شناسایی باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری از خاک‌های شور گلستان و بررسی برخی صفات فیزیولوژیک آنها

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای فیزیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران

2 استادیار فیزیولوژی مولکولی، دانشگاه شهید بهشتی تهران، ایران

3 استادیار اصلاح نباتات مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیۀ نهال و بذر، کرج، ایران

4 استاد ژنتیک مولکولی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ایران

چکیده

مقدمه: میکروارگانیسم‌های هالوفیل (نمک‌دوست) و هالوتولرانت (تحمل‌کنندۀ نمک) گروهی از افراطی پسندها که قادر به رشد در محیط واجد نمک سدیم‌کلراید هستند و برای زندگی در محیط‌های شور تطابق یافته‌اند. وجود باکتری‌های نمک‌دوست در خاک‌های شور ازطریق حفظ چرخۀ غذایی، تجزیۀ مواد آلی و بهبود ساختمان و حاصلخیزی خاک شرایط خاک را بهبود می‌بخشد.
مواد و روش‏‏ها: به‌منظور جداسازی باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری، از ریزوسفر گیاهان شورپسند، چهار منطقۀ بیابانی در استان گلستان نمونه‌گیری شد. برای بررسی میزان اکسترموفیل‌بودن جدایه‌ها، مقاومت آنها به شوری، خشکی، دما و pH بررسی شد و.همچنین صفات محرک رشد آنها نیز اندازه‌گیری گردید.‏‏
نتایج: از چهل و پنج جدایۀ به‌دست‌آمده، سه جدایه (G3، G6 و G14) مقاومت 40 درصدی به شوری را نشان دادند. جدایه‌های G6 و G3 به‌ترتیب دارای قدرت حل‌کنندگی فسفات به‌میزان 301 و 201 میلی‌گرم بر لیتر بودند. جدایۀ G6 7/20 میکروگرم بر میلی‌لیتر اکسین تولید کرد. جدایۀ G14 وG6 در دمای 50 درجه سلسیوس، 10 pH= و پتانسیل اسمزی 7/0- مگاپاسکال رشد داشتند؛ درحالی‌که جدایۀ G3 در دمای 50 درجه، در5/7pH= و پتانسیل اسمزی 49/0- رشد داشتند. این سه سویه مربوط به جنس‌های باکتریایی Bacillusو Pseudomonas بودند.
بحث و نتیجه‏گیری: در مطالعۀ حاضر جدایه‌های جداشده به‌دلیل رشد در غلظت‌های اشباع نمک و تحمل شرایط سخت محیطی، باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری و یا احتمالاً نمک‌دوست است و پتانسیل استفاده در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژیکی ازجمله تولید آنزیم‌هایی صنعتی و کودهای بیولوژیکی برای اصلاح خاک‌های شور را دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identification of halophile bacteria from salt deserts of Iran and study some of their physiological traits

نویسندگان [English]

  • Maryam Safdarian 1
  • Hossein Askari 2
  • Masoud Soltani 3
  • Ghorbanali Nematzadeh 4
1 PhD student of Molecular physiology, Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran
2 Associate Professor of Molecular physiology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
3 Associate Professor of Plant breeding, Seed and Plant improvement institute, Karaj, Iran
4 Professor of Molecular genetics, Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran
چکیده [English]

Introduction: Halophiles and halotolerant microorganisms are some of the extremophiles that are able to grow in medium containing sodium chloride and have adapted to life in salinity environments. Halophiles bacteria in saline soils by maintaining the food chain, decomposition of organic matter and improvement of soil structure and fertility improve soil conditions.
Materials and methods: In order to isolate the halotoletant bacteria, from the halophyte rhizosphere, four desert areas in Golestan province were sampled. To check the Extremophile of isolates, their resistance was tested for resistant to salinity, drought, temperature and PH. Also, plant growth promoting traits were measured.
Results: Fromforty-five strains which were isolated, three strains (G3, G6 and G14) have demonstrated the ability of resistance to 35% salt. Isolates G6 and G3 phosphate solubiliziation power of 301 and 201 ppm, respectively. Isolated G6 micrograms produced auxin 20/7 Mg/ ml. G14 and G6 grow at 50 °C, pH = 10 and osmotic potential -0 /7MPa. While G3 strain grows at 50 °C, pH = 7/ 5 and osmotic potential -0/49. The three strains of the bacterial genera Bacillus and Pseudomonas, respectively.
Discussion and conclusion: In this study, isolates due to the growth in concentrations of salt and saturated salt tolerance of extreme environmental conditions and are likely halotolerant or halophile bacteria and its potential for use in various fields of biotechnology including biotech, industrial enzyme production and biological fertilizers for saline soil improvement.

کلیدواژه‌ها [English]

  • auxin
  • Bacillus
  • Halotoerant
  • Halophile
  • Pseudomonas
  • Phosphate solubility
  • Salt

مقدمه.

باکتری‌ها و آرکی‌ها میکروارگانیسم‌های غالب در شوره‌زارها[1] هستند (1 و 2). سازگاری آنها می‌تواند به‌دلیل بالابودن فشار اسمزی، تجمع املاح آلی در سیتوپلاسم آنها و ایجاد تعادل اسمزی باشد. دریاچه‌های نمک، حوضچه‌های استخراج نمک، شورابه‌ها و خاک‌های بسیار شور و خشک، زیستگاه طبیعی باکتری‌ها و آرکی‌های نمک‌دوست هستند (1 و 3). این‌گونه میکروارگانیسم‌ها در چنین شرایط سخت طبیعی با تنش‌های فراوان ازجمله غلظت‌های بالای نمک، خشکی شدید و تابش نور فرابنفش خورشید مقابله می‌کنند و با تنظیم فشار اسمزی بقای خود را تضمین می‌کنند (4 و 5). در سال‌های اخیر، پتانسیل استفاده از این ارگانیسم‌ها در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژی دارویی، زیست‌پالایی، کودهای زیستی و غیره به‌شدت مورد توجه قرار گرفته است. پتانسیل بالای این ارگانیسم‌ها به‌دلیل خصوصیات منحصربه‌فرد، متابولیسم متفاوت و سازگاری آنها به شوری بالا است که سبب تسهیل در استفاده از آنها برای بسیاری از فرایندهای صنعتی می‌شود؛ برای مثال هنگام کار با آنها به استریلیزاسیون نیازی نیست. باکتری‌های اکسترموفیل (میکروارگانیسم‌هایی را که قادر به زندگی در زیستگاه‌هایی با دمای بالا و پایین، pH قلیایی و اسیدی، فشار هیدروستاتیک بالا و غلظت بالای نمک هستند) به‌جهت سازگاری با شرایط سخت زیستی به‌عنوان منابع ارزشمندی برای شناسایی و تخلیص آنزیم‌های مورداستفاده در صنایع مختلف مانند آمیلاز، پروتئاز، نوکلئاز، لیپاز، ایزومرازها و هیدرولازهای جدید که در غلظت‌های نمکی بالا پایداری خود را حفظ می‌کنند مطرح هستند (۱، 2و 5).

میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست به‌دلیل مقدار بالای نمک در درون سلول، تعادل اسمزی ایجاد می‌کنند، گاهی غلظت نمک (به‌خصوص پتاسیم‌کلرید) در درون سلول ممکن است به 5 مولار هم برسد. پروتئین‌های هالوفیل‌ها به‌نحوی سازگار شده‌اند که برای پایداری و فعالیت مناسب به این میزان نمک نیاز دارند (3). هالوتولرانت‌ها طیف وسیعی از باکتری‌ها را تشکیل می‌دهند که در برابر نمک مقاوم هستند؛ بدین معنی که در حضور نمک و یا غیاب آن می‌توانند رشد و تکثیر داشته باشند. معمولاً این باکتری‌ها که روی مواد غذایی حاوی 5درصد یا بیشتر نمک می‌توانند رشد کنند، شامل بعضی از انواع Bacillus، Microcucus، Corynebacterium، Streptococcus و Clostridium هستند (5).

از راهکارهای نوین برای مقابله با تنش شوری در گیاهان و کاهش آثار زیان‌بار آن معرفی میکروارگانیسم‌های تحمل‌کنندۀ شوری است که بهبوددهندۀ رشد گیاه نیز هستند. گیاه‌پالایی (استفاده از گیاهان تحمل‌کنندۀ شوری) و یا اصلاح زیستی (با استفاده از میکروارگانیسم‌های تحمل‌کنندۀ شوری) برای اصلاح خاک‌های شور در مقیاس وسیع ازجملۀ این روش‌ها است (6 و 7). برخی از باکتری‌های جداسازی‌شده از مناطق شور شامل Flavobacterium, Azospirillum, Alcaligens, Acetobacterium و Pseudomonasاست. باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کنندۀ شوری در اطراف ریشۀ گیاهان می‌توانند آثار تنش شوری را کاهش دهند و حاصلخیزی خاک را بهبود ببخشند (2). باکتری‌های محرک رشد جداسازی‌شده از مناطق شور مقاومت به مقادیر بالای نمک را نشان می‌دهند و باعث افزایش مقاومت گیاه دربرابر تنش شوری اطریق هدایت هیدرولیکی، تجع اسمزی، ازبین‌بردن آثار سمی یون سدیم، حفظ هدایت اسمزی بالاتر و فتوسنتز بیشتر می‌شود (8). باکتری‌های ریزوسفری می‌توانند از افزایش غلظت اتیلن در گیاهان در هنگام بروز تنش جلوگیری کند و سبب کاهش آثار منفی این هورمون در رشد و توسعه اندامهای گیاهی به ویژه ریشه شوند. باکتری‌های محرک رشد می‌توانند ازطریق تولید آنزیم ACCدآمیناز (1- آمینوسیکلوپروپان 1-کربوکسیلات) میزان تولید اتیلن را تنظیم کنند. این آنزیم به‌صورت غیرمستقیم و عمدتاً ازطریق کاهش سطح اتیلن در گیاه باعث تداوم رشد گیاه می‌شود (9). همچنین باکتری‌های محرک رشد با مکانیسم‌های مختلفی همچون تثبیت نیتروژن مولکولی، انحلال فسفر نامحلول، تولید سیدروفور میکروبی، تولید هورمون‌های گیاهی ازقبیل اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، جیبرلین‌ها و کاهش غلظت اتیلن می‌توانند باعث افزایش رشد شوند (2 و 10). برای شناسایی و توصیف تکامل نژادی باکتری‌ها از تجزیه و تحلیل ژن 16SrRNA استفاده می‌شود. ژن‌های 16SrRNA برای زنده‌ماندن همۀ موجودات ضروری هستند و همچنین ردیف بازهای آلی در این ژن‌ها به‌شدت محافظت می‌شود. به همین دلیل تعیین ردیف بازهای آلی ژن 16SrRNA به‌عنوان یک روش استاندارد برای شناسایی گونه‌ها، جنس‌ها و باکتری‌ها به کار می‌رود. اخیراً ردیف بازهای آلی فقط در بخش کوچکی از ژن 16SrRNA برای تشخیص باکتری‌های در سطح جنس یا سطوح بالاتر استفاده می‌شود. از جمله اهداف موردنظر در پژوهش پیش رو جداسازی و شناسایی باکتری‌های محرک رشد تحمل‌کنندۀ شوری، و بررسی مقاومت به خشکی، حرارت و اسیدیتۀ محیط در این باکتری‌ها است.

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‌برداری خاک: نمونه‌گیری از عمق 30سانتی‌متری خاک چهار منطقۀ بیابانی از بیابان‌های شور استان گلستان (اینچه برون، آق قلا، گمیشان و سیمین شهر) در مهرماه 1392 صورت گرفت. نمونه‌های خاک در داخل کیسه‌های نایلونی قرار گرفتند و برای به‌حداقل‌رسیدن تبخیر به آزمایشگاه میکروبیولوژی پژوهشکده ژنتیک و زیست‌فناوری کشاورزی طبرستان منتقل گردیدند و در دمای 4 درجه سانتیگراد (یخچال) نگهداری شدند.

جداسازی باکتری‌ها: برای جداسازی باکتری‌ها یک گرم از نمونۀ خاک در 9 میلی‌لیتر از محلول نمکی استاندارد (85/0درصد نمک طعام) حل شد و به‌مدت یک ساعت روی شیکرانکوباتور با دور 100 دور در دقیقه قرار گرفت و تا رقت11-10رقیق شد. 60 میکرولیتر از سوسپانسیون خاک روی چند محیط کشت پخش و در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت انکوبه شد. کلونی‌هایی که مورفولوژی متفاوتی داشتند، انتخاب شدند و با کشت متوالی خالص‌سازی و برای مطالعات بیشتر در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در این آزمایش از محیط‌های کشت (جدول 1) برای باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری برای جداسازی باکتری‌ها استفاده شد.

 

جدول 1- نام محیط کشت و ترکیبات آنها

ترکیبات (گرم بر لیتر)

نام محیط کشت

Nutrient Brouth: 8, Agar: 15

NA

Tryptone: 15, Soytone: 5, Sodioum Chloride: 5, Agar: 15

TSA

LB: 25, Agar: 15

LBA

Glycerol: 5, Yeast Extract: 2, Dipotassium phosphate: 1, Agar: 15

GYA

NaCl: 174, MgSO4.7H2O: 0.1, (NH4)2SO4: 2, K2HPO4: 3.12, NH4CL: 2, Glucose: 10

A

 

 


مقاومت به شوری: برای بررسی میزان مقاومت به شوری جدایه‌ها، آنها در محیط کشت مایع نوترینت براث با غلظت‌های بدون شوری (شاهد)، 5، 10، 15، 20، 25، 35 و 40درصد کلریدسدیم کشت داده شدند. میزان رشد جدایه‌ها (با اندازه‌گیری چگالی نوری در 660 نانومتر) اندازه‌گیری شدند.

مقاومت به خشکی: محیط کشت مایع با پتانسیل‌های مختلف (50/0 ، 15/0-، 03/0-، 49/0-، و 73/0- مگاپاسکال) با اضافه‌کردن غلظت‌های مناسب از پلی‌اتیلن‌گلیکول (PEG 6000) تهیه و با 1/0 میلی‌لیتر از کشت مایع باکتریایی تلقیح شدند. از هر غلظت سه تکرار تهیه شد؛ سپس در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس و با 120 دور در دقیقه به‌مدت 24 ساعت انکوبه شدند. رشد باکتری‌ها با اندازه‌گیری چگالی نوری در 600 نانومتر با دستگاه اسپکتوفتومتر اندازه‌گیری شد (11).

مقاومت به pH بالا: باکتری‌ها در محیط کشت مایع نوترینت براث با pHهای مختلف 5، 5/5، 6، 5/6، 7، 5/7، 9 و 10 کشت داده شدند. باکتری‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای 2 ± 30 درجه سلسیوس قرار داده شدند؛ سپس جذب نوری محیط حاوی باکتری‌ها در طول‌موج 600 نانومتر خوانده شد (12).

مقاومت به درجه حرارت: به‌منظور بررسی اثر تنش حرارتی یک لوپ از کشت تازه باکتری در لوله‌های 30میلی‌لیتری حاوی 10 میلی‌لیتر نوترینت براث تلقیح و به‌مدت 8 ساعت در شیکر انکوباتور قرار داده شد تا جمعیت باکتریایی به  cfu/ml108 ×2 برسد. لوله‌های کشت‌شده را به‌مدت 24 ساعت در دمای 50 درجه سلسیوس قرار داده و سپس جذب نوری آنها در 600 نانومتر خوانده شد (3).

تخمین کمی ایندول3- استیک‌اسید (IAA): برآورد میزان اکسین با روش بریک و همکاران (1991) و با استفاده از اسپکتروفتومتری انجام شد. نمونه‌های باکتری که به‌مدت 72 ساعت در محیط کشت نوترینت برات همراه با ال-تریپتوفان (500 میکروگرم در میلی‌لیتر) و 2درصد نمک طعام در30 درجه سانتیگراد رشد کرد و با معرف سالکوسکی[2] (50 میلی لیتر، 35درصد از اسیدپرکلریک، 1 میلی‌لیتر 5/0 مولار محلول FeCl3) به نسبت 1:1 مخلوط شدند. تولید اکسین به‌صورت درجاتی از رنگ صورتی نشان داده می‌شود و چگالی نوری آن، در 530 نانومتر خوانده شد. غلظت اکسین تولیدشده با تهیۀ منحنی استاندارد از اکسین در محدودۀ 10 تا100 میکروگرم در میلی‌لیتر برآورد شد (13).

حلالیتفسفات: برای شناسایی قدرت حل‌کنندگی فسفات باکتری‌ها، هر جدایه به‌طور جداگانه روی محیط کشت جامد پیکوفسکی (PKV) حاوی 10 گرم گلوگز، 5 گرم تری‌کلسیم‌فسفات، 5/0 گرم عصارۀ مخمر، 5/0 گرم سولفات آمونیوم، 2/0 گرم کلرید پتاسیم، 2/0 گرم کلرید سدیم، 1/0گرم سولفات منیزیم، 0003/0گرم سولفات آهن، 0003/0گرم سولفات منگنز و 10 گرم آگار در لیتر با اسیدیتۀ ثابت 7 (محیط کشت جامد) کشت شد و پتری‌ها در دمای 2±30 درجه سانتیگراد به‌مدت 5 روز نگهداری شدند. برای شناسایی قدرت حل‌کنندگی فسفات از خصوصیت شفاف‌سازی محیط پیرامون کلنی استفاده شد (3)؛ سپس هر جدایه به‌صورت جداگانه در محیط کشت مایع پیکوفسکی به‌مدت 100 ساعت (با سرعت 100 دور در دقیقه) و در دمای 2±30 درجه سانتیگراد کشت داده شد. در پایان، 2 میلی‌لیتر محیط کشت از هر فالکون برداشته و به ویال‌های 2میلی‌لیتری انتقال داده شد. سپس برای حذف باکتری و مواد جامد موجود در محیط کشت، ویال‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه و در دمای 25 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و محلول رویی شفاف هر ویال به ویال‌های جدید منتقل گردید (14 و15). درنهایت فسفر قابل‌استفاده با روش پیشنهادشده توسط واتانابی و السن[3] (14) اندازه‌گیری شد.

سیدروفور: اندازه‌گیری سیدروفور تولیدشده توسط باکتری‌ها با استفاده از روش کاس شاتل[4] (16) صورت گرفت. باکتری‌های کشت‌شده در محیط حداقل آهن و در دمای (2±30) درجه سلسیوس کشت شدند؛ سپس به‌مدت 15 دقیقه در 27000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. محلول کاس به مایع رویی کشت به نسبت مساوی اضافه و به‌مدت 20 دقیقه انکوبه شد. در صورت وجود سیدروفور، آهن از ترکیب رنگی حذف و باعث کاهش در شدت رنگ آبی می‌شود. شدت رنگ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در 630 نانومتر خوانده می‌شود. برای اندازه‌گیری میزان سیدروفور، محیط حداقل به‌عنوان شاهد استفاده شد و درصد سیدروفور با استفاده از فرمول [(Ar–As)٫Ar] × 100 محاسبه شد که در آن، به Ar = جذب مرجع (محیط حداقل + محلول تولیدشده به‌روش کاس)، As= جذب نمونه است. (16).

اندازه‌گیری میزان اسیدسیانیدریک(HCN) : بررسی تولید HCN، به‌روش نمک الی یا معدنی اسیدپیکریک (10) انجام شد. باکتری‌ها در محیط کشت نوترینت براث حاوی 4/4درصد گرم گلیسین کشت داده شدند؛ سپس کاغذ صافی (واتمن شماره 1) آغشته به محلول 2درصد کربنات سدیم و 0/5درصد اسیدپیکریک روی محیط کشت قرار داده شد و در انکوباتور با دمای 2± 28 درجه سانتیگراد به‌مدت 96 ساعت قرار گرفتند. تولید HCN توسط تغییر رنگ کاغذ صافی از زرد تا نارنجی قهوه‌ای نشان داده می‌شود (17).

بررسی مولکولی: استخراج DNA به‌روش فنل-کلروفرم انجام گرفت (3) به‌منظور انجام واکنش PCR و تکثیر ژن 16SrDNA با طول bp 1500، از پرایمرهای 27F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ و 1525R, 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′ استفاده شد (12). هر واکنش 25میکرولیتری شامل 10 میکرولیترPCR Master Mixes kit (Thermo Scientific, USA)، 50 نانوگرم DNA و pmol20 از هر پرایمر بود. شرایط PCR شامل دمای واسرشت‌سازی 94 درجه به‌مدت 5 دقیقه، به‌همراه 35 سیکل حرارتی با دمای 94 درجه به‌مدت یک دقیقه، 58 درجه به‌مدت 90 ثانیه و 72 درجه به‌مدت 2 دقیقه و تکثیر نهایی در 72 درجه به‌مدت 10 دقیقه بود. به‌منظور خالص‌سازی محصولPCR از روی ژل آگارز (یک‌درصد) بریده و توسط کیت خالص‌سازی (MN آلمان) خالص شد و توالی‌یابی توسط شرکت Bioneer کره جنوبی انجام گرفت.

بررسی‌های بیوانفورماتیکی: توالی ژن16SrDNA باکتری‌های موردنظر که مشابه با توالی‌های 16SrDNA سایر باکتری‌ها در بانک ژنی GenBank/EMBL/DDBJ بودند ازطریق برنامۀ BLASTN مقایسه و با نرم‌افزارMEGA6 هم‌ردیف[5] شدند. آنالیز فیلوژنی و رسم درخت فیلوژنتیک براساس الگوریتم Neighbor-joining phylogeny انجام شد (18).

 

نتایج.

خالص‌سازی باکتری‌ها: از مناطق نمونه‌گیری‌شده با شوری 40 دسی‌زیمنس بر متر 45 جدایه، جداسازی و خالص‌سازی شد. از میان این جدایه‌ها، 30 جدایه توانایی تحمل 5درصد شوری، 10جدایه توانایی تحمل 7/0- مگاپاسکال، 15 جدایه توانایی تحمل دمای 50 درجه و 10 pH= را داشتند. 10 جدایه هم تا حدودی مقاومت به هر چهار تنش را نشان دادند. سه جدایۀ G14، G6 و G3 بالاترین میزان مقاومت به تنش‌های غیرزیستی (شوری، خشکی و pH) را نشان دادند. جدایۀ G14 وG6 در دمای 50 درجه سانتیگراد، 10pH=، پتانسیل اسمزی 7/0- مگاپاسکال و شوری 40درصد مقاومت داشتند. بهترین رشد G6 در شوری 10-25درصد G14 در شوری 10-30درصد مشاهده شد (شکل 2 و 3)؛ درحالی‌که جدایۀ G3 در 30 درصد شوری، دمای 50 درجه، 5/7pH= و پتانسیل اسمزی 49/0- را تحمل کرد و بهینۀ رشد این جدایه در شوری 10درصد مشاهده شد (شکل 1، 2 و3). ارزیابی سه جدایه برای حل‌کنندگی فسفات، تولید اکسین، اسیدسیانیدریک و تولید سیدروفور انجام شد. نتایج نشان داد از بین سه جدایه، جدایه‌های G6 و G3 به‌ترتیب دارای قدرت حل‌کنندگی فسفات به‌میزان 301 و 201 میلی‌گرم بر لیتر بودند. جدایۀ G6 قادر به تولید 7/20  میکروگرم بر میلی‌لیتر اکسین پس از 72 ساعت انکوباسیون بود؛ هیچ‌کدام از جدایه‌ها HCN و سیدروفور تولید نکردند (جدول 2).

 

   
 

شکل 1- رشد جدایه‌های G14 ,G6 و G3 در محیط کشت مایع و نوترینت براث حاوی درصدهای متفاوت نمک (نشان‌داده‌شده در نمودار). رشد باکتری‌ها با OD 660 nm نشان داده شده است.

 

 

شکل 2- رشد جدایه‌های G14 ,G6 و G3 در محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف پلی‌اتیلن‌گلیکول در پتانسیل‌های (05/0-، 3/0-، 49/0- و 73/0- مگاپاسکال). رشد باکتری‌ها با OD 600 nm نشان داده شده است.

 

   

شکل 3- اثر pH ها (نمودار راست) و دماهای مختلف (نمودار چپ) بر رشد باکتری‌هایG14 ,G6 و G3 رشد باکتری‌ها با OD 600 nm نشان داده شده است.

جدول2- صفات فیزیولوژیکی در جدایه‌های جداسازی‌شده

جدایه

تست گرم

مقاومت به شوری (5 مولار)

حل‌کنندگی فسفات(ppm)

تولید اکسین (µg/ml)

تولید سیدروفور

HCN

G6

+

+

201

7/20

-

-

G14

+

+

-

-

-

-

G3

-

+

301

-

-

-

+، وجود صفت و -، نبودِ صفت

 


شناسایی جدایه‌ها: تطابق چندگانۀ (Multiple alignment) توالی 16SrDNA باکتری موردنظر با سایر توالی‌های 16SrDNA موجود در بانک ژنی NCBI نشان داد که باکتری G14و G6 با 99 و 9/99درصد شباهت متعلق به Bacillus subtillis و باکتریG3 با 99درصد شباهت متعلق به reactansPesudumonas است(4) (شکل 4).

 

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی براساس توالی ژن16S rDNA باکتریG6, G14 و G3 و سایر توالی‌های دردسترس در بانک ژنی NCBI که نشان‌دهندۀ موقعیت این باکتری‌ها در میان سایر باکتری‌هاست. رسم درخت فیلوژنتیک براساس الگوریتم neighbor-joining و براساس ضریب Boot Strap صد

 

 

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

باکتری‌های تحمل‌کنندۀ نمک و نمک‌دوست نسبی گروه متنوعی را متشکل از جنس‌های مختلف تشکیل داده‌اند که در محدودۀ وسیعی از غلظت‌های نمک می‌توانند رشد کنند و در مناطق بسیار شور یا شور در خاک و آب وجود دارند. باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری و نمک‌دوست در خاک‌های شور ازطریق حفظ چرخۀ مواد غذایی، تجزیۀ مواد آلی و بهبود ساختمان و حاصلخیزی خاک، شرایط خاک را بهبود می‌بخشند. مطالعۀ حاضر جداسازی باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری از خاک‌های منحصربه‌فرد با شوری و pH قلیایی بالا است. عوامل محیطی مختلف بر رشد هالوتولرانت‌ها و نمک‌دوست‌ها بسیار مؤثرند. دمای محیط کشت علاوه بر تأثیر بر میزان رشد، در نمک‌دوستی میکروارگانیسم نیز دخالت دارد؛ به‌گونه‌ای که می‌تواند حتی در طبقه‌بندی آنها به نمک‌دوست یا تحمل‌کننده تأثیرگذار باشد (6، 7 و 15)؛ به این دلیل، اثر تغییرات دما بر محیط کشت بررسی شد تا شرایط رشد ازنظر دما و میزان تحمل آنها به دماهای بالا بررسی شود. در پژوهشی که ونتوسا[vi] در سال 1998 انجام داده، دامنۀ تحمل دما در بین باکتری‌های نمک‌دوست نسبی جداسازی‌شده از زیستگاه‌های معمول اکثراً بین 45-15 درجه سانتیگراد است (8)؛ از طرفی در کتاب مرجع برگی[vii] نیز گزارش‌های ارائه‌شده دربارۀ دامنۀ تحمل دما در باکتری‌های نمک‌دوست نسبی بیشتر بین 45-15 درجه سانتیگراد است؛ هرچند برخی در 4 درجه سانتیگراد نیز رشد می‌کنند (20). در صورتی که نتایج این پژوهش نشان داد بهترین دما برای باکتری‌های هالوفیل40-30 درجه سانتیگراد است که تا 50 درجه را هم توانستند تحمل کنند و دامنۀ تحمل دمایی بین 50-20 درجه بود.

تأثیر تنش شوری با استفاده از غلظت‌های متفاوت کلرید سدیم و خشکی با استفاده از غلظت‌های متفاوت پلیاتیلنگلیکول 6000 بر رشد جدایه‌ها بررسی شد. هر دو تنش با افزایش فشار اسمزی محیط باعث ایجاد تنش اسمتیک در جدایه‌ها می‌شوند که خود مستلزم تنظیم اسمزی توسط جدایه‌ها هستند. پلی‌اتیلنگلیکول به‌دلیل وزن مولکولی زیاد (6000) نمی‌تواند وارد آپوپلاست شود؛ بنابراین آب نه تنها از سلول فاصله می‌گیرد؛ بلکه از دیوارۀ سلولی نیز دور نگه داشته می‌شود و این امر باعث می‌شود این پلیمر شرایط بسیار مشابهی با خاک نسبت به سایر مواد اسمزی که به‌تدریج وارد دیوارۀ سلولی می‌شوند، ایجاد کند (6  و 8). در این آزمایش جدایه‌ها توانایی زنده‌ماندن در 20درصد پلیاتیلنگلیکول و رشد در 35درصد کلرید سدیم دیده شد. در گزارشی رحمان و ناتیال[viii] (12)، گزارش کردند که سویه‌هایی از جنس ریزوبیوم توانایی مقاومت در تنش 45درصد پلیاتیلنگلیکول را دارند. همچنین راوین کومار[ix] و همکاران (21)، در آزمایشی اعلام کردند سویه‌های سودوموناس توانایی زنده‌ماندن در 5/40درصد پلیاتیلنگلیکول را دارند. مقاومت به تنش شوری، خشکی و حرارت بالا در دو جدایۀ G6 و G14 که از جنس باسیلوس بودند بالاتر از جدایۀ G3 که از جنس سودوموناس بود دیده شد که می‌تواند به‌دلیل شکل دیوارۀ داخلی باسیلوس باشد (13). خواب در اندوسپورهای باسیلوس آنها را مستعد مقاومت در برابر شرایط سخت محیطی کرده است. شکل اسپورها و توانایی مقاومت در برابر تنش‌های زیستی باعث حفظ جمعیت و استفاده از آنها در فرمولاسیون پودری کرده است (9 و 22).

باکتری های نمک‌دوست و تحمل‌کننده شوری در اطراف ریشۀ گیاهان می‌توانند آثار تنش شوری را کاهش دهند و حاصلخیزی خاک را بهبود ببخشند (8). راجپوت[x] و همکاران (11) گزارش کردند که ایزولۀ SAL-15 قادر به افزایش مقاومت گندم به شرایط شوری خاک است. ارتفاع گیاه و بیوماس گیاه پس از تلقیح در مقایسه با عدمِ‌تلقیح به‌میزان زیادی افزایش یافت. ایزولۀ SAL-15 براساس تجزیه و تحلیل توالی‌یابی ژنی 16SrRNA متعلق به گونه و جنس Planococcus rifietoensisبود. این باکتری قادر به زنده‌ماندن در غلظت بالای نمک (65 گرم بر لیتر) و pH برابر 9 است که می‌تواند رشد گیاه را نیز در این شرایط بهبود ببخشد. نتیجۀ این مطالعه نشان داد باکتری SAL-15 پتانسیل زیادی برای تولید کود بیولوژیکی برای افزایش عملکرد در خاک‌های شور را دارد. همچنین دارای توانایی تولید اکسین و انحلال فسفات معدنی است (15). باکتری‌های محرک رشد جداسازی‌شده از مناطق شور مقاومت به مقادیر بالای نمک را نشان می‌دهند و باعث افزایش مقاومت گیاه در برابر تنش شوری ازطریق هدایت هیدرولیکی، تجع اسمزی، ازبین‌بردن آثار سمی یون سدیم، حفظ هدایت اسمزی بالاتر و فتوسنتز بیشتر می‌شود (8). باکتری‌های محرک رشد تحمل‌کنندۀ شوری نسبت به سایر باکتری‌های محرک رشد توانایی بیشتری برای تحمل شوری محیط را دارند. از میان جدایه‌ها دو جدایۀ تولیدکنندۀ اکسین و حل‌کنندۀ فسفات بودند؛ درحالی‌که فسفر در شرایط شوری غیرمحلول یا با حلالیت ضعیف است. بسیاری از باکتری‌های حل‌کنندۀ فسفات عملکرد گیاه را حتی در شرایط تنش هم افزایش می‌دهند. حلالیت فسفات توسط جنس Bacillus sp جداشده از خاک‌های شور را پژوهشگران دیگر نیز گزارش داده‌اند (4 و 16). جدایه‌ها در غلظت بالای نمک (5 مولار کلرید سدیم) در شرایط آزمایشگاهی مقاومت نشان دادند. حل‌کنندگی فسفات صفت بسیار مهم محرک رشد گیاه است. در این فرایند میکروارگانیسم‌های حل‌کنندۀ فسفات، فسفات نامحلول را حل می‌کنند و آن را در دسترس گیاهان قرار می‌دهند (23). ال آزیم[xi] و همکاران گزارش دادند که تمام جدایه‌هایی که حل‌کنندۀ فسفات هستند می‌توانند تری‌کلسیم‌فسفات (TCP) را در محیط کشت مایع و جامد به اسیدهای آلی تبدیل کند و باعث اسیدی‌شدنpH محیط کشت شود (25 و 26). کاهش pH محیط به‌دلیل تولید اسیدهای آلی و قند توسط جدایه‌ها است؛ علاوه بر این، جدایه‌ها قادر به تحمل 5 مولار کلرید سدیم (35درصد) هستند که نشان‌دهندۀ مقاومت به شوری است. از سه سویۀ شناسایی‌شده یک سویه تولید‌کنندۀ اکسین بود. تولیدIAA وابسته به حضور ال تریپتوفان در محیط است که باکتری با بهره‌گیری از نصف ال تریپتوفان، ایندول‌استیک‌اسید تولید می‌کند. افزایش در تولید IAA وابسته به افزایش در میزان ال تریپتوفان بود. تولید ایندول‌استیک‌اسید یک صفت مهم محرک رشد گیاه برای باکتری است؛ به‌طوری که این فیتوهورمون سیستم ریشۀ گیاه را توسعه می‌دهد، جذب مواد غذایی را بهبود می‌بخشد (24 و 25). اگامباردیوا (2009) گزارش داد باکتری‌های محرک رشد تحمل‌کنندۀ شوری، در شرایط تنش شوری تولید اکسین آنها افزایش می‌یابد و باعث افزایش رشد گیاه در شرایط تنش شوری می‌شوند (10 و 20).

براساس نتایج آنالیز فیلوژنی دو جدایه مربوط به جنس باسیلوس و یکی از آنها به جنس سودوموناس تعلق داشت. نقش باسیلوس در ارتقای رشد گیاه به‌طور گسترده‌ای شناخته شده است. بسیاری از گونه‌های باسیلوس ازجمله Bacillus subtilis، Bacillus amyloliquoefaciens، Bacillus cereus،Bacillus pumilusو Bacillus polymyxa به‌طور گسترده‌ای به‌عنوان عامل کنترل بیولوژیکی به‌دلیل تولید چندین آنتی‌بیوتیک شناخته شده‌اند و حمایت‌کنندۀ رشد گیاه در شرایط تنش شوری توسط تولیدکنندۀ فیتوهورمون‌ها، حل‌کنندۀ فسفات، تولید آمونیاک از مواد نیتروژن‌دار آلی و غیره هستند (13 و 28). لیم و کیم[xii] (2009) گزارش تولید IAA و IBA توسط Bacillus Subtilis AH18 و Bacillus licheniforims K1 کردند. همچنین افزایش در رشد فلفل قرمز، اسفناج، گوجه فرنگی و تربچه را نشان دادند (17). همچنین جدایه‌هایBacillus pumilusوBacillus licheniforimsجداشده از ریزوسفر توسکا با تولید جیبرلین C19 باعث رشد ساقه می‌شوند (22).

گزارش‌های پژوهشگران دیگر نیز نشان داد که باکتری‌های جداسازی‌شده از خاک شور به احتمال زیاد مقاومت در برابر تنش شوری را از خود نشان می‌دهند. از سوی دیگر اگر این باکتری‌ها دارای صفات محرک رشد نیز باشند، برای کشاورزی پایدار ایدئال هستند (8 و11).

در مطالعۀ حاضر جدایه‌های جداشده به‌دلیل رشد در غلظت‌های اشباع نمک و تحمل شرایط تنش محیطی احتمالاً جزء باکتری‌های تحمل‌کنندۀ شوری بود و پتانسیل استفاده در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژیکی ازجمله تولید آنزیم‌های صنعتی و کودهای بیولوژیکی برای اصلاح خاک‌های شور را دارند.



[1]- Salt Marsh

[2]- Salkowski

[3]- Watanabe and Olsen

[4]- CAS-Shattle

[5]- Blast

[vi]- Vensota

[vii]- Bergey

[viii]- Rehman and Nautiyal

[ix]- Praveen Kumar

[x]- Rajput

[xi]- El-Azeem

[xii]- Lim and Kim

 

(1) Abrol IP., Yadav JSP., Massoud, FI. Salt Affected Soils and Their Management. Food and Agriculture Organization (FAO), Soils Bulletin, Food and Agriculture Organization of the United Nations,  Rome; 1988. vol. 39.

(2) Margesin R., Schinner F. Potential of halotolerant and halophilic Microorgnisms for biotechnology. Extremophiles 2001; 5(4): 73-83.

(3) Holt JG., Krieg NR., Sneath PHA., staley JT., Williams ST. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9thed. Williams and Wilrins. Maryland; 1994.

(4) Kaye JZ., Baross AJ. Synchronous effects of temperapture, hydrostatic pressure and salinity on growth, phospholipids profiles, and protein patterns of four Halomonas species isolated from deep see hydrothermal -vent and sea surface environments. Applied and Environmental Microbiology 2004; 56(10): 6220-6229.

(5) Larsen H. Halophilic and halotolerant microorganisms -an overview and historical perspective. FEMS Microbiology Reviews 1986; 39 (1): 3-7.

(6) Madigan M., Oren A. Thermophilic and halophilic extremophils. Current Opinion in Microbiology 1999; 2(3): 265-269.

(7) Mehrshad M., Amoozegar MA., Yakhchali B., Shahzedeh Fazeli A. Biodiversity of moderately halophilic and halotolerant bacteria in the western coastal line of Urmia lake. Biological Journal of Microorganisms 2012; 1(2): 49-70.

(8) Ventosa A., Nieto JJ., Oren A. Biology of moderately holophilic aerobic bacteria. Microbiologyand Molecular Biology Reviews 1998; 62(2): 504-544.

(9) Kiran KK., Chandra TS. Production of surfactant and detergent-stable, halophilic, and alkalitolerant alpha-amylase by a moderately halophilic Bacillus sp. strain TSCVKKApplied Microbiology and Biotechnology 2008; 77 (5): 1023- 31.

 

(10)           Egamberdiyeva D. Alleviation of salt stress by plant growth regulators and IAA producing bacteria in wheat. Acta Physiologiae Plantarum 2009; 31(4): 861-864.

(11)           Rajput L., Imran A., Mubeen F., Hafeez FY. Salt-tolerant pgpr strain planococcus rifietoensis promotes the growth and yield of wheat (triticum aestivum l.) Cultivated in saline soil. Pakistan journal of botany 2013; 45(6): 1955-1962.

(12)           Rehman A., Nautiyal CS. Effect of drought on the growth and survival of the stress-tolerant bacterium Rhizobium sp. NBRI2505 sesbania and its drought-sensitive transposon Tn5 mutant. Current Microbiology 2002; 45(5): 368- 377.

(13)           Barazani O, Friedman J. Effect of exogenously applied l-tryptophan on allelochemical activity of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Journal of Chemical Ecology. 2000; 26(2): 343- 9.

(14)           Watanabe F., Olsen S. Test of an ascorbic acid method for determining phosphorous in water and NaHCO3 extracts from soil. Soil Science Society of America, Proceedings 1965; 29(6): 677–678.

(15)           Yasmin S., Hafeez F., Schmid M., Hartmann A. Plant beneficial rhizobacteria for sustainable increased yield of cotton with reduced level of chemical fertilizer. Pakistan Journal of Botany 2013; 45(2): 655-662.

(16)           Payne SM. Detection, Isolation and characterization of siderophores. Methods in Enzymology 1994; 235(1): 329- 44.

(17)           Castric PA. Hydrogen cyanide, a secondary metabolite of Pseudomonas aeruginosaCanadian Journal of Microbiology 1974; 21 (5): 613- 8.

(18)           Weisburg WG., Barns SM., Pelletier DA., Lane DJ. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 1991; 173(2): 697- 703.

(19)           Kunte H. Halophilic microorganisms. Canadian Journal ofMicrobiology 1995; 48: 185-197.

(20)           Barazani O, Friedman J. Effect of exogenously applied l-tryptophan on allelochemical activity of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Journal of Chemical Ecology. 2000; 26(2): 343- 9.

(21)           Praveen Kumar G., Kishore N., Leo Daniel Amalraj E., Mir Hassan Ahmed SK., Rasul A., Desai S. “Evaluation of fluorescent Pseudomonas sp. with single and multiple PGPR traits for plant growth promotion of sorghum in combination with AM fungi,” Plant Growth Regulation 2012; 67(2): 133- 140.

(22)           Lim JH., Kim SD. Synergistic plant growth promotion by the indigenous auxins-producing PGPR Bacillus subtilis AH18 and Bacillus licheniforims K11. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 2009; 52(5): 531- 8.

(23)           Pikovskaya R. Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species. Microbiologyal 1948; 17(2): 362- 370.

(24)           Arabi F., Nikravesh Z., Babaeezad V., Rezaeian V., Rahimian H. Occurrence of bacterial leaf spot of garden beet caused by Pseudomonas syringae pv. aptata in Iran. Iran Journal of Plant Pathology 2006; 42 (4): 655- 671 (In Persian).

(25)           El-Azeem SAMA., Mehana TA., Shabayek AA. Some plant growth promoting traits of rhizobacteria isolated from Suez Canal region, Egypt. African Crop Science Conference Processing 2007; 8: 1517- 25.

(26)           Jan AT., Azam M., Ali A., Haq Q. Novel approaches of beneficial Pseudomonas in mitigation of plant diseases an appraisal. Journal of Plant Interactions 2011; 6(4): 195- 205.

(27)           Klopper JW. A review of mechanisms for plant growth promoting by PGPR. 6th international PGPR workshop, 5-10 october 2003, calculla, India; 2003.

(28)           Yildirim E., Taylor AG. Effect of biological treatments on growth of bean Plants under Salt Stress. Annual Report of the Bean Improvement Cooperative 2005; 48: 176-177.