بررسی روش‌های مختلف ارزیابی تولید سیدروفور در سودوموناس‌های فلورسنت بومی ایران

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار بیماری‌شناسی گیاهی، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران

2 استادیار بیماری‌شناسی گیاهی، دانشگاه جیرفت، جیرفت، ایران

3 استاد بیماری‌شناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی دانشگاه تهران، کرج، ایران

4 دانشیار خاکشناسی، دانشگاه ارومیه، آذربایجان غربی، ایران

چکیده

مقدمه: سودوموناس‌های فلورسنت سیدروفورهای متعددی را تولید می‌کنند که مهم‌ترین آنها سیدروفور نوع پایووردین است. تولید سیدروفور در این باکتری‌ها باعث افزایش فراهمی آهن موردنیاز باکتری و گیاهان می‌شود و همچنین اهمیت ویژه‌ای در کنترل بیماری‌های گیاهی دارد.
مواد و روش‏‏ها: به‌منظور مقایسۀ روش‌های اندازه‌گیری تولید سیدروفور، میزان تولید سیدروفور 21 سویۀ سودوموناس بومی ایران به‌همراه دو سویۀ مرجع خارجی و یک سویۀ باسیلوس با روش کیفی CAS-Agar، روش نیمه‌کمّی CAS-AD و روش کمّی اسپکتروفتومتری با استفاده از سیدروفور خالص اندازه‌گیری شد.
نتایج: در روش CAS-Agar به‌علت وجود مادۀ شویندۀ HDTMA رشد سلولی تعدادی از سویه‌ها محدود و درنتیجه تولید سیدروفور آنها پایین بود. در روش CAS-AD همۀ باکتری‌ها قادر به تولید سیدروفور بودند که بیشترین و کمترین مقدار تولید مربوط به P. fluorescens UTPF76 و P. fluorescens UTPF45 با تولید معادل 005/1 و 0026/0 میلی‌گرم در لیتر دفروکسامین بود. در دو روش اخیر سویۀ باسیلوس و موتانت پایووردین P. aeruginosa MPFM1 به‌میزان کمی تولید سیدروفور کردند که نشان‌دهندۀ غیرانتخابی‌بودن این روش‌ها به نوع سیدروفور بود. در روش کمی فقط سیدروفور نوع پایووردین قابل‌اندازه‌گیری بود که سویه‌های P. aeruginosa MPFM1 وBacillus sp. قادر به تولید آن نبودند. بیشترین میزان تولید پایووردین مربوط به سویۀ خارجی 7NSK2 با 29/625 میکرومول بر لیتر بود و در پی آن سویه‌های P. fluorescens UTPF65، P. fluorescens UTPF81 و P. fluorescens UTPF87 در رتبۀ بعدی قرار گرفتند.
بحث و نتیجه‏گیری: در مجموع روش CAS-AD بهترین روش برای بررسی میزان تولید سیدرفور کل و روش اسپکتروفتومتری نیز روشی دقیق و کارا برای تشخیص سیدروفور نوع پایووردین است که عمدتاً توسط سودوموناس‌های فلورسنت تولید می‌شود.‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation of different methods in siderophore measurement in indigenous Fluorescent Pseudomonads

نویسندگان [English]

  • Rouhallah Sharifi 1
  • Hamidreza Alizadeh 2
  • Masoud Ahmadzadeh 3
  • Mirhassan Rasouli Sadaghiani 4
1 Assistant professor of Plant pathology, Razi University, Kermanshah, Iran
2 Assistant professor of Plant Pathology, University of Jiroft, Jiroft, Iran
3 Professor of Plant pathology, University of Tehran, Karaj, Iran
4 Associate professor Soil science, Urmia University, Urmia, Iran
چکیده [English]

Introduction:Fluorescent pseudomonads produced a variety of siderophores in which the pyoverdine type siderophore is the main one. These bacteria employ siderophores to increase availability of Iron for their own and plants consumption. Siderophores have a special role in the biological control activity of these bacteria against plant pathogens.
Materials and methods: Siderophore production was checked in 21 indigenous Pseudomonads strains, two reference strains and one Bacillus sp. strain by qualitative CAS-Agar, semi-quantitative CAS-AD and quantitative spectrophotometric methods.
Results: Colony growth in some of isolates such as UTPF93 has been inhibited in CAS-Agar method because of the detergent compound HDTMA. So, siderophore production was low in these strains. All strains produced siderophore by the CAS-AD method. The highest and the lowest siderophore production were recorded in UTPF76 and UTPF45 with 1.005 and 0.0026 mM of defroxamin equivalent, respectively. The Pyoverdine mutant strain MPFM1 and the Bacillus sp. strain also produce low amounts of siderophore in two recent methods. So, these methods are non-selective to the type of siderophore. In quantitative method only Pyoverdine type siderophore was detectable and the strains MPFM1 and Bacillus sp. did not produce this type of siderophore. The highest amount of pyoverdine was recorded in non-indigenous strain 7NSK2 with 625.29 mM/L followed by UTPF65, UTPF81 and UTPF87.
Discussion and conclusion: CAS-AD was the best method for total siderophore measurement and spectrophotometric was the accurate and efficient method for detection of pyoverdine type siderophore in fluorescent pseudomonads.

کلیدواژه‌ها [English]

  • CAS-Agar
  • fluorescent pseudomonads
  • Pyoverdine
  • Siderophore

مقدمه.

آهن چهارمین عنصر فراوان پوستۀ زمین بعد از اکسیژن، سیلیسیم و آلومینیم با میزان 6/5 درصد است و تقریباً در هر نوع خاکی یافت می‌شود. این عنصر در pH بالای 5/6 برای رشد گیاهان بیشتر به‌صورت غیرقابل‌حل در بین لایه‌های مختلف کانی‌ها وجود دارد (1). موجودات خاک برای فائق‌آمدن بر این مشکل سازوکارهای مختلفی را به کار می‌بندند که مهم‌ترین آنها تولید سیدروفورها است (2).

تقریباً همۀ میکروارگانیسم‌هایی که قابل‌کشت هستند به غیر از لاکتوباسیلوس‌ها قادر به تولید سیدروفور هستند (3). تاکنون تقریباً 500 ساختار سیدروفوری شناخته شده است؛ اگرچه به نظر می‌رسد که تعداد زیادی از اینها نتیجۀ اختلافات واقعی ساختاری نباشند. براساس ساختار مولکولی و نوع باندها سیدروفورها به چهار گروه باکتریایی و سه گروه قارچی تقسیم‌بندی می‌شوند (4). سیدروفورهای باکتری‌ها شامل موارد هستند: 1. گروه فنول کاتکول‌ها از جمله انتروباکتین که بالاترین میل ترکیبی برای آهن را بین سیدروفورهای شناخته شده دارد؛ اما این ترکیب بسیار ناپایدار است و به‌سرعت در خاک هیدرولیز می‌شود. انتروباکتین توسط E. coli و همچنینspp.  Enterobacte تولید می‌شود. اگروباکتین و پایوچلین هم از این گروه هستند. 2. هیدروکسیمات‌ها از جمله ائروباکتین و فروکسامین‌ها؛ این سیدروفورها اغلب توسط اعضای خانواده انتروباکتریاسه[1] و اکتینومیست‌ها تولید می‌شوند که همه کلونیزه‌کننده‌های عمومی ریشۀ گیاهان هستند. سیدروفور تولیدشده توسط قارچ‌ها به غیر از موارد معدودی از این نوع است، این نوع سیدروفور بیشترین غلطت را در خاک دارد؛ ولی ثابت پایداری (قدرت اتصال به آهن) آن نسبتاً پایین است؛ لذا می‌تواند نقش مهمی در افزایش رشد گیاه داشته باشد (5). 3. گروه ریزوباکتین‌ها (در بعضی منابع کربوکسیلات نامیده می‌شوند) که توسط اعضای جنس ریزوبیوم[2] تولید می‌شوند و به‌عنوان منبع مؤثری از آهن برای گیاهان عمل می‌کنند. 4. گروه آخر از سیدروفورهای میکروبی پایووردین‌ها هستند که ساختار مرکب و پیچیده‌تری دارند. وجود این ترکیبات اولین بار در سال 1943 گزارش شد و در سال 1978 مایر و عبدالله[3] ساختار شیمیایی و خصوصیات فیزیولوژیکی آن را مشخص کردند (6). این سیدروفورها به‌طور اختصاصی توسط اعضای جنس سودوموناس تولید می‌شوند و نقش مهمی در توان رقابتی سودومونادهای عامل کنترل بیولوژیک بیمارگرهای گیاهی ایفا می‌کنند (6 و 7). گزارش‌های اخیر نشان داده‌اند که این سیدروفورها نقش مهمی در تأمین آهن موردنیاز گیاهان ایفا می‌کنند (8). گفتنی است که سودوموناس‌های فلورسنت علاوه بر پایووردین سیدروفورهای دیگری از جمله پایوچلین، اسید‌سالیسیلیک و کوئینولوباکتین را نیز تولید می‌کنند که کارایی آنها در جذب آهن بسیار پایین‌تر از پایووردین است (3). تاکنون روش‌های متعددی برای بررسی میزان تولید سیدروفور ارائه شده است که پژوهشگران بسته به نیاز، از آنها استفاده می‌کنند. برای اولین بار شان و نیلند[4](9) روش CAS[5]-Agar را برای بررسی میزان تولید سیدروفور ارائه دادند. نقطه ضعف این روش وجود مادۀ دترجنت HDTMA[6] بود که مانع رشد بسیاری از میکروارگانیسم‌ها می‌شد. برای رفع این نقص روش CAS-AD[7] معرفی شد که میکروارگانیسم ابتدا در محیط اختصاصی خود رشد داده می‌شود و سپس مایع رویی حاوی سیدروفور به چاهک‌های محیط کشت CAS اضافه می‌شود. روش اسپکتروفتومتری که مایر و عبدالله (6) معرفی کردند، امکان تعیین دقیق مقدار سیدروفور نوع پایووردین را فراهم کرد اما سیدروفورهای دیگر تولیدشده توسط سودوموناس‌ها با این روش قابل‌اندازه‌گیری نبودند. در ایران برای اولین بار رسولی صدقیانی و همکاران (10) به‌منظور غربال باکتری‌های محرک رشد گیاه، میزان تولید سیدروفور سودومونادهای فلورسنت ریزوسفری را با روش CAS-Agar بررسی کردند. هدف از این پژوهش بررسی میزان تولید سیدروفور سودوموناس‌های فلورسنت بومی خاک‌های ایران با روش‌های اندازه‌گیری متفاوت و مقایسۀ این روش‌ها برای ارائۀ بهترین روش برای هر شرایط است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

سویه‌های باکتری: 22 سویۀ باکتری از سویه‌های منتخب کلکسیون باکتری‌های آنتاگونیست قطب کنترل بیولوژیک دانشگاه تهران که دارای قدرت بالایی در بیوکنترل عوامل بیمارگر مختلف بوده و همچنین قادر به بهبود صفات رشدی گیاه بودند انتخاب شدند. سویۀ P. aeruginosa 7NSK2 جداشده از مزارع جو بلژیک (11) به‌عنوان سویۀ مرجع استفاده شد. وجود سه نوع سیدروفور پایووردین، پایوچلین و سالیسیلیک‌اسید در این سویه به اثبات رسیده است. سویۀ  P. aeruginosa MPFM1 موتانت پایووردین سویۀ 7NSK2 و مقاوم به آنتی‌بیوتیک کانامایسین است. این سویه توانایی تولید سیدروفور نوع پایووردین را ندارد (11).

نگهداری باکتری‌ها: باکتری‌ها روی محیط کشت کینگ‌بی داخل لوله آزمایش به‌صورت مورب کشت داده شدند و بعد از رشد کامل باکتری روی آن پارافین مایع دوبار سترون‌شده ریخته و در دمای منفی چهار درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

نگهداری به‌صورت یخ خشک نیز انجام شد. در این روش یک میلی‌لیتر محیط کشت شیرخشک بدون چربی (شیرخشک بدون چربی 100 گرم، پپتون 5 گرم، ساکاروز 5 گرم در یک لیتر آب) درون لوله‌های آزمایشی با حجم چهار میلی‌لیتر ریخته و اتوکلاو شد. بعد از سردشدن در شرایط سترون یک لوپ باکتری به این لوله‌ها اضافه شد. بعد از هشت ساعت محیط درون لوله‌ها با استفاده از نیتروژن مایع منجمد شد. این لوله‌ها به‌مدت 12 ساعت در دستگاه لیوفلیز قرار داده شدند تا به‌طور کامل آبگیری شوند. سپس با استفاده از شعلۀ گاز اکسیژن سر لوله‌ها بسته و در دمای محیط نگهداری شدند (12).

خالص‌سازی پیووردین: تهیه و خالص‌سازی پایووردین سویۀ P. fluorescens UTPF59 با استفاده از روش کروماتوگرافی تعویض یونی براساس روش مایر و عبدالله (6)، با اندکی تغییر (13) انجام شد.

برای بررسی میزان تولید سیدروفور در تیمارهای مختلف لازم بود منحنی استاندارد این متابولیت با استفاده از پایووردین خالص رسم شود. بدین منظور 90 میلی‌گرم سیدروفور خالص در آب مقطر حل شد و حجم آن به 100 میلی‌لیتر رسید. محلول حاصل از فیلتر 2/0 میکرون عبور داده شد تا سترون شود. محلول فوق در دمای 4 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شد. غلظت‌های مختلف این محلول در آب مقطر تهیه شد و میزان جذب آنها در طول موج 400 نانومتر خوانده شد (دستگاه پی‌جی اینسترومنت[8] مدل T70+). با استفاده از داده‌های به‌دست‌آمده، منحنی استاندارد در نرم‌افزار اکسل 2007 رسم شد و معادله خط همبستگی نوشته شد. با استفاده از معادله خط و وزن ملکولی پایووردین ضریب مولی پایووردین محاسبه شد ( 7300 =ε). براساس این ضریب مولی و فرمول زیر غلظت پایووردین اندازه‌گیری شد (6).

A=εBC   A = جذب در 400 نانومتر ε= ضریب مولی B= قطر کووت  C= غلظت پایووردین

.اندازه‌گیری میزان تولید سیدروفور در سویه‌ها

 روش CAS-Agar: در این بررسی از روش الکساندر و زوبرر[9] (14) استفاده شد. محیط CAS-Agar از چهار محلول که هر کدام به‌صورت جداگانه‌ای سترون می‌شوند تهیه می‌شود.

محلول معرف Fe-CAS (محلول 1): این محلول از اختلاط 10 میلی‌لیتر FeCl3-6H2O یک میلی‌مولار (در اسیدکلریدریک 10 میلی‌مولار) با 50 میلی‌لیتر محلول CAS (21/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر) تهیه شد. محلول ارغوانی تیرۀ حاصل به‌آرامی و همراه با تکان‌دادن پیوسته به 40 میلی‌لیتر محلول HDTMA (82/1 میلی‌گرم‌در‌لیتر) اضافه شد. محلول حاصل که دارای رنگ آبی تیره بود اتوکلاو شد و در دمای محیط تا 50 درجه سانتیگراد سرد شد. این محلول باید به‌صورت تازه تهیه شود.

محلول بافر (محلول 2): محلول شماره دو با حل‌کردن 24/30 گرم بافرPIPES (piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) در 750 میلی‌لیتر محلول نمکی حاوی 3/0 گرم KH2PO4، 5/0 گرم NaCl و 0/1 گرم NH4Cl تهیه گردید و pH آن با KOH 50% به 8/6 رسانده شد. قبل از اتوکلاو، به محلول فوق 15 گرم آگار اضافه شد و با افزودن آب مقطر حجم آن به 800 میلی‌لیتر رسید. بعد از اتوکلاو تا 50 درجه سانتیگراد سرد شد.

محلول غذایی (محلول 3): حاوی دو گرم گلوکز، دو گرم مانیتول، 493 میلی‌گرم MgSO4. 7H2O، 11 میلی‌گرم CaCl2، 17/1 میلی‌گرم MnSO4.H2O، 4/1 میلی‌گرمH3BO3، 04/0 میلی‌گرم CuSO4.5H2O، 2/1 میلی‌گرم ZnSO4. 7H2O و 0/1 میلی‌گرم Na2MoO4. 2 H2O است. این محلول نیز به‌صورت جداگانه اتوکلاو و سرد شد.

محلول کازامینواسید (محلول 4): مقدار سه گرم کازامینواسید به 30 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد. این محلول با استفاده از دستگاه میلی‌پور از فیلتر 2/0 میکرون عبور داده شد تا سترون گردد.

ابتدا محلول چهار و سپس محلول سه به محلول بافر اضافه شد. در آخر محلول معرف به‌آرامی و با هم‌زدن کافی اضافه شد و در تشتک‌های پتری نُه سانتیمتری توزیع شد. برای تلقیح این تشتک‌های پتری، پنج میکرولیتر سوسپانسیون، از کشت 24ساعته باکتری‌ها به‌صورت قطره‌گذاری استفاده شد. از سویۀ 7NSK2 به‌عنوان شاهد مثبت و از سویۀ MPFM1، (موتانت پایووردین) به‌عنوان شاهد منفی استفاده شد. این تشتک‌های پتری در دمای C˚27 نگهداری شدند.

تولید سیدروفور باعث جداشدن آهن از CAS می‌شود که نتیجۀ آن تولید یک هالۀ نارنجی‌رنگ اطراف کلنی باکتری است. قطر این هاله در سه روز متوالی ثبت شد و میانگین سه روز نیز محاسبه گردید.

روش CAS-AD: محیط CAS agar به‌دلیل داشتن مادۀ دترجنت کاتیونی HDTMA که برای جلوگیری از رسوب کمپلکس Fe-CAS اضافه می‌شود، مانع رشد بسیاری از باکتری‌های ریزوسفری است. طبق گزارش الکساندر و زوبرر (14)، 79-70درصد باکتری‌های ریزوسفری که روی محیط کشت غیرانتخابی [10]TSA رشد کرده بودند، قادر به رشد روی محیط CAS-Agar نبودند.

ترکیبات محیط CAS-Agar برای این آزمایش مشابه آزمایش قبل است. به غیر اینکه تمام مواد غذایی (محلول 3 و4) حذف شدند. بعد از ریختن محیط درون تشتک پتری، با استفاده از چوب‌پنبه‌سوراخ‌کن پنج میلی‌متری، چاهک‌هایی در تشتک‌های پتری CAS-Agar ایجاد شد. این تشتک‌های پتری تا زمان استفاده درون نایلون های پلاستیکی و در یخچال نگهداری شدند (15).

باکتری‌ها به‌مدت 40 ساعت، در دمای 27 درجه سانتیگراد روی محیط کشت سوکسینات ( 6 گرم‌برلیتر K2HPO4، 3 گرم‌بر‌لیتر KH2PO4، 2/0 گرم‌بر‌لیتر 7H2O MgSO4، یک گرم‌بر‌لیتر NH4SO4 و 4گرم‌بر‌لیتر سوکسینیک‌اسید که با استفاده از KOH 50% به 7 pH رسانده شد) رشد داده شدند و سپس سوسپاسیون باکتری در g10000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی جدا شد. به‌میزان 35 میکرولیتر از مایع رویی هر سویه درون چاهک‌ها ریخته شد. بعد از جذب آن مقدار مساوی دیگر از همان مایع رویی دوباره به چاهک‌ها اضافه شد. تشتک‌های پتری به‌مدت 8 ساعت در دمای 27 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و قطر هالۀ نارنجی اطراف چاهک‌ها اندازه‌گیری شد. از سری رقت‌های محلول 5/2 میلی‌گرم‌درلیتر سیدروفور تجاری دسفرال® برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و درنهایت میزان تولید سیدروفور به‌صورت معادل دسفرال اندازه‌گیری شد.

روش اسپکتروفتومتری: مقدار 100 میکرولیتر از کشت 24ساعتۀ باکتری‌ها در محیط سوکسینات به فلاسک‌های حاوی 40 میلی‌لیتر محیط سوکسینات منتقل شد. این سوسپانسیون‌های باکتری به‌مدت 40 ساعت در دمای 27 درجه سانتیگراد و 120 دور در دقیقه روی شیکر نگهداری شدند. سلول‌های باکتری با سانتریفیوژکردن در g10000 به‌مدت 10 دقیقه رسوب داده شدند. بعد از حذف سلول‌ها میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. از مایع رویی به‌دست‌آمده از موتانت پایووردین (MPFM1) به‌عنوان شاهد استفاده شد. داده‌های حاصل با استفاده از منحنی استاندارد به‌دست‌آمده از پایووردین خالص به مول‌برلیتر تبدیل شدند. بدین منظور از پایوورین خالص‌سازی‌شدۀ سویۀ UTPF5 استفاده شد. تمام لوازم شیشه‌ای استفاده‌شده در این روش با اسیدهیدروکلریدریک 1/0 نرمال اسیدشویی شدند تا آلودگی‌های آهن زدوده شود (9).

محاسبات آماری: تجزیۀ واریانس و مقایسۀ میانگین صفات به‌روش حداقل تفاوت معنی‌دار[11] (05/0P < ) و با استفاده از روش مدل خطی[12] SAS، انجام گرفت. نرمال‌بودن پراکنش داده‌ها قبل از آنالیز آماری با نرم‌افزار SAS آزمایش شد (17).

 

نتایج.

.اندازه‌گیری میزان تولید سیدروفور در سویه‌ها

1-     روش CAS-Agar: معرف CAS، هنگامی که آهن به آن متصل است به‌رنگ آبی دید می‌شود و در صورتی که آهن آن جدا شود نارنجی‌رنگ می‌شود. چون اتصال CAS-Fe قوی نیست، هر عاملی که بتواند با گرفتن آهن این پیوند را بشکند باعث بروز رنگ نارنجی می‌شود، قطر هالۀ تغییر رنگ داده‌شده برآوردی تقریبی از مقدار آن ماده است (شکل 1). قابل توجه است که این محیط در مقابل هر ماده‌ای که خاصیت سیدروفوری داشته باشد جواب می‌دهد؛ بنابراین قطر هاله نمایانگر مجموع سیدروفورهای آن سویه است. از بین سویه‌های موردآزمایش سویۀ UTPF76 با هاله‌ای به‌قطر 4/20 میلی‌متر بیشترین تولید سیدروفور را داشت و به دنبال آن سویه‌های 7NSK2،UTPF45 و UTPF68قرار گرفتند که قطر هالۀ تولیدشده توسط آنها به‌ترتیب 13، 92/12 و 11 میلی‌متر بود. در جدول 1 قطر هالۀ تولیدشده توسط سویه‌های مختلف در سه روز متوالی و همراه با میانگین سه روز آورده شده است. همان‌طور که در جدول مشاهده می‌شود سویۀ MPFM1 که موتانت پایووردین است نیز هاله داده است؛ اما قطر این هاله در مقایسه با سویۀ وحشی (7NSK2) خیلی کمتر است. همان‌طور که در قسمت خصوصیات سویه‌ها گفته شد، در این سویه علاوه بر پایووردین که سیدروفور اصلی است دست کم دو سیدروفور دیگر به‌اسم پایوچلین و سالیسیلیک‌اسید نیز تولید می‌شوند که می‌توانند باعث ایجاد هاله شوند. باکتری باسیلوس مورداستفاده نیز قادر به تولید هاله‌ای ضعیف بود که رنگ هالۀ آن نیز با مابقی هاله‌ها متفاوت بود. سویۀ UTPF93 در محیط CAS-آگار رشد ضعیفی داشت و فاقد توان تولید سیدروفور بود.

 

 

 

شکل 1- تولید سیدروفور سویه‌ها در روش CAS-اگار. هالۀ نارنجی‌رنگ اطراف کلنی باکتری‌ها نشان‌دهندۀ میزان تولید سیدروفور کل آنها است. سویۀ 7NSK2 با عدد 95 و موتانت پایووردین آن (MPFM1) با عدد 94 نشان داده شده است.

 

 

2- روش CAS Agar Diffusion : بسیاری از باکتری‌های ریزوسفری به‌علت وجود مواد دترجنت HDTMA در محیط CAS-Agar فاقد توانایی رشد روی این محیط هستد؛ درنتیجه میزان تولید سیدروفور آنها به این روش قابل‌اندازه‌گیری نیست؛ بنابراین برای رفع این مشکل، این روش چند بار اصلاح شده است. شین و همکاران[13] (15) آزمونی را طراحی کردند که به جای کشت مستقیم باکتری روی محیط CAS از مایع رویی تولیدشده در محیط‌های اختصاصی آن گونه استفاده می‌شد. این آزمون در قسمت مواد و روش‌ها شرح داده شده است. نتایج به‌دست‌آمده از این روش دربارۀ بسیاری از سویه‌ها با روش قبلی متفاوت بود. سویۀ UTPF76 با تولیدی معادل 005/1 میلی‌گرم‌درلیتر دسفرال بیشترین میزان تولید را به خود اختصاص داد. سویه‌های UTPF92، UTPF87 و UTPF61 در گروه دوم قرار گرفتند؛ در صورتی که مقدار تولید آنها در روش قبلی پایین‌تر از میانگین بود (جدول 1). سویه‌های UTPF75 و UTPF86 که طبق روش قبلی تولید بالایی داشتند در این روش در گروه آخر آماری قرار گرفتند. باکتری UTPF93 که قادر به رشد مطلوبی روی محیط CAS-Agar نبود و لذا سیدروفوری تولید نکرد در این روش تغییریافته، هالۀ مشهودی تولید کرد و میزان تولید آن برابر340/0 میلی‌گرم‌درلیتر دسفرال بود. تولید در موتانت MPFM1 و باکتری باسیلوس خیلی ناچیز بود که مربوط به متابولیت‌های غیر از پایووردین است.

 

جدول 1- بررسی میزان تولید سیدروفور سویه‌های باکتری به‌روش‌های کمّی اسپکتروفتومتری، نیمه‌کمّی CAS-AD و کیفی CAS-Agar

 

 

 

روش اسپکتروفتومتری

روش CAS-AD

روش

CAS-Agar

سویه باکتری

محل

نمونه‌برداری

میزبان

میکرومول

پیووردین

معادل دفروکسامین

میلی‌گرم در لیتر

قطر هاله میلی‌متر

UTPF5

کرج

ترپچه

c 05/487

fg 442/0

d 15/10

UTPF10

کرج

گندم

c 82/448

gh 338/0

c 88/10

UTPF45

خمین

لوبیا

g 11/280

026/0 j

13 b

UTPF54

خمین

لوبیا

hi 31/199

455/0 fg

8 jk

UTPF59

قره تپه

پیاز

k 88/95

hi 237/0

h 26/9

UTPF61

الموت

برنج

c 82/498

bcd 647/0

j 48/8

UTPF68

ساری

ترپچه

h 06/230

48/0 ef

11 bc

UTPF75

الموت

برنج

kl 41/69

fg 440/0

d 23/10

UTPF76

الموت

برنج

h 11/234

a 005/1

a 4/20

UTPF81

قسین رود

برنج

b 590

fg 442/0

d 20/10

UTPF82

الموت

برنج

e 76/351

cde 595/0

d 18/10

UTPF83

الموت

برنج

ij 82/148

gh 338/0

g 38/9

UTPF84

کرج

گندم

ef 23/328

g 365/0

f 58/9

UTPF85

گازرخان

برنج

g 17/281

def 544/0

e 94/9

UTPF86

شموک

برنج

i 41/169

gh 341/0

d 15/10

UTPF87

رازمیان

برنج

b 23/578

bc 698/0

e 98/9

UTPF88

رازمیان

برنج

h 240

ef 493/0

m 08/6

UTPF90

شموک

برنج

j 29/125

gh 329/0

k 73/7

UTPF92

الموت

برنج

l 58/60

b 749/0

fg 48/9

UTPF93

الموت

برنج

j 140

gh 340/0

o 0/0

UTPF96

کرج

گندم

f 52/313

fg 439/0

i 72/8

7NSK2

بلژیک

جو

a 29/625

ef 493/0

b 92/12

MPFM1

بلژیک

جو

m 0/0

ij 135/0

l 28/6

Bacillus sp.

کرج

گندم

m 0/0

j 050/0

n 82/3

 

 

3- روش اسپکتروفتومتری: در این روش به‌صورت اختصاصی، مقدار تولید سیدروفور نوع پایووردین قابل ارزیابی است. نتایج به‌دست‌آمده از میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر با استفاده از منحنی استاندارد پایووردین خالص به میکرومول‌برلیتر تبدیل شد. از بین سویه‌های موردآزمایش سویۀ 7NSK2 با تولید 29/625 مول‌برلیتر پایووردین بیشترین مقدار تولید را داشت و ازلحاظ آماری با سایر سویه‌ها اختلاف معنی‌داری نشان داد. به دنبال آن UTPF81، UTPF87 و UTPF61 به‌ترتیب با تولید 590، 23/578 و 82/498 میکرومول‌درلیتر در گروه بعدی قرار گرفتند. همان‌طور که انتظار می‌رفت موتانت MPFM1 فاقد توانایی تولید پایووردین بود. سویۀ باسیلوس مورداستفاده در این آزمایش نیز در 400 نانومتر پیک جذبی نداشت. سویۀ UTPF93 که در روش CAS-Agar سیدروفور تولید نکرده بود، قادر به تولید سیدروفور نوع پایووردین بود و توانست به‌میزان 140 میکرومول‌برلیتر پایووردین تولید کند.

سویۀ UTPF76 که در روش‌های قبل بیشترین تولید سیدروفور را داشت، در این روش جزء باکتری‌های برتر قرار نگرفت. همان‌طور که قبلاً گفته شد، روش اسپکتروفتومتری به‌صورت اختصاصی فقط قادر به تعیین کمیت سیدروفور نوع پایووردین است؛ چرا که سیدروفورهای مختلف طول موج‌های متفاوتی دارند؛ بنابراین می‌توان چنین فرض کرد که سویۀ ذکرشده علاوه بر پایووردین قادر است سیدروفورهای دیگری را در حجم بالا تولید کند که عامل گسترش هالۀ نارنجی در محیط CAS- آگار هستند.

درنتیجه از روی اختلافات موجود بین داده‌های روش‌های CAS-Agar و روش اسپکتروفتومتری می‌توان به تولید و مقدار تولید سیدروفورهای غیر از پایووردین در سویه‌های سودوموناس فلورسنس پی برد.

 

بحث و نتیجه‏‏گیری.

روش قدیمی تشخیص میکروارگانیسم‌های تولیدکنندۀ سیدروفور که شاون و نیلند (9) معرفی کرده بودند به‌علت وجود مادۀ HDTMA مانع رشد باکتری‌های گرم‌مثبت و قارچ‌ها می‌شد (17). روش تغییریافتۀ میلارگس[xiv] و همکاران (18) که در آن نصف تشتک‌های پتری را محیط کشت و نصف دیگر را محیط CAS می‌ریختند مشکل بازداری از رشد روش قبلی را حل می‌کرد؛ اما این روش بسیار کاربر بود و کند جواب می‌داد؛ علاوه بر این، با این روش فقط یک نوع میکروارگانیسم قابل بررسی بود. از بین روش‌های دیگری که ارائه شد (15، 19 و 20) روش CAS-AD بهتر از سایر روش‌ها توانست مشکلات موجود را حل کند. در روش CAS-AD باکتری‌ها در محیط اختصاصی خود رشد می‌کنند و فقط از عصارۀ خارج سلولی آنها برای اندازه‌گیری سیدروفور استفاده می‌شود (15). در این روش میزان تولید سیدروفور تمام میکروارگانیسم‌های قابل‌کشت قابل‌اندازه‌گیری است. همچنین به‌صورت هم‌زمان می‌توان میزان تولید سیدروفور میکروارگانیسم‌های متفاوت را با هم مقایسه کرد. داده‌های به‌دست‌آمده از این روش با استفاده از سیدروفور تجاری دسفرال قابل‌کمّی‌سازی است.

تفاوت معنی‌دار بین تولید سیدروفور سویه‌ها در دو روش CAS-Agar و CAS-AD نشان می‌دهد که اگرچه اغلب سویه‌ها قادر به رشد روی محیط CAS بودند ولی این بهینه رشدی آنها نیست؛ به عبارت دیگر، میزان رشد و تولید سیدروفور هریک از سویه‌ها مقداری تحت تأثیر مواد دترجنت محیط قرار می‌گیرد. درمجموع می‌توان گفت که روش CAS-Agar معمولی روشی مناسب برای بررسی میزان تولید سیدروفور میکروارگانیسم‌ها نیست و بهتر است از روش‌های جایگزین اصلاح‌شده استفاده شود. به هرحال، تهیۀ محیط CAS کاری زمان‌بر و حساس است و با کوچک‌ترین خطا در تنظیم pH محیط، رنگ آن عوض شده و غیرقابل‌استفاده می‌شود (15)؛ بنابراین بهتر است روش‌های جایگزین ارائه شوند. ازآنجاکه پایووردین مهم‌ترین سیدروفور سودوموناس‌های فلورسنت است که در مقایسه با سایر انواع از میزان تولید و قدرت باندشدن با آهن بالاتری برخوردار است (21)، اندازه‌گیری دقیق آن به‌صورت مجزا می‌تواند در مشخص‌کردن توان سویۀ باکتری در فراهم‌کردن آهن موردنیاز گیاه و کنترل رقابتی بیمارگرها استفاده شود. خاصیت فلورسنت سیدروفور در طول موج 400 نانومتر امکان ارزیابی کمّی آن با روش اسپکتروفتومتری را فراهم کرده است (22)؛ علاوه بر این، اختلاف بین داده‌های به‌دست‌آمده از روش اسپکتروفتومتری با روش CAS-AD به‌شرط یکسان‌بودن شرایط کشت می‌تواند نشان‌دهندۀ میزان تولید سیدروفورهای غیر از پایووردین توسط سویۀ باکتری باشد. همان‌طور که برای سویۀ UTPF76 شرح داده شد، درمورد سویۀ 7NSK2 نیز مشخص است که میزان تولید سیدروفورهای به غیر از پایووردین بسیار پایین است؛ چرا که در روش اسپکتروفتومتری که فقط سیدروفور نوع پایووردین را نشان می‌دهد در رتبۀ اول قرار گرفته؛ اما در روش CAS-AD که تولید همۀ سیدروفورها را اندازه‌گیری می‌کند در گروه با تولید متوسط قرار می‌گیرد. میزان تولید سیدروفورهای غیر از پایووردین توسط سویۀ MPFM1 نیز گواه این مطلب است. درمجموع می‌توان روش CAS-AD را به‌عنوان بهترین روش برای اندازه‌گیری میزان تولید سیدروفور کل سویه‌ها و روش اسپکتروفتومتری را به‌عنوان روش مناسب برای اندازه‌گیری تولید سیدروفور نوع پایووردین ارائه داد.



[1]- Enterobacteriaceae

[2]- Rhizobium

[3]- Meyer and Abdallah

[4]- Schwyn and Neilands

[5]- Chrome Azurol S

[6]- Hexadecyltrimethylammonium bromide

[7]- CAS agar diffusion

[8]- PG-Instrument

[9]- Alexander and Zuberer

[10]- Tryptic soy agar

[11]- Least significant difference

[12]- General linear model (SAS 9.1, SAS institute, Cary, NC)

[13]- Shin

[xiv]- Milagres

(1) Lindsay WL. Chemical equilibria in soils. New York: Wiley; 1979.

(2) Salamian N., Ebrahimipour G., Ghasemi M., Fakhari J. Isolation and characterization of a Facultative chemolithotrophic sulfur and iron oxidizing bacterium from Ardabil acidic springs. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (1):1-10.

(3) Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads. FEMS Microbiology Review 1993; 104 (3, 4): 209–228.

(4) Crowley D. Microbial Siderophores in the Plant Rhizosphere. In: Barton LL., Abadía J., Editor. Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms. Netherlands: Springer; 2006: 169–198.

(5) Fernandez V., Ebert G., Winkelmann G. The use of microbial siderophores for foliar iron application studies. Plant and Soil 2005; 272 (1, 2): 245–252.

(6) Meyer JM., Abdallah MA. The fluorescent pigment of Pseudomonas fluorescens: biosynthesis, purification and physico-chemical properties. Journal of General Microbiology 1978; 107 (2): 319–328.

(7) Sharifi R., Ahmadzade M., Sharifi-Tehrani A., Fallahzade V. Competition for iron uptake by fluorescent pseudomonads to control Rhizoctonia solani Kühn, a causing agent of bean damping-off disease. Journal of Plant Protection 2009; 22 (2): 183-196.

(8) Vansuyt G., Robin A., Briat JF., Curie C., Lemanceau P. Iron Acquisition from Fe-Pyoverdine by Arabidopsis thaliana. Molecular Plant Microbe Interaction 2007; 20 (4): 441–447.

(9) Schwyn B., Neilands JB. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry 1987; 160 (1): 46–56.

 

 

(10)           Rasouli-Sadaghiani MH., Khavazi K., Rahimian H., Malakouti MJ., Asadi-rahmani H. An evaluation of potential of indigenous fluorescent Pseudomonads of wheat rhizosphere for producing siderophore. Soil and water Journal 2006; 20: 133-143.

(11)           Hofte M., Seong KY., Jurkevitch E., Verstraete W. Pyoverdin production by the plant growth beneficial Pseudomonas strain 7NSK2: Ecological significance in soil. Plant and Soil 1991; 130 (1, 2): 249-257.

(12)           Kim DS., Cook RJ., Weller DM. Bacillus sp. L324-92 for biological control of three root diseases of wheat grown with reduced tillage. Phytopathology 1997; 87(5): 551-558.

(13)           Sharifi R., Ahmadzadeh M., Sharifi-Tehrani A., Talebi-Jahromi K. Pyoverdine production in Pseudomonas fluorescens UTPF5 and its association with suppression of common bean damping off caused by Rhizoctonia solani (Kühn). Journal of Plant Protection Research 2010; 50(1): 72-78.

(14)           Alexander DB., Zuberer DA. Use of chrome azurol S reagents to evaluate siderophore production by rhizosphere bacteria. Biology and Fertility of Soils 1991; 12(1): 39-45.

(15)           Shin SH., Lim Y., Lee SE., Yang NW., Rhee JH. CAS agar diffusion assay for the measurement of siderophores in biological fluids. Journal of Microbiological Methods 2001; 44(1): 89–95.

(16)           Kamaly A., Ahmadzadeh M., Sadeghi A., Karimi E. Effect of exogenous ectoines on some antifungal activity of Pseudomonas fluorescens UTPF5 under salt conditions. Biological Journal of Microorganism 2016; 17:1-10.

(17)           Perez-Miranda S., Cabirol N., George-Téllez R., Zamudio-Rivera LS., Fernández FJ. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods 2007; 70(1): 127–131.

(18)           Milagres AM., Machuca A., Napoleao D. Detection of siderophores production from several fungi and bacteria by a modification of chrome azurol S (CAS) agar plate assay. Journal of Microbiological Methods 1999; 37(1): 1–6.

(19)           Ames-Gottfred NP., Christie BR., Jordan DC. Use of the chrome azurol S agar plate technique to differentiate strains and field isolates of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Applied Environmental Microbiology 1989; 55: 707–710.

(20)           Machuca A., Milagres AMF. Use of CAS-agar plate modified to study the effect of different variables on the siderophore production by Aspergillus. Letters in Applied Microbiology 2003; 36(3): 177–181.

(21)           Cornelis P., Matthijs S. Pseudomonas siderophores and their biological significance. In: Varma A., Chincholkar S., Editors. Microbial Siderophores. Berlin: Springer-Verlag; 2006: 230-254.

(22)           Castaneda GC., Munoz TJJ., Videa JRP. A spectrophotometric method to determine the siderophore production by strains of fluorescent Pseudomonas in the presence of copper and iron. Microchemical Journal 2005; 81(1): 35– 40.