معرفی قارچ تحمل‌کنندۀ نمک Mucor circinelloides UTMC 5032 به‌منظور حذف ترکیبات هیدروکربنی نفت خام

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، بخش زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

چکیده

مقدمه: کاهش حلالیت هیدروکربن‌ها و اکسیژن در آب شور و همچنین کاهش تنوع میکروبی به‌سبب آثار بازدارندۀ نمک، باعث ماندگاری ترکیبات هیدروکربنی در محیط‌های شور می‌شود و پاکسازی زیستی این محیط‌ها با چالش زیادی همراه است‏. ‏‏
مواد و روش‏‏ها: در این پژوهش جداسازی قارچ‌های تجزیه‌کنندۀ نفت خام از خاک‌های مناطق شور آلوده به نفت ایران، انجام شد. در ادامه توانمندی هریک از جدایه‌ها ازنظر میزان حذف نفت خام در حضور50 گرم‌بر‌لیتر نمک طعام با روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی(TPH) اندازه‌گیری شد. همچنین میزان تحمل‌پذیری به نمک و میزان حذف نفت در حضور غلظت‌های مختلف نمکی با استفاده از سنجش‌های TPH، FTIR و اندازه‌گیری وزن خشک و نیز توانایی تولید بیوسورفاکتانت جدایۀ منتخب ارزیابی شد. درنهایت برترین جدایه با استفاده از روش‌های ریخت‌شناسی و مولکولی شناسایی گردید. ‏‏
نتایج: در مرحلۀ جداسازی، 15گونۀ قارچی به دست آمد. آزمون TPH در حضور نفت و نمک در این جدایه‌ها نشان داد که جدایۀ S-05 با حدود 60درصد حذف، بیشترین میزان حذف نفت در حضور50 گرم‌بر‌لیتر نمک، توانمندترین جدایه در حذف هیدروکربن‌های نفتی است. آنالیز FTIR حذف 90درصد ترکیبات آلیفاتیک را نشان داد. سنجش تولید بیوسورفاکتانت نیز نشان داد که این جدایه به‌طور کارآمدی در محیط نمکی و بدون نمک مولد ترکیبات فعال سطحی است. نتایج حاصل از شناسایی نشان داد که S-05 متعلق به گونۀ Mucor circinelloides است. ‏
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که جدایۀ تحمل‌کنندۀ نمک M. circinelloides UTMC5032 برای اولین بار به‌عنوان قارچی توانمند در جهت حذف زیستی خاک‌های شور آلوده به نفت گزارش شده است. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Introduction of halotolerant Mucor circinelloides UTMC 5032 for bioremediation crude oil hydrocarbons

نویسندگان [English]

  • Rezvan Heidarytabar 1
  • Ehsan Azin 2
  • Hamid Moghimi 3
1 M.Sc. of Microbial Biotechnology, Department of Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
2 M.Sc. student in Microbial Biotechnology, Department of Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Assistant professor in Microbiology, Department of Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Biodegradation of hydrocarbons in the saline environment is diminished due to the reduced solubility of hydrocarbons and oxygen and lower microbial diversity because of inhibitory effect of salt.
Materials and methods: In this research, fungi isolation was carried out from salty oil contaminated soil from different parts of Iran. Then, the ability of crude oil degradation was measured for each isolate in the presence of 50 g/l NaCl by total petroleum hydrocarbon (TPH) assay. The salt tolerance and crude oil degradation capacity of the selected isolate was evaluated in medium containing different salt concentration by analysis of TPH, FTIR and dried cell weight assay. Finally, the selected isolate was studied for biosurfactant production and identified using morphological and molecular approach.
Results: In this study, 15 different halotolerant fungal species were isolated. TPH assay in medium containing crude oil (1%) and salt (50 g/l) showed that the isolate S-05 with 60 % oil removal was the best strain. FTIR analysis revealed that 90% of aliphatic compounds were removed when treated with S-05. Biosurfactant production assay indicated that this strain can produce surface active compounds in presence and absence of salt. Molecular identification  confirmed that the S-05 belongs to Mucor circinelloides with 100% similarity.
Discussion and conclusion: Our results indicate that M. circinelloides UTMC 5032 is potent fungus for bioremediation in saline oil contaminated soils.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioremediation
  • Saline soils
  • Halotolerant fungi
  • Mucor circinelloides UTMC 5032

مقدمه.

فراورده‌های نفتی از پرمصرف‌ترین مواد شیمیایی در دنیای مدرن امروز محسوب می‌شوند. محصولات مشتق از نفت خام، منبع اصلی انرژی مورداستفاده در صنعت و زندگی روزمرۀ بشر هستند (1). روزانه مقادیر زیادی نفت و فراورده‌های نفتی، در حجم زیاد و از راه‌های مختلف به محیط‌زیست وارد می‌شود که آثار منفی و طولانی‌مدتی را بر منابع طبیعی و زندگی موجودات زنده به دنبال دارد (2). این آلودگی‌ها تهدید بزرگی برای حیات موجودات زنده و هم‌چنین سلامت انسان‌ها است. وجود این آلاینده‌ها تعادل اکولوژیکی را بر هم می‌زند که این عدمِ‌تعادل ممکن است تا سال‌ها در محیط باقی بماند (3). در این میان توجه به این نکته بسیار ضروری است که منشأ بسیاری از مخازن نفتی، محیط‌هایی با شوری بالا است. به عبارت دیگر، نفت خام به‌طور معمول با آب شور همراه است و معمولاً در مجاورت با محیط‌های آبی با شوری بالا و تبخیر زیاد یافت می‌شود. با توجه به فعالیت‌های صنعت نفت مانند حفاری، انتقال و پالایش نفت در این‌گونه مناطق، همواره احتمال آلودگی مناطق شور با آلاینده‌های نفتی اجتناب‌ناپذیر است (4). علاوه بر این، پساب خروجی بسیاری از تأسیسات نفتی دارای درصد بالایی نمک محلول است و همچنین آب خروجی از چاه‌ها معمولاً بیش از 10درصد و گاه در حد اشباع دارای نمک است که پس از جداسازی نفت از آن، میزان قابل‌توجهی ترکیبات آروماتیک در آن به جا می‌ماند. رهاسازی این پساب در محیط علاوه بر آلودگی هیدروکربنی، سبب افزایش شوری محیط می‌شود (5). بنابراین لازم است قبل از رهاسازی این پساب در محیط، بازیافت و تصفیه‌سازی انجام گیرد. تصفیۀ این‌گونه پساب‌ها با روش‌های متداول بسیار دشوار و گاه غیرممکن بوده و نیازمند توسعۀ روش‌های پاک‌سازی با قابلیت کاربرد در محیط‌های شور است (5 و 6). یکی از روش‌های اصلی در جهت حذف آلودگی‌های نفتی استفاده از توان میکروارگانیسم‌های زنده یا دراصطلاح پاک‌سازی زیستی[1] است (7). روش پاک‌سازی زیستیکه به‌طور معمول شامل تبدیل آلاینده‌ها به مواد غیرسمی با استفاده از فعالیت میکروارگانیسم‌ها است، فرایند بسیار امیدوارکننده‌ای برای تیمار آلودگی‌های نفتی به شمار می‌رود (7 و 8)؛ اما در این راستا، در پاک‌سازی زیستی محیط‌های آلوده به نفت مناطق شور بسیاری از انواع میکروارگانیسم‌ها توانایی تحمل تنش شوری و سمیت نفت را ندارند و پاک‌سازی زیستی به‌کندی صورت می‌گیرد. درواقع با توجه به کاهش حلالیت هیدروکربن‌ها و اکسیژن در آب شور و کاهش تنوع میکروبی به‌سبب آثار بازدارندۀ نمک، ترکیبات هیدروکربنی در محیط‌های شور، ماندگاری بالایی دارد و پاک‌سازی این‌گونه مکان‌های آلوده با روش‌های زیستی متداول مقدور نیست و نیازمند استفاده از میکروارگانیسم‌های با توان تحمل‌کنندگی نمک است. این امر سبب شده که زیست‌پالایی آلاینده‌های نفتی در محیط‌های شور به‌سختی انجام گیرد که تاکنون کمتر به آن پرداخته شده است (9 و 10). علاوه بر این، تاکنون محدودۀ پژوهش‌های انجام‌شده در این زمینه بر باکتری‌ها تمرکز داشته؛ حال آنکه پاک‌سازی زیستی این محیط‌ها با استفاده از قارچ‌ها به‌علت وجود توانمندی‌های خاص موجود در این میکروارگانیسم‌ها و نیز برتری آنها در برخی موارد نسبت به باکتری‌ها در پژوهش‌های مختلف تا حدودی نادیده گرفته شده است؛ در این راستا، می‌توان به قارچ‌ها اشاره کرد که در برخی از شرایط محیطی سخت مثل فشار اسمزی بالا و یا خشکی و یا pH پایین نسبت به باکتری‌ها مقاومت و فعالیت بیشتری دارند؛ علاوه بر این، گزارش‌های متعددی دربارۀ برخی از قارچ‌ها منتشر شده است که نشان می‌دهد که این قارچ‌ها، میکروارگانیسم‌های توانمندی در تجزیۀ ترکیبات هیدروکربنی هستند که علت این توانمندی بالا ترشح آنزیم‌های خارج سلولی از قبیل لاکاز، لیگنین پراکسیداز و منگنز پراکسیداز است (11). بنابراین هدف از انجام این پژوهش در گام نخست غربالگری جدایه‌های قارچی توانمند در تحمل نمک از مناطق شور آلوده به آلاینده‌های نفتی و دستیابی به جدایۀ قارچی بومی توانمند در تولید ترکیبات فعال زیستی و حذف ترکیبات نفتی است که برای این منظور بعد از جداسازی و غربالگری جدایه‌های قارچی، با استفاده از روش‌های استاندارد تولید ترکیبات سورفکتانتی و حذف آلاینده‌های نفتی در حضور نمک برای بهترین ایزولۀ قارچی بررسی شد.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

جمع‌آوری نمونه: نمونه‌های خاک از 4 منطقۀ آلوده به نفت شامل قم، پوند 3 پالایشگاه نفت تهران، منطقۀ نفتی مارون و جزیرۀ سیری جمع‌آوری و سریعاً به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه‌ها در آزمایشگاه با الک 5/0 میلی‌متر همگن شد و ذرات درشت آن جداسازی شد. در ادامه اسیدیته و هدایت الکتریکی خاک‌ها به‌منظور بررسی شوری خاک اندازه‌گیری و جهت جداسازی قارچ‌ها استفاده شد (12).

.جداسازی قارچ‌های تخریب‌کنندۀ ترکیبات نفتی: جدایه‌های قارچی موجود در نمونه‌های خاک با استفاده از دو روش غنی‌سازی[2] و کشت در پلیت[3] جداسازی و خالص‌سازی شد. برای این منظور در روش غنی‌سازی، جهت فعال‌کردن و سازگاری جمعیت‌های قارچی تخریب‌کنندۀ ترکیبات نفتی خاک، از محیط تغییریافتۀ پایۀ نمکی[4] همراه با یک‌درصد نفت خام سبک جزیرۀ سیری به‌عنوان منبع کربن و50 میکروگرم بر میلی‌لیترکلرامفنیکل به‌منظور مهار رشد باکتریایی و 50 گرم‌بر‌لیتر نمک استفاده شد (13). ترکیبات این محیط کشت شامل(گرم‌بر‌لیتر):  NaNO3(2)، CaCl2.2H2O (1/0)، KH2PO4(3)، MgSO4 (2/0)، FeSO4.7H2O (01/0)،Na2HPO4.12H2O (3)، KCl(1) و عصارۀ مخمر (02/0) در یک لیتر آب مقطر دیونیزه، همراه با 2 میلی‌لیتر محلول عناصر جزئی شامل )گرم‌برلیتر(: FeCl3.6H2O (08/0)، ZnSO4.H2O (75/0)، CoCl2.6H2O (08/0)، CuSO4.5H2O (075/0)، MnSO4.H2O (75/0)، NaMoO4.2H2O (05/0)، H3BO3 (15/0) بود. pH اولیه پیش از اتوکلاو 2/0±8/6 تنظیم شد (14). ارلن‌های غنی‌سازی از نمونه‌های خاک همگن‌شده به‌مدت سه هفته در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سانتیگراد و 180 دور بر دقیقه گرماگذاری شد. بعد از این مدت 100 میکرولیتر از محیط غنی‌شده بر روی محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز آگار[5] و سابرودکستروز آگار[6]  دارای کلرامفنیکل و 1درصد نفت خام و 50 گرم‌برلیتر نمک پخش و به‌مدت دو هفته در انکوباتور گرماگذاری گشت. پس از این مدت جدایه‌های قارچی حاصله بر روی محیط کشت PDA خالص‌سازی شد. علاوه بر روش ذکرشده از روش کشت گسترده در پلیت نیز برای جداسازی قارچ‌های نفت‌خوار استفاده شد. برای این منظور ابتدا از نمونه‌های خاک، رقت‌های2-10، 3-10 و 4-10 تهیه و سپس رقت‌های حاصله به‌مدت 15 دقیقه با استفاده از همزن مخلوط و سپس سونیکاسیون نمونه‌ها توسط دستگاه اولتراسونیک[7] انجام شد. درنهایت 100 میکرولیتر از هریک از رقت‌ها بر روی محیط‌های PDA و SDA دارای 50 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک همراه با 1درصد نفت خام و 50 گرم‌برلیتر نمک پخش شد. برای هریک از نمونه‌های خاک در 3 تکرار این عمل انجام شد. در ادامه برای رشد قارچ‌ها، پلیت‌های کشت داده شده در دمای 28 درجه سانتیگراد به‌مدت دو هفته در انکوباتور گرماگذاری شد (15).

سنجش میزان حذف نفت: جهت تعیین توانمندی جدایه‌های حاصله در حذف نفت خام در حضور50 گرم‌برلیتر نمک، هریک از جدایه‌ها با استفاده از روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی براساس روش رحمان[8] و همکاران از طریق اسپکتروفتومتری در طول موج 420 نانومتر ارزیابی شد و جدایۀ برگزیده حاصل از این مرحله برای ادامۀ آزمایش‌ها استفاده شد. برای این منظور، به ارلن‌ها هم‌حجم با محیط کشت، حلال تلوئن به منظور استخراج هیدروکربن‌های نفتی از محیط کشت و ورود به فاز آلی اضافه شد. برای جداسازی و تفکیک بهتر فاز آبی از آلی، مخلوط فوق برای مدت 5 دقیقه با استفاده از ورتکس به‌خوبی همزده و به‌مدت 15 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفوژ شود. در مرحلۀ بعدی فاز آلی حاوی هیدروکربن‌های نفتی جدا شد و میزان جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 420 نانومتر تعیین گشت. نهایتاً برای تعیین میزان حذف نفت، جذب نمونه‌های تیمار با نمونۀ کنترل مقایسه شد و میزان حذف گزارش گردید (16 و 17).

.تعیین بازده میزان تحمل‌پذیری نمک و میزان حذف: جدایۀ برتر ازنظر میزان تحمل‌پذیری نمک در غلظت‌های متفاوت نمکی شامل صفر، 25، 50، 75، 100، 150 و 200 گرم‌برلیتر نمک طعام در محیط کشت PDB در طی مدت یک هفته ارزیابی شد؛ در این راستا، اندازه‌گیری وزن خشک زیست‌توده به‌عنوان معیار تحمل‌پذیری نمک و رشد جدایه‌های قارچی استفاده شد. زیست‌تودۀ قارچی حاصله، از محیط با استفاده از کاغذ فیلتر واتمن شماره 1 جدا شد و به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای 105 درجه سانتیگراد خشک گردید. سپس وزن خشک به‌دست‌آمده براساس گرم‌درلیتر گزارش شد (18). با توجه به بهینۀ شرایط رشد قارچ منتخب در حضور نمک، جدایۀ قارچی در غلظت‌های متفاوت نمک همراه با 1درصد نفت خام در محیط پایۀ نمکی کشت شد و میزان حذف نفت و بیومس تولیدی سنجش شد.

.سنجش میزان حذف نفت با استفاده از طیف‌سنجی FT-IR: با توجه به اینکه گروه‌های هیدروکربنی در cm-1 2930 و cm -1 2960 دارای جذب هستند، میزان حذف نفت توسط طیف‌سنجی FT-IR بررسی و اندازه‌گیری دقیق شد (18)؛ برای این منظور جدایه‌های قارچی برگزیده در محیط کشت پایۀ نمکی همراه با 1درصد نفت خام و غلظت بهینۀ 25گرم‌برلیتر نمک کشت شد و در انتهای روز پانزدهم محتوای هیدروکربنی باقیمانده در محیط کشت با استفاده از حلال تتراکلریدکربن استخراج شد. در این روش هم‌حجم محیط، از حلال تتراکلرید کربن به فلاسک افزوده شد و محتوای فلاسک به‌مدت 5 دقیقه ورتکس شد و در ادامه به‌ مدت 15 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفوژ شد. در مرحلۀ بعدی فاز آلی حاوی هیدروکربن‌های نفتی جدا شد و در نهایت با استفاده از سل مایع، طیف‌سنجی FT-IR انجام شد. درنهایت میزان حذف نفت با توجه به نمونۀ شاهد تعیین شد (17).

.ارزیابی تولید بیوسورفاکتانت در حضور نمک: به‌منظور تشخیص تولید بیوسورفاکتانت و اثر آن در حذف نفت، در حضور 25 گرم‌برلیتر نمک و بدون نمک، جدایۀ منتخب در محیط پایۀ نمکی دارای روغن آفتابگردان با غلظت 5درصد کشت داده شد و محلول رویی کشت قارچی در طی مدت 12 روز با استفاده از روش‌های گسترش روغن و تنسیومتری حلقه دونوی[9] ارزیابی شد. این روش براساس اندازه‌گیری نیروی لازم برای جداکردن یک حلقۀ سیمی از سطح یا بین دو سطح است که این نیروی جداسازی متناسب با کشش بین سطحی است و می‌توان آن را با یک تنسیومتر اتوماتیک اندازه‌گیری کرد. در هربار اندازه‌گیری کشش سطحی آب مقطر و محیط کشت فاقد تلقیح نیز به‌عنوان شاهد سنجیده شد (5).

شناسایی جدایۀ قارچی: برای شناسایی جدایه‌های قارچی، ویژگی‌های ریخت‌شناسی آنها از قبیل شکل میسلیوم، آرایش اسپورها، آرایش و رنگ کلنی و پیگمان‌های تولیدی، ازطریق رنگ‌آمیزی با لاکتوفنل کاتن بلو و تهیۀ اسلاید کالچر و نیز با توجه به کلیدهای شناسایی ریخت‌شناسی بررسی شد (19). به‌منظور شناسایی مولکولی ابتدا جدایۀ منتخب در محیط PDB به‌مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سپس میسلیوم‌های قارچ با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا و بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته شد. در ادامه ازطریق شکستن فیزیکی با کمک روش کوبیدن زیست‌توده منجمد شد و با استفاده از ازت مایع، سلول‌ها شکسته شد و DNA آن به‌روش استخراج با فنل-کلروفرم جداسازی شد (20). در این روش ابتدا عصارۀ سلولی به‌دست‌آمده در میکروفیوژ با دور rpm 8000 به‌مدت 5 دقیقه قرار داده شد. سپس روشناور جدا‌شده که حاوی مولکول‌های DNA است، به یک ویال استریل منتقل شد. در این مرحله هم‌حجم روشناور، از مخلوط فنل-کلروفرم (به نسبت 1:1) به ویال افزوده شد. سپس ویال به‌مدت دو دقیقه تکان داده شد تا محتویات آن با هم مخلوط شود. در ادامه ویال در میکروفیوژ با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه قرار داده شد و پس از این مدت‌زمان به‌آرامی ویال از درون دستگاه خارج شد تا فازها با هم مخلوط نشوند و فاز رویی درون یک ویال استریل دیگر ریخته شد. در ادامه حجم تقریبی محتوای ویال تعیین شد و به‌میزان 1/0 آن محلول سدیم‌استات 3 مولار با pH برابر 5 و 3 برابر حجم تعیین شد و اتانول مطلق سرد افزوده شد. سپس ویال به‌مدت 30 دقیقه به فریزر با دمای 20- درجه سانتیگراد منتقل شد. در ادامه فاز رویی با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه جدا و دور ریخته شد و 700 میکرولیتر اتانول 70درصد به رسوب DNA افزوده شد و مجدداً با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد و فاز رویی موجود در ویال دور ریخته شد. درنهایت رسوب حاصل در 15 تا 20 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد. PCR توالی ناحیۀ فاصله‌انداز رونویسی‌شوندۀ داخلی[10] با پرایمرهای ITS1 و ITS4 (ITS1: 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′ و ITS4: 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) انجام شد. جهت اضافه‌کردن مواد به‌منظور انجام واکنش PCR، 1 میکرولیتر پرایمر رفت و 1 میکرولیتر پرایمر برگشت با غلظت 10 پیکومول به‌همراه 1 میکرولیتر از DNA قارچی با غلظت 40 نانوگرم به 5/12 میکرولیتر مخلوط آمادۀ شرکت آمپلیکون دانمارک[11] اضافه شد و حجم نهایی ویال با آب مقطر استریل به 25 میکرولیتر رسانیده شد. برنامۀ PCR به‌ شکل 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد تقلیب اولیه انجام شد و در ادامه 30 سیکل دمایی به‌ شکل 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، 30 ثانیه در 54 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام شد. درنهایت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد ویال گرمادهی شدند (جدول 1 و 2). محصول به‌دست‌آمده بعد از خالص‌سازی از روی ژل جهت تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. نتایج تعیین ترادف در بانک ژنی و ازطریق هم‌ردیفی توالی ارزیابی شد (20).

 

نتایج.

جمع‌آوری نمونه و جداسازی قارچ‌های تجزیه‌کنندۀ نفت: در این مطالعه از 4 منطقۀ آلوده به نفت نمونه‌برداری انجام و میزان شوری و pH نمونه‌ها اندازه‌گیری شد. pH تمام نمونه‌ها خنثی و براساس نتایج هدایت‌سنجی الکتریکی، بیشترین شوری به‌ترتیب مربوط به نمونه‌های خاک پوند پالایشگاه تهران و مارون بود و منطقۀ سیری و قم شوری متوسطی داشتند (جدول ۳). در ادامه با کشت نمونه‌های موردنظر با استفاده از دو تکنیک غنی‌سازی و گسترده در حضور نمک، 15 جدایۀ قارچی مختلف با ویژگی‌های ریخت‌شناسی متفاوت جداسازی شد.

 

جدول 1- برنامۀ دمایی PCR برای تکثیر ژن ITS

تکرار

زمان (دقیقه)

دما (درجه سانتیگراد)

مراحل واکنش

1

5

94

واسرشت‌شدن اولیه

30

5/0

94

واسرشت‌شدن

30

5/0

57

اتصال پرایمر

30

1

72

پلیمریزاسیون

1

5

72

پلیمریزاسیون نهایی

 

جدول 2- مواد استفاده‌شده در واکنش زنجیره پلیمراز

حجم (میکرولیتر)

اجزای واکنش PCR

متغیر وابسته به DNA استخراجی

آب مقطر استریل

1

پرایمر رفت[12]

1

پرایمر برگشت[13]

متغیر

DNA استخراج‌شده

5/12

Master mix

25

حجم کل

 

 

 

جدول 3- محل نمونه‌برداری و ویژگی‌های هریک از نمونه‌های آلوده به نفت جمع‌آوری‌شده

محل نمونه‌برداری

موقعیت

(ثانیه-دقیقه-درجه)

علت آلودگی

EC

(ds/m)

pH

قم

5/43 44 34 N:

6/43 53 50 E:

چشمۀ طبیعی نفت

9/7

62/7

سیری

51 54 25 :N

38 31 54 : E

پایانۀ اصلی صادرات نفت کشور

8/5

3/7

پوند 3 پالایشگاه تهران

12.7 31 35 : N

56.6 24 51 : E

حوضچۀ تبخیر پساب‌های پالایشگاه نفت

6/9

51/7

مارون

13 51 30 : N

19 50 49 : E

میدان نفتی در اهواز

10

9/7

 

 


سنجش میزان حذف نفت و رشد در جدایه‌ها: پس از خالص‌سازی، توانایی هریک از جدایه‌ها در حذف نفت و تولید زیست‌توده در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت خام و 50گرم‌برلیتر نمک طی مدت 15روز بررسی شد (شکل 1).

در این میان جدایۀ S-05 جداسازی‌شده از خاک آلوده به نفت منطقۀ مارون با بیش از 55درصد حذف نفت خام در غلظت 50 گرم‌بر‌لیتر نمک به‌عنوان توانمندترین جدایه در حذف نفت خام انتخاب شد (شکل 2).

 

شکل 1- توانایی حذف نفت خام جدایۀ S-05 در محیط کشت پایۀ نمکی در مقایسه با نمونۀ شاهد

 

 

شکل 2- درصد حذف نفت خام توسط جدایه‌های قارچی در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت همراه با غلظت 50 گرم‌بر‌لیتر نمک بعد از 15 روز

 

 

در ادامه، بررسی میزان تحمل‌پذیری نمک در این سویه در حضور غلظت‌های متفاوت نمک شامل صفر، 25، 50، 75، 100، 150 و 200 گرم‌برلیتر در محیط کشت PDB سنجش شد. نتایج گویای آن بود که با افزایش غلظت نمک میزان رشد قارچی نیز کاهش می‌یابد؛ با این حال، قارچ موردنظر تا غلظت 75 گرم‌برلیتر نمک کلرید سدیم رشد مناسبی را نشان داده و تا غلظت 150 گرم‌بر‌لیتر همچنان قادر به تولید زیست‌توده و تحمل نمک است (شکل 3).

شناسایی سویۀ منتخب: نتیجۀ انجام آزمایش‌های ریخت‌شناسی و نیز مولکولی لازم برای شناسایی جدایۀ S-05 از PCR و تعیین ترادف ژن ITS و مقایسۀ توالی به‌دست‌آمده در بانک ژنی نشان داد که جدایۀ S-05 با میزان شباهت 99درصد متعلق به Mucor circinelloidesاست. این جدایه در بانک ژنی با کد دستیابیKR263057 ثبت شد و با کد M. circinelloides UTMC 5032در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران ثبت و نگهداری شد. تصویر ماکروسکوپی و میکروسکوپی جدایه S-05 در شکل 4 مشاهده می شود (شکل4). رسم درخت فیلوژنی این جدایه نشان داد که این سویه بیشترین نزدیکی را به f. circinelloides M. circinelloidesدارد (شکل 5).

 

 

شکل 3- میزان تحمل‌پذیری نمک وتولید بیومس خشک در غلظت‌های مختلف نمک توسط جدایۀ S-05

ب)

 

الف)

شکل4- الف) مورفولوژی کلنی، ب) شمای میکروسکوپی M. circinelloides UTMC 5032

 

شکل 5- درخت فیلوژنی 5032 UTMC Mucor circinelloides با استفاده از پرایمرهای ITS، با الگوریتم اتصال- همسایگی برای هم‌ردیفی و تعیین فاصلۀ توالی‌ها و نیز نرم‌افزارهای مگا 5 نشان می‌دهد


.بررسی میزان حذف نفت در حضور غلظت‌های مختلف نمک: میزان حذف نفت خام توسط سویۀ منتخب در حضور غلظت‌های متفاوت نمک 0، 25،50، 75 و 100 گرم‌برلیتر همراه با 1درصد نفت خام سنجش شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که سویۀ M. circinelloides UTMC 5032در حضور نمک همچنان قادر به حذف ترکیبات نفتی است؛ ولی با افزایش میزان نمک قدرت تجزیه‌کنندگی نفت توسط این سویه کاهش می‌یابد (شکل6)؛ با این حال، همان‌طور که در شکل 6 نشان داده شده است، میزان حذف نفت و تولید زیست‌توده در غلظت 25 گرم‌برلیتر نمک نسبت به محیط بدون نمک تغییر معنی‌داری نشان نداده و این میزان نمک اثر بازدارندگی بر جدایۀ موردنظر نداشته و به‌میزان حدود 90درصد حذف ترکیبات نفتی در حضور 25 گرم‌برلیتر نمک توسط این جدایه انجام شده است. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نمک به غلظت 50 گرم‌بر‌لیتر 55درصد حذف و در غلظت‌های 75 و 100 گرم‌بر‌لیتر به‌ترتیب تنها 15 و 18درصد حذف نفت حاصل می‌شود (شکل 6).

 

 

 

شکل 6- درصد حذف نفت خام در M. circinelloides UTMC 5032در محیط کشت پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت همراه با غلظت‌های مختلف 0، 25، 50، 75 و 100 گرم بر لیتر نمک کلرید سدیم

 


طیف‌سنجی FTIR: در ادامه جهت بررسی و تخمین دقیق‌تری از حذف ترکیبات آلیفاتیک توسط سویۀ M. circinelloidesUTMC5032، در محیط پایۀ نمکی دارای 1درصد نفت خام در حضور 25 گرم‌برلیتر نمک و بدون نمک مورد آنالیز باقیماندۀ نفت خام با روش FTIR قرار گرفت. بررسی طیف به‌دست‌آمده از این روش نشان داد که پیک ایجادشده بین طول موج‌های cm-1 2960-2930 که مربوط به ترکیبات آلیفاتیک است در نمونه‌های کشت‌داده‌شده با سویۀ قارچی در حضور و عدمِ‌حضور نمک کاهش قابل‌توجهی را نشان می‌دهد که نشان از حذف این ترکیبات آلیفاتیکی توسط سویۀ قارچی دارد. نتایج حاصل از این سنجش و مقایسۀ آن با نمونۀ شاهد و تیمارنشده نشان داد که این ایزوله قادر به تجزیه و کاهش 90درصدی ترکیبات آلیفاتیک در حضور و نیز بدون حضور نمک بوده و این میزان نمک تغییر محسوسی در حذف ترکیبات آلیفاتیک نفتی ایجاد نکرده است (شکل 7).

 

 

شکل 7- طیف‌سنجی FTIR – مقایسۀ میزان کاهش ترکیبات آلیفاتیک توسط M. circinelloides UTMC 5032در حضور 1درصد نفت خام و 25 گرم‌برلیتر نمک و بدون حضور نمک

 


سنجش تولید بیوسورفاکتانت در حضور نمک: ارزیابی‌های انجام‌شده با استفاده از روش گسترش روغن نشان داد که سویۀ منتخب توانایی تولید ترکیبات فعال در سطح را دارد؛ به‌طوری که پس از تلقیح در محیط کشت نمکی حاوی روغن به‌عنوان تنها منبع کربن، سویۀ ذکرشده با تولید بیوسورفکتانت از روغن موجود در محیط استفاده کرده و به‌میزان قابل‌ملاحظه‌ای رشد می‌کند. با افزودن یک قطره از سوپرناتانت کشت قارچی در آزمون گسترش روغن، هالۀ شفاف به‌قطر 12 سانتیمتر در محیط بدون نمک و 6 سانتیمتر در حضور 25 گرم‌برلیتر نمک بعد از گذشت 6 روز از تلقیح ایجاد شد (شکل 8).

 

 

شکل 8- قطر هالۀ شفاف تولیدی در روش گسترش روغن در طی روزهای مختلف در محیط بدون نمک کلرید سدیم و دارای 25 گرم‌برلیتر نمک

 

اندازه‌گیری کشش سطحی سوپرناتانت کشت قارچی در روزهای مختلف با استفاده از روش تنسیومتری نیز نشان داد که میزان کشش سطحی محیط کشت از mN/m 45 به عدد mN/m 28 در محیط بدون نمک و mN/m 33 در محیط حاوی نمک کاهش‌یافته و سویه‌ای توانمند در تولید ترکیبات فعال سطحی طی تجزیۀ ترکیبات نفتی است (شکل 9).

 

 

 

شکل9- میزان کشش سطحی در طی روزهای مختلف در محیط بدون نمک و دارای 25 گرم‌برلیتر نمک

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

آلودگی محیط‌های شور به انواع ترکیبات آلایندۀ نفتی مشکلات زیست‌محیطی متعددی را برای انسان و سایر موجودات اکوسیستم‌ها ایجاد کرده و توسعه روش‌های پاک‌سازی زیستی با قابلیت کاربرد در شرایط شور از دیدگاه کاربردی بسیار مهم است؛ با وجود این، اطلاعات درخصوص تجزیۀ هیدروکربن‌ها در محیط‌های شور بسیار کم است (21). یک پاک‌سازی زیستی موفق نیازمند به جمعیت توانمندی از میکروارگانیسم‌ها در محل آلوده است که قادر باشند از ترکیبات نفتی به‌عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کنند و با تحمل شرایط تنش‌زای محیطی و تولید ترکیباتی مانند مواد فعال زیستی موجبات حذف آلاینده را از محیط زیست فراهم کنند (22). روش‌های پاک‌سازی زیستی در محیط‌های شور بسیار پیچیده‌تر و با کارآمدی کمتری نسبت به محیط‌های بدون این تنش انجام می‌گیرد. نمک به‌دلیل ایجاد حالت پلاسمولیز، بر متابولیسم میکروارگانیسم‌ها تأثیر می‌گذارد و کارآمدی حذف آلودگی را کاهش می دهد و پاک‌سازی را بسیار زمان‌بر می‌کند (17)؛ بنابراین برای پاک‌سازی این مناطق استفاده از میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست و یا تحمل‌کنندۀ نمک یک ضرورت است.

در میان پژوهش‌های انجام‌شده بر میکروارگانیسم‌های تجزیه‌کنندۀ ترکیبات نفتی، اطلاعات موجود درخصوص تجزیۀ هیدروکربن‌ها توسط قارچ‌ها به‌عنوان یک عامل بسیار مؤثر و توانمند در حذف ترکیبات نفتی و تحمل‌کنندۀ شرایط تنش‌زای محیطی بسیار کم است و نیازمند بررسی‌های بیشتر درزمینۀ یافتن و بررسی سازوکارهای حذف در این گروه از میکروارگانیسم‌ها است (23 و 24). در این پژوهش به‌منظور بررسی تجزیۀ هیدروکربن‌های نفتی در شرایط شور، در گام اول از خاک‌های مناطق شور آلوده به نفت ایران به‌منظور جداسازی قارچ‌های تجزیه‌کننده نمونه‌گیری و غنی‌سازی انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که سمیت آلاینده‌های نفتی و نیز شرایط شوری محیط از رشد جدایه‌های قارچی جلوگیری نمی‌کنند و آنها می‌توانند از ترکیبات نفتی موجود در محیط به‌عنوان منبع کربن و مواد غذایی برای رشد و تولید زیست‌توده استفاده کنند. آزمایشات حاکی از آن بود که با افزایش غلظت نمک توانایی جدایه‌های قارچی در حذف نفت کاهش می‌یابد. این موضوع با نتایج سایر پژوهشگران هم‌راستا است (21 و 25) که در ارتباط با کاهش تنوع و فعالیت متابولیکی جدایه‌های تخریب‌کننده در محیط‌های با شوری بالا هستند.

از میان 15 جدایۀ خالص‌سازی‌شده در این مطالعه سویۀ M. circinelloides UTMC 5032با توانایی حذف بیش از 55درصد نفت خام در محیط با شوری 50 گرم‌برلیتر و توانایی رشد و تولید زیست‌توده تا غلظت 150 گرم‌بر‌لیتر نمک به‌عنوان سویۀ منتخب تحمل‌کنندۀ نفت و نمک انتخاب شد (شکل 2 و ۴)؛ درحالی‌که بررسی توانمندی سایر جدایه‌های قارچی در حذف نفت در غلظت 50 میلی‌گرم‌برلیتر نمک نشان داد که این جدایه‌ها توانمندی کمتری نسبت به M. circinelloides UTMC 5032دارند و میزان حذف آنها بین 2 تا 40 درصد گزارش شده است. ابکوی[xiv] و همکاران در مطالعه بر قارچ‌های جداسازی‌شده از محیط دارای استرس شوری، دو قارچ Fusarium lateritiumو Drechslera sp. را به‌عنوان قارچ‌های تحمل‌کننده 10درصد نمک NaCl و توانمند در حذف ترکیبات نفتی معرفی کردند (26). در مطالعۀ دیگری نیز که بهنود[xv] و همکاران بر تخریب زیستی نفت خام از پساب‌های شور با استفاده از قارچ Phanerochaete chrysosporium انجام دادند، نشان داده شد که با افزایش غلظت نمک از 0 تا 40 گرم‌بر‌لیتر میزان حذف نفت از 50درصد به 20درصد کاهش می‌یابد (17). بررسی‌های FTIR باقیماندۀ هیدروکربن‌های نفتی توسط سویۀ M. circinelloides UTMC 5032نشان داد که بیش از 90درصد ترکیبات آلیفاتیک بعد از گذشت 12روز در محیط بدون نمک و نیز 25 گرم‌بر‌لیتر نمک توسط این سویه تجزیه شده‌اند و وجود این میزان نمک بر حذف نفت تأثیر بسزایی نداشته است (شکل 7).

 پژوهش‌های زیادی در رابطه با توانایی میکروارگانیسم‌های تجزیه‌کنندۀ ترکیبات نفتی و ارتباط آن با تولید بیوسورفاکتانت انجام شده است؛ با این حال، پژوهش‌های اندکی بر آثار مهارکنندگی نمک بر رشد و تولید بیوسورفاکتانت و نیز ارتباط میان غلظت نمک و میزان آثار بازدارندگی حذف نفت در قارچ‌ها انجام پذیرفته است. نتایج به‌دست‌آمده از تولید بیوسورفکتانت توسط M. circinelloides UTMC 5032در محیط با نمک و بدون نمک در مقایسه با نمونۀ شاهد نیز نشان داد که جدایۀ معرفی‌شده مولد ترکیبات فعال سطحی است و به‌میزان قابل‌توجهی قادر به کاهش کشش سطحی محیط کشت است. این موضوع را می‌توان به یکی از دلایل حذف نفت بالا توسط این جدایه نسبت داد (شکل 8 و 9). نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش نشان داد که مقدار تولید بیوسورفکتانت در طی 6 روز اول رو به افزایش است و بیشترین میزان تولید در روز ششم است؛ درحالی‌که بعد از این مدت مقدار بیوسورفکتانت موجود کاهش یافته است که علت این نتیجه را می‌توان به این صورت تفسیر نمود که احتمالاً یا میزان پایداری بیوسورفکتانت در محیط پایین است و بعد از تولید به‌دلیل ناپایداری در محیط فعالیت خود را از دست می‌دهد و یا اینکه به‌دلیل فقر مواد غذایی در روزهای پایانی، سویۀ قارچی از این ترکیب به‌عنوان منبع کربن و انرژی خود برای رشد استفاده می‌کند و با این کار موجب کاهش مقدار بیوسورفکتانت محیط می‌شود. همچنین نتایج نشان داد که وجود نمک در محیط موجب کاهش تولید بیوسورفکتانت در محیط می‌شود که علت احتمالی آن را می‌توان تأثیر منفی نمک بر رشد سلول قارچی و عملکرد بیوسورفکتانت دانست.

مطالعات نشان داده است که آنزیم‌های تولیدشده از M. cirninelloidesقادر به افزایش تجزیۀ هیدروکربن‌های روغن‌های دیزل است (27)؛ همچنین مطالعات نشان از توانمندی این‌گونه قارچ در تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی داشته است (28)؛ همچنین بررسی‌ها نشان داده است که این‌گونه قارچی توانمند در تولید گاما-لینولنیک اسید است (29). براساس نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش برای اولین بار Mucor cirninelloides UTMC 5032 با ویژگی نفت‌خواری در عدمِ‌حضور و غلظت 25 گرم‌بر‌لیتر نمک با درصد حذف بیش از 90 ترکیبات آلیفاتیک و حدود 55درصد حذف نفت در غلظت 50 گرم‌بر‌لیتر نمک از خاک‌های بومی ایران جداسازی و خالص‌سازی شده است با توجه به توانایی این سویه در تولید بیوسورفاکتانت و کاهش کشش سطحی محیط کشت به‌میزان mN/m 6/17 واحد در محیط بدون نمک و mN/m 94/8 واحد در محیط نمکی نسبت به نمونۀ شاهد و گزارش‌نکردن آن به‌عنوان عامل زیستی حذف‌کننده ترکیبات نفتی در محیط‌های با این میزان شوری، این جدایه می‌تواند به‌عنوان گزینۀ ارزشمند و مناسبی در جهت پاک‌سازی زمین‌های شور آلوده به نفت در کشور معرفی شود.



[1]- Bioremediation

[2]- Enrichment technique

[3]- Spread plate technique

[4]- MSM

[5]- Potato dextrose agar(PDA)

[6]- Sabouraud dextrose agar (SDA)

[7]- Ultrasonic

[8]- Rahman

[9]- Du Nouyring method

[10]- Internal Transcribed Spacer (ITS)

[11]- Ampliqon master mix, Denmark

[12]- Forward primer

[13]- Reverse primer

[xiv]- Obuekwe

[xv]- Behnood

(1)              Bustamante M., Durán N., Diez MC. Biosurfactants are useful tools for the bioremediation of contaminated soil: a review. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 2012; 12(4): 667-87.

(2)              SINGH H. MYCOREMEDIATION: Fungal Bioremediation. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc; 2006.

(3)              Gogoi B., Dutta N., Goswami P., Krishna Mohan T. A case study of bioremediation of petroleum-hydrocarbon contaminated soil at a crude oil spill site. Advances in Environmental Research 2003; 7(4): 767-82.

(4)              McGenity TJ., Gramain A. Cultivation of Halophilic Hydrocarbon Degraders. In: Timmis K, editor. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Berlin: Springer Heidelberg; 2010. p. 3847-54.

(5)              Dastgheib SM., Amoozegar MA., Khajeh K., Ventosa A. A halotolerant Alcanivorax sp. strain with potential application in saline soil remediation. Applied microbiology and biotechnology 2011; 90(1): 305-12.

(6)              Le Borgne S., Paniagua D., Vazquez-Duhalt R. Biodegradation of organic pollutants by halophilic bacteria and archaea. Journal of molecular microbiologyand biotechnology 2008; 15(2-3): 74-92.

(7)              Gadd GM. Fungi in Bioremediation. New York: Cambridge University Press; 2001.

(8)              Mancera-López ME., Esparza-García F., Chávez-Gómez B., Rodríguez-Vázquez R., Saucedo-Castañeda G., Barrera-Cortés J. Bioremediation of an aged hydrocarbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation–bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration & Biodegradation 2008; 61(2): 151-60.

 

 

(9)              Hua X., Wang J., Wu Z., Zhang H., Li H., Xing X, et al. A salt tolerant Enterobacter cloacae mutant for bioaugmentation of petroleum-and salt-contaminated soil. Biochemical Engineering Journal 2010; 49(2): 201-6.

(10)          Martins LF., Peixoto RS. Biodegradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Brazilian Journal of Microbiology 2012; 43(3): 865-72.

(11)          Mouhamadou B., Faure M., Sage L., Marçais J., Souard F., Geremia RA. Potential of autochthonous fungal strains isolated from contaminated soils for degradation of polychlorinated biphenyls. Fungal Biology 2013; 117(4): 268-74.

(12)          Page, A.L., Methods of soil analysis. Part 2. Chemical and microbiological properties. American Society of Agronomy, Soil Science Society of America. 1982

(13)          Zhang G-l., Wu Y-t., Qian X-p., Meng Q. Biodegradation of crude oil by Pseudomonas aeruginosa in the presence of rhamnolipids. Journal of Zhejiang University Science B 2005; 6: 725–30.

(14)          Sepahi AA., Golpasha ID., Emami M., Nakhoda AM. isolation and characterization of crude oil degrading bacillus spp. Iranian Journal of Environmental Health Science & Engineering 2008; 5: 149-54.

(15)          Ekundayo FO., Olukunle OF., Ekundayo EA. Biodegradation of Bonnylight crude oil by locally isolated fungi from oil contaminated soils in Akure, Ondo state. Malaysian Journal of Microbiology 2012; 8(1): 42-6.

(16)          Rahman KS., Thahira-Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat IM. Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. Bioresource technology 2002; 85(3): 257- 261.

(17)          Behnood M., Nasernejad B., Nikazar M. Biodegradation of crude oil from saline waste water using white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 2013.

(18)          Weisman W., Group TPHCW. Analysis of petroleumhydrocarbons in environmental media.vol 1. Massachusetts: Amherst Scientific Publishers; 1998.

(19)          Watanabe T. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi: Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species.Third Edition. :CRC press; 2011.

(20)          Sambrook J. Molecular cloning : a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 2001.

(21)          Le Borgne S., Paniagua D., Vazquez-Duhalt R. Biodegradation of organic pollutants by halophilic bacteria and archaea. Journal of molecular microbiology and biotechnology 2008; 15(2): 74-92.

(22)          Fan C-Y., Krishnamurthy S. Enzymes for enhancing bioremediation of petroleum-contaminated soils: a brief review. Journal of the Air & Waste Management Association 1995; 45(6): 453-60.

(23)          Shankar S., Kansrajh C., Dinesh MG., Satyan RS., Kiruthika S., Tharanipriya A. Application of indigenous microbial consortia in bioremediation of oil-contaminated soils. International Journal of Environmental Science and Technology 2014; 11(2): 367-76.

(24)          Husaini A., Roslan H., Hii K., Ang C. Biodegradation of aliphatic hydrocarbon by indigenous fungi isolated from used motor oil contaminated sites. world Journal of Microbiology and Biotechnology 2008; 24(12): 2789-97.

(25)          Riis V., Kleinsteuber S., Babel W. Influence of high salinities on the degradation of diesel fuel by bacterial consortia. Canadian journal of microbiology 2003; 49(11): 713-21.

(26)          Obuekwe CO., Badrudeen AM., Al-Saleh E., Mulder JL. Growth and hydrocarbon degradation by three desert fungi under conditions of simultaneous temperature and salt stress. International Biodeterioration & Biodegradation 2005; 56(4): 197-205.

(27)          Olga M., Ewa K., Dorota W., Tadeusz A. Biodegradation of diesel oil hydrocarbons enhanced with Mucor circinelloides enzyme preparation. International Biodeterioration & Biodegradation 2015; 104: 142-148.

(28)          Vânia S A., Leonie A S., Kasutaka F., Makoto M., Kazuko N., Galba M and et al. production of extracellular proteases by mucor circinelloides using d-glucose as carbon source / substrate. Brazilian Journal of Microbiology2002; 33(2)

(29)          J.C.du Preez., M. Immelman, J.L.F. Kock, S.G. Kilian. Production of gamma-linolenic acid by Mucor circinelloides and Mucor rouxii with acetic acid as carbon substrate. Biotechnology letters 1995; 17(9): 933-938.