تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات با استفاده از عصارۀ آنزیمی آزوسپریلوم‌برازیلنس در محیط عاری از سلول

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروب‌شناسی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 استاد میکروب‌شناسی، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات‌ها (PHAS) پلیمرهای باکتریایی هستند که معمولاً به‌عنوان پلی‌استر ذخیره‌ای توسط طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌ها تحت شرایط عدم‌تعادل مواد غذایی ساخته می‌شوند و خواص مکانیکی پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات‌ها آنها را جهت جایگزینی با پلاستیک‌های تولیدشده از مواد پتروشیمی مشابه مناسب ساخته است.؛اما برخلاف پلاستیک‌های رایج در طبیعت به‌طور کامل به CO2 و H2O تبدیل می‌شود. PHA می‌تواند به‌وسیلۀ روش‌های بیوتکنولوژی تحت شرایط کنترل‌شده تولید شود.‏‏
مواد و روش‏‏ها: ابتدا یک سوسپانسیون میکروبی غنی از PHB آماده شد و پس از شکستن سلول‌ها و اطمینان از نبودِ سلول زنده، به محیط حداقل یا محیط M9 اضافه شد. سپس کدورت نمونه در طول‌موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد و انکوباسیون در 30 درجه سلسیوس و rpm 120 صورت گرفت. بعد از طی مدت‌زمان تعیین‌شده کدورت محلول و میزان PHB موجود در محیط اندازه‌گیری شد و از مقدار شاهد کسر گردید. میزان گلوکز محیط نیز اندازه‌گیری شد؛ سپس روی نمونۀ PHB استخراج‌شده آنالیزهای فیزیکی و شیمیایی جذب UV، FTIR، HPLC و HNMR1 انجام شد و با نمونۀ استاندارد مقایسه گردید.‏‏
نتایج: در آزمایش‌های انجام‌شده در دوازده روز متوالی از روز سوم میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات قابلِ‌اندازه‌گیری بود. و در روز دهم بیشترین مقدار پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات که 3/0 گرم در صد بود حاصل شد و بعد از آن میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات ثابت ماند. در ضمن میزان قند نمونه هر روز کاهش پیدا می‌کرد و در روز دهم به مقدار 2/0 گرم‌برلیتر رسید، آنالیز فیزیکوشیمیایی نیز تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات را تأیید کرد.
بحث و نتیجه‏گیری: در این پژوهش آزمایش با استفاده از کلیۀ آنزیم‌های باکتری در خارج از سلول انجام گرفت با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش بازده واکنش 5/37درصد است که با خالص‌سازی آنزیم و استفاده از سوبسترای اختصاصی و بهینه‌کردن شرایط آنزیم می‌توان تولید PHB را به‌طور مستمر در خارج از سلول ادامه داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) using enzymes Azospirillum brasilense in vitro

نویسندگان [English]

  • Soheila Abbasi 1
  • Giti Emtiazi 2
  • Rasoul Roghanian 2
1 M.Sc. of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Polyhydroxyalkaniates (PHAS) are bacterial polymers that are formed as naturally occurring storage polyesters by a wide range of microorganisms usually under unbalanced growth conditions. Mechanical properties of PHAS make them suitable replacements for petrochemically produced bulk plastics (polyethylene, polypropylene etc.), but in contrast to these commodity plastics PHA are completely degradable to carbon dioxide and water through natural microbiological mineralization. PHAS can be produced by biotechnological processes under controlled conditions. Polyhydroxybotyric acid (PHB) was the first of thePHAS discovered and is the most abundant polyester found in bacteria.
Materials and methods: First, a rich bacterial suspension prepared from poly(3-hydroxybutyrate), then the cells were broken down and ensure the absence of live cells.The cell free enzymes were added to M9 medium.Then the sample turbidity was measured at a wavelength of 600 nm and incubated at 30°C and centrifiuged at 120rpm. Next, the amount of PHB as well as solution turbidity were measured and compared with control. The physical and chemical analyzes of extracted PHB samples such as UV absorbtion, FTIR, HPLC and HNMR assesed and compared with standard sample.
Results: In twelve days this experiment was conducted, from the third day, the amount of polyhydroxybutyrate was measurable and the highest polyhydroxybutyrate was gained on the tenth day. The level of PHB was constant. Moreover, the level of glucose was decreased gradually till the tenth day. By Physico-chemical analysis, production of polyhydroxybutyrate was approved.
Discussion and conclusion: In this experiment, the reaction efficiency was 37.5 percent. Probably the rest of glucose could be changed to other intermediate compounds by other enzymes in the sample.Therefore, by purification of the enzyme, usage of specific substrate and optimization of conditions outside the cell could help the production of polyhydroxybutyrate continually. Production is very cost-effective, by this method.

کلیدواژه‌ها [English]

  • PHB
  • Polyester
  • Azospirillum brasilense
  • HPLC
  • NMR
  • FTIR

مقدمه

طیف گسترده و متنوعی از پلیمرها توسط موجودات زنده سنتز می‌شوند که از میان آنها پلی‌استرها بیشتر از بقیه مورد توجه قرار گرفته‌اند (1). برخی از باکتری‌ها این توانایی را دارند که ترکیبات پلیمری را سنتز کنند که به‌لحاظ خواص، مشابه برخی از انواع پلاستیک‌های صنعتی هستند. این ترکیبات شامل گروه گسترده و پیچیده‌ای از اسیدهای هیدروکسی‌آلکانوئیک هستند که با نام کلی پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات‌ها (PHAs) شناخته می‌شوند (2). PHAs انواع مختلفی از پلی‌اکسواستر هستند که توسط باکتری‌های حقیقی و حتی اعضای خانواده هالو باکتر آرکی‌ها ساخته می‌شوند (3).

میکروارگانیسم‌های یوکاریوت و جانوران قادر به سنتز این پلیمرها نیستند. این ترکیبات خصوصیات قابل‌توجهی دارند (4). آنها زیست‌تجزیه‌پذیر و زیست‌سازگار هستند و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاصی دارند که آنها را جهت کاربردهای صنعتی، کشاورزی، پزشکی و داروسازی مستعد می‌کند (5)؛ لذا اول مشکل دفع زباله‌ها را حل می‌کنند و دوم در بسیاری از موارد که پلاستیک‌های صنعتی را نمی‌توان استفاده کرد یا استفاده از آنها مشکلاتی را به‌همراه دارد، نظیر بسیاری از کاربردهای پزشکی، قابلیت استفاده دارند. مهم‌ترین مشکل در راه جایگزینی این دسته از پلیمرها به‌جای پلاستیک‌های صنعتی، هزینۀ بالای فرایند تولید آنها است. اگر ما بخواهیم از این پلیمر استفاده کنیم، لازم به نظر می‌رسد که فرایند تولید آن را ازنظر اقتصادی بهبود بخشیم.

بیوسنتز پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات‌ها به محض اینکه سوبسترای موردنظر یا هیدروکسی‌آسیل‌کوآ‌تیواستر در داخل سلول مهیا شد، شروع می‌شود. در حالت عادی آنزیم پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات سنتاز در میزان کم و به‌طور مداوم در سلول تولید می‌شود. به محض افزایش سوبسترا، این آنزیم شروع به کاتالیز و سنتز پلی‌استر با وزن مولکولی بالا می‌کند (6). در ابتدا متراکم‌کردن دو مولکول از استیل‌کوآ به استواستیل‌کوآ توسط آنزیم بتاکتو‌تیولاز صورت می‌گیرد سپس احیای این مولکول به هیدروکسی‌بوتیریل‌کوآ توسط آنزیم استواستیل‌کوآ ردوکتاز وابسته به NADP صورت می‌گیرد. د نهایت با فعالیت آنزیم سنتاز مونومرهای موردنظر به یکدیگر متصل شده و زنجیره‌های هیدروکسی‌آلکانوات‌ها ساخته می‌شوند (7).

در قرن بیستم رشدی سریع در تولید پلاستیک‌های حاصل از مواد نفتی و به‌دلیل قیمت پایین آنها انجام شد و درنتیجه این پلاستیک‌ها به‌واسطۀ نیاز روزافزون به آنها و به‌میزان غیرقابل‌تصور تولید شدند؛ اما امروزه به یکی از معضلات زیست‌محیطی در جوامع بشری تبدیل شده‌اند (8). صنایع بسته‌بندی یکی از مهم‌ترین و بزرگ‌ترین مصرف‌کننده‌های این پلیمرها هستند. با وجود اینکه در حال حاضر بازیافت این پلاستیک‌ها به‌طور مداوم صورت می‌گیرد، به‌جرأت می‌توان گفت که پلاستیک‌ها دومین معضل جدی برای محیط زیست بعد از آلودگی هوا هستند. همچنین با توجه به ارزش نفت و احتمال کاهش ذخایر نفتی نیاز روزافزون به یک جایگزین احساس می‌شود.؛ازاین‌رو در دهۀ اخیر میزان استفاده از پلاستیک‌های سبز و سازگار با محیط زیست رو به افزایش است (9). این پلیمر توانایی ترکیب‌شدن با پلیمرهای دیگر و تشکیل ترکیب را دارد و درنتیجه این خصوصیات پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات، آن را گزینه‌ای مناسب جهت کاربرد در صنایع دسته‌بندی و پلاستیک‌سازی می‌کند (10).

به‌دلیل تجزیه‌پذیربودن پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات در خاک می‌توان از آن به‌عنوان یک ناقل تجزیه‌پذیر برای حشره‌کش‌ها، علف‌کش‌ها، کودها و یا یک پوشش پلاستیکی برای جوانه‌زدن بذرها و یا نگه‌داشتن نهال‌ها استفاده کرد (11).

مونومرهای حاصل از تجزیۀ پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات در بدن، هیدروکسی‌بوتیریک‌اسید است که یک حد واسط متابولیک در ارگانیسم‌های عالی به شمار می‌رود؛ بنابراین پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات سازگار با بدن موجودات زنده است و می‌توان از آن به‌عنوان مواد پلیمری زیست‌سازگار برای کاربردهای گسترده در پزشکی و داروسازی استفاده کرد (12).

مهم‌ترین کاربرد پزشکی آن عبارت است از:

ارسال دارو: یعنی کنترل فارماکوکینتیک و پخش دارو در بدن به‌منظور محدودکردن فعالیت آنها تنها در بافت هدف و نگه‌داشتن غلظت دارو در یک سطح قابل‌قبول از نظر درمانی برای مدت‌زمان خاص به این منظور از سیستم‌های کلوئید ارسال دارو استفاده می‌شود (13). سیستم‌های کلوئید ارسال دارو شامل لیپوزوم (liposome)، دندریمرها (Dendrimer)، میسل‌ها (Micelle) میکروامولسیون‌ها و نانوپارتیکل‌ها هستند. نانوپارتیکل‌ها ذرات جامد کلوئیدی هستند که از پلیمرهای طبیعی و یا سنتزی با قطر 10 نانومتر تا 1 میکرومتر ساخته می‌شوند که برای اهداف درمانی و یا تشخیصی به کار رفته‌اند. مولکول‌های فعال بیولوژیکی می‌توانند به سطح نانوپارتیکل‌ها جذب یا متصل و یا در داخل آنها حل و یا کپسوله شوند و یا به دام افتند. نانوپارتیکل یک نام عمومی برای نانواسفرها و نانوکپسول‌ها هستند (14).

مهندسی بافت: یعنی کمک به بازیابی، ابقا یا افزایش فعالیت بافت یا ارگان ازطریق میان‌کنش هم‌زمان سلول‌های زنده و مواد زیستی تولید شده است (15).

عملکرد حفاظتی: الیاف الکتروریسی‌شده به‌عنوان پوشش‌دهندۀ زخم استفاده می‌شود. درواقع پوشش‌های متخلخل متشکل از ساختارهای لیفی، زخم را از نفوذ باکتری با مکانیسم به‌دام‌انداختن ذرات آئروسل محافظت کرده؛ درحالی‌که الگوی مناسبی را برای انتقال بخار تأمین می‌کند (16).

خواص ساختاری پلی‌استر سنتازها: تاکنون ساختمان دقیق این آنزیم‌ها مشخص نشده است، ساختمان ثانویه نیز ازطریق نحوۀ قرارگرفتن و توالی اسیدآمینه‌ها تعیین شده است. بررسی‌های دستگاهی نشان داده که ساختمان ثانویه دارای لوپ‌های متغیری است که از مارپیچ آلفا و صفحات بتا تشکیل شده است. در شرایط آزمایشگاهی، پلی‌استر سنتاز به‌صورت مخلوط تعادلی از حالت مونومری و دایمری وجود دارد و در حضور سوبسترا و یا آنالوگ‌های کو آنزیم A سه‌تایی به‌سرعت دی‌مریزه می‌شود. در حضور آنالوگ‌های سه‌تایی، یک افت در شروع کار آنزیم مشاهده می‌شود؛ درحالی‌که فعالیت ویژۀ آن افزایش می‌یابد. آنزیم دایمر نسبت به مونومر فعالیت بالایی دارد (4). پلی‌استر سنتاز دارای زنجیرۀ سیستئین به‌عنوان محل کاتالیزوری نوکلئوفیل است و مانند پروتئاز عمل می‌کند؛ چرا که پروتئاز نیز دارای زنجیرۀ سیستئین است.

دو گروه تیول موجود در پلی‌استر سنتازها در واکنش پلی‌مریزاسیون نقش عمده‌ای دارند و ازآنجایی‌که فقط یک زیرواحد سیستئینی در تمامی پلی‌استر سنتازها وجود دارد نقش مهمی را ایفا می‌نماید.

پلی‌استر سنتاز محلول در هنگام طویل‌سازی زنجیرۀ پلی‌استر تبدیل به یک مولکول دوگانه دوست می‌شود. این عمل باعث خودتجمعی گرانول‌های پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات می‌شود که قسمت فعال پلی‌استر سنتاز در سطح و چربی پلی‌هیدروکسی‌آلکانوئیک در مرکز قرار می‌گیرد. این حالت در اثر خاصیت قرارگرفتن چربی در آب به وجود می‌آید.

تجزیه ‌و تحلیل فعالیت آنزیمی که در سطح قرار گرفته است، نشان می‌دهد که این آنزیم موجود در سطح، حدود 40 برابر فعال‌تر از آنزیم محلول است. درواقع سطوح گرانول مانند آنزیم لیپاز کروی عمل می‌کند (15).

پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات (PHA) یکی از پلی‌استرهای میکروبی است که از مواد اولیۀ تخمیری تولید می‌شود. با وجود آنکه این پلیمر دارای کاربرد خاصی در تولید پلاستیک تجزیه‌پذیر است، کاربرد متنوعی درزمینۀ ریز زیست‌فناوری دارد. با استفاده از دامین متصل‌شونده به سوبسترا (SBD)آنزیم PHA دپلی‌مراز می‌توان پروتئین‌های موردنظر را روی سطحPHA تثبیت کرد (17).

تثبیت مولکول‌های زیستی چون پروتئین‌ها پپتیدها و اسیدهای نوکلئیک در سطح جامد برای تولید حسگرهای زیستی و میکروآرایه‌ها ضرورت دارد (11).

 

‏‏مواد و روش‏ها.

سویۀ باکتری: سویۀ مورداستفاده در این پژوهش آزوسپریلومبرازیلنس جداشده از پاراندول علف هرز است که در مقایسه با آزوسپریلومبرازیلنس سویه‌های Sp7 و SP245قادر به تولید میزان بیشتری پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات است (جدول 1).

 

جدول 1- مقایسۀ سویۀ جداشده با سویه‌های استاندارد

PHBcomponent

%dry weight

PHB g/lit

CDW g/lit

Type of strain

76%

65/5

448/7

SP7

79%

30/5

71/6

SP245

86%

13/8

46/9

Wild strain

 

شرایط رشد و تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات: یک کشت تازه از باکتری‌های غربالگری‌شده روی محیط TSA تهیه شد؛ سپس کدورت معادل نیم‌مک‌فارلند تهیه شد و تلقیح به محیط M9 انجام شد (جدول 2). ارلن‌های تلقیح‌شده در دمای 30 درجه سلسیوس و rpm 150 انکوبه شدند.

 

جدول 2- محیط حداقل نمکی M9 جهت غربالگری باکتری با توانایی تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات

مقدار موردنیاز g/lit

ترکیبات موردنیاز

5/0

NaCl

1

KH2PO4

2

K2HPO4

5/0

Yeast extract

10

Glucose

015/0

CaCl2

5/0

MgSO4

05/0

NH4Cl

pH این محیط نزدیک به 2/7 تنظیم شد.

 

.تعیین میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات از روش شیمیایی: 10 میلی‌لیتر از محیط کشت سانتریفوژ (rpm 4000 و به‌مدت 20 دقیقه) و پلت سلولی در PH برابر 4/7 شسته شد. 10 میلی‌لیتر از محلول قلیایی هیپوکلریت‌سدیم ( 5درصد کلر فعال با pH برابر 10) به پلت سلولی اضافه شد و به‌مدت 1 ساعت در 37 درجه سلسیوس انکوباسیون انجام شد. سپس سانتریفیوژ و شستشوی مجدد رسوب سفیدرنگ توسط آب مقطر انجام شد؛ علاوه بر این، رسوب سفیدرنگ جهت حذف ناخالصی‌های پروتئینی و لیپیدی توسط الکل 96درصد و استون به نسبت مساوی شسته شد. درنهایت پودر سفیدرنگ در آون و در دمای 50 درجه سلسیوس به‌طور کامل خشک شد (۷).

سپس یک میلی‌لیتر اسیدسولفوریک غلیظ به آن اضافه شد و در دمای 100 درجه سلسیوس به‌مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم انکوباسیون انجام شد. اسیدسولفوریک غلیظ، پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات را تبدیل به کورتونیک‌اسید می‌کند. درنهایت بعد از سردشدن محلول فوق، جذب نوری کورتونیک‌اسید در طول‌موج 235 نانومتر (طول‌موج ماکزیمم) در مقابل اسیدسولفوریک غلیظ به‌عنوان شاهد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Specord S10, CarelZeiss Tech بررسی شد و با منحنی استاندارد مقایسه شد (۷).

رسم منحنی استاندارد پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات: برای به‌دست‌آوردن طول‌موج ماکزیمم مقدار مشخص (01/0 گرم) وزن‌شده از پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات به یک میلی‌لیتر اسیدسولفوریک غلیظ در یک لوله اپندروف اضافه شد و در بن ماری آب جوش به‌مدت 10 دقیقه قرار گرفت و با استفاده از گزینۀ رسم منحنی دستگاه اسپکتروفتومتر طیف جذبی کورتونیک‌اسید رسم شد و طبق منحنی ماکزیمم جذب 235 به دست آمد.

سپس منحنی استاندارد با استفاده از پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات خالص از شرکت سیگما رسم شد؛ به این صورت که یک مقدار مشخص وزن‌شده از پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات به یک میلی‌لیتر اسیدسولفوریک غلیظ در یک لولۀ آزمایش اضافه شد و در یک بن ماری جوش 100درجه سانتیگراد قرار گرفت. پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات تحت حرارت و اثر اسیدسولفوریک به کورتونیک‌اسید تبدیل می‌شود. این محصول در 235 نانومتر دارای حداکثر جذب است و درنتیجه می‌توان با مطالعه و اندازه‌گیری جذب کورتونیک‌اسید در این طول‌موج، مقدار پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات تولیدشده توسط سلول‌ها را تعیین کرد.

اگر جذب نوری محلول تهیه‌شده بیشتر از یک باشد، باید نمونه را با اسیدسولفوریک غلیظ به‌نسبت 1 به 10 رقیق کنیم تا جذب آن در طول‌موج موردنظر به زیر یک کاهش یابد. سپس رقت‌های موردنظر از این نمونه تهیه و جذب نوری آنها تعیین شد. درنهایت منحنی استاندارد از طریق رسم غلظت پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات (میکروگرم پلیمر در یک میلی‌لیتر از اسیدسولفوریک) و جذب در 235 نانومتر و رابطۀ خطی بین آنها رسم شد (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- منحنی استاندارد پلی‌هیدوکسی‌بوتیرات

 


رسم منحنی استاندارد گلوکز: رقت‌های متفاوت از گلوکز تهیه‌شده از کمپانی MERK ( 2۰، 40، 60، 80، 100، 120،140، 160، 180 و 200) گرم‌برلیتر تهیه شد و به یک میلی‌لیتر از هر رقت یک میلی‌لیتر معرف DNS اضافه شد و به‌مدت 10 دقیقه در 90 درجه سانتیگراد انکوبه شد. بعد از این مدت تغییر رنگ قرمز تا قهوه‌ای مشاهده شد و با توجه به اینکه طول‌موج ماکزیمم 523 نانومتر است، منحنی استاندارد براساس غلظت گلوکز و جذب نوری در 523 نانومتر رسم شد (شکل 2).

طرز تهیۀ معرف DNS: به 50 میلی‌لیتر آب مقطر، 6/1 گرم سود اضافه و هم زده شود. سپس به این محلول قلیایی، 1 گرم دی‌نیترو سالیسیلیک‌اسید و 25 گرم نمک تارتارات مضاعف سدیم- پتاسیم اضافه شود و به‌خوبی حل گردد. سپس حجم نهایی به 100 میلی‌لیتر رسانده شده و در تاریکی و یخچال نگهداری شود. به این نکته دقت شود که دی‌نیتروسالیسیلیک‌اسید باید به آب قلیایی اضافه شود تا به‌خوبی حل گردد.

 

 

 

شکل 2- منحنی استاندارد گلوکز

 


بررسی تولید PHBدر خارج سلول توسط آنزیم

جداسازی آنزیم:ابتدا 5درصد از سوسپانسیون میکروبی نیم‌مک‌فارلند به محیط کشت بهینۀ M9 broth تلقیح شد و بعد از 48 ساعت انکوباسیون در30 درجه سلسیوس وrpm120 محتوای ارلن سانتریفیوژ شد و ته‌نشین آن با بافرفسفات نمکی دو بار شستشو داده شد. ته‌نشین به یک ظرف کوچک شیشه‌ای جهت شکستن سلول‌ها با اولتراسونیک انتقال داده شد و 2 میلی‌لیتر بافرفسفات نمکی به آن اضافه شد. بعد از شکستن سلول‌ها 1/0 میلی‌لیتر از آن به محیط کشت  Nutriant broth برده شد تا اطمینان حاصل شود که سلول زنده باقی نمانده است. سپس سوسپانسیون سلولی به 100میلی‌لیتر از محیط کشت M9 برده شد و انکوباسیون در 30 درجه سلسیوس و rpm120 انجام شد.

هم‌زمان یک نمونه با همان شرایط قبلی آماده شد و سلول‌ها شکسته شد. سپس هم‌حجم با سوسپانسیون سلولی ( 2 میلی‌لیتر) کلروفرم در یک میکروتیوپ پلاستیکی به آن اضافه شد. یک ساعت در 37 درجه سلسیوس قرار داده شد و بعد کلروفرم جدا شد و در یک میکروتیوپ دیگر با وزن مشخص ریخته شد و در آون قرار داده شد. پس از تبخیر کلروفرم دوباره میکروتیوپ وزن شد و میزان چربی سلول‌ها جهت محاسبات بعدی تعیین شد.

همچنین یک نمونۀ شاهد با تمام شرایط فوق منتها بدون شکستن سلول‌ها گذاشته شد تا میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات تولیدشده در داخل و خارج سلول در طی این مدت‌زمان محاسبه شود.

جداسازی PHB از محیط کشت در این آزمایش: قبل از جداسازی کدورت محلول در طول‌موج 600 نانومتر در مقابل شاهد که همان محیط کشت قبل از تلقیح است خوانده شد.

برای جداسازی پلیمر پلی‌هیدروکسی‌بوتیریک از محیط کشت از حلال کلروفرم استفاده شد. هم‌حجم محیط کشت، کلروفرم به محیط اضافه شد و یک ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس قرار گرفت؛ سپس درون قیف جداکننده ریخته شد و با دقت کلروفرم از محلول رویی درون یک ظرف با وزن مشخص جدا شد و بعد در آون کلروفرم تبخیر شد و پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات باقیمانده با الکل و استن شستشو داده و جهت آنالیزهای بعدی استفاده شد.

جهت اطمینان از تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات، پودر به‌دست‌آمده در این روش جهت آنالیز فیزیکوشیمیایی استفاده شد.

آنالیز فیزیکو- شیمیایی پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات

طیف ماوراءبنفش پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات: 2 میلی‌گرم پلیمر وزن شده و به یک بالن ژوژه منتقل می‌شود؛ سپس حجم آن توسط اسیدسولفوریک غلیظ به 10 میلی‌لیتر رسید. سپس 125 میکرولیتر از آن به بالن ژوژه دیگر انتقال داده شد و توسط اسیدسولفوریک غلیظ به حجم نهایی 5 میلی‌لیتر رسید. غلظت پلیمر در این محلول معادل 5 میلی‌گرم‌برلیتر است که طیف ماوراءبنفش آن در طول‌موج‌های بین 200 تا 400 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدلSpecord S10,Carel Zeiss Tech مطالعه شد.

آنالیز طیف‌سنجی تبدیل فوریر مادون قرمز [1]: طیف‌سنجی تبدیل فوریر مادون قرمز یک تکنیک بسیار مفید برای شناسایی مواد شیمیایی آلی و معدنی است. از این تکنیک می‌توان برای تعیین مقدار یک ماده در یک مخلوط استفاده کرد.

این تکنیک می‌تواند برای شناسایی مواد شیمیایی در رنگ‌ها، پلیمرها و داروها به کار رود. این روش یکی از قدرتمندترین تکنیک‌ها برای شناسایی پیوندهای شیمیایی[2]و گروه‌های عاملی[3] است. جذب نور در طول‌موج‌های خاص، یکی از خصوصیات باندهای شیمیایی است که می‌تواند برای شناسایی آنها در یک طیف گسترده از طول‌موج توسط FT-IR به کار رود. با تغییر این طول‌موج‌ها در یک طیف جذبی می‌توان به وجود باندهای شیمیایی در یک مولکول پی برد. طیف FT-IR برای مواد شیمیایی خالص همانند یک اثرانگشت[4] است که برای هر ترکیب به‌صورت اختصاصی وجود دارد. برای شناسایی ترکیباتی که تاکنون شناسایی نشده‌اند و اطلاعات و داده‌های کمی در مورد آنها وجود دارد، باید از ترکیب این تکنیک با سایر تکنیک‌های شناسایی مثل NMR استفاده کرد. در مورد ترکیباتی که شناسایی شده‌اند و داده‌های زیادی دربارۀ ساختار آنها وجود دارد، تنها می‌توان با مقایسۀ طیف جذبی ماده استاندارد با نمونۀ موردنظر، آن را شناسایی کرد.

آنالیز با NMRاسپکتروسکوپی: متد NMR اسپکتروسکوپی برای PHB امروزه اطلاعات جدیدی از بیولوژی و شیمی‌فیزیکPHB در داخل سلول می‌دهد. متد NMR می‌تواند مشخصات و اندازه PHB در پلیمر را حتی قبل از استخراج از سلول تعیین کند. (Nuclear magnetic resonance)NMR یا طیف‌سنجی رزونانس مغناطیس هسته شاید مهم‌ترین طیف‌سنجی در شناسایی ساختار گستردۀ ترکیبات آلی باشد.

تکنیک طیف‌سنجی رزونانس مغناطیس هسته‌ای براساس اندازه‌گیری تابش الکترومغناطیسی در ناحیۀ فرکانس رادیویی به‌طور تقریبی 4 تا 600 مگا هرتز است. برخلاف جذب‌های فرابنفش، مرئی و زیر قرمز که الکترون‌ها در فرایند جذب درگیرند، در این تکنیک هسته اتم‌ها در فرایند جذب درگیر هستند. هسته‌های اتمی خاص، خواص اسپین و گشتاور مغناطیسی دارند که درنتیجۀ قرارگرفتن در یک میدان به شکافتگی انرژی آنها منجر می‌شود. روش‌های عمدۀ این تکنیک شامل طیف‌سنجی هیدروژن (HNMR)، کربن (CNMR) و فسفر(PNMR) هستند.

اهمیت HNMR در آن است که به‌طور تقریبی تمامی ترکیبات آلی، دارای هیدروژن هستند و چون درواقع تمامی هیدروژن‌های موجود در ترکیبات آلی دارای ایزوتوپ پروتون هستند، بنابراین تمامی ترکیبات آلی قابل‌استفاده در این دستگاه هستند. اطلاعاتی که این دستگاه به ما می‌دهد، نقش بسیار مهمی در یافتن ساختار گستردۀ مولکول دارد و به‌طور عملی بدون این طیف‌سنجی ساختار گسترده‌ای که رسم می‌کنیم بسیار نامطمئن خواهد بود. این دستگاه نمونه را تخریب نکرده و می‌توان نمونه را دوباره بازیابی کرد.

برخی هسته‌ها، مانند الکترون به دور محور خود حرکت چرخشی دارند. در حضور یک میدان آهنربایی خارجی، یک هسته در حال چرخش تنها تعداد معدودی جهت‌گیری پایدار دارد. رزونانس مغناطیسی هسته (NMR) هنگامی ایجاد می‌شود که یک هستۀ اسپین‌دار با جذب تابش الکترومغناطیسی به‌مقدار کافی، در حضور یک میدان آهنربایی از یک جهت‌گیری با انرژی پایین‌تر به یک جهت‌گیری باانرژی بالاتر برانگیخته شود. طیف‌سنجی رزونانس مغناطیسی هسته شامل اندازه‌گیری میزان انرژی لازم برای تغییر هسته‌های اسپین‌دار از یک‌ جهت‌گیری پایدار به جهت‌گیری ناپایدارتر در یک میدان مغناطیسی است.

ازآنجاکه هسته‌های اسپین‌دار در میدان مغناطیسی در فرکانس‌های مختلف تغییر جهت می‌دهند، فرکانس متفاوتی از تابش جذبی برای عوض‌کردن جهت‌گیری هسته‌های اسپین‌دار نیاز است. فرکانسی که در آن جذب صورت می‌گیرد، برای تجزیه و طیف‌سنجی به کار برده می‌شود.

1HNMR برای تشخیص بین 3- هیدروکسی بوتیریک‌اسید با دیگر اسیدهای چرب 3- هیدروکسی در یک هتروپلیمر PHA استفاده می‌شود و همچنین برای روشن‌کردن ساختمان مونومرهای غیراشباع در MCL- PHA به کار می‌رود. نیم گرم از PHB تولیدشده در شرایط بهینه جهت آنالیز NMR به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه اصفهان فرستاده شد.

آنالیز با HPLC: HPLC یکی از ابزار بسیار قدرتمند در آنالیز شیمیایی است که توانایی جداسازی، تشخیص و اندازه‌گیری مقدار ترکیبات موجود در نمونه‌هایی را دارد که می‌توانند در مایع حل شوند. امروزه ترکیبات با غلظت خیلی خیلی کم در حد(parts per trillion) ppt به‌آسانی با این روش تشخیص داده می‌شود. نیم گرم از PHB تولیدشده در شرایط بهینه جهت آنالیز HPLC به آزمایشگاه مرکزی دانشگاه اصفهان فرستاده شد.

نتایج.

پس از انتخاب بهترین سویۀ تولیدکنندۀ پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات و انتخاب بهترین شرایط برای تولید حداکثری بیوماس سلولی باکتری در محیط M9 کشت داده شده و در دمای 30 درجه سلسیوس و rpm120 انکوبه شد. پس از سه روز سوسپانسیون سلولی تهیه و سلول‌ها با اولتراسونیک شکسته شد. به یکی از نمونه‌ها کلروفرم اضافه شد و پس از یک ساعت در 37 درجه سلسیوس، کلروفرم خارج شد و بعد از تبخیر حلال، میزان چربی موجود در سوسپانسیون سلولی اندازه‌گیری شد که در جدول 3 آورده شده است.

تولید PHB در خارج از سلول: تولید پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات در خارج سلول به‌ترتیبی که در فصل دوم گفته شد انجام شده و برای اولین بار بعد از یک هفته با سه تکرار آزمایش نتایج ارائه‌شده در جدول 3 به دست آمد.

اما درون ارلن که چربی سوسپانسیون با کلروفرم خارج‌شده به‌دلیل دناتوره‌شدن آنزیم هیچ تولید PHB نداشتیم.

 

جدول3- میزان PHB تولیدشده در خارج سلول پس از یک هفته

دفعات آزمایش

میزان PHBتولیدشده در 100ml

میزان چربی باقیمانده از بقایای سلول

تکرار اول

2071/0

0910/0

تکرار دوم

2280/0

1001/0

تکرار سوم

2187/0

980/0

شاهد

1010/0

-

 

این آزمایش با دوازده ارلن در دوازده روز متوالی تکرار شد و هر روز میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات اندازه‌گیری شد. مطابق آنچه در شکل دیده می‌شود، از روز سوم میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات قابل‌اندازه‌گیری بود و در روز دهم بیشترین مقدار پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات که 3/0 گرم در صد بود حاصل شد (شکل 3).

اندازه‌گیری میزان کدورت محلول هر روز نشان داد که با افزایش میزان پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات کدورت محلول نیز افزایش یافت.

 

 

شکل3- نمودار تولید PHB در خارج از سلول با آنزیم خارج‌شده از سلول باکتری آزوسپریلوم در شرایط بهینۀ رشد در 100 میلی‌لیتر محیط M9.

 

 

این آزمایش با استفاده از کلیۀ آنزیم‌های باکتری انجام گرفت و به‌طور روزانه PHB محتویات یک ارلن با استفاده از استخراج با کلروفرم جداشده اندازه‌گیری شد و منهای مقدار چربی اولیۀ باکتری‌ها (که با نمونۀ شاهد اندازه‌گیری شده بود) گردید و روی نمونه‌های ارلن اندازه‌گیری قند انجام گرفت. هر روز جذب قند کاهش پیدا می‌کرد تا روز دهم به مقدار 2/0 گرم‌درلیتر رسید. به احتمال زیاد، مابقی قند توسط آنزیم‌های دیگر موجود در نمونه به ترکیبات حد واسط دیگر تبدیل شده است. با خالص‌سازی آنزیم و استفاده از سوبسترای اختصاصی و بهینه‌کردن شرایط آنزیم می‌توان تولید PHB را به‌طور مستمر در خارج از سلول داشت.

آنالیز فیزیکو- شیمیایی پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات

طیف جذبی: طیف جذبی پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات از روش اسپکتروفتومتری در طول‌موج‌های بین 200 تا 400 نانومتر بررسی شد ( شکل4). حداکثر جذب پلیمر(طول‌موج ماکزیمم) در طول‌موج 235 نانومتر قابل‌مشاهده است.

آنالیز FT-IR: FTIR برای تشخیص PHA در سوسپانسیون سلولی استفاده می‌شود؛ ولی دارای فقدان اختصاصیت لازم برای تشخیص بین مونومرهای متفاوت است و بنابراین با این روش نمی‌توان کوپلیمرهای مرکب PHA را تشخیص داد.

طیف مادون‌قرمز: طیف مادون‌قرمز پاسخ شناساگر را به‌صورت درصد عبور Transmittance( %T) بر محور عمودی (Y) و فرکانس IR را به‌صورت شماره موج بر محور افقی (X) نشان می‌دهد. پاسخ شناساگر بیانگر وسعت میان‌کنش اشعۀ الکترومگنتیک مادون‌قرمز با نمونه است و ازاین‌رو متناسب با شدت اشعۀ مادون‌قرمز است.

 

شکل4- طیف جذبی کورتونیک‌اسید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر: ماکزیمم جذب 235 است.

 

ناحیۀ میانی مادون‌قرمز[5]: شامل یک طیف گسترده با استفادۀ وسیع در آنالیز شیمیایی مواد در ناحیۀ میانی است. این ناحیه دارای دامنۀ فرکانس از 500 تا 4000cm-1 را شامل می‌شود. این ناحیه می‌تواند به زیر ناحیه‌هایی با فرکانس‌های مشخص تقسیم شود (جدول 4).

N-H, O- H (3000 – 4000 cm-1)-

C- H stretch region (2800 -3000 cm-1)-

Window region (1800 – 2800 cm-1)-

Carbonyl region (1500 – 1800 cm-1)-

Finger print region (500 – 1300 cm-1)-

 

 وجود و یا نبود این باندهای اختصاصی برای گروه‌های عاملی برای تعیین خصوصیات ساختار مولکولی ترکیب موردنظر بسیار مهم هستند. باندهای جذبی در ناحیۀ اثرانگشتی به‌همراه دیگر باندهای ذکرشده در بالا می‌توانند برای تفسیر ساختار مولکولی ترکیب موردآنالیز به کار روند (شکل 5).

 

 

شکل5- طیف FTIR پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات: در این طیف، باند کربونیل‌استر در عدد موج 1726cm-1 (باند شاخص پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات) قابل‌مشاهده است. بیش از ده باند (جدول 3) در ناحیۀ اثرانگشتی و در ارتباط با پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات دیده می‌شود. وجود این باندها به‌همراه باند شاخص پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات در تشخیص این پلیمر به کار می‌رود.

 


جدول 4- طیف FT-IR از پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات استخراج‌شده از باکتری آزوسپریلوم‌برازیلنس جداشده

نوع پیوند

عدد موج

C-O stretch

1050،1096،1128،1180

C-O-C stretch, crystalline

1128،1163،1278،1289

C-O-C stretch, crystalline

1259،1302

CH3 symmetric deformation

1378

CH3 asymmetric deformation

1449

CH2 deformation

1458

C=O stretch, crystalline

1726

C=O stretch, amorphous

1740

CH2, CH3, symmetric stretch

2875

CH2 asymmetric stretch

2933

CH3 asymmetric stretch, crystalline

2967

CH3 asymmetric stretch, crystalline

2974

CH3 asymmetric stretch, amorphous

2983

CH3 asymmetric stretch, crystalline

2995

CH3 asymmetric stretch, crystalline

3009

C=O overtone, crystalline

3436


آنالیز HPLC[6]: HPLC برای تشخیص هیدروکسی‌بوتیرات از هیدروکسی‌والرات به کار می‌رود. از این روش می‌توان برای تعیین PHB در بیوماس سلولی هم استفاده کرد. همچنین با HPLC می‌توانcis- و trans- کورتونیک‌اسید را تشخیص داد (شکل 6 و 7).

در روش HPLC چون نیاز به نمونه مواد لئوفیلیزه ندارد، طول مدت آنالیز سریع‌تر است؛ چون نیاز به خشک‌کردن نمونه نیست.

 

 

 

شکل6- کروماتوگرام HPLC مربوط به PHB استاندارد: دارای زمان شروع 989/8 و زمان خروج 328/10 و وزن مولکولی 2247 کیلو دالتون است.

 

شکل7- کروماتوگرام HPLC مربوط به نمونۀ PHB تولیدشده با آنزیم در خارج سلول: مشابه PHB استاندارد دارای زمان شروع 323/9 و زمان خروج 984/10 و وزن مولکولی 1223 کیلو دالتون است.

 


آنالیز با NMRاسپکتروسکوپی: 1HNMR از PHB در دستگاه MSL- 300 (BRUker, Germany) در فرکانس 400 مگاهرتز انجام شد و بررسی شیمیایی از ppm برابر صفر شروع شد. پروتون‌های باقیمانده از کلروفرم یا CDCl3در ppm برابر 27/7 وجود دارد. پارامترهای آزمایش بر 1درصد پلیمر در محلول کلروفرم- د وK313 و s 5/2طول مدت فراگیری (Acquistio time) و 4000 هرتز پهنای طیف تنظیم شد.

استاندارد PHB برای به‌دست‌آوردن آنالیز بهتر استفاده شد (شکل 8 و 9).

تمام طول طیف رزونانس برای PHB نشان می‌دهد که سیگنال گروه متیل یا CH3 در ppm برابر 25/1 و سیگنال گروه متیلن یا CH2 درppm بین 45/2 و 65/2 و گروه متین یا CH در ppm برابر 25/5 وجود دارد. یک سیگنال دیگر هم در ppm برابر 25/7وجود دارد که مربوط به کلروفرم است.

 

 

شکل 8- طیف NMR مربوط به PHB استاندارد: در این طیف باندهای مربوط به سیگنال گروه متیل یا CH3 در ppm برابر 25/1 و سیگنال گروه متیلن یا CH2 درppm بین 45/2و 65/2 و گروه متین یا CH در ppm برابر 25/5 وجود دارد. یک سیگنال دیگر هم در ppm برابر 25/7 وجود دارد که مربوط به کلروفرم است.

 

 

شکل 9- طیف NMR مربوط به تولید PHB در خارج سلول: در این طیف همانند طیف استاندارد باندهای مربوط سیگنال گروه متیل یا CH3 در ppm برابر 25/1 و سیگنال گروه متیلن یا CH2 در ppm بین 45/2 و 65/2 و گروه متین یا CH در ppm برابر 25/5 وجود دارد. یک سیگنال دیگر هم در ppm برابر 25/7 وجود دارد که مربوط به کلروفرم است.

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

برای تولید پلاستیک‌های سازگار با محیط زیست با منشأ زیستی روش‌های گوناگونی در دست است؛ برای مثال این امکان وجود دارد که سویه‌های طبیعی تولیدکنندۀ این ترکیبات را به‌صورت صنعتی کشت کنیم (18). این امر اگرچه در ابتدا جالب به نظر می‌رسد، مشکلات حین فرایند مانع از تولید گستردۀ صنعتی با هزینۀ قابل‌قبول می‌شود و تاکنون عمده مانع بر سر راه استفادۀ تجاری از این ترکیبات و جایگزین‌شدن کامل آنها به‌جای پلاستیک‌های صنعتی همین مسئلۀ هزینه بوده است.

سویه‌های تولیدکنندۀ طبیعی این ترکیبات دورۀ رشد طولانی دارند و برای ذخیره‌کردن این ترکیبات باید محیط کشت آنها را از شرایط بهینه خارج کرد که این امر خود دورۀ رشدی آنها را طولانی‌تر نیز می‌کند؛ همچنین استحصال محصول نیز در آنها به‌آسانی صورت نمی‌گیرد و روش‌های مهندسی ژنتیک نیز برای آنها بهینه‌سازی نشده است؛ به‌علاوه، آنها مسیرهایی برای هضم پلی‌استرهای تولیدشده دارند که به‌طور طبیعی به کاهش میزان محصول می‌انجامد.

مهم‌ترین مشکل در راه جایگزینی این دسته از پلیمرها به‌جای پلاستیک‌های صنعتی، هزینۀ بالای فرایند تولید آنها است که این امر حتی با استفاده از سوبستراهای ارزان‌قیمت (19) و میزبان‌های سریع‌رشدی نظیر E.coli نیز هنوز رفع نشده است (20).

یکی از علل بالابودن هزینه‌های تولید، هزینه‌های مربوط به فرآوری‌های پایین‌دستی، یعنی هزینه‌های مربوط به استحصال و خالص‌سازی است. استفاده از ترکیبات شیمیایی و آنزیم‌ها جهت لیز باکتری اول هزینۀ بالایی را به فرایند تحمیل می‌کند و دوم خود به مراحل تخلیص می‌افزاید. روش‌های فیزیکی نیز مشکلات مربوط به دما و نیز برهم‌زدن ساختار گرانول‌های حاوی پلیمر را به‌همراه دارد.

با توجه به مشکلات فوق، استفاده از آنزیم جهت تولید در خارج از سلول ضروری به نظر می‌رسد و تا به حال چندین گزارش از تولیدPHB در خارج از سلول گزارش‌شده که یکی از قابل‌توجه‌ترین آنها توسط Tajima et al در سال 2003 که با خالص‌سازی phaC و تثبیت آن بر روی رزین چیتوپال (Chitopal) با استفاده از استات (40 میلی‌مولار) و گلوکز (20 میلی‌مولار) و COA (5/0 میلی‌مولار) و آنزیم‌ها و ATP و NADH در محیط و استفاده از 3HB-COA به‌عنوان سوبسترا در مدت 24 ساعت 90درصد سوبسترا به پلی‌هیدروکسی‌بوتیرات تبدیل شده است (21).

بیشترین مقدار PHB به‌دست‌آمده در ایران با استفاده از بیوماس سلولی و در سویۀ سینوریزوبیومملیلوتی که تثبیت‌کنندۀ هم‌زیست ازت است، معادل 43/۱۰ درصد بوده است (22).

در این پژوهش آزمایش با استفاده از کلیۀ آنزیم‌های باکتری انجام گرفت و به‌طور روزانه PHBمحتویات یک ارلن با استفاده از روش استخراج با کلروفرم جدا شد سپس اندازه‌گیری شد و منهای مقدار چربی اولیۀ باکتری‌ها که با نمونۀ شاهد اندازه‌گیری شده بود، گردید و روی نمونه‌های ارلن اندازه‌گیری قند انجام گرفت. هر روز جذب قند کاهش پیدا می‌کرد تا روز دهم به مقدار 2/0 گرم‌درلیتر رسید.

در روز دهم به‌میزان 3/0 گرم‌درلیتر PHB تولید گردید و بازده واکنش 5/37درصد بود. به احتمال زیاد مابقی قند توسط آنزیم‌های دیگر موجود در نمونه به ترکیبات حد واسط دیگر تبدیل شده است؛ بنابراین با خالص‌سازی آنزیم و استفاده از سوبسترای اختصاصی و بهینه‌کردن شرایط آنزیم می‌توان تولید PHB را به‌طور مستمر در خارج از سلول داشت.

از مزایای این روش که در صورت کامل‌شدن، یک روش مؤثر در تولید PHB است، می‌توان به نکات زیر اشاره کرد:

الف) PHB تولیدشده توسط باکتری دپلیمریزه نمی‌شود.

ب) هزینه‌های مربوط به رشد طولانی‌مدت باکتری و شکستن باکتری و استخراج محصول تا حدود زیادی کاهش پیدا می‌کند.

ج) هدر رفت محصول در طی فرایند خالص‌سازی به‌مراتب کمتر می‌شود.

د) با این روش می‌توان با استفاده از آنزیم‌های باکتری آزوسپریلوم‌برازیلنس پلیمرهای طولانی از PHB تولید کرد.



[1]- Fourier transform infrared spectroscopy

[2]- Chemical bound

[3]- Functional groups

[4]- Fingerprint

[5]- Mid- infrared region

[6]- High performance liquid chromatography

References

 

(1)              Sakai K., Miyake S., Iwama K. Polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulation potential and PHA accumulating microbial communities in various activated sludge processes of municipal wastewater treatment plants. Journal of applied microbiology 2015; 118(1): 255-266.

(2)              Erickson B., Nelson JE and Winters P. Perspective on opportunities in industrial biotechnologyin renewable chemicals. Biotechnology Journal 2011; 7(3): 176-185.

(3)              GiedraityteGand Kalediene L. Purification and characterization of polyhydroxybutyrate produced from thermophilicGeobacillussp AY 946034. Strain chemija 2015; 26(4): 38–45.

(4)              Wältermann M., Steinbüchel A. Neutral lipid bodies in prokaryotes: recent insights into structure, formation, and relationship to eukaryotic lipid depots. Journal of bacteriology 2005; 187(11): 3607-3619.

(5)              Xu Y., Wang R.H., Koutinas A.A., Webb C. Microbial biodegradable plastic production from a wheat-based biorefining strategy. Process Biochemistry 2010; 45(2): 153–163.

(6)              Mozumder S.I., Goormachtigh L., Garcia-Gonzalez L., Wever Hand Volcke E. Modeling pure culture heterotrophic production of polyhydroxybutyrate(PHB). Bioresource Technology 2014; 155 (4): 272–280.

(7)              Shah K. R. Optimization and production of Polyhydroxybutarate (PHB) by Bacillus subtilis G1S1from soil.Curr.Microbiol 2014; 5(3): 377-387.

(8)              Chua H., Wang Y.J., Hua F.L., Tseng Y.F., Chan S.Y., Sin S.N. Synthesis of PHAs from waster under various C: N ratios. Bioresource Technology 2007; 98 (3): 1690-1693.

(9)              Madison L.L., and Huisman G.W. Metabolic Engineering of Poly (3-ydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiology and Molecular Biology Reviews.1999; 63(1): 21-22.

(10)          Yun S.I., Gadd G.E., Latella B.A., Lo V., Russell R.A., HoldenP.J. Mechanical properties of biodegradable polyhydroxyalkanoates/single wall carbon nanotube nanocomposite films.Trends in Biotechnology 2008; 6(2): 267-275.

(11)          Philip S., Keshavarz T., Roy I. Polyhydroxyalkanoates: biodegradable polymers with a range of applications. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2007; 82 (1): 233–247.

(12)          Chen G.Q. A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) bio- based and materials industry.Chemical Society Reviews 2009; 38(8): 2434-46

(13)          .Misra S.K., Valappil S.P., Roy I., Boccaccini A.R. Polyhydroxyalkanoate (PHA)/inorganic phase composites for tissue engineering applications. Biomacromolecules 2006: 7(8): 2249-58.

(14)          Zinn M., Witholt B., Egli T. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Advanced drug delivery reviews 2001; 53(1): 5-21.

(15)          Steinbüchel A., Füchtenbusch B. Bacterial and other biological systems for polyesterproduction. Trends in Biotechnology 1998; 16 (3): 419–427.

(16)          Christopher T., Taguchi N., Taguchi S. PHA synthase engineering toward superbiocatalysts for custom-made biopolymers.MicrobiolBiotechnol2007; 73 (1): 969–979.

(17)          Nomura CT., Taguchi S. PHA synthase engineering toward superbiocatalysts for custom-made biopolymers. Applied microbiology and biotechnology 2007; 73(5): 969-979.

(18)          Shakeri S., Roghanian R., Emtiazi G. Comparison of intracellular polyhydroxybutyrate granules formation between different bacterial cell subpopulations by flow cytometry. Jundishapur Journal of Microbiology 2015; 2011(13): 1-10.

(19)          Kalousek S., Lubitz W. High-level poly (β-hydroxybutyrate) production in recombinant Escherichia coli in sugar-free, complex medium. Canadian journal of microbiology 1995; 41(12): 216-221.

(20)          Choi J-i., Lee SY., Han K. Cloning of the Alcaligeneslatuspolyhydroxyalkanoate biosynthesis genes and use of these genes for enhanced production of poly (3-hydroxybutyrate) in Escherichia coli. Applied and environmental microbiology 1998; 64(12): 4897-4903.

(21)          Tajima K., Tannai H., Satoh Y., et al. Synthesis of poly (3-hydroxybutyrate) by immobilized poly (3-hydroxybutyrate) synthase. Polymer jornal 2003; 35 (5): 407-410.

(22)          Hashemi Beidokhti M., Nakhaei Moghaddam M. Biodegradable plastics from sinorhizobiummeliloti as plastics compatible with the environment and humanhealth. Biologicaljornal of microorganism 2016; 4(16): 55-64.