جداسازی، تعیین هویت وتهیۀ الگوی ژنومی باکتری‌های عضوکمپلکس مایکوباکتریوم‌توبرکولوزیس از گاو های توبرکولین مثبت استان قم با روش PGRS RFLP

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ساوه، ساوه، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریوم های بیماری‌زای دام - موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی(تات)، کرج، ایران

3 استاد میکروبیولوژی دانشگاه تهران، گروه زیست‌شناسی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: مایکوباکتریوم‌بویس عامل اصلی ایجاد سل در گاوها است. در مطالعۀ حاضر یافته‌های مربوط به جداسازی، تعیین هویت وتهیۀ الگوی ژنومی باکتری‌های عضوکمپلکس مایکوباکتریوم‌توبرکولوزیس (MTbC) از گاوهای توبرکولین مثبت استان قمباروشRFLPبااستفادهازپروبPGRSبررسیشدهاست. ‏‏
مواد و روش‏‏ها: از دی 1391 تا بهمن 1392 غدد لنفاوی اصلی سر و تنه لاشۀ 30 رأس گاو توبرکولین مثبت استان قم بر روی محیط لونشتاین ـ جانسون گلیسرینه و پیروات‌دار کشت و 8 تا 12 هفته در C° 37 نگهداری شدند. بر تمام لوله‌های کشت دارای رشد باکتریایی اسید فست، PCR-IS6110اجرا شد و جدایه‌های عضو MTbC به‌روشRFLP-PGRSژنوتایپ شدند.
نتایج: در 21 نمونه در آزمایش PCR-IS6110 وجود MTbC تأیید شد و در RFLP-PGRS در مجموع سه تیپ ژنتیکی شناسایی شد.
بحث و نتیجه‏گیری: آلودگی گله‌های گاو در استان قم به MTbC اهمیت خطر احتمالی انتقال بیماری به میزبان‌های انسانی را نشان می‌دهد. شناسایی سه تیپ ژنتیکی در میان 21 جدایۀ استان قم ضمن نشان‌دادن فعالیت سویه‌های مختلف MTbC در منطقه، وجود تنوع ژنتیکی این باکتری‌ها را در استان قم نشان می‌دهد که تعیین میزان گستردگی آن نیازمند به انجام پژوهش‌های تکمیلی خواهد بود. با درنظرگرفتن تنوع ژنتیکی حاضر در جمعیت MTbC در استان قم، به نظر می‌رسد برنامۀ در حال اجرای تست و کشتار در این استان نیازمند بازنگری و تقویت مبانی راهبردی در اجرا باشد.‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation, Identification and genomic pattern of Mycobacterium tuberculosis from tuberculin positive cattle from Qom province with RFLP metod by PGRS prob

نویسندگان [English]

  • Sina Nimrooz 1
  • Nader Mosavari 2
  • Taghi Zahraei Salehi 3
1 M.Sc Student of Microbiology, Islamic Azad university, Saveh, Iran
2 Assistant professor of Reference Laboratory for Bovine Tuberculosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
3 Professor of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction:Mycobacterium bovis is the principal cause of bovine tuberculosis in bovids. In the present work, isolation, identification and genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex (MTbC) isolates collected from slaughtered reactor (tuberculine-positive) cattle in Qum province using RFLP-PGRS are addressed.
Materials and methods: From January 2012 to February 2013, major head and trunk lymph nodes from a total of 30 carcasses originating from reactor cattle were collected at Qum abbatoir. These were all cultured on gycerinated and pyruvated Lowenstein-Jensen slopes and incubation at 37°C 8-12 weeks. Slopes bearing acid-fast bacterial growth were subjected PCR-IS6110 in searching for MTbC isolates. The identified MTbC complex isoltes were strain typed by RFLP-PGRS.
Results: Totally, PCR-IS6110 experiment detected MTbC in 21 specimens. Genotyping these by RFLP-PGRS resulted characterization of 3 different genotypes.
Discussion and conclusion: Isolation of MTbC bacteria from tuberculinated cattle of Qum province raises public health concern due to the likely transmission of infection to human subjects. Identification of three RFLP-PGRS types between the 21 collected isolates from Qum is a reflection of co-existence of different MTbC strains and genetic diversity in the region, the extent of this diversity however, remains to be assessed by further epidemiological works. Taking the current level of genetic diversity between MTbC bacteria in Qum into account, re-consideration of the existing test-and-slaughter scheme seems necessary.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mycobacterium tuberculosis complex
  • Genomicfingerprinting
  • RFLP
  • PGRS
  • Bovine tuberculosis

مقدمه.

سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم‌بویس از قدیمی‌ترین و مهم‌ترین بیماری‌های شناخته‌شدۀ مشترک بین انسان و دام است که قدمت آن را به‌اندازۀ حیات بشریت می‌دانند (1). این بیماری از تمام جهان به‌جز قطب جنوب گزارش شده است. در بسیاری از کشورهای جهان هرساله مبالغ هنگفتی بودجه صرف اجرای برنامه‌های ریشه‌کنی سل گاوی در دام‌ها می‌شود.

با معرفی دانش مولکولار اپیدمیولوژی و بهره‌گیری از تکنیک‌های ژنوتایپینگ جدایه‌های مایکوباکتریوم‌بویس امکان ارزیابی دقیق‌تر برنامه‌های کنترل بیماری، شناسایی ارتباط فیلوژنتیکی میان سویه‌ها، ارتباط میان میزبان‌های مختلف و نقش حیوانات ناقل و همچنین ردیابی منشأ آلودگی فراهم شده است (1، ۲ و ۳). ایران با داشتن حدود 5/8 میلیون رأس گاو و اجرای بیش از 2/1 میلیون نوبت تست سل در هر سال، همچنان به‌عنوان بزرگ‌ترین کشور اجراکنندۀ برنامۀ تست و کشتار علیه سل گاوی در منطقۀ خاورمیانه شناخته می‌شود (1). با وجود اینکه فراوانی موارد گزارش سل گاوی در سطح گله‌ها و همچنین تعداد دام‌های مبتلا در هر گله، کاهش درخورتوجهی داشته است، براساس گزارش‌های سالیانۀ سازمان دامپزشکی کشور و درنتیجۀ اجرای این برنامه، سل گاوی تقریباً در هیچ یک از مناطق جغرافیایی دامپروری مهم ایران ناپدید نشده است؛ علاوه بر این، مشاهدۀ موارد سل سرتاسری در لاشه‌های گاو ذبح‌شده در برخی از واحدهای کشتارگاه کشور همچنان بر کافی‌نبودن اقدامات در حال انجام در کنترل بیماری اشاره دارد. نقل و انتقالات و خرید و فروش دام‌ها به‌صورت غیرمجاز بین واحدهای گاوداری، مراتع، بازارهای دام و کشتارگاه از جملۀ اصلی‌ترین راه‌های انتقال بیماری و شکست برنامۀ کنترل سل در تمام جهان شناخته شده‌اند (2-4).

در این پژوهش با استفاده از تکنیک RFLP-PGRS تنوع ژنتیکی موجود در جمعیت جدایه‌های مایکوباکتریومتوبرکلوزیس کمپلکس جمع‌آوری‌شده از گاوهای توبرکولین مثبت استان قم بررسی شده است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

جمع‌آوری نمونه: در مطالعۀ حاضر تعداد 30 جدایه جمع‌آوری شده از غدد لنفاوی و نمونه‌های پاتولوژیک لاشۀ گاوان توبرکولین مثبت کشتارشده در استان قم بررسی شد. این دام‌ها به‌دنبال اجرای عملیات توبرکولیناسیون در 4 واحد گاوداری در شهرستان قم به‌عنوان دام راکتور(توبرکولین مثبت) شناسایی شدند و در بازۀ زمانی دی 1391 تا بهمن 1392 به دو واحد کشتارگاه در سطح استان اعزام و ذبح گردیدند. عقده‌های سر (رتروفارنژیال)، لنفاوی تنه (مدیاستینال، برونشیال، مزانتریک) و نمونه‌های پاتولوژیک نظیر ضایعات احتمالی در ریه و کبد و طحال (در صورت مشاهده) در کشتارگاه جمع‌آوری شدند و پس از بسته‌بندی در ظرف نمونه‌برداری مناسب و ثبت مشخصات با رعایت زنجیرۀ سرد به مؤسسه رازی کرج انتقال داده شدند.

کشت میکروبی بر روی محیط اختصاصی:  در آزمایشگاه با استفاده از مواد و وسایل استریل، ابتدا همۀ نمونه‌های مربوط به هر لاشه به‌صورت مجتمع توسط هاون آزمایشگاهی و ماسه بادی، سلایه و یکنواخت شد و سپس با استفاده از محلول آلودگی‌زدای هم‌حجم نمونه، شامل: مخلوط ان‌استیل‌ال‌سیستئین[i](5/0درصد)، هیدروکسیدسدیم (5/3 مولار) و سیترات‌سدیم (05/0 مولار) به‌مدت 15 دقیقه آلودگی‌زدایی شدند (5). حدود 5 میلی‌لیتر از بخش فوقانی مایع موجود در هاون به یک لوله یونیورسال منتقل شد و با استفاده از اسیدکلریدریک خنثی گردید و سپس در rpm3500 به‌مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. از رسوب به‌دست‌آمده برای تلقیح یک لوله کشت لونشتاین-جانسون گلیسیرین‌دار و یک لوله کشت لونشتاین-جانسون پیروات‌دار استفاده شد. لوله‌های کشت‌شده در دمای 37 درجه سانتیگراد برای 12 هفته به دور از نور نگهداری شدند.

آزمایش میکروسکوپی: از تمام لوله‌های کشت در پایان دورۀ انکوباسیون گسترش میکروسکوپی تهیه شد و پس از رنگ‌آمیزی به‌روش اسید فست، رنگ آنها بررسی شد.

ویژگی‌های رشد بر روی محیط کشت اختصاصی، مدت‌زمان لازم برای مشاهدۀ نخستین پرگنه‌های رشد و برخورداری از خصوصیت اسید فست بودن، به‌عنوان مؤلفه‌های مؤید هویت احتمالی جدایه‌های جمع‌آوری ‌شده به‌عنوان اعضای مایکوباکتریوم‌توبرکولوزیس کمپلکس در نظر گرفته شدند(6).

تعیین هویت : برای اطمینان از هویت جدایه‌ها از نشانگر اختصاصی IS6110 به‌روش PCR-IS6110 و بر مبنای روش پیشنهادی ونسولینگن[ii] استفاده شد (6). در این روش تولید یک قطعه به‌طول bp 245 در نتیجۀ آمپلیفیکاسیون ژنوم باکتری تحت‌بررسی نشان‌دهندۀ هویت آن به‌عنوان جدایۀ مایکوباکتریوم‌توبرکلوزیس کمپلکس است.

آزمایش PCR-IS6110: حجم هر واکنش PCR به‌میزان lµ 25 به‌گونه‌ای تنظیم شد که شامل lµ 15 محلول آمادۀ مصرف [iii](مرک آلمان)، 1 میکرولیتر از هریک از دو پرایمر INS-1 (5’CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC 3’) و INS-2 (5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’) ٬ 25/1 واحد آنزیم DNA پلیمراز،2 میکرولیتر نمونه template DNA و تا سقف 10 میکرولیتر از آب مقطر باشد. برنامۀ حرارتی اجرای PCR شامل یک مرحلۀ گرمایش مقدماتی (/3 m 94°C) و 35 چرخۀ آمپلی‌فیکاسیون سه‌مرحله‌ای مشتمل بر گرمایش اول (/1 m 94°C)، گرمایش دوم (/1 m 65°C) و گرمایش سوم (/1 m 72°C) بود که در پایان با یک مرحله گرمایش در دمای 72 درجه سانتیگراد به‌مدت 4 دقیقه خاتمه می‌یافت.

آزمایش RFLP-PGRS: استخراج ژنوم باکتری و اجرای RFLP براساس روش ون سولینگن صورت گرفت. به‌طور خلاصه، تودۀ رشدیافته بر روی 5-3 لوله کشت لونشتاین-جانسون متناسب با میزان رشد باکتری، در یک میکروفیوژ مجهز به واشر ضدنشت[iv] جمع‌آوری و توسط بن ماری محتوی آب مقطر در حال جوش غیرفعال شد. سوسپانسیون غیرفعال‌شده باکتری سپس تحت‌تأثیر لیزوزیم[v] و پروتکیناز K [vi]و[vii]CTABقرار گرفت. مادۀ ژنتیکی توسط کلروفورم استخراج شد. درمورد RFLP، ژنوم باکتری تحت‌تأثیر آنزیم PvuII در طول شب و در دمای 37 8°C هضم شد. قطعات به‌دست‌آمدۀ حاصل از هضم ژنوم توسط ژل الکتروفورز تفکیک شدند و به سطح یک غشای نایلون دارای شارژ مثبت منتقل و تثبیت شدند. برای هیبریدیزاسیون از پروب نشاندار PGRS (5' CGG CCG TTG CCG CCG TTG CCG CCG TTG CCG CCG) با دیگ اکسژنه[viii] استفاده شد که این مرحله در آون مخصوص هیبریدیزاسیون و درون بطری‌های ویژه در دمای °C65 انجام شد. پس از هیبریدیزاسیون غشا در معرض آنزیم الکالین‌فسفاتازگونژوگه با دیگ آنتی‌بادی[ix]قرار گرفت و به دنبال آن با افزودن BCIP/NBT به‌عنوان سوبسترای آنزیم، سیگنال‌های نوری حاصل احتمالی ظاهر شدند و تصاویر به‌دست‌آمده توسط یک اسکنر[x] تصویربرداری و ضبط شدند.

 

نتایج.

کشت میکروبی:  در کشت میکروبی و بررسی میکروسکوپی رشد مایکوباکتریایی در 21 مورد از 30 نمونه تأیید شد.

نتایج تعیین هویت به‌روش PCR-IS6110: همۀ 21 جدایۀ جمع‌آوری‌شده در این آزمایش با موفقیت قطعاتی به‌طول 245bp تولید کردند و بدین ترتیب هویت آنها به‌عنوان جدایه‌های کمپلکس مایکوباکتریوم‌توبرکلوزیس تأیید شد.

RFLP: اجرای آزمایش RFLP-PGRS بر 21 جدایه سبب شناسایی 3 تیپ ژنتیکی شد (تصویر 1). در بین این 3 ژنوتیپ دو مورد از نوع خوشه‌ای[xi] بودند به‌طوری که درمورد تیپ 1 تعداد 15 (43/71 درصد) جدایه و درمورد تیپ 2 تعداد 5 (81/33 درصد) جدایه تیپ ژنتیکی یکسانی را از خود نشان دادند. تیپ ژنتیکی سوم فقط در یک جدایه مشاهده شد و بر همین اساس، به‌عنوان یک تیپ منحصربه‌فرد[xii] شناخته شد. تیپ یک، فراوان‌ترین تیپ مشاهده‌شده در این پژوهش بود؛ در عین حال درمورد سویۀ فرانسوی Mycobacterium bovis BCG 17162P2، سویۀ واکسینال BCG مورداستفاده در ایران نیز مشاهده شد (شکل 1).

6

 

2

 

5

 

4

 

1

 

3

 

7

شکل 1- در تصویر فوق الگوی 1 با 2 و 6، و الگوی 3 با 4 و5 شباهت دارند و الگوی 7 منحصربه‌فرد است.

 

بحث و نتیجه‏‏گیری.

از سه ژنوتیپ شناسایی‌شده در مطالعۀ حاضر، فراوان‌ترین آنها تیپ شناخته‌شده‌ای است که به‌جهت اشتراک آن با تیپ ژنتیکی سویۀ واکسینال BCG به‌نام تیپ شبیه BCG[xiii]شهرت دارد. مطالعات انجام‌شدۀ قبلی که مصوری[xiv] (7) بر جدایه‌های گاوی مایکوباکتریوم‌توبرکولوزیس کمپلکس در ایران نشان داده‌اند در RFLP-PGRS تیپ ژنتیکی شبیه BCG در تمام ایران به‌صورت مشخص فراوان‌تر از تمام تیپ‌های دیگر یافت می‌شود. فراوانی مطلق یک یا تعداد محدودی از سویه‌های مایکوباکتریوم‌توبرکولوزیس کمپلکس با توجه به نبودِ طبیعی انتقال ژنتیکی عرضی[xv] در میان این پاتوژن‌ها (8-9) به‌عنوان تجلی پدیدۀ تشکیل ساختارهای کلونال[xvi] شناخته شده است (10). این ساختارها درواقع سویه‌هایی هستند که به‌صورت مشترک از یک سلول باکتریایی که حد مشترک همۀ آنها محسوب می‌شود اشتقاق و تکامل یافته‌اند. اگرچه مطالعات جدید در حال انجام وجود هیچ‌یک از سه ساختار کلونال شناخته‌شدۀ مایکوباکتریوم‌بوویس حال حاضر در جهان شامل(11) European 1 و African 1 و همچنین African 2 (تدین، اطلاعات منتشر‌نشده)[xvii] در فضای جغرافیایی ایران نشان نداده‌اند، غلبۀ بلامنازع سویه‌های شبیه BCG در ایران و از جمله در استان قم بنا بر احتمال بسیار زیاد از وجود یک و یا تعداد بیشتری ساختارهای کلونال در این کشور حکایت دارد که وجود آنها هنوز به اثبات نرسیده است.

موقعیت جغرافیایی استان قم در مجاورت استان تهران به‌گونه‌ای است که این استان را به یکی از مراکز اصلی نقل و انتقالات دام برای واحدهای گاوداری در کشور تبدیل کرده است. بدین ترتیب مشاهدۀ تیپ‌های ژنتیکی متفاوت با سه نوع گزارش‌شده در این پژوهش در صورت انجام مطالعات مشابه و مشارکت واحدهای دامپروری بیشتر، خارج از انتظار نخواهد بود. در بین روش‌های مولکولار ژنوتایپینگ[xviii] م. بوویس REA،  [xix]RFLP، اسپولیگوتایپینگ[xx] و در سال‌های اخیرتر[xxi]MIRU-VNTRعمومیت بیشتری دارند (12). توانایی و قدرت تشخیص افتراقی RFLP-PGRS در شناسایی تیپ‌های ژنتیکی م. بوویس حتی بالاتر از توانایی روش MIRU-VNTRشناخته شده است (۱۳). به نظر می‌رسد استفاده از روش‌های MIRU-VNTR و اسپولیگوتایپینگ بر نمونه‌های باکتری‌های جداشده در این پژوهش بتواند اطلاعات بهتری را دربارۀ ساختار ژنتیک جمعیت این پاتوژن‌ها در استان قم فراهم کند.



[i] -N-acetyl-L-cysteine

[ii] -Vansolinger

[iii] -PCR master mix

[iv] -O-ring

[v] -lysozyme

[vi] -Proteinase K

[vii] -Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

[viii] -Digoxigenin

[ix] -Dig antibody

[x]- (Cannon Laser BaseMF3110, Japan)

[xi] -Clustered

[xii] -Orphan

[xiii] -BCG-like

[xiv] -Mosavari

[xv] -Horizontal gene transfer

[xvi] -Clonal complexes

[xvii] -Tadayon (no information)

[xviii] -Restriction Endonuclease

[xix] -Restriction Fragment Length Polymorphism

[xx] -Analysis Spoligotyping

[xxi] -Mycobacterial Interspersed Repetitive-unit-Variable-Number Tandem-Repeat (MIRU-VNTR) typing

References

 

(1)              Tadayon K., Mosavari N., Feizabadi M. An epidemiological perspective on bovine tuberculosis spotlighting facts and dilemmas in Iran. Iranian Journal of Microbiology. 2013; 5(1): 1-13.

(2)              Wright D.M, Reid N., Montgomery W.I., Allen A.R., Skuce R.A., Kao R.R. Herd-level bovine tuberculosis risk factors: assessing the role of low-level badger population disturbance. Scientific reports 2015; 5: 13062.

(3)              Vial F., Miguel E., Johnston WT., Mitchell A., Donnelly CA. Bovine Tuberculosis Risk Factors for British Herds Before and After the 2001 Foot-and-Mouth Epidemic: What have we Learned from the TB99 and CCS2005 Studies. Transboundary and Emerging Diseases. 2015; 62(5):505-515.

(4)              More SJ., Radunz B., Glanville RJ. Lessons learned during the successful eradication of bovine tuberculosis from Australia. The Veterinary record 2015; 177(9): 224-232.

(5)              Goyal M., Lawn S., Afful B., Acheampong JW., Griffin G., Shaw R. Spoligotyping in molecular epidemiology of tuberculosis in Ghana. Journal of Infection 1999; 38(3): 171-175.

(6)              McLernon J., Costello E., Flynn O., Madigan G., Ryan F. Evaluation of mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat analysis and spoligotyping for genotyping of Mycobacterium bovis isolates and a comparison with restriction fragment length polymorphism typing. Journal of Clinical Microbiology. 2010; 48(12): 41-45.

(7)              Mosavari N., Feizabadi M., Jamshidian M., Shahpouri M., Forbes K., Pajoohi R., et al. Molecular genotyping and epidemiology of Mycobacterium bovis strains obtained from cattle in Iran. Veterinary Microbiology 2011; 151(1-2): 148-152.

 

(8)              Behr MA. Evolution of Mycobacterium tuberculosis. Advances in experimental medicine and biology 2013; 783: 81-91.

(9)              Smith NH., Gordon S. de la Rua-Domenech R, Clifton-Hadley R, Hewinson R. Bottlenecks and broomsticks: the molecular evolution of Mycobacterium. Nature reviews Microbiology 2006, 9(4): 670- 681.

(10)          Smith NH., The global distribution and phylogeography of Mycobacterium bovis clonal complexes. Infect Genet Evol Journal 2012; 12(4): 857-865.

(11)          Smith NH., Berg S., Dale J., Allen A., Rodriguez S., Romero B., et al. European 1: a globally important clonal complex of Mycobacterium bovis. Infect Genet Evol Journal 2011; 11(6): 1340-1351.

(12)          Ribeiro-Lima J., Enns E., Thompson B., Craft M., Wells S. From network analysis to risk analysis--An approach to risk-based surveillance for bovine tuberculosis in Minnesota, US. Preventive Veterinary Medicine 118(4): 328-340.

(13)          Michel AL.,  Hlokwe T., Coetzee M., Maré L., Connoway L., Rutten V., et al. High Mycobacterium bovis genetic diversity in a low prevalence setting. Veterinary Microbiology Journal 2008; 126(1-3): 151-159.