جداسازی و شناسایی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد در خاک کشاورزی و بررسی عملکرد اکسایش گوگرد

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

2 دانشیار میکروبیولوژی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

3 استاد بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

4 استاد مینرالوژی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

5 مربی پژوهش بخش هیدرومتالورژی، مجتمع مس سرچشمه، شرکت ملی صنایع مس ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد در کشاورزی، اهمیت زیادی دارند. هدف این پژوهش، شناسایی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد در شرایط خاک کشاورزی منطقۀ مس سرچشمه کرمان بود.
مواد و روش‏‏ها: نمونه‌برداری از خاک کشاورزی در منطقۀ مس سرچشمه کرمان انجام شد. بعد از غنی‌سازی نمونه‌ها در محیط پایۀ معدنی دارای گوگرد به‌عنوان تنها منبع انرژی، مجموعۀ میکروبی حاصل، خالص‌سازی شد و توانایی اکسایش گوگرد براساس تغییر اسیدیته و سولفات مورد ارزیابی قرار گرفت؛ سپس جدایه‌های اکسیدکنندۀ گوگرد براساس خصوصیات ریخت‌شناسی و تکنیک‌های تبارزایی، جداسازی و شناسایی شدند. بهترین جدایه‌ها انتخاب شدند و تغییرات pH و سولفات توسط جدایه‌ها در درجه حرارت و pH مختلف بررسی شد. ‏‏
نتایج: 6 جدایۀ اکسیدکنندۀ گوگرد جداسازی و شناسایی شدند که با جنس‌های تیوباسیلوس و استارکی شباهت تبارزایی نشان دادند. چهار جدایۀ 103، 129، 190 و 158، مزوفیل و خنثی‌دوست بودند؛ درحالی‌که دو جدایۀ 192 و 156، میانه دوست و قلیادوست بودند. از میان این جدایه‌ها، جدایۀ 103 با 86/99درصد شباهت تبارزایی به سویۀ استارکی نوولا، به‌علت بیشترین توانایی اکسایش گوگرد در محیط پایۀ معدنی حاوی گوگرد، به‌عنوان جدایۀ برتر شناسایی شد.
بحث و نتیجه‏گیری: جدایۀ 103 قادر به رشد در شرایط خنثی تا نسبتاً قلیایی با اسیدیتۀ 5/7 بود. بیشترین رشد این جدایه در دمای 30 درجه سانتیگراد و به‌صورت هوازی بود. این جدایه، کمولیتوتروف اختیاری بود و نتایج این پژوهش، نشان‌دهندۀ ظرفیت بالای این جدایه برای اکسیدکنندگی گوگرد بود که می‌تواند به‌عنوان جدایه‌ای کاربردی در کودهای زیستی کشاورزی در شرایط خاک خنثی تا قلیایی و شور استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of sulfur oxidizing bacteria in agricultural soil and evaluating sulfur oxidation yield

نویسندگان [English]

  • Mahdi Sadeghi Pour Marvi 1
  • Ahmad Ali Pourbabaee 2
  • Hosein Ali Alikhani 3
  • Ahmad Haidari 4
  • Zahra Manafi 5
1 PhD student of Soil Biology and Biotechnology, Department of Soil Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran. Karaj, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Department of Soil Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
3 Professor of Soil Biology and Biotechnology, Department of Soil Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran. Karaj, Iran
4 Professor of Mineralogy, Department of Soil Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran. Karaj, Iran
5 Research and development office, Sarcheshmeh Copper Complex, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction:Sulfur oxidizing bacteria are important in agriculture. The aim of this study was to identify the sulfur oxidizing bacteria in Sarcheshmeh (Kerman, Iran) agricultural soil.
Materials and methods: Sampling was conducted from agricultural soil in Kerman province, Iran. After enrichment, samples were purified in the basic mineral culture containing sulfur as the only source of energy. Sulfur oxidation capability was evaluated based on the variation of pH and sulfate content and then strains of sulfur oxidizing were isolated and identified using morphological characteristics and phylogenic techniques. The best strains were selected and were evaluated for variation of pH and sulfate content by isolates in different pH and temperature.
Results: Six sulfur-oxidizing strains were isolated and identified which had similarity to Thiobacillus and Starkeya genous. Isolates of 103, 129, 190 and 158 were mesophyll and neutrophil, but isolates of 192 and 156 were thermophile and alkalophill. Of these isolates, isolate 103 was 99.86% similar to Starkeya novella, identified as superior isolate, due to the most sulfur oxidation capability in the synthetic mineral medium containing sulfur.
Discussion and conclusion: Isolate 103 was able to grow in neutral to slightly alkaline conditions with pH 7.5. Most of the growth of this isolate was at 30 ° C as aerobic. This isolate was facultative chemolithotroph and the results of this research showed capacity of the isolate for oxidizing sulfur, so that it could be used as a practical isolate in bio-fertilizers for neutral to alkaline and saline conditions in agriculture.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Soil
  • Sulfur Oxidizing Bacteria
  • Thiobacillus

مقدمه.

گوگرد، دهمین عنصر موجود در پوستۀ زمین است که در ساختار اسید آمینه، به‌صورت گروه سولفیدریل و پل‌دی‌سولفیدی، در اقیانوس‌ها به‌صورت سولفات، در جو زمین به‌صورت گاز اکسید گوگرد و در سنگ و خاک، به‌صورت کانی سولفیدی وجود دارد (1)(Benson, 1978 #2379;Benson, 1978 #2379). pH خنثی تا قلیایی خاک‌های کشور، باعث عدمِ‌انحلال عناصر غذایی موجود در خاک، برای استفاده گیاه می‌شود و درنتیجه، استفاده از باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد، ضمن تأمین غذایی گیاه به گوگرد، با اسیدی‌کردن محیط، به افزایش فراهمی سایر عناصر غذایی و درنتیجه بهبود رشد گیاه می‌انجامد (2) در این میان، استفاده از باکتری‌های بومی خاک، ضمن داشتن رقابت‌پذیری بالا، امکان سازگاری با شرایط اقلیمی محیط را بیشتر از گونه‌های غیربومی دارند و از این جهت، بیشتر مورد توجه هستند (3). از طرفی، سینتیک پایین واکنش تبدیل گوگرد به سولفات، موجب شده است تا توجه خاصی به باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد معطوف شود؛ به‌طوری که کاربرد کود گوگرد به‌تنهایی، تأثیر معنی‌داری بر کشت گیاه در کشاورزی نداشته است (4). بدین ترتیب، توصیه کودی گوگرد در کشاورزی، باید همراه با توصیه کاربرد مایۀ تلقیح حاوی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد باشد تا تأثیر آن بر عملکرد گیاه معنی‌دار شود (5)؛ از طرفی، عملکرد باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد نیز متفاوت است. برخی تندرشد هستند و توانایی اکسیدکنندگی بالایی دارند و برخی کندرشد هستند و توانایی اکسیدکنندگی پایینی دارند. به‌طور کلی، توانایی اکسیدکنندگی گوگرد در جدایه‌های گرمادوست و اسیددوست بیشتر از جدایه‌های خنثی‌دوست معتدل‌دوست است (6). این توانایی متفاوت آنها در اکسیدکنندگی گوگرد، با ژن‌های موجود در ژنوم این میکروارگانیسم‌ها ارتباط دارد (7). جنس‌های مختلفی توانایی اکسیدکنندگی گوگرد را دارند؛ به‌عنوان مثال استارکی[1]، تیوباسیلوس[2]، اسیدی فیلوم[3]، اسیدیانوس[4] و سولفولوبوس[5](8).

هدف این پژوهش، بررسی عملکرد جدایه‌های مختلف اکسیدکنندۀ گوگرد بود که بدین منظور به جداسازی و شناسایی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد از خاک کشاورزی اقدام شد.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

به‌منظور جداسازی و شناسایی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد، نمونه‌برداری از خاک کشاورزی محدودۀ اطراف معدن مس سرچشمه کرمان انجام شد. 14 نمونه خاک در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. آزمایش‌های شیمیایی شامل اسیدیته و شوری خاک‌ها توسط دستگاه اسیدیته‌سنج و هدایت‌ِالکتریکی‌سنج مدل یونیکم[6] اندازه‌گیری شدند. غنی‌سازی نمونه‌ها روی محیط پایۀ معدنی 9k که گوگرد به‌عنوان تنها منبع انرژی به آن اضافه شده بود، انجام شد (9). محیط پایۀ معدنی (گرم‌درلیتر) شامل K2HPO45/0،KCl 1/0، MgSO4. 7H2O 5/0، Ca(NO3)201/0، (NH4)2SO43 وFeSO4.7H2O 01/0 به‌همراه 1 گرم‌درلیتر گوگرد بود. شرایط اسیدیتۀ محیط کشت شامل 3 تا 9 و دمای محیط کشت 25 و 45 درجه سانتیگراد تعیین شد تا شرایط برای جداسازی باکتری‌های اسید‌دوست و خنثی‌دوست (10) و همچنین معتدل‌دوست و گرمادوست معتدل مهیا باشد (11).

 

جداسازی کشت مخلوط میکروبی: یک گرم از نمونه‌های خاک با 50 میلی‌لیتر از محیط کشت 9k حاوی 1 گرم گوگرد در لیتر، در داخل ارلن 200میلی‌لیتری ریخته شد و به‌مدت 2 هفته در دمای 30 و 45 درجه سانتیگراد در همزن با دور rpm 120 گرماگذاری شدند. بعد از این مدت، مقدار 200 مایکرولیتر از محیط پیش کشت 9k 2 هفته‌ای، به محیط کشت جدید منتقل گردید و گرماگذاری انجام شد. این عمل برای هر نمونه 5 بار تکرار شد و درنهایت، محیط‌هایی با پتانسیل اکسیداسیون- احیا حداکثر و رشد میکروبی آن براساس میزان کدورت (جذب نور در طول‌موج 650 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر)، جهت جداسازی و خالص‌سازی جدایه‌ها انتخاب شد (12).

خالص‌سازی: به‌منظور خالص‌سازی جدایه‌ها از کشت مخلوط میکروبی، رقت‌های متوالی تا 6-10 تهیه شد و به محیط کشت آگار 9k، منتقل گردید و به‌روش ریختن در پلیت[7] و با استفاده از میلۀ U شکل، در پلیت به‌طور یکسان پخش شد. پلیت‌ها به‌مدت 2 هفته در دمای 30 و 45 درجه سانتیگراد گرمگذاری شدند و بعد از این مدت، کلنی‌های رشدکرده، در محیط کشت جدید دیگر به‌روش خطی، کشت داده شدند. در این مرحله بر مبنای تفاوت‌های ریخت‌شناسی کلنی‌ها از قبیل رنگ، شکل و اندازۀ کلنی، خالص‌سازی جدایه‌ها انجام شد. به‌منظور اطمینان از خالص‌بودن نمونه‌ها 5 مرحله تجدید کشت انجام شد (13) (12).

انتخاب جدایۀبرتر: به منظور ارزیابی توانایی اکسایش گوگرد توسط جدایه‌ها، کلنی‌های خالص‌سازی‌شده در مرحلۀ قبل، به محیط کشت مایع پایۀ معدنی 9k، منتقل شدند و بر مبنای تغییر اسیدیته و سولفات محیط، ارزیابی شدند. در این مرحله، بهترین جدایه از نظر توانایی اسیدی‌کردن محیط و همچنین تولید سولفات، انتخاب شد. سنجش سولفات به‌روش کدورت‌سنجی با کلرید باریم انجام گرفت.

.بررسی تغییرات pH و سولفات توسط جدایه‌های مورد آزمایش: به‌منظور تعیین pH و درجه حرارت مناسب برای اکسایش گوگرد، تیمارهای دمایی 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتیگراد و همچنین تیمارهای اسیدیتۀ 5/3، 5/4، 5/5، 5/6، 5/7، 5/8 و 5/9 (14) با دور شیکر rpm 120 در محیط کشت پایۀ معدنی 9k در 3 تکرار اعمال شد. تحلیل نتایج با استفاده از نرم‌افزار اکسل انجام شد.

.شناسایی مولکولی جدایه‌های اکسیدکنندۀ گوگرد: برای شناسایی مولکولی جدایه‌های موردنظر، از نشانگر SrRNA16 استفاده شد. بدین منظور ابتدا زیست‌توده از جدایه‌ها تهیه شد و سپس با استفاده از کیت شرکت توپارژن[8] مطابق دستورالعمل شرکت ذکرشده، به استخراج DNA اقدام شد. سنجش کیفی DNA، با الکتروفورز ژل آگاروز 1درصد و سنجش کمی DNA، با استفاده از نانودراپ[9] و با محاسبۀ نسبت nm 280/260 انجام شد. PCR و تکثیر ژن مربوطه با استفاده از پرایمرهای f27 (′3´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5) و r1492 (′3´-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-5) انجام شد و تأیید آن به‌وسیلۀ الکتروفورز انجام شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم نهایی 50 مایکرولیتر انجام شد که 5 مایکرولیتر بافر PCR X1، 5 مایکرولیتر بافر MgCl2 با غلظت برابر 2 میلی‌مولار، 4 مایکرولیتر dNTP با غلظت 100 مایکرومولار، 5/2 مایکرولیتر از هر پرایمر رفت و برگشت با غلظت 5/0 مایکرومولار، 1 مایکرولیتر آنزیم Taq DNA پلیمراز U/µl 02/0، 1 مایکرولیتر DNA و 29 مایکرولیتر آب مقطر استفاده شد. برای تأیید PCR، از شاهد منفی در PCR استفاده شد که در شرایط مشابه و به جای DNA آب اضافه شده بود، استفاده گردید. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به شرح زیر انجام شد: واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به‌مدت 5 دقیقه، 35 چرخۀ تکرارشونده شامل واسرشت در دمای 94 درجه سانتیگراد به‌مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 59 درجه سانتیگراد به‌مدت 50 ثانیه و سنتز در دمای 72 درجه سانتیگراد به‌مدت 2 دقیقه و پس از اتمام این 30 چرخه، برای سنتز نهایی، مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد. در مرحلۀ بعد، محصول PCR با استفاده از کیت فرمنتاز[10] و مطابق دستورالعمل شرکت گفته‌شده، کلون گردید و با استفاده از دستگاه سکوئنسسر[11] (توسط شرکت ماکروژن کره) توالی‌یابی شد. نتایج توالی‌یابی با استفاده از نرم‌افزار (Technelysium Pty Ltd) 01/2 Chromas ویرایش شد و با استفاده از نرم‌افزار BLASTn با توالی‌های معتبر ثبت‌شده در پایگاه ژنی NCBI مقایسه شد و نزدیک‌ترین جدایه براساس مشابهت در توالی ژن SrRNA16 شناسایی گردید. تحلیل تبارزایی جدایه‌ها با استفاده از نرم‌افزار ClustalW انجام شد (15). در مرحلۀ بعد، رسم درخت تبارزایی با استفاده از الگوریتم Neighbour Joining انجام شد (16).

 

نتایج.

مشخصات شیمیایی خاک‌های موردبررسی، در جدول 1 نشان داده شده است. میانگین اسیدیتۀ خاک‌ها 89/7 و هدایت الکتریکی خاک‌ها 18/3 دسی‌زیمنس بر متر بود. خاک موردآزمایش، اسیدیتۀ خنثی تا نسبتاً قلیایی داشت و شور بود.

 

 

جدول 1- مشخصات اسیدیته و شوری خاک‌های موردبررسی

پارامتر

نمونه‌ها

میانگین

 

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

S9

S10

S11

S12

S13

S14

 

pH

89/7

84/7

84/7

89/7

89/7

86/7

89/7

89/7

89/7

97/7

99/7

92/7

87/7

89/7

89/7

EC(dS/m)

18/3

19/3

19/3

21/3

18/3

19/3

19/3

18/3

19/3

10/3

19/3

22/3

10/3

20/3

18/3

 

 

در مرحلۀ غنی‌سازی، از محیط‌های کشت که به‌وسیلۀ نمونه‌ها تلقیح شده بودند و کدورت ایجاد کرده بودند، 6 جدایه با توانایی اکسایش گوگرد خالص‌سازی شد و توانایی آنها در شرایط یکسان محیط (اسیدیتۀ 7، دمای 30 درجه سانتیگراد، rpm 120)، از نظر تغییر اسیدیته و تولید سولفات مورد ارزیابی قرار گرفت (جدول 2) که از این میان، جدایۀ 103 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد و سویه‌های 192 و 156 گرچه قادر به رشد روی محیط کشت بودند، در شرایط دمایی و اسیدیتۀ موجود (درجه حرارت 30 درجه سانتیگراد و اسیدیتۀ 5/7) قادر به اکسایش گوگرد و تغییر اسیدیته و سولفات محیط کشت نبودند که در مرحلۀ بعدی آزمایش، شرایط بهینۀ دما و اسیدیتۀ آنها برای رشد و اکسایش گوگرد، تعیین شد.

 

 

 

جدول 2- توانایی جدایه‌ها برای تغییر اسیدیته و تولید سولفات در شرایط محیطی یکسان (اسیدیتۀ 7 و دمای 30 درجه سانتیگراد و rpm 120)

سویه

تغییرات pH

تغییرات سولفات (mg S/L)

158

26/0

43

190

62/0

99

192

0

0

156

0

0

129

83/0

152

103

80/1

354

بررسی تغییرات pH و سولفات برای جدایه‌های موردآزمایش (با هدف تعیین pH و درجه حرارت مناسب برای اکسایش گوگرد): در مرحلۀ بعد، برای اینکه حداکثر توان اکسایش گوگرد توسط جدایه‌ها تعیین شود، تغییرات pH و سولفات برای جدایه‌های موردآزمایش به‌وسیلۀ اعمال تیمارهای مختلف دمایی و اسیدیته طی مدت 2 هفته تعیین شد (شکل 1).

 

 

 

 

(الف) تغییرات pH و سولفات در اسیدیتۀ ثابت (pH 5/7) توسط جدایه‌های مختلف در محیط کشت 9k در دماهای 45-25 درجه سانتیگراد

 

 

(ب)         تغییرات pH و سولفات در درجه حرارت ثابت (30 درجه سانتیگراد) توسط جدایه‌های مختلف در محیط کشت 9k در pH 5/9-5/3

شکل 1- تغییرات pH و سولفات برای جدایه‌های موردآزمایش بعد از 2 هفته (برای تعیین pH و درجه حرارت مناسب برای اکسایش گوگرد) توسط جدایه‌های مختلف در محیط کشت 9k در pH و درجه حرارت ثابت

 

 

براساس نتایج شکل 1 (الف)، در شرایطی که اسیدیتۀ محیط کشت 7 باشد، جدایه‌های موردبررسی از نظر دمای بهینۀ رشد به دو گروه تقسیم شدند؛ به‌طوری که جدایه‌های 103، 129، 190 و 158 در گروه مزوفیل (30 درجه سانتیگراد) و جدایه‌های 192 و 156 در گروه میانه دوست (40 درجه سانتیگراد) قرار گرفتند. همچنین از شکل 2 (ب) چنین بر می‌آید که جدایه‌های موردبررسی از نظر اسیدیتۀ بهینۀ رشد، در دمای 30 درجه سانتیگراد، به دو گروه تقسیم شدند. گروه اول که خنثی‌دوست بودند (اسیدیتۀ 5/7) شامل جدایه‌های 103، 129، 190 و 158 بودند و گروه دوم که قلیادوست بودند (اسیدیتۀ 5/8) شامل جدایه‌های 192 و 156 بودند. بدین ترتیب براساس نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش، چهار جدایۀ 103، 129، 190 و 158، مزوفیل و خنثی‌دوست بودند؛ درحالی‌که دو جدایۀ 192 و 156، میانه دوست و قلیادوست بودند.

ارزیابی توانایی اکسایش گوگرد براساس میزان توانایی تغییر اسیدیتۀ محیط کشت و تولید سولفات در این جدایه‌ها نشان داد (شکل 1، الف و ب) در شرایط مزوفیل و خنثی‌دوست، جدایۀ 103 و در شرایط میانه دوست و قلیادوست، جدایه 192 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان دادند. همچنین از میان دو جدایۀ 103 و 192، جدایۀ 103 توانایی بیشتری برای اکسایش گوگرد داشت. دامنۀ تغییرات اسیدیته در پژوهش حاضر حدود 2 است که این نتیجه، با سایر پژوهش‌ها هم‌خوانی داشت (17).

شناسایی مولکولی: نتایج تعیین توالی ژن SrRNA16 جدایه‌های موردنظر و مقایسۀ شباهت آنها با داده‌های معتبر ثبت‌شده در پایگاه NCBI، در جدول 3 نشان داده شده است.


 

جدول 3- مقایسۀ میزان شباهت ژن SrRNA16 جدایه‌های موردآزمایش با سویه‌های استاندارد

نام جدایه

شماره دستیابی

درصد شباهت

سویۀ استاندارد با بیشترین میزان شباهت

تاکسونومی

158

KR020052

9/93

Thiobacillus thiophilus NR 044555

Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Thiobacillus

190

KR020051

9/93

Thiobacillus thioparus NR 117817

Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Thiobacillus;

192

KR020050

9/99

Thiobacillus aquaesulis NR 117675

Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Thiobacillus

156

KR020049

1/94

Thiobacillus aquaesulis NR 117675

129

KR020043

3/95

Starkeya novella NR 074219

Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Starkeya; Starkeya novella

103

CP002026

86/99

Starkeya novella NR 074219

 

 

براساس نتایج مشاهده‌شده در جدول 2، دو جدایۀ 103 و 129 به‌ترتیب 86/99 و 3/95درصد با سویۀ استارکی نوولا شباهت تبارزایی داشتند و جدایه‌های190 و 158 به‌ترتیب 9/93 و 9/93درصد با سویه‌های تیوباسیلوس تیوپاروس[12] و تیوباسیلوس تیوفیلوس[13] شباهت تبارزایی داشتند. دوجدایۀ 192 و 156 نیز به‌ترتیب 9/99 و 1/94درصد با سویۀ تیوباسیلوس اکواسولیس[14] شباهت تبارزایی داشتند. همچنین، درخت تبارزایی جدایه‌های موردنظر براساس روش Neighbor-joining و با استفاده از نرم‌افراز 6MEGA ترسیم شد (شکل 2).

 

 

 

بحث و نتیجه‏‏گیری.

در سال‌های اخیر، استفادۀ بهینه از باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد صنایع مختلف از قبیل فروشویی معادن فلزی، تصفیۀ خانه‌های شهری و همچنین تهیۀ کودهای زیستی در کشاورزی، مورد توجه بیشتری قرار گرفته است. استفاده از این باکتری‌ها در کشاورزی علاوه بر تأمین گوگرد موردنیاز گیاه، با اسیدی‌کردن محیط، به جذب سایر عناصر غذایی مورد نیاز گیاه نیز، کمک می‌کند و استفاده از این کودهای زیستی، ضمن افزایش عملکرد در گیاه، اثرات زیست محیطی منفی برخی کودهای شیمیایی را نیز در پی‌نخواهد داشت (19، 18، 2) بدین ترتیب، نتایج حاصل از این پژوهش، می‌تواند برای تهیه کود زیستی کارگشا باشد که برای تحقیقات آتی، پیشنهاد می‌گردد.

 

 

شکل 2- درخت تبارزایی جدایه‌های اکسیدکنندۀ گوگرد براساس روش Nighor-Joining منتج از آنالیز توالی‌های ژن S rRNA16. عدد نشان‌داده‌شده در گره‌ها، نشان‌دهندۀ bootstrap 1000 است.

 

در این مطالعه، 6 جدایه بررسی شد که دو جدایۀ آن با سویۀ تیوباسیلوس اکواسولیس (به‌ترتیب با 9/99 و 1/94درصد شباهت)، دو جدایۀ دیگر با سویۀ استارکی نوولا[xv] (به‌ترتیب با 86/99 و 3/95درصد)، 1 جدایه با سویۀ تیوباسیلوس تیوفیلوس (با 9/93درصد) و 1 جدایه نیز با سویۀ تیوباسیلوس تیوپاروس (با 9/93درصد) شباهت تبارزایی نشان دادند. جدایه‌هایی که درصد شباهت تبارزایی آنها با سویه‌های شناخته‌شدۀ قبلی، کمتر از 99درصد بود احتمال دارد جدایه‌های جدیدی باشند که تأیید این مطلب، نیاز به انجام آزمایش‌های تکمیلی دارد. در گزارش‌های دیگر نیز، این سویه‌های جنس تیوباسیلوس در خاک شناسایی شده بود (20) و نتایج پژوهش حاضر، با نتایج دیگر پژوهش‌ها (21)، دربارۀ باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد از این جهت، هم‌خوانی نشان داد.

در طی فرآیند زیستی اکسایش گوگرد، محصولات متنوعی تولید می‌شود؛ ولی در هر حال محصول نهایی سولفات است (22) که از این ترکیب در کنار شاخص تغییر اسیدیته، می‌توان در ارزیابی توان اکسایش گوگرد استفاده کرد. در این پژوهش نیز از توانایی تغییر اسیدیته و تولید سولفات برای ارزیابی توانایی اکسایش گوگرد توسط باکتری‌ها، استفاده شد که این پارامترها، شاخص خوبی برای سنجش توانایی اکسایش گوگرد هستند (23).

از میان این 6 جدایه، جدایۀ 103 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد. جدایۀ 103، با 3/95درصد به سویۀ استارکی‌نوولا شباهت تبارزایی داشت و بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را از میان تمامی جدایه‌ها نشان داد. این گونه که قبلاً تیوباسیلوس‌نوولوس[xvi] نام داشت (24) و جنس وابسته به آن یعنی تیوباسیلوس، شناخته‌شده‌ترین جنس از باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد هستند که بیشتر در کلاس بتا‌پروتئوباکتریا قرار دارند و بیشترین مطالعات شناسایی باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد نیز بر آنها انجام شده است (24)؛ گرچه تیوباسیلوس‌نوولوس در کلاس آلفا‌پروتئوباکتریا قرار داشت (24). در یک پژوهش، باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد، اسیدیتۀ محیط را طی دو هفته تا 8 واحد کاهش دادند و مقدار تولید سولفات تا 20 میلی‌گرم گوگرد بر گرم گزارش شد (25) که در پژوهشی دیگر، این مقادیر، میان 10 تا 40 میلی‌گرم گوگرد بر کیلوگرم خاک، طی مدت 10 هفته گزارش شده بود (26). براساس نتایج این پژوهش تغییرات سولفات و اسیدیته، کمتر از نتایج قبلی بود که می‌تواند به‌دلیل تفاوت در توانایی اکسایش گوگرد توسط باکتری‌ها باشد.

با وجود اینکه دربارۀ گونه‌های مزوفیل تیوباسیلوس مطالعات زیادی صورت گرفته است، دربارۀ گونه‌های ترموفیل آن مطالعات کمتری صورت گرفته است که از میان می‌توان به تیوباسیلوس‌اکواسولیس اشاره کرد (27). در مطالعه‌ای (28) باکتری­های اکسیدکنندۀ گوگرد را تیوباسیلوس‌تیوپاروس، تیوباسیلوس‌ورسوتوس[xvii] و تیوباسیلوس‌اکواسولیس معرفی کردند که با نتایج پژوهش ما مشابهت داشتند.

براساس نتایج پژوهش حاضر، دو جدایۀ 103 و 192 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان دادند که این آنالیز مولکولی نشان داد این دو جدایه به‌ترتیب 86/99 و 9/99درصد با استارکی نوولا و تیوباسیلوس‌اکواسولیس شباهت تبارزایی داشتند. همچنین براساس نتایج دیگری از پژوهش حاضر، از میان دو جدایۀ 103 و 192، جدایۀ 192 شرایط سخت‌تر، یعنی دمای 40 درجه سانتیگراد و اسیدیتۀ 5/8 را بهتر تحمل می‌کند که این نتایج نیز در دیگر پژوهش‌ها گزارش شده بود (۲ و 2۹)؛ به همین دلیل این جدایه به‌عنوان یک باکتری میانه دوست و قلیادوست شناسایی شد. در پژوهش دیگری نیز، تیوباسیلوس‌اکواسولیس به‌عنوان جدایۀ برتر، انتخاب شده بود (30).

 آنزیم‌های مختلفی در اکسایش گوگرد دخیل هستند (31). در استارکی‌نوولا آنزیم کلیدی cytochrome cاز طریق مسیر TOMES[xviii]، در اکسایش گوگرد دخالت دارد. تولید این آنزیم به‌وسیلۀ بخشی از اپرون sox به‌نام soxAX انجام می‌گیرد (۳۲، ۳۳ و ۳۴). آنزیم اکسایش گوگرد در مزوفیل‌های اکسیدکننده گوگرد از قبیل تیوباسیلوس‌تیوپاروس، به دمای بالا حساس است و فعالیت خود را در این دماها از دست می‌دهد (۳۵ و ۳۶). بدین ترتیب، عدمِ‌رشد جدایۀ 103 در دمای بالاتر از 30 درجه سانتیگراد، ممکن است به‌دلیل کاهش فعالیت این آنزیم باشد.

یکی دیگر از دلایل تفاوت باکتری‌های اکسیدکنندۀ گوگرد کلاس آلفا و بتا پروتئوباکتریا، مربوط به تنوع ژنی آنهاست (32) ؛ به‌طوری که آلفا پروتئوباکتریا، اپرون کامل sox (sulfur oxidizing) را دارند؛ ولی بتاپروتئوباکتریا، اپرون sox را به‌طور ناقص دارند؛ یعنی ژن‌های کدکنندۀ سولفور دهیدروژناز را ندارند و به جای آن سیستم احیای برگشتی سولفات[xix] را دارند (37). در این پژوهش نیز، جدایۀ 103 (با 86/99درصد شباهت تبارزایی با استارکی‌نوولا) متعلق به آلفا پروتئوباکتریا بود ولی جدایۀ 192 (با 9/99درصد شباهت تبارزایی با تیوباسیلوس‌تیوپاروس) متعلق به بتا پروتئوباکتریا بود که این خود یکی دیگر از دلایل تفاوت عملکرد این دو باکتری بود.

با توجه به این نتایج و درنظرگرفتن این که دمای خاک کشاورزی در حد 30 درجه سانتیگراد بود، در صورتی که اسیدیتۀ خاک نیز در حد خنثی تا قلیایی باشد، کاربرد جدایۀ 103 برای تهیۀ کود زیستی در کشاورزی، پیشنهاد می‌شود و از آنجایی که استفاده از جدایۀ 192، برای شرایط قلیایی و دمای 40 درجه سانتیگراد کاربرد دارد، استفاده از آن در دیگرصنایع مرتبط، پیشنهاد می‌شود.

در کشاورزی، فاکتورهای مختلفی از قبیل تعداد جمعیت میکروبی، تنوع جمعیت میکروبی، شرایط اقلیمی (از قبیل درجه حرارت، هوادهی، پتانسیل آب در خاک)، سطح ویژۀ گوگرد در تماس با محیط، اندازۀ ذرات، فراوانی باکتری‌های هترتروف موجود در محیط و فراوانی سوبسترای ترکیبات آلی و معدنی و نوع عملیات کشاورزی (۳۸، ۳۹ و ۴۰)، در اکسایش گوگرد دخیل هستند. از آنجایی که پژوهش حاضر، از دیدگاه اکسایش مواد معدنی گوگردی مورد نظر بود، برای پژوهش‌های آتی، می‌توان نقش ترکیبات آلی در اکسایش گوگرد را نیز مورد توجه قرار داد.

در پژوهش حاضر، براساس نتایج شناسایی مولکولی و آزمایش‌های انجام‌شده، 6 جدایۀ اکسیدکنندۀ گوگرد شناسایی شد که 4 جدایۀ آن (103، 129، 190 و 158)، مزوفیل و خنثی‌دوست بودند و به‌ترتیب 86/99، 3/95، 9/93 و 9/93درصد با سویه‌های استارکی‌نوولا، استارکی‌نوولا، تیوباسیلوس‌تیوپاروس و تیوباسیلوس‌تیوفیلوس شباهت تبارزایی داشتند؛ درحالی‌که دو جدایۀ دیگر (192 و 156)، میانه دوست و قلیادوست بودند و به‌ترتیب 9/99 و 1/94درصد با سویه‌های تیوباسیلوس‌اکواسولیس شباهت تبارزایی نشان دادند. از میان این 6 جدایه، جدایۀ 103 بیشترین توانایی اکسایش گوگرد را نشان داد.

تشکر و قدردانی

این پژوهش، با حمایت مالی شرکت ملی صنایع مس ایران (مجتمع مس سرچشمه، امور تحقیق و توسعه) انجام شد که بدین وسیله، تشکر و قدردانی می‌شود.



[1]- Starkeya

[3]- Acidiphilium

[4]- Acidianus

[5]- Sulfolobus

[6]- Conductronic Unicam 2000 pH/EC meter

[7]- Pour plate method

[8]- TOP General Genomic DNA Purification Kit,(mini-prep), Topaz Gen Research, Iran.

[9]- NanoDrop 2000c spectrophotometry (Thermo Scientific, USA)       

[10]- InsTAclone PCR Cloning Kit, (Fermentas, USA)

[11]- ABI 3730 capillary sequencer

[12]- Thiobacillus thioparus

[13]- Thiobacillus thiophilus

[14]- Thiobacillus aquaesulis

[xv]- Starkeya novella

[xvi]- Thiobacilluc novellus

[xvii]- Thiobacillus versutus

[xviii]- Thiosulfate-Oxidizing Multi-Enzyme System, TOMES

[xix]- Reverse-acting sulfate-reducing systems           

1) Benson SW. Thermochemistry and kinetics of sulfur-containing molecules and radicals. Chemical Reviews 1978; 78(1): 23- 43.

(2) Hussain SA., Ahmad K., Arif-un-Nisa Naqvi TK., Ahmed M., Nafees MH., Abass Q. The colossal influence of biological fertilization on medicinal and aromatic plants. Journal of Biodiversity and Environmental Sciences 2014; 5(5): 299- 314.

(3) Havlin J., Beaton JD., Tisdale SL., Nelson WL. Soil fertility and fertilizers: An Introduction to Nutrient Management: 6th ed. Upper Saddle River, NewJersey: Pearson Prentice Hall; 2005: 515-205.

(4) Georgievskii V., Annenkov BN., Samokhin V. Mineral nutrition of animals: Studies in the Agricultural and Food Sciences. London: Elsevier; 2013: 459.

(5) Eriksen J. Soil sulfur cycling in temperate agricultural systems. Advances in Agronomy 2009; 102 (1): 55- 89.

(6) Hallberg KB., Lindström EB. Characterization of Thiobacillus caldus sp. nov., a moderately thermophilic acidophile. Microbiology 1994; 140(12): 3451- 6.

(7) Pronk J., Meulenberg R., Hazeu W., Bos P., Kuenen J. Oxidation of reduced inorganic sulphur compounds by acidophilic thiobacilli. FEMS Microbiol Rev. 1990; 75: (2-3): 293- 306.

(8) Friedrich CG., Rother D., Bardischewsky F., Quentmeier A., Fischer J. Oxidation of reduced inorganic sulfur compounds by bacteria: emergence of a common mechanism? Applied and Environmental Microbiology 2001; 67(7): 2873- 82.

(9) Liu J-Y., Xiu X-X., Cai P. Study of formation of jarosite mediated by Thiobacillus ferrooxidans in 9K medium. Procedia Earth and Planetary Science 2009; 1(1): 706- 12.

(10) Garrity GM., Bell JA., Lilburn T. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Acidithiobacillales ord. nov. Verlag US: Springer; 2005. 2 (B): 60- 63.

(11) Nemati M., Harrison SA. comparative study on thermophilic and mesophilic biooxidation of ferrous iron. Minerals Engineering 2000; 13(1): 19- 24.

(12) Valdebenito-Rolack EH., Araya TC., Abarzua LE., Ruiz-Tagle NM., Sossa KE., Aroca GE., Urrutia HE. Thiosulphate oxidation by Thiobacillus thioparus and Halothiobacillus neapolitanus strains isolated from the petrochemical industry. Electronic Journal of Biotechnology 2011; 14 (1): 7-8.

(13) Øvreås L., Torsvik V. Microbial diversity and community structure in two different agricultural soil communities. Microbial Ecology 1998; 36(3- 4): 303- 15.

(14) Nowaczyk K., Domka F. Kinetic Model of CuS Oxidation by. Polish Journal of Environmental Studies 2000; 9 (3): 195-201.

(15) Thompson JD., Gibson T., Higgins DG. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Current Protocols in Bioinformatics 2002; 2 (1): 2- 3.

(16) Hiraishi A., Nagashima KV., Matsuura K., Shimada K., Takaichi S., Wakao N. Phylogeny and photosynthetic features of Thiobacillus acidophilus and related acidophilic bacteria: its transfer to the genus Acidiphilium as Acidiphilium acidophilum comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 1998; 48(4): 1389- 98.

(17) White C., Shaman AK., Gadd GM. An integrated microbial process for the bioremediation of soil contaminated with toxic metals. Nature Biotechnology 1998; 16(6): 572- 5.

(18) Pasricha N., Abrol Y. Food production and plant nutrient sulphur. Sulphur in Plants. Netherlands: Springer; 2003: 29- 44.

(19) Kashirad A., Bazargani J. Effect of sulfur on pH and availability of phoshorus in calcareous soils, influence of sulfur and nitrogen on yield and chemical composition of corn. Zeitschrift für Pflanzenernährung und Bodenkunde 1972; 131(1): 6- 13.

(20) Brito EM., Piñón-Castillo HA., Guyoneaud R., Caretta CA., Gutiérrez-Corona J F., Duran R. Bacterial biodiversity from anthropogenic extreme environments: a hyper-alkaline and hyper-saline industrial residue contaminated by chromium and iron. Applied Microbiology and Biotechnology 2013; 97(1): 369- 78.

(21) Kappler U., Davenport K., Beatson S., Lucas S., Lapidus A., Copeland A. Complete genome sequence of the facultatively chemolithoautotrophic and methylotrophic alpha proteobacterium Starkeya novella type strain (ATCC 8093T). Standards in Genomic Sciences 2012; 7(1): 44.

(22) Alam M., Pyne P., Mazumdar A., Peketi A., Ghosh W. Kinetic enrichment of 34S during proteobacterial thiosulfate oxidation and the conserved role of SoxB in SS bond breaking. Applied and Environmental Microbiology 2013; 79(14): 4455- 64.

(23) Bardsley C., Lancaster J. Determination of reserve sulfur and soluble sulfates in soils. Soil Science Society of America Journal 1960; 24(4): 265- 8.

(24) Kelly DP., McDonald IR., Wood AP. Proposal for the reclassification of Thiobacillus novellus as Starkeya novella gen. nov., comb. nov., in the alpha-subclass of the Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2000; 50(5): 1797- 802.

(25) Okabe S., Odagiri M., Ito T., Satoh H. Succession of sulfur-oxidizing bacteria in the microbial community on corroding concrete in sewer systems. Applied and Environmental Microbiology 2007; 73(3): 971- 80.

(26) Riffaldi R., Saviozzi A., Cardelli R., Cipolli S., Levi-Minzi R. Sulphur mineralization kinetics as influenced by soil properties. Biology and Fertility of Soils 2006; 43(2): 209- 14.

(27) McDonald IR., Kelly DP., Murrell JC., Wood AP. Taxonomic relationships of Thiobacillus halophilus, T. aquaesulis, and other species of Thiobacillus, as determined using 16S rDNA sequencing. Archives of Microbiology 1996; 166(6): 394- 8.

(28) Kelly DP., Wood AP. Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermithiobacillus gen. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2000; 50(2): 511- 6.

(29) Robertson LA., Kuenen JG. The genus Thiobacillus. The Prokaryotes: New York: Springer; 2006: 812- 27.

(30) Wood AP., Kelly DP. Isolation and physiological characterisation of Thiobacillus thyasiris sp. nov., a novel marine facultative autotroph and the putative symbiont of Thyaspira flexuosa. Archives of Microbiology 1989; 152(2): 160- 6.

(31) Kappler U., Bacterial sulfite-oxidizing enzymes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 2011; 1807(1): 1- 10.

(32) Rzhepishevska O. Physiology and Genetics of Acidithiobacillus species: Applications for Biomining. Umea university, Sweden. 2008; 1- 73.

(33) Kappler U., Aguey-Zinsou K-F., Hanson GR., Bernhardt PV., McEwan AG. Cytochrome c551 from Starkeya novella characterization, spectroscopic properties, and phylogeny of adiheme protein of the soxAX family. Journal of Biological Chemistry 2004; 279(8): 6252- 60.

(34) Dambe T., Quentmeier A., Rother D., Friedrich C., Scheidig AJ. Structure of the cytochrome complex soxXA of Paracoccus pantotrophus, a heme enzyme initiating chemotrophic sulfur oxidation. Journal of Structural Biology 2005; 152(3): 229- 34.

(35) Middaugh C., MacElroy R. The Effect of Temperature on Ribose-5-phosphate Isomerase from a Mesophile, Thiobacillus thioparus, and a Thermophile, Bacillus caldolyticus. Journal of Biochemistry 1976; 79(6): 1331- 44.

(36) Lyric RM., Suzuk I. Enzymes involved in the metabolism of thiosulfate by Thiobacillus thioparus. I. Survey of enzymes and properties of sulfite: cytochrome c oxidoreductase. Canadian Journal of Biochemistry 1970; 48(3): 334- 43.

(37) Ghosh W., Dam B. Biochemistry and molecular biology of lithotrophic sulfur oxidation by taxonomically and ecologically diverse bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews 2009; 33(6): 999- 1043.

(38) Attoe O., Olson R. Factors affecting rate of oxidation in soils of elemental sulfur and that added in rock phosphate-sulfur fusions. Soil Science 1966; 101(4): 317- 25.

(39) Germida J., Janzen H. Factors affecting the oxidation of elemental sulfur in soils. Fertilizer Research 1993; 35(1- 2): 101- 14.

(40) Salmanian N., Ebrahimipour G., Ghasemi M., Fakhari J. Isolation and characterization of a Facultative chemolithotrophic sulphur and iron oxidizing bacterium from Ardabil acidic springs. Biological Journal of Microorganism 2012; 1(1): 1- 10.