدروکسیدآلومینیوم[9]، بافر فسفات دی‌هیدروژن‌پتاسیم و فسفات‌هیدروژن‌سدیم و ساپونین فرموله‌ و اسیدیته بین 7 تا 8 با استفاده از گلیکوکول (گلیسین+سود) تنظیم شد.

واکسیناسیون حیوانات: در پژوهش حاضر از الگوی حیوانی خوکچه هندی استفاده شد. تعداد 9 عدد خوکچه هندی ماده با وزن تقریبی 20 گرم انتخاب و در سه گروه تقسیم شدند و به‌ترتیب به گروه اول 200 میکرولیتر واکسن رایج تولیدشده در مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، به گروه دوم 200 میکرولیتر رادیوواکسن تولیدشده در پژوهش حاضر و به گروه سوم بافر فسفات (شاهد) به روش زیرپوستی تزریق شد. دوز یادآور واکسن، 21 روز پس از نخستین تزریق واکسن انجام و 10 تا 14 روز پس از دوز دوم، خون‌گیری از قلب حیوانات و جداسازی سرم خون انجام و طحال خوکچه‌های هندی جداسازی شد.

آزمون MTT: برای بررسی میزان تکثیر لنفوسیت‌های T در طحال حیوانات واکسینه‌شده، ابتدا طحال جداسازی‌شده همراه با بافر فسفات استریل و روی یخ به آزمایشگاه منتقل و پس از جداسازی لنفوسیت‌های طحال، شمارش آنها و تعیین درصد سلول‌های زنده با لام نئوبار انجام شد. کشت لنفوسیت‌های طحال با استفاده از محیط‌کشت RPMI1640 بدون فنل‌رد و همراه با 10 درصد سرم جنین گوساله در میکروپلیت 96‌ خانه انجام و برای هر نمونه 9 خانه کشت داده شد؛ به‌شکلی که 3 خانه با افزودن فیتوهماگلوتینین (عامل محرک رشد سلول) شاهد مثبت، 3 خانه با افزودن آنتی‌ژن ویروسی به‌عنوان آزمون اصلی نمونه و 3 خانه شاهد منفی انتخاب شد. پس از 48 ساعت، معرف نمک تترازولیوم طبق دستورعمل کیت تجاری[10] افزوده شد و پس از 4 ساعت، بلورهای فورمازان تشکیل شدند؛ در چاهک‌هایی که رشد لنفوسیت‌ها بیشتر بود، بلورهای بیشتری مشاهده شدند. سپس حلال کیت، شامل SDS 10 درصد در کلریدریک‌اسید 01/0 مولار اضافه و یک شب در 37 درجه سانتی‌گراد گرم‌خانه‌گذاری و در انتها، جذب نوری هر خانه با دستگاه الایزاریدر در طول موج 540 نانومتر خوانده شد. ضریب شاخص تحریکی تکثیر لنفوسیت‌های طحال با تقسیم‌کردن میانگین جذب نوری خانه‌های آزمون اصلی نمونه به میانگین جذب نوری خانه‌های شاهد منفی محاسبه و در سه گروه واکسن پرتوتابی‌شده، واکسن رایج و گروه شاهد با یکدیگر مقایسه شد (15 و 16).

تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده: از آزمون خنثی‌سازی سرم برای تیتراسیون آنتی‌بادی خنثی‌کننده در سرم حیوانات واکسینه‌شده استفاده شد؛ 100 میکرولیتر از رقت‌های 1:8، 1:16، 1:32، 1:64 و 1:128 سرم تهیه و با 100 میکرولیتر ویروس تب برفکی با تیتر 100 دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد مخلوط شد، پس از یک ساعت مخلوط یادشده به چاهک‌های حاوی کشت سلول BHK21 منتقل و پس از 48 ساعت، تیتر آنتی‌بادی با توجه به آشکارشدن یا نشدن آثار تخریب سلولی[11] محاسبه شد. در هر چاهکی که سرم حیوان، ویروس را خنثی کرده است، نشانه‌های تخریب سلولی دیده نشد به این معنا که سرم حیوان، آنتی‌سرم ضدویروس را داشته است و در هر چاهکی که نشانه‌های تخریب سلولی دیده شد یعنی سرم حیوان، آنتی‌سرم ضدویروس را نداشته، ویروس خنثی شده است و نشانه‌های تخریب سلولی بروز کرده‌اند. در نهایت، بیشترین رقت سرم که نشانه‌های تخریب سلولی را در 50 درصد سلول‎های تک‌لایه‌ای نشان می‌دهد، تیتر سرم در نظر گرفته و لگاریتم مبنای ده عکس ضریب آن رقت، تیتر آنتی‌سرم ضدویروس گزارش ‎شد (17).

اندازه‌گیری میزان سایتوکاین‌ها: در پژوهش حاضر، سایتوکاین‌های اینترفرون گاما[12] که بیشتر لنفوسیت‌های T کمک‌کننده کلاس یک[13] آنها را تولید می‌کنند و اینترلوکین 4[14] که به‌طور عمده لنفوسیت‌های T کمک‌کننده کلاس دو[15] آنها را تولید می‌کنند با کیت‌های تجاری الایزا ساخت شرکت ای بیوساینس[16] اندازه‌گیری شدند.

مطالعات آماری: مقایسه میانگین‌ها برای نتایج تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده، ضریب شاخص تحریکی رشد لنفوسیت‌های طحال، مقادیراینترفرون گاما و اینترلوکین 4 به روش آنالیز واریانس یک‌طرفه[17] با نرم‌افزار اس‌پی‌اس‌اس-16[18] تجزیه و تحلیل شدند (18).

 

نتایج.

تیتر ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 پرتوتابی‌شده و نشده به روش دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد و با رابطه رید و مونچ[19] محاسبه شد (جدول 1). با توجه به تیتر ویروس در دوزهای مختلف پرتوتابی، نمودار دوز/پایندگی با نرم‌افزار 6.1 Origin رسم و رابطه بهترین خط عبوری از منحنی یافت شد (شکل 1). با معادله خط، فاکتور ارزش D10 و دوز مطلوب غیرفعال‌سازی کامل ویروس به ترتیب 69/7 و 52/50 کیلوگری محاسبه شدند. در جدول 2، نتایج بررسی نشانه‌های تخریب سلولی در چهار پاساژ متوالی از نمونه‌های پرتوتابی‌شده در دوزهای 40، 45 و 50 کیلوگری مشاهده می‌شوند؛ با توجه به این نتایج، دوز مطلوب گاما برای غیرفعال‏سازی ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 با تیتر 5/106 در میلی‌‌لیتر که در هر چهار پاساژ متوالی نشانه تخریب سلولی ایجاد نکند، 50 کیلوگری تعیین شد.

 

 

جدول1- تیتر نمونه‏های ویروس پرتوتابی‌شده با پرتو گاما با دوزهای صفر، 10، 20، 25، 30، 35، 40 و 50 کیلوگری

دوز پرتوتابی (کیلوگری)

0

10

20

25

30

35

40

45

50

تیتر ویروسی

دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد/mL

5/6 10

5/5 10

66/3 10

5/3 10

102

66/1 10

33/1 10

5/0 10

5/0 10

 

شکل1- منحنی دوز/پایندگی و رابطه بهترین خط عبوری از منحنی برای نمونه‌های ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 پرتوتابی‌شده

 

جدول 2- نتایج آزمون بی‌ضرری در نمونه‏های ویروسی پرتوتابی‌شده تا چهار پاساژ متوالی

نمونه ویروس پرتوتابی‌شده

نشانه‌های سایتوپاتیک در پاساژهای متوالی

پاساژ اول

پاساژ دوم

پاساژ سوم

پاساژ چهارم

kGy  40– نمونه 1

+

+

+

+

kGy  40– نمونه 2

+

+

+

+

kGy  45– نمونه 1

-

+

+

+

kGy  45– نمونه 2

-

+

+

+

kGy  50– نمونه 1

-

-

-

-

kGy  50– نمونه 2

-

-

-

-

 

اتصال اختصاصی بین آنتی‌سرم اختصاصی ضدویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 و نمونه‌های ویروسی پرتوتابی‌شده با دوزهای مختلف پرتو گاما از صفر تا 50 کیلوگری به روش ثبوت کمپلمان ارزیابی شد؛ این آزمون مشخص کرد که ویژگی آنتی‌ژنیک نمونه‌های ویروسی پس از پرتوتابی تغییر نکرده است. لوپ G-H قرارگرفته در پپتید VP1 کپسید ویروس تب برفکی، جایگاه اختصاصی اتصال آنتی‌بادی خنثی‌کننده به ویروس و گفتنی است که این لوپ در ویروس پرتوتابی‌شده در پژوهش حاضر بدون تغییر مانده است. نتایج آزمون ثبوت کمپلمان در جدول 3 مشخص می‌کنند که ویژگی آنتی‌ژنیک ویروس پس از پرتوتابی تا دوز 50 کیلوگری پرتوی گاما در دو رقت اولیه نسبت به نمونه پرتوتابی‌نشده بدون تغییر باقی می‌ماند و باعث القای پاسخ ایمنی مناسب در حیوان می‌شود.


جدول 3- نتایج آزمون ثبوت کمپلمان نمونه‌های پرتو‌تابی‌شده با پرتو گاما

دوز پرتوتابی (کیلوگری)

رقت ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 با تیتر 106در هر میلی‌لیتر از دوز عفونت‌زایی کشت بافتی 50 درصد

1

2/1

4/1

8/1

0

+4

+4

+0.5

0

10

+4

+4

+0.5

0

20

+4

+4

+0.5

0

30

+4

+4

Tr

0

40

+4

+4

Tr

0

45

+4

+4

Tr

0

50

+4

+4

Tr

0

 

پس از تزریق واکسن فرموله‌شده به خوکچه های هندی، تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده، میزان تکثیر لنفوسیت‌های T طحال و میزان اینترفرون گاما و اینترلوکین 4 در هر سه گروه تعیین شد (جدول 4). تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده و میزان تکثیر لنفوسیت‌های طحال در گروه‌های واکسن مرسوم و رادیوواکسن افزایش معناداری (P<0.05) نسبت به گروه شاهد نشان دادند، هرچند اختلاف معناداری بین دو گروه واکسینه‌شده وجود نداشت (P>0.05). افزایش غلظت اینترفرون گاما در هر دو گروه واکسینه‌شده نسبت به گروه شاهد معنادار و این افزایش در گروه رادیوواکسن نسبت به واکسن مرسوم معنادار (P<0.05) بود. افزایش غلظت اینترلوکین 4 در هر دو گروه واکسینه‌شده نسبت به گروه شاهد معنادار نیست (P>0.05).

 

 

 

 

 

جدول 4- نتایج تیتر آنتی‌بادی خنثی‌کننده، میزان تکثیر لنفوسیت‌های T طحال، میزان اینترفرون گاما و اینترلوکین 4

گروه واکسن

تکثیر لنفوسیت‌ها (SI)

میانگین SI ±انحراف معیار

غلظتIFN-γ (pg/ml)

میانگین غلظت IFN-γ ± انحراف معیار

غلظت IL4

میانگین غلظت IL4 ± انحراف معیار

تیتر آنتی‌بادی

شاهد

67/0

018/0 ± 69/0

53/98

96/12±68/84

52/665

220/220± 84/857

< 6/0

شاهد

70/0

69/82

05/1098

< 6/0

شاهد

704/0

84/72

96/809

< 6/0

واکسن مرسوم

15/1

149/0± 1/1

95/332

41/48±25/315

96/809

57/1697± 84/2351

> 1/2

واکسن مرسوم

20/1

48/260

97/4170

> 1/2

واکسن مرسوم

92/0

33/352

60/2074

> 1/2

رادیوواکسن

3/1

280/0± 56/1

80/501

65/128±08/395

41/1035

63/641± 73/1436

> 1/2

رادیوواکسن

27/1

00/252

75/2176

>1/2

رادیوواکسن

90/0

45/323

05/1098

> 1/2

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

والی و کاری، پژوهشگران فرانسوی، در سال 1927 نخستین تلاش برای استفاده از واکسن حفاظتی تب برفکی را انجام دادند (19). باهنمان در سال 1973 در مرکز FMD آمریکا از آزیریدین‌ها مانند اتیلن ایمین برای واکسن تب برفکی استفاده کرد (19). پرتوهای یون‌ساز گاما و ایکس که برای غیرفعال‏سازی ریزموجودات استفاده می‌شوند، پرتوهای الکترو‌مغناطیسی با طول موج کوتاه و قدرت نفوذ زیاد هستند. مطالعات درباره باکتری‌ها و ویروس‌های دامی نشان داده‌اند که پرتوتابی، عفونت‌زایی ویروس‌ها را از بین می‌برد و آنتی‌ژنسیتی آنها بدون تغییر می‌ماند و تیمارهای شیمیایی روی ویژگی‌های آنتی‌ژنیک اثر می‌کنند مگر اینکه این مواد شیمیایی از محیط واکسن حذف یا خنثی شوند (9، 12، 14 و 20). در پژوهش حاضر، از عامل غیرفعال‌کننده پرتوی یون‌ساز گاما استفاده شد. مزیت‌های استفاده از پرتوی گاما به جای مواد شیمیایی عبارتند از: باقیمانده‌های توکسیک و آلرژیک مواد شیمیایی استفاده‌شده برای غیرفعال‌سازی ویروس در محصول نهایی واکسن پرتوتابی‌شده وجود ندارند؛ به دلیل قدرت نفوذ بسیار زیاد پرتو گاما که تنها دیوار سربی مانع نفوذ آن می‌شود، امکان فرار ذره‌های ویروسی از تیمار با پرتو وجود ندارد و خطر ابتلا به بیماری پس از واکسیناسیون از بین می‌رود ولی در واکسن های غیرفعال به روش شیمیایی امکان فرار ذره‌های ویروسی زنده از تیمار با ماده شیمیایی وجود دارد؛ پرتودهی در دمای کم انجام می‌شود و مدت زمان پرتودهی مطابق استانداردهای موجود فقط چند دقیقه است و بنابراین امکان تغییر پروتئین‌های آنتی‌ژنتیک ویروس در روش پرتوتابی وجود ندارد و با کم‌شدن زمان پرتوتابی توان سیستم تولید واکسن در واحد زمان افزایش می‌یابد (3، 4، 5 و 21).

لمباردو و اسمولکو (1990) از پرتوی گامای تابش‌شده از چشمه کبالت 60 برای غیرفعال‌سازی ویروس تب برفکی و تهیه واکسن با کیفیت آنتی‌ژنیک خوب برای آن استفاده کردند (12). اسمولکو و لمباردو (2005) پرتوتابی گاما را برای غیرفعال‏سازی نسبی یا کامل ویروس‌های تب برفکی، هرپس سیمپلکس ویروس و RLV استفاده کردند و نشان دادند که منحنی غیرفعال‏سازی به ویروس و سایر پارامترهای خارجی مانند دوز، نوع پرتو، دمای پرتوتابی و طبیعت مواد ویروسی طی فرایند پرتوتابی بستگی دارد. نتیجه درخور توجه پژوهش یادشده، کاربرد تئوری هدف برای غیرفعال‏سازی ویروس تب برفکی بود که به‌طور موفقیت‌آمیزی به آنتی‌ژن پرتوتابی‌شده غیرفعال این ویروس به‌صورت واکسن ضد بیماری تب برفکی منجر شد. همچنین، مقدار یک میلیون دوز این واکسن به‌طور تجاری تولید شد و گوساله‌ها را در برابر بیماری محافظت کرد (14). شریف و مول باچر (2010) نشان دادند که ویروس آنفولانزا A غیرفعال‌شده با پرتوی گاما، نامزد واکسن پیشنهاد می‌شود و متوجه شدند که تجویز داخل بینی ویروس Flu A/RR/8 پرتوتابی گاما شده به‌شکل تک دوز باعث القای پاسخ ایمنی متقاطع در عفونت‌های هتروساب تایپی ازجمله سویه آنفولانزای پرندگان H5N1 می‌شود. بنابراین، روش تهیه ویروس آنفولانزای پرتوتابی‌شده با پرتوی گاما، فناوری جدیدی برای تهیه واکسن آنفولانزا با اثر حفاظتی متقاطع شد (22). فورویا و همکاران در دانشگاه ملی استرالیا (2010)، اثر روش‌های غیرفعال‏سازی بر پاسخ ایمنی متقاطعی را بررسی کردند که ویروس‌های آنفولانزا A کشته‌شده القا می‌کنند. آنها با بررسی کارایی ویروس‌های غیرفعال‌شده با اشعه ماورای بنفش، فرمالین و پرتوی گاما برای القای پاسخ ایمنی در آزمون چلنج بر ضد ویروس هترولوگ و همولوگ نشان دادند که فعالیت هماگلوتیناسیون در ویروس غیرفعال‌شده با پرتوی گاما و ویروس‌های غیرفعال‌شده با فرمالین و اشعه ماورای بنفش به‌ترتیب سه و ده برابر کاهش داشته است. از این رو پرتوتابی گاما در مقایسه با سایر روش‌های غیرفعال‏سازی، کمترین اثر تخریبی را روی ساختار پروتئینی ویروس دارد و ویروس غیرفعال‌شده با پرتوی گاما برخلاف ویروس غیرفعال‌شده با دو روش دیگر باعث القای ایمنی در ویروس‌های هتروساب تایپ می‌شود. همچنین، ویروس غیرفعال‌شده با پرتوی گاما برخلاف ویروس‌های غیرفعال‌شده با فرمالین و اشعه ماورای بنفش باعث القای پاسخ ایمنی سلولی از نوع تی سایتوتوکسیک[xx] می‌شود. واکسن آنفولانزای غیرفعال‌شده با پرتوی گاما، ایمونوژنیستی غالبی در مقایسه با سایر روش‌های رایج غیرفعال‏سازی تجاری دارد و باعث اثر حفاظتی بیشتری در مقابله با عفونت‌های هموتایپ و هتروتایپ این ویروس می‌شود که به کاهش پاسخ التهابی ریه و میزان ویروس در ریه میزبان منجر می‌شود (23). معتمدی و همکاران (1385)، ویروس تب برفکی (FMDV type A87/IRN) را با پرتوی گاما ساطع از چشمه کبالت 60 غیرفعال کردند و پس از فرمولاسیون به‌عنوان رادیوواکسن برای ایجاد ایمنی هومورال در خوکچه هندی استفاده کردند (9 و 24).

با توجه به مزایایی که واکسن پرتوتابی‌شده نسبت به واکسن غیرفعال با مواد شیمیایی دارد و نیز شیوع سه سویه ویروس تب برفکی در ایران (A05، O Panasia و Asia 1)، آماده‌سازی و آزمون واکسن پرتوتابی برای هر کدام از سویه‌ها به‌طور جداگانه ضروری بود. در پروژه‌ای مشترک بین پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای و مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، واکسن پرتوتابی‌شده برای تایپ O Panasia ویروس تب برفکی بررسی و نتایج رضایت‌بخشی یافت شد (25). نتایج پژوهش حاضر مشخص کردند که رادیوواکسن تهیه‌شده برای تایپ آسیا-1 ویروس تب برفکی باعث ایجاد پاسخ ایمنی هومورال حفاظتی (تولید آنتی‌بادی با تیتر بیش از 1/2) و ایمنی سلولی (تکثیر بیشتر لنفوسیت‌های طحال و میزان اینترفرون گامای بیشتر) مناسب در خوکچه هندی می‌شود. از نظر تولید اینترفرون گاما نیز حیوانات واکسینه‌شده با رادیوواکسن، غلظت بیشتری را نشان دادند و بنابراین، تحریک لنفوسیت‌های T کمک‌کننده کلاس یک در رادیوواکسن بهتر از واکسن مرسوم انجام می‌شود. از آنجا که غلظت اینترلوکین 4 در هر دو گروه واکسینه‌شده نسبت به شاهد معنادار نبود، هیچ‌یک از دو نوع واکسن، لنفوسیت‌های T کمک‌کننده کلاس دو را تحریک نمی‌کنند. پیشنهاد می‌شود بررسی‌های ایمونولوژیکی کامل‌تر ازجمله اندازه‌گیری میزان اینترلوکین 2 و 10 و اثر بر لنفوسیت‌های T سیتوتوکسیک در پژوهش‌های آتی انجام شوند و در نهایت، رادیوواکسن تولیدشده در میزبان اصلی، گوساله، آزمون شود.



[1]- kbp

[2]- Asia-1

[3]- TCID50

[4]- MDS Nordion

[5]- Fricke

[6]- D10 Value

[7]- BHK21

[8]- 108.5 TCID50/ml

[9]- Al (OH)3

[10]- Cell Proliferation Kit 1 (MTT)- Roche

[11]- CPE

[12]- IFN-γ

[13]- T-helper1

[14]- IL4

[15]- T-helper2

[16]- eBioscience

[17]- Anowa One-way (LSD method)

[18]- SPSS16

[19]- Reed and Mounch

[xx]- T Cytotoxic Cells

 

(1)              Alexandersen S., Zhang Z., Donaldson AI., Garland AJ. The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Comparative Pathology 2003; 129(1): 1-36.

(2)              Barteling SJ., Vreeswijk J. Development in foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine 1992; 9(2): 75-88.

(3)              Genoza W. Inactivation of viruses by ionizing radiation and by heat In: Aramorosch K., Oprowski H. editors. Methods in virology. New York: Academic Press Inc; 1968: 4.

(4)              Jordan RT., Kempe LL. Inactivation of some animal viruses with gamma radiation from cobalt 60. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine1956; 91: 212-215.

(5)              Frescura T., Vivoli P. Studies of the foot and mouth disease virus sub-types using antigens inactivated by gamma radiations. Zoonoses and Public Health 1973; 20: 822-825.

(6)              Morton R., Tribble HR., Leonard G. Gamma-irradiated Venezuelan equine encephalitis vaccines. Applied Microbiology 1970; 19(5): 763-767.

(7)              Rodriguez LL, Grubman MJ. Foot and mouth disease virus vaccines. Vaccine. 2009; 27: D90- D94.

(8)              Motamedi Sedeh F., Khorasani A., Shafaee SK., Arbabi K. Immune response of foot and mouth disease virus type A87/IRN inactivated on guinea pig in Iran. Iranian Journal of Science and Technology, Transaction A. 2007; 31(A1): 35-41.

(9)              Motamedi sedeh F., Khorasani A., Shafaee SK., Fatolai H., Arbabi K. Preparation of FMD type A87/IRN inactivated vaccine by gamma irradiation and Immune response on guinea-pig. Indian Journal of Microbiology. 2008; 48 (3): 326-330.

(10)          Standard practice for using the Fricke Reference-Standard Dosimetry system. ASTM E1026- 04e1.

(11)          Lombard M., Pastoret PP., Moulin AM. A brief history of vaccines and vaccination. Scientific and Technical Review of the Office International des Epizooties 2007; 26(1): 29-48.

(12)          Lombardo JH, Smolko E. Biotechnological project with a gamma radiation source of 100,000 Ci. Radiatio. Physics and Chemistry 1990; 35(4-6): 585-589.

 

(13)          Stark LM, Lewis AL. Complement Fixation Test In: Specter S., Lancz G., editors. Clinical Virology Manual. New York: Published Elsevier; 1992: 203-208.

(14)          Smolko EE, Lombardo JH. Virus inactivation studies using ion beams, electron and gamma irradiation. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research 2005; B 236: 249-253.

(15)          Grubman MJ., Lewis SA., Morgan DO. Protection of swine against foot-and-mouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems Vaccine.1993; 11(8): 825-829.

(16)          Roosien J., Belsham GJ, Ryan MD., King AM., Vlak JM. Synthesis of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in insect cells using baculovirus expression vectors. Journal of General Virology. 1990; 71(Pt 8): 1703-1711.

(17)          Chinsangaram J., Beard C., Mason PW., Zellner MK, Ward G., Grubman MJ. Antibody response in mice inoculated with DNA expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins. Journal of Virology 1998; 72(5): 4454- 4457.

(18)          Goris N., Maradei E., D’aloia R., Fondevila N., Mattion N., Perez A., et al. Foot-and-mouth disease vaccine potency testing in cattle using homologous and heterologous challenge strains: precision of the “Protection against Podal Generalisation” test. Vaccine. 2008; 26(27-28): 3432–3437.

(19)          Sutmoller P., Barteling SJ. The history of foot and mouth disease vaccine development: a personal perspective In Dodet B., Vicari M. editors. Foot and mouth disease control strategies. Paris: Elsevier (Editions scientifiques et medicales SAS); 2003.

(20)          Bahnemann HG. The inactivation of foot and mouth disease virus by ethyleneimine and propyleneimine. Zentralbl. Veterinärmed 1973; B(20): 356-360.

(21)          Polley JR. The use of gamma radiation for the preparation of virus vaccines. Canadian Journal of Microbiology1962; 8: 455-459.

(22)           Alsharifi M., Mu¨ llbacher A. The c-irradiated influenza vaccine and the prospect of producing safe vaccines in general. Immunology and Cell Biology2010; 88: 103–104.

(23)          Furuya Y., Regner M., Lobigs M., Koskinen A., Mu¨ llbacher A., Alsharifi M. Effect of inactivation method on the crossprotective immunity induced by whole ‘killed’ influenza A viruses and commercial vaccine preparations. Journal of General Virology2010; 91: 1450-1460. ]

(24)          Motamedi-Sedeh F., Khorasani A., Shafaei S. K., Salehizadeh M., Fatollahi H., Arbabi K., Majd F. Inactivation of Foot and Mouth Disease Virus by Gamma Irradiation in order to killed vaccine preparation. Nuclear Science and Technology Journal 1385; 37(2): 17-21.

(25)          Motamedi-Sedeh F., Production of FMD type O vaccine by nuclear and molecular techniques in cattle-Phase1. Final report of project, Research and technical deputy of Atomic Energy Organization of Iran; 1394.