مقایسه تولید سلولاز در سلول‌های جهش‌یافتۀ Trichoderma parceramosume PTCC5140

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

2 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3 دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: سلولز فراوان­ترین پلیمر زیستی در طبیعت است. کمپلکس آنزیمی سلولاز از سه آنزیم اندوگلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و β-گلوکوزیداز تشکیل شده است. گلوکز آزادشده از هیدرولیز آنزیمی سلولز به‌عنوان یک سوبسترای مناسب در زیست‌فناوری استفاده می­شود. ‏‏
مواد و روش‏‏ها: در این پژوهش ۷ گونۀ مختلف از جنسTrichodermaاز مرکز کلکسیون میکروارگانیسم­های صنعتی ایران دریافت و فعالیت سلولازی در آنها بررسی شد. کربوکسی‌متیل سلولز، آویسل و سلوبیوز به‌ترتیب به‌عنوان سوبسترای سنجش فعالیت آنزیم­های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز استفاده شد و همچنین زیست‌تودۀ خشک سلولی و روند تولید آنزیم بررسی شد. درنهایت جهش‌زایی با اسید نیترو ۲/۰ مولار انجام شد.
نتایج: براساس سنجش فعالیت آنزیمی از بین ۷ گونۀ مختلف تریکودرما، PTCC5140 Trichoderma parceramosume به‌عنوان بهترین سویه با بالاترین فعالیت سلولولیتیک انتخاب شد. این سویه با داشتن فعالیت اندوگلوکانازی ۱۸۲/۰ واحد در میلی­لیتر، فعالیت اگزوگلوکانازی ۵۳۸/۰ واحد در میلی­لیتر و فعالیت سلوبیازی ۱۰۹/۰ واحد در میلی­لیتر به‌عنوان سویه­ای که بالاترین فعالیت را در هر سه آنزیم داشت انتخاب شد. جهش‌زایی تصادفی سویۀ والد و انتخاب سویه‌های جهش‌یافته منجر به تولید 4 سویۀ جهش‌یافتۀ پایدار شد که میزان تولید آنزیم در آنها از 2 تا 11 برابر بیشتر از سویۀ والد بود.
بحث و نتیجه‏گیری: بررسی سلولاز تولیدشده در جهش‌یافته­های حاصل از PTCC 5140 T. parceramosumeنشان داد که استفاده از روش جهش­زایی، با افزایش 2 تا 11 برابری فعالیت آنزیمی می­تواند به‌عنوان روش مناسبی برای افزایش فعالیت کمپلکس آنزیمی سلولاز باشد. جهش‌یافته­های به‌دست‌آمده در این پژوهش، می‌توانند به‌عنوان انتخابی مناسب جهت فرآیندهای تبدیل سلولز به سوبستراهای ساده­تر مطرح باشند. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Comparative production of cellulases by mutants of Trichoderma parceramosume PTCC5140

نویسندگان [English]

  • Hoda Nouri 1
  • Tahereh Sajjadi 2
  • Mehrdad Azin 3
1 M.Sc. of Microbiology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, Science and Research baranch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
3 Associate professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Cellulose is the most abundant biopolymer in the world. Cellulase, including endoglucanase, cellobiohydrolase and beta-glucosidase, catalyzes the hydrolysis of cellulose. Released glucose from enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass is used in different biotechnology fields.
Materials and methods: In this study, seven different Trichoderma species were obtained from Persian Type Culture Collection (PTCC) and in order to select the best ones, cellulase activity of native strains was determined. Sodium salt of carboxymethyl cellulose (CMC-Na), Avicel and cellobiose were used for endoglucanase, cellobiohydrolase (exoglucanase) and cellobiase (beta-glucosidase) assays, respectively. Kinetics of cellulose production was evaluated for the selected strain. Finally, random mutagenesis with 0.2 M sodium nitrate was done.
Results: Among 7 different fungal species, Trichoderma parceramosum PTCC 5140 was selected as the best strain with the highest cellulase activity. This strain, by production of 0.182 U/ml of endoglucanase, 0.538 U/ml of exoglucanase and 0.109 U/ml of cellubiase, showed the highest amount of all three constituents of cellulolytic complex. Random mutagenesis and mutant selection of this strain caused to isolate 4 stable mutants that were able to produce 2 to 11 fold more enzymes compared with the parent strain.
Discussion and conclusion: Evaluation of cellulase production in mutant strains of Trichoderma parceramosume PTCC 5140 showed that use of chemical mutagenesis with 2 to 11 fold increasing in enzyme activity is a potent method to improve cellulase complex activity. In the current study, obtained mutant strains could be introduced as a potent cellulase producer for further studies in bioconversion processes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Trichoderma parceramosume PTCC 5140
  • Random mutagenesis
  • Acid nitro
  • Cellulase

مقدمه.

با رشد روزافزون جمعیت جهان و صنعتی‌شدن بیشتر کشورها، مصرف انرژی پیوسته در حال افزایش است. به نظر می­رسد که تقاضای انرژی در ایران به‌طور متوسط سالیانه ۶/۲درصد در سال­های ۲۰۰۳-۲۰۳۰ افزایش یابد. استفاده از انرژی­های تجدیدپذیر به‌ویژه سوخت­های زیستی[1] سبب می­شود که ایران شانس بهتری در مبادلۀ منابع انرژی غیرفسیلی داشته باشد و مصرف سوخت­های فسیلی را کاهش دهد. در ایران تولید سوخت­های زیستی براساس باقیمانده­های کشاورزی از پتانسیل بالایی برخوردار است (۱، ۲ و ۳).

ترکیبات لیگنوسلولزی به‌فراوانی در طبیعت وجود دارد و می­تواند در تولید صنعتی و انبوه بیواتانول به‌عنوان مادۀ اولیۀ ارزان‌قیمت و تجدید­پذیر استفاده شود. سلولز، همی‌سلولز و لیگنین اجزای اصلی سازندۀ ترکیبات لیگنوسلولزی هستند. جهت استفاده از سلولز لازم است به‌کمک تیمارهای مقدماتی، سازمان‌بندی کریستالی سلولز به هم بخورد و سپس مولکول­های خطی حاصل، به الیگوساکارید­های کوچک‌تر و درنهایت به واحد ساختمانی خود یعنی د-گلوکز تبدیل شود. پیش‌تیما­رهای به‌کاررفته می­تواند فیزیکی، شیمیایی، آنزیمی یا ترکیبی از این رو­ش­ها باشد تا حداکثر بازده و خلوص قند مدنظر به دست آید (۴ و ۵).

هیدرولیز آنزیمی سلولز یک فرایند پیچیده است که نیاز به مشارکت حداقل سه گروه آنزیم دارد: اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز که به‌طور سینرژیستی با یکدیگر عمل می­کنند. آنزیم اندو- بتا-1و۴ گلوکاناز[2] یا زیرواحد اندوگلوکاناز، به‌طور تصادفی به مناطق درونی بی­شکل فیبر سلولز حمله می‌کند و در آن نواحی پیوند­های بتا ۱و۴ گلیکوزیدی زنجیره سلولز را به‌طور تصادفی می­شکند و زنجیره­هایی با انتهای آزاد ایجاد می­کند. کربوکسی‌متیل سلولز[3] سوبسترای مناسبی برای این آنزیم است. حاصل عمل این آنزیم، گلوکز و سلوالیگوساکاریدها است. آنزیم اگزو- بتا-۱و۴-گلوکاناز[4] یا زیرواحد اگزوگلوکوناز، بخش عمدۀ کمپلکس سلولاز قارچی را تشکیل می­دهد. میزان آن بین ۴۰ الی ۷۰درصد کل پروتئین­های تشکیل‌دهندۀ سلولاز محاسبه‌شده است که در اکثر مواقع نواحی بلورین سلولز را هدف قرار می­دهد پیوند گلیکوزیدی بتا ۱و۴ را از سر شکسته و از انتهای غیراحیاکننده، زنجیره­های آزاد واحدهای سلوبیوز را جدا می­کند. آنزیم بتا-۱و۴-گلوکوزیداز[5] که سلوبیاز هم نامیده می­شود، بر خود سلولز بی­تأثیر است و واحدهای دوتایی گلوکوزیدی و سلوبیوز و همچنین در برخی موارد الیگوساکاریدهای تولیدشده را هیدرولیز و به گلوکز تبدیل می­کند (۶، ۷ و ۸).

در میان میکروارگانیسم­ها قارچ­ها عامل اساسی تجزیۀ زیستی مواد سلولزی خاک هستند. انواع متعددی از قارچ‌ها شامل جنس­های Aspergillus، Fusarium، Trichoderma، Neurospora و Thermomonosporaدارای فعالیت تجزیه‌کنندگی سلولز هستند. مهم‌ترین گونه­های صنعتی مولد سلولاز شاملTrichoderma reesei , Trichoderma viride هستند. از قارچ­های دیگر که قادر به تجزیۀ سلولز هستند، می­توان به Fusarium solani، Penicellium، T. koningii و T. viridae اشاره کرد (۹ و ۱۰). قارچ‌ها به‌دلیل تولید مقادیر فراوان آنزیم سلولولیتیک خارج سلولی و اهمیت آنها در صنعت، مورد توجه زیادی قرار گرفته­اند.

به‌دلیل تولید کم محصول، به‌ندرت از سویه‌های وحشی جداشده از طبیعت برای تولید تجاری فرآوردۀ مختلف استفاده می‌شود. استفاده از روش­های مختلف بهسازی و افزایش تولید محصولات مختلف سابقۀ طولانی در زیست‌فناوری دارد و یکی از مهم‌ترین راهبردها برای این منظور جهش­زایی سویۀ وحشی است که بدین منظور می­توان از عوامل جهش­زای فیزیکی همچون اشعه ماوراء بنفش و روش­های شیمیایی همچون تیمار با اتیدیوم بروماید و یا اسید نیترو نام برد (11).

براین‌اساس هدف از انجام این مطالعه بررسی گونه­های مختلف جنس Trichoderma موجود در مرکز منطقه­ای کلکسیون میکروارگانیسم‌های صنعتی ایران به‌منظور ارزیابی توانایی آنها در تولید اجزای آنزیم سلولاز بود. سپس از روش ایجاد جهش­های القایی با استفاده از اسید نیترو به‌عنوان ابزاری در بهبود سویه استفاده شد. نتایج به‌دست‌آمده در میزان تولید آنزیم در سویه­های جهش­یافته مقایسه شد و درنهایت، بهترین سویه­ها با بیشترین میزان تولید زیرواحدهای مختلف آنزیم نسبت به سویۀ وحشی معرفی شدند. معرفی سویه­های قارچی جهش­یافته با افزایش 2 تا 11 برابری در فعالیت آنزیم سلولاز از جمله یافته­های این پژوهش کاربردی است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

میکروارگانیسم­های موردِاستفادۀ مولد سلولاز: در این پژوهش 7 گونۀ­ مختلف جنس Trichoderma شامل T.viride PTCC 5157، T. virens PTCC 5300، Trichoderma sp. PTCC 5238،T. reesei PTCC 5142، T. Paraceramosome PTCC 5140، T. longibrachiatum PTCC 5307 و T. longibrachiatum PTCC 5308 از مرکز منطقه­ای کلکسیون میکروارگانیسم‌های صنعتی ایران[6] استفاده شد.

غربالگری قارچ­های تولیدکنندۀ سلولاز و انتخاب گونۀ برتر: انتخاب گونۀ برتر از میان ۷ گونۀ تهیه‌شده براساس فعالیت آنزیم­های سلولولیتیک و وزن خشک سلولی حاصل انجام شد که در ادامه به روش انجام هریک اشاره شده است.

بررسی فعالیت سلولازی سویه‌های قارچی: ازآنجاکه سلولاز متشکل از سه آنزیم است و سوبسترای موردنیاز آنزیم‌ها جهت فعالیت متفاوت­اند، برای تهیۀ محیط تولید آنزیم از دو سوبسترای آویسل و کربوکسی‌متیل سلولز استفاده شد. به این صورت که جهت بررسی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز از سوبسترای کربوکسی‌متیل سلولز و جهت فعالیت آنزیم‌های سلوبیاز و اگزوگلوکاناز از سوبسترای آویسل استفاده شد. برای این منظور ۸۰ میلی­لیتر محیط نمکی مندل حاوی ۱۰ گرم در لیتر آویسل[7] و یا کربوکسی‌متیل سلولز همراه با ۱ گرم در لیتر پپتون در ارلن ۲۵۰ میلی­لیتر تهیه شد و قارچ‌ها در آن کشت داده شدند. محیط کشت مندل علاوه بر منبع کربن و نیتروژن، حاوی محلول نمکی و عناصر ناچیز نیز بود و pH محیط بر روی ۲/۰±۷ تنظیم شد. محیط کشت به‌مدت ۵ روز در دمای ۳۰ درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار با ۱۵۰دور در دقیقه هوادهی شد و نمونه‌ها از نظر میزان تولید زیست‌توده و فعالیت آنزیم­های سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز بررسی شدند. تمامی آزمایش‌ها با سه تکرار انجام شد (۱2 و ۱3).

از روش دی‌نیتروسالیسیلیک‌اسید[8] جهت تعیین غلظت قندهای احیاکنندۀ حاصل از فعالیت آنزیم­ها و کیت سنجش گلوکز شرکت پارس آزمون استفاده شد (14و ۱5). جداسازی سوپرناتانت حاصل از فعالیت قارچ جهت بررسی فعالیت آنزیمی توسط فیلتراسیون انجام شد.

بررسی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز: جهت سنجش فعالیت اندوگلوکانازی، ۲۵/۰ میلی­لیتر سوپرناتانت کشت قارچی به ۲۵/۰ میلی­لیتر محلول کربوکسی­متیل سلولز 2درصد در بافر سیترات 50 میلی‌مولار و ۸/۴pH، اضافه شد و در دمای ۵۰ درجه سانتی­گراد به‌مدت ۳۰ دقیقه گرماگذاری شد. سپس ۵/۱ میلی­لیتر معرف DNS جهت توقف واکنش اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونه‌ها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.

بررسی فعالیت اگزوگلوکانازی: جهت سنجش فعالیت اگزوگلوکاناز بعد از صاف‌کردن محیط کشت، ۵/۰ میلی­لیتر بافر ۵۰ میلی‌مولار و ۸/۴pH، به ۲۵/۰ میلی­لیتر سوپرناتانت کشت قارچی افزوده شد و انکوباسیون در دمای ۵۰ درجه سانتی­گراد به‌مدت۶۰ دقیقه انجام شد. به‌منظور توقف واکنش ۵/۱ میلی­لیتر معرف DNS به مخلوط واکنش اضافه شد. نمونه‌ها به‌مدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونه‌ها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.

بررسی فعالیت سلوبیازی: جهت سنجش فعالیت سلوبیاز، ۵/۰ میلی­لیتر از سوپرناتانت کشت قارچی به‌همراه ۵/۰ میلی­لیتر محلول ۱۵ میلی‌مولار سلوبیوز در بافر سیترات ۵۰ میلی‌مولار و ۸/۴pH، در دمای ۵۰ درجه سانتی­گراد به‌مدت ۳۰ دقیقه انکوبه شد. نمونه‌ها به‌مدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونه‌ها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد. 10 میکرولیتر از نمونۀ حاصل از واکنش به ۱ میلی­لیتر کیت گلوکز اضافه شد و سپس جذب نوری در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.

تعیین واحد آنزیمی: یک واحد آنزیمی، معرف مقدار آنزیمی است که در هر دقیقه ۱ میکرومول گلوکز را آزاد می­کند. برای محاسبۀ واحد آنزیمی از فرمول زیر استفاده شد. در این رابطه بالا ۱۷/۱۹۸ وزن مولکولی گلوکز است.

 

 

وزن خشک سلولی: وزن خشک سلولی به‌عنوان شاخص رشد قارچ در محیط کشت تولید آنزیم (مندل) و درنتیجه مقدار مصرف سوبسترا توسط میکروارگانیسم اندازه­گیری شد. به این منظور، کشت ۵روزۀ قارچ بعد از فیلتراسیون روی کاغذ واتمن شماره ۱ به‌مدت ۲۴ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتی­گراد خشک و وزن توده سلولی براساس گرم در لیتر گزارش شد.

بررسی منحنی تولید آنزیم سلولاز توسط PTCC 5140T. parceramosume: برای تعیین بهترین زمان جهت سنجش فعالیت آنزیمی، سینتیک تولید آنزیم سلولاز در گونه پرتولید بررسی شد. برای این منظور ارلن­های۲۵۰ میلی­لیتر حاوی۸۰ میلی­لیتر محیط نمکی مندل تهیه و در هرکدام یک قطعۀ ۱×۱ سانتی‌متری از سطح پلیت PDA [9]حاوی میسلوم‌های اسپوردارPTCC 5140 T. parceramosumeتلقیح شد. محیط کشت به‌مدت ۷ روز در دمای ۳۰ درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار با ۱۵۰دور در دقیقه قرار داده شد. میزان تولید آنزیم­های سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز ازطریق سنجش فعالیت هر یک از زیرواحدها به‌صورت روزانه بررسی شد. تمامی آزمایش‌ها با سه تکرار انجام شد.

جهش‌زایی PTCC 5140T. parceramosume به‌منظور افزایش تولید آنزیم سلولاز: در این پژوهش برای ایجاد سویه­های جهش‌یافتۀ مناسب، از روش جهش­زایی شیمیایی و تیمار با اسید نیترو استفاده شد. غلظت ۲/۰ مولار از نیتریت‌سدیم در بافر استات ۲/۰ مولار و اسیدیته ۸/۴ تهیه شد و در مراحل جهش‌زایی استفاده شد. جهت رسم نمودار درصد بقا، رقت‌های سریالی از سوسپانسیون حاوی اسپور قارچی به‌تعداد 108 اسپور در میلی‌لیتر تهیه شد. سپس 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی اسپور قارچی به 4 میلی‌لیتر اسید نیترو اضافه شد و در شیکر با 150 دور در دقیقه و در زمان‌های 10،20،30، 40، 45، 50 و 60 دقیقه قرار داده شد. برداشت از نمونه به‌میزان 100 میکرولیتر همراه با افزودن 400 میکرولیتر بافر فسفات صورت گرفت. 100 میکرولیتر از هر رقت به پلیت حاوی محیط کشت تولید آنزیم افزوده شد و انکوباسیون نمونه‌ها در دمای 30 درجه سانتی­گراد و به‌مدت 3 تا 5 روز انجام شد. شمارش تعداد کلنی‌های موجود در هر پلیت مربوط به زمان‌های مختلف جهش به‌منظور دست‌یابی به زمانی که در آن ۹۹/۹۹درصد از اسپورها از بین رفته باشند، انجام شد (16).

انتخاب سویۀ برتر جهش‌یافته: جهت انتخاب سویۀ جهش‌یافته برتر از دو روش کیفی (غربال اولیه) و کمی (غربال ثانویه) استفاده شد. در روش کیفی، تشکیل هالۀ شفاف درنتیجۀ هیدرولیز سلولز توسط آنزیم تولیدی همراه با افزودن رنگ قرمز کنگو استفاده شد. بدین منظور محلول ۱/۰درصد قرمز کنگو به محیط کشت اضافه شد و سپس شستشوی پلیت با کلرید سدیم 1 مولار پس از 15 دقیقه انجام شد. فعالیت آنزیم سلولاز با توجه به قطر هالۀ ایجادشده به قطر کلنی سویۀ جهش‌یافته (H/C) ارزیابی شد. سویه‌های جهش­یافتۀ دارای مقیاس بزرگ‌تر (H/C≥1.5) جهت سنجش کمی انتخاب شدند. جهت بررسی کمی، سوپرناتانت مایع تخمیر توسط فیلتراسیون جداسازی شد و فعالیت آنزیم‌های سلولاز برای هر سویه اندازه‌گیری شد. جهش­یافته­هایی با توان بالای تولید آنزیم انتخاب شدند (16).

سنجش پایداری در تولید و فعالیت آنزیم سلولاز در سویه­های جهش­یافته: میزان پایداری تولید و فعالیت آنزیمی سویه­های جهش­یافته منتخب و همچنین سویۀ وحشی بررسی شدند. بدین منظور سویه­های پرتولید 10 بار واکشت داده شدند و درانتها فعالیت آنزیمی در هر سویه منتخب سنجیده شد.

آنالیز آماری: نتایج و اطلاعات به‌دست‌آمده در مراحل مختلف، به‌وسیلۀ نرم‌افزار آماریSPSS ویرایش 19 تجزیۀ آماری شدند. در این پژوهش از آزمون آماری One-way ANOVA، Tukey با ضریب اطمینان 95درصد استفاده شد و سطح معناداری نتایج به‌صورت P≤0.05 گزارش شد.

 

نتایج.

بررسی ماکروسکوپی گونه­های Trichoderma: قارچ­های کشت‌شده در محیط مندل از لحاظ رنگ، میزان رشد و ویسکوزیته ظاهری (به‌صورت کیفی) محیط بررسی شدند. با توجه به اینکه این محیط حاوی سوبسترای کربوکسی‌متیل سلولز بود و از ویسکوزیتۀ بالایی برخوردار بود، کاهش ویسکوزیته در محیط می­تواند نشان‌دهندۀ تولید سلولاز و شکست سوبسترا باشد. نتایج، حاکی از آن بود که در محیط مندلی که از کربوکسی‌متیل سلولز به‌عنوان سوبسترا استفاده شده بود، ویسکوزیتۀ محیط حاوی سویه­های PTCC 5308 وPTCC 5300 پس از گذشت ۵ روز نسبت به سایر سویه­ها، تغییر چندانی نداشته است. با این حال سویه­های PTCC 5307 و PTCC 5140 کاهش ویسکوزیته درنتیجۀ مصرف کربوکسی‌متیل سلولز را نشان دادند (جدول1). همچنین براساس نتایج به‌دست‌آمده مشخص شد که دربارۀ محیط مندلی که در آن از آویسل به‌عنوان سوبسترا استفاده شده بود نیز سویه­های PTCC 5140 وPTCC 5307 نسبت به سایر سویه­ها رشد بهتری داشتند.

 

غربالگری قارچ­های تولیدکنندۀ سلولاز: غربالگری قارچ­های تولیدکنندۀ سلولاز با تعیین وزن خشک سلو‌لی و همچنین بررسی فعالیت زیرواحد­­­های آنزیم سلولاز انجام شد.

بررسی وزن خشک سلولی: در شکل ۱ وزن خشک حاصل از رشد ۷ گونۀ Trichoderma بر روی دو نوع سوبسترای کربوکسی‌متیل سلولز و آویسل در محیط مندل نشان داده شده است. طبق نتایج به‌دست‌آمده در محیط­هایی که از کربوکسی‌متیل سلولز به‌عنوان سوبسترا استفاده شده بود، سویۀ PTCC 5300 بیشترین میزان رشد را داشت و در محیط­هایی که از آویسل به‌عنوان سوبسترا استفاده شده بود، سویه­های PTCC 5157 و PTCC 5308 بیشترین میزان رشد را داشتند. نتایج بیانگر آن بود که لزوماً سویه­هایی که رشد بالایی دارند، میزان فعالیت آنزیم­های سلولاز آنها بالا نیست، به‌طوری که سویۀ PTCC 5140 با رشد متوسط (شکل ۱)، میزان فعالیت آنزیم بسیار بیشتری نسبت به سایر سویه­ها داشت (شکل ۲).

 

 

جدول 1- مشخصات ظاهری رشد گونه­های مختلف Trichoderma در محیط حاوی کربوکسی‌متیل سلولز و آویسل

کد سویه

 

 

تغییر ویسکوزیته

 

کربوکسی‌متیل سلولز

آویسل

کربوکسی‌متیل سلولز

++

آویسل

+

کربوکسی‌متیل سلولز

آویسل

5157

کرم روشن

کرم تیره

+

-

5308

کرم مات

زرد روشن

+

+

++++

+

5300

صورتی روشن

شیری روشن

+

-

+++

+

5238

صورتی روشن

شیری کدر

+++

++

++

-

5142

صورتی روشن

صورتی کدر

++

++

++

-

5307

کرم- قهوه ای

زیتونی روشن

+++

+++

-

-

5140

صورتی

زیتونی

++++

++++

-

-

رشد: - عدم رشد و یا تغییر + ضعیف ++ متوسط +++ خوب ++++ خیلی خوب. ویسکوزیته: - عدم تغییر + تا ++++ کاهش گرانروی از ضعیف تا خیلی خوب

 

 

 

شکل 1-  وزن خشک حاصل از رشد گونه­های قارچ Trichoderma در محیط حاوی آویسل و کربوکسی‌متیل سلولز

 


بررسی فعالیت سلولازی: جهت تعیین بهترین سویه از میان ۷ قارچ تهیه شد و فعالیت آنزیم­های سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز بررسی شدند (شکل ۲). با توجه به نتایج به‌دست‌آمده مشخص شد که سویۀ T. parceramosumeبا داشتن فعالیت اندوگلوکانازی ۱۸۲/۰ واحد در میلی­لیتر فعالیت اگزوگلوکانازی ۵۳۸/۰ واحد در میلی­لیتر و فعالیت سلوبیازی ۱۰۹/۰ واحد در میلی­لیتر به‌عنوان سویه­ای که بالاترین فعالیت را در هر سه آنزیم داشت انتخاب شد. نتایج حاصل از فعالیت سلولازی در (شکل ۲) نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 2- فعالیت زیرواحد­های مختلف آنزیم سلولاز حاصل از رشد گونه­های مختلف جنس Trichoderma

 


روند تولید آنزیم سلولاز توسط سویۀ PTCC 5140T. parceramosumeدر محیط تولید آنزیم:  به‌منظور تعیین بهترین زمان جهت سنجش فعالیت آنزیمی، روند تولید آنزیم در روزهای مختلف بررسی شد. برای این منظور میزان فعالیت آنزیم­های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز در ۱ میلی‌لیتر محیط کشت در زمان یک دقیقه برای هر سه آنزیم و به‌صورت روزانه تعیین شد.

 

 

 

شکل 3- تولید آنزیم اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز توسط سویۀ PTCC 5140 T. parceramosume

 

 

نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که تولید آنزیم اندوگلوکاناز، ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و با گذشت زمان افزایش یافت. حداکثر میزان تولید آنزیم اندوگلوکاناز در روز ۵ به ۲۳۷/۰ واحد در میلی­لیتر رسید و از روز ۷ به بعد به‌تدریج کاهش نشان داد (شکل۳). تولید آنزیم اگزوگلوکاناز نیز ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد. حداکثر میزان تولید آنزیم اگزوگلوکاناز در روز ۵ به‌میزان ۲۴۴/۰ واحد در میلی­لیتر اندازه‌گیری شد و از روز ۷ به بعد به‌تدریج کاهش یافت (شکل۳). تولید آنزیم سلوبیاز ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و حداکثر میزان تولید آنزیم سلوبیاز در روز ۵ به‌میزان ۰۵/۰ واحد در میلی­لیتر به دست آمد و پس از روز ۷ به‌تدریج کاهش یافت (شکل۳).

انتخاب سویۀ برتر جهش‌یافته: پس از رسم نمودار درصد بقا و به‌دست‌آوردن معادله، 53 دقیقه زمانی است که در آن ۹۹/۹۹ درصد سویه­ها تحتِ‌تأثیر جهش با اسید نیترو از بین می‌روند و سویه­هایی که در این زمان بر روی پلیت تشکیل کلنی می­دهند، به احتمال زیاد جهش‌یافته هستند.

در بررسی کیفی فعالیت آنزیم، از میان 100 پرگنه جهش­یافته توسط اسید نیترو، 20 پرگنه که قطر هالۀ آنها بزرگ‌تر از سویۀ والد بودند، به‌عنوان سویه­های برتر انتخاب شدند. بررسی کمّی فعالیت آنزیم نشان داد که فعالیت اندوگلوکانازی و سلوبیازی سویۀ 19، به‌ترتیب 8/2 و 2/11 برابر و فعالیت اگزوگلوکانازی سویۀ 10 نسبت به سویۀ والد 3/1 برابر افزایش یافته است (جدول 2).

 

جدول 2- سنجش فعالیت آنزیم‌های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز سویه­های جهش‌یافته نسبت به سویۀ والد

نمونه

اندوگلوکاناز

(واحد در میلی­لیتر)

افزایش

فعالیت

اگزوگلوکاناز

(واحد در میلی­لیتر)

افزایش

فعالیت

سلوبیاز

(واحد در میلی­لیتر)

افزایش فعالیت

سویه والد

156/0

-

243/0

-

013/0

-

1

202/0

2/1

108/0

-

018/0

3/1

2

39/0

5/2

277/0

1/1

008/0

-

3

277/0

7/1

291/0

1/1

032/0

4/2

4

271/0

7/1

26/0

06/1

004/0

-

5

354/0

2/2

249/0

02/1

004/0

-

6

317/0

2

092/0

-

021/0

6/1

7

275/0

7/1

152/0

-

041/0

1/3

8

199/0

2/1

073/0

-

008/0

-

9

318/0

2

233/0

-

048/0

6/3

10

305/0

9/1

316/0

3/1

054/0

1/4

11

317/0

2

264/0

08/1

149/0

4/11

12

351/0

2/2

301/0

2/1

136/0

4/10

13

259/0

6/1

258/0

06/1

068/0

2/5

14

361/0

3/2

308/0

2/1

115/0

8/8

15

333/0

1/2

269/0

1/1

089/0

8/6

16

344/0

2/2

301/0

23/1

121/0

3/9

17

421/0

6/2

261/0

07/1

094/0

2/7

18

313/0

2

269/0

1/1

059/0

5/4

19

451/0

8/2

265/0

09/1

146/0

2/11

20

375/0

4/2

274/0

1/1

069/0

3/5

 

 

براساس نتایج به‌دست‌آمده در جدول 2، سویه‌های جهش­یافته ۱۰، ۱۱، ۱۷ و ۱۹ بالاترین میزان تولید آنزیم‌های سلولازی را نسبت به سویۀ والد نشان می­دهند.

سنجش پایداری فعالیت آنزیمی در سویه‌های جهش‌یافته و والد: به‌منظور تعیین میزان پایداری فعالیت هر یک از زیرواحدهای آنزیم سلولاز، فعالیت آنزیمی سویۀ وحشی در 4 سویۀ جهش‌یافته و پس از 10 بار کشت مجدد سنجیده شد. نتایج حاصل از میانگین 10 تکرار در جدول 3 ذکر شده است.

 

 

جدول 3- میانگین سنجش فعالیت آنزیم‌های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز سویه‌های جهش‌یافته نسبت به سویۀ والد (10 تکرار)

میانگین فعالیت آنزیم سلوبیاز (واحد در میلی­لیتر)

میانگین فعالیت آنزیم اگزوگلوکاناز (واحد در میلی­لیتر)

میانگین فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز (واحد در میلی­لیتر)

شماره سویه

50/0

245/0

238/0

سویۀ والد

-

320/0

-

10

149/0

-

-

11

-

-

438/0

17

153/0

-

446/0

19

 

سویۀ جهش‌یافتۀ 10 با فعالیت اگزوکلوکانازی320/0 واحد در میلی­لیتر و سویۀ جهش‌یافتۀ شماره 19 با فعالیت اندوگلوکانازی 446/0 واحد در میلی­لیتر و فعالیت سلوبیازی 153/0 واحد در میلی­لیتر سویۀ جهش‌یافتۀ شماره 17 با فعالیت اندوگلوکانازی 438/0 واحد در میلی­لیتر و سویۀ موتانت شماره 11 با فعالیت سلوبیازی 149/0 واحد در میلی­لیتر به‌عنوان سویه­های جهش‌یافته انتخاب شدند. نتایج حاصل از پایداری فعالیت آنزیمی نتایج نشان داد که فعالیت اندوگلوکانازی، اگزوگلوکانازی و سلوبیازی در سویه­های جهش­یافته پس از 10 بار کشت تغییری نداشته و تولید پایدار آنزیم مشاهده شد (جدول3).

 

بحث و نتیجه‏‏گیری.

ترکیبات لیگنوسلولزی به‌فراوانی در طبیعت وجود دارد و به‌عنوان مادۀ اولیه در تولید صنعتی و انبوه بیواتانول به‌عنوان یک مادۀ ارزان‌قیمت و تجدیدپذیر، می‌تواند استفاده شود. ترکیب اصلی شیمیایی زیست‌توده در منابع لیگنوسلولزی مختلف، متفاوت است؛ اما به‌طور کلی از ۲۵درصد لیگنین و ۷۵درصد پلیمرهای کربوهیدراتی سلولز و همی‌سلولز تشکیل شده است (۴، ۱7 و ۱8).

قبل از استفادۀ میکروارگانیسم از سوبسترای لیگنوسلولزی، چاره‌ای جز هیدرولیز این ترکیبات جهت تولید قندهای قابلِ‌تخمیر نیست. پیش تیمارهای فیزیکی، شیمیایی، آنزیمی یا ترکیبی از این روش‌ها می­تواند در آزادسازی قندهای موجود در ساختارهای لیگنوسلولزی به کار برده شود. هیدرولیز آنزیمی به‌دلیل شرایط متعادل از نظر pH و دمای فعالیت، معایب روش­های رایج مانند هیدرولیز اسیدی یا قلیایی از جمله خوردگی را ندارد، اختصاصیت و بازده در تولید گلوکز بالا است و ترکیبات سمی کمی تولید می­شود در عین حال باید اشاره کرد که در حال حاضر، قیمت تولید آنزیم­های میکروبی تجزیه‌کننده بالا است (۴، ۵ و ۱9). جهت استفاده از سلولز به‌عنوان منبع انرژی، ابتدا سلولز ازطریق هیدرولیز توسط آنزیم‌های سلولاز باید به گلوکز تبدیل شود و سپس به‌وسیلۀ عمل تخمیر اتانول تولید شود. تولید سلولاز، پرهزینه­ترین قسمت این فرآیند است به همین سبب کاستن هزینۀ تولید آنزیم سبب کاهش هزینۀ نهایی تولید اتانول خواهد شد؛ ‌علاوه بر این، آنزیم سلولاز موارد کاربرد متعدد دیگری نظیر استفاده در صنایع نساجی و صنایع کاغذسازی دارد (۱7 و 20). میکروارگانیسم‌های سلولیتیک قادر به تجزیۀ سلولز هستند و عمدتاً در دو گروه قارچ‌ها و باکتری­ها قرار می­گیرند. باکتری­ها در مقایسه با قارچ‌ها آنزیم کمتری تولید می­کنند و کارایی کمتری در تولید آنزیم دارند. در حال حاضر روش­های رایج برای بهبود سویه جهت استفاده در صنعت، استفاده از روش­های فیزیکی و شیمیایی برای ایجاد جهش و مهندسی ژنتیک است. با این حال در گام اول باید سویۀ والد توانایی مناسبی در تولید آنزیم داشته باشد. قارچ­های تجزیه‌کنندۀ سلولز از جمله گونه‌های مخلتف جنس‌های Trichoderma، Aspergillus و Penicillium از مهم­ترین قارچ­های تولیدکنندۀ سلولاز هستند و در این میان Trichoderma جهت تولید سلولاز در صنعت بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. به همین دلیل در این پژوهش برای اولین بار گونه­های مختلف جنس Trichoderma بررسی شد. در بسیاری از پژوهش­های انجام‌شده T. reesei به‌عنوان سویۀ برتر در تولید سلولاز معرفی شده است (۸، ۹ و ۱۰). در این تحقیق میزان فعالیت زیرواحدهای آنزیم سلولاز در بین ۷ گونه جنس Trichoderma مقایسه شد. نتایج نشان داد که T. parceramosum PTCC 5140 در مقایسه با سایر گونه­ها توانایی بالاتری در تولید آنزیم سلولاز دارد. این سویه با داشتن فعالیت اندوگلوکانازی ۱۸۲/۰ واحد در میلی­لیتر فعالیت اگزوگلوکانازی ۵۳۸/۰ واحد در میلی­لیتر و فعالیت سلوبیازی ۱۰۹/۰ واحد در میلی­لیتر به‌عنوان سویه­ای که بالاترین فعالیت را در هر سه آنزیم داشت انتخاب شد. بررسی منحنی تولید آنزیم در این سویه نشان داد که تولید آنزیم‌های سلولاز، ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و با گذشت زمان افزایش یافت. حداکثر میزان تولید هر سه آنزیم در روز ۵ و به‌ترتیب به‌میزان ۲۳۷/۰، ۲۴۴/۰ و ۰۵/۰ واحد در میلی­لیتر به دست آمد و پس از روز ۷ روند کاهشی داشت. این کاهش احتمالاً به‌علت کمبود مواد غذایی به‌خصوص منابع کربنی و درنتیجه تجزیۀ آنزیم‌های سلولازی توسط آنزیم‌های پروتئازی و مصرف این آنزیم‌ها به‌منظور تأمین رشد سلول است.

استفاده از روش­های کلاسیک و مدرن جهش­زایی سویه­های صنعتی با استفاده از مواد جهش‌زایی شیمیایی و یا روش­های فیزیکی و مهندسی ژنتیک به‌عنوان مهم‌ترین ابزار بهینه­سازی و افزایش تولید از زمان‌های گذشته مورد توجه دانشمندان بوده است (21).

چاندرا[x] و همکاران در سال 2009 افزایش تولید آنزیم سلولاز در T. citrinovirideرا ازطریق جهش­زایی اتیل، متیل سولفونات و اتیدیوم برماید بررسی کردند. براساس نتایج ارائه‌شده عنوان شد که جهش­زایی شیمیایی این سویه به‌منظور افزایش تولید سلولاز باعث افزایش 14/2، 10/2 و 73/1 برابری به‌ترتیب در تولید اگزوکلوکاناز، اندوگلوکاناز و سلوبیاز شده است (22). در پژوهش دیگر انجام‌شده توسط ادسول[xi] و همکاران در سال 2007 به‌منظور افزایش تولید سلولاز ازطریق جهش­زایی با اشعۀ ماوراء بنفش و ترکیب شیمیایی اتیل متیل سولفونات درPenicillium janthinellum NCIM 1171 عنوان شد که دو برابر افزایش فعالیت در آنزیم­های اگزوکلوکاناز و کربوکسی‌متیل سلولاز مشاهده شد (11). براساس نتایج به‌دست‌آمده دراین پژوهش در سویۀ جهش­یافته 10، فعالیت آنزیم‌های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز به‌ترتیب ۹/۱، ۳/۱ و ۱/۴ برابر به‌صورت پایدار افزایش یافت. همچنین افزایش تولید در سویۀ جهش­یافته 11 برای این سه آنزیم به‌ترتیب 2، ۰۸/۱ و ۴/۱۱ برابر بود که بیشترین افزایش تولید آنزیم سلوبیاز را نشان داد. سویۀ 17 نیز با ۶/۲، ۰۷/۱ و ۲/۷ برابر و سویۀ 19، ۸/۲، ۰۹/۱ و ۲/۱۱ افرایش تولید را به‌ترتیب در فعالیت آنزیم­های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز نشان دادند (جدول 2). تولید آنزیم‌های سلوبیاز و اندوگلوکاناز در سویۀ جهش‌یافته 19 و همچنین تولید آنزیم اگزوگلوکانازدر سویۀ موتانت 10 نسبت به سویۀ والد تفاوت چشمگیری داشته به همین دلیل دو سویۀ موتانت 10و 19 به‌عنوان سویه‌های جهش‌یافتۀ برتر انتخاب شدند (جدول3). درنهایت نتایج این تحقیق نشان داد که سویۀ جهش‌یافتۀ PTCC 5140 T. parceramosumمی­توانند به‌عنوان سویۀ مناسبی جهت استفاده در صنعت مورد توجه قرار گیرد و باعث افزایش بهره­وری تولید قندهای ساده در مرحلۀ هیدرولیز آنزیمی ترکیبات سلولزی به‌منظور استفاده به‌عنوان سوبسترای تولید محصولات مختلف در حوزۀ زیست‌فناوری شود.



[1]- Biofules

[2]- EC 3.2.1.4

[3]- CMC

[4]- EC 3.2.1.91

[5]- EC 3.2.1.2

[6]- PTCC

[7]- Avicel

[8]- DNS

[9]- Potato Dextrose Agar (PDA)

[x]- Chandra

[xi]- Adsul

(1)               Chiaramonti D. Bioethanol: role and production technologies. In: Improvement of crop plants for industrial end uses (ebook). Springer link; 2007; 209-251.

(2)              Hansen AC., Zhang Q., Lyne PW. Ethanol diesel fuel blends a review. Bioresource technology 2005; 96(3): 277-285.

(3)              Najafi G., Ghobadian B., Tavakoli T., Yusaf T. Potential of bioethanol production from agricultural wastes in Iran. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2009; 13(6-7): 1418-1427.

(4)              Naik S., Goud VV., Rout PK., Dalai AK. Production of first and second generation biofuels: a comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2010; 14(2): 578-597.

(5)              Sun Y., Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource technolog 2002; 83(1): 1-11.

(6)              Badger P. Ethanol from cellulose: A general review. Trends in new crops and new use, Proceedings of the fifth National Symposium, New Crops and New Uses 2002. 17-21.

(7)              Bhat M. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnology advances 2000; 18(5): 355-383.

(8)              Taherzadeh MJ., Karimi K. Pretreatment of Lignocellusic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review. International Journal of Molecular Science 2008; 9(9): 1621-1651.

(9)              Goyal A., Ghosh B., Eveleigh D. Characteristics of fungal cellulases. Bioresource Technolog1991; 36(1): 37-50.

(10)          Schuster A., Schmoll M., Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied microbiology and biotechnology 2010; 87(3): 787-799.

(11)           Adsul MG., Bastawde KB., Varma AJ., Gokhale DV. Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production. Bioresource Technology 2007; 98(7): 1467-1473.

(12)           Ghose TK. Measurement of Cellulase Activities. Pure and Applied Chemistry 1987; 59(2): 257-268.

(13)           Eveleigh DE., Mandels M., Andreotti R., Roche C. Measurement of saccharifying cellulase. Biotechnology and Biofuel 2009; 2(21): 1-8.

(14)           Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry 1959; 31(3): 426-428.

(15)           Lott JA., Turner K. Evaluation of Trinder's glucose oxidase method for measuring glucose in serum and urine. Clinical Chemistr 1975; 21(12): 1754-60.

(16)           Azin M., Noroozi E. Random mutagenesis and use of 2-deoxy-D-glucose as an antimetabolite for selection of α-amylase-overproducing mutants of Aspergillus oryzae. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2001; 17(7): 747-50.

(17)           Chandel AK., Chan E., Rudravaram R., Narasu ML., Rao LV., Ravindra P. Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal. Biotechnology and Molecular Biology Review 2007; 2(1): 14-32.

(18)           Hahn-Hägerdal B., Galbe M., Gorwa-Grauslund MF., Lidén G., Zacchi G. Bio-ethanol the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends in biotechnology 2006; 24(12): 549-556.

(19)           Carere CR., Sparling R., Cicek N., Levin DB. Third generation biofuels via direct cellulose fermentation. International journal of molecular science 2008; 9(7): 1342-1360.

(20)           Eggeman T., Elander RT. Process and economic analysis of pretreatment technologies. Bioresource technology 2005; 96(18): 2019-2025.

(21)           Ghazi S., Azin M., Akhavan sepahi A. Over production of xylanase from Bacillus mojavensis by classical mutagenesis. Biological Journal ofMicroorganism 2014; 3(11) :21-36.

(22)           Chandra M., Kalra A., Sangwan NS., Gaurav SS., Darokar MP., Sangwan RS. Development of a mutant of Trichoderma citrinoviride for enhanced production of cellulases. Bioresource Technology 2009; 100(4): 1659-1662.