جداسازی و شناسایی باکتری شیمیولیتوتروف اجباری Thioalkalivibrio sp. سویۀ EMA و بهینه‌سازی حذف تیوسولفات در شرایط شور و قلیایی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه تهران، ایران

2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: ورود آلاینده‌های خطرناک صنایع نفت و گاز مانند سود مصرف‌شده به خاک و آب یک معضل زیست‌محیطی است و تصفیۀ زیستی می‌تواند در این زمینه راهکار مناسبی باشد. با توجه به میزان بالای ترکیبات گوگردی در پساب سود مصرف‌شده، در این پژوهش جداسازی باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی از خاک تالاب میقان مورد توجه قرار گرفت. ‏‏
مواد و روش‏‏ها: برای جداسازی باکتری‌های نمک‌قلیادوست گوگردی از خاک تالاب میقان، از محیط کشت مخصوص شیمیولیتوتروفی استفاده شد که در آن تیوسولفات به‌عنوان منبع انرژی و الکترون و سدیم کربنات/بیکربنات به‌عنوان منبع کربن در نظر گرفته شد. برای تعیین اجباری یا اختیاری بودن رشد اتوتروفی جدایه‌ها، از کشت روی محیط نوترینت آگار استفاده شد و سویه‌های منتخب با تعیین توالی ژن 16S rRNA شناسایی شدند. بهینه‌سازی رشد و فعالیت سویۀ منتخب با نام EMA، در pHها و غلظت‌های مختلف نمک با کمک روش پروتئین‌سنجی و تیتراسیون تیوسولفات انجام شد. ‏‏
نتایج: براساس آنالیز مولکولی، جدایه‌ها نزدیک‌ترین شباهت را به گونه‌های جنس Thioalkalivibrio نشان دادند. با توجه به نتایج به دست آمده، بهینه رشد باکتری و حذف تیوسولفات در pH 10 و غلظت ۵درصد نمک (سدیم‌کلرید یا سدیم‌سولفات) حاصل شد. در غلظت‌های بالاتر نمک، در حضور سدیم‌سولفات در مقایسه با سدیم‌کلرید، باکتری با سرعت بیشتری تیوسولفات را حذف کرد. ‏
بحث و نتیجه‏گیری: پتانسیل بالای حذف ترکیبات گوگردی از محیط توسط جدایه‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست در شرایط حاد، نشان‌دهندۀ قابلیت کاربرد این باکتری‌ها برای تصفیۀ پساب سود مصرف‌شده است. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of obligately chemolithoautotrophic, haloalkaliphilic bacterium Thioalkalivibrio sp. strain EMA and optimizing its thiosulfate removal activity in haloalkaliphilic condition

نویسندگان [English]

  • Somaye Makzum 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Seyed Mohammad Mehdi Dastgheib 3
1 M.Sc. of Biotechnology, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Professor of Microbiology, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Biotechnology, Research institute of petroleum industry (RIPI), Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Dischargeing hazardous pollutants of oil and gas industries such as spent caustic into the soil and water is an environmental concern for which biological treatment could offer a solution. To remove high levels of sulfur compounds in spent caustic waste, isolation of chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from Meighan wetland was considered in this study.
Materials and methods: For isolation of chemolithoautotroph haloalkaliphile sulfur-oxidizing bacteria, alkaline sulfur-respiring medium with sodium thiosulfate as the sole electron and energy source and sodium carbonate/bicarbonate as carbon source were utilized. To confirm that the purified isolates are obligated autotroph, their growth on nutrient agar medium was surveyed and selected strains were identified based on 16S rRNA sequence analysis. The growth and activity of selected strain named EMA were optimized at various pHs and salt conditions by assessment of protein content and remained thiosulfate in the culture medium.
Results: Following enrichment, 10 chemolithoautotrophic, haloalkaliphilic sulfur-oxidizing strains were isolated. 16S rRNA sequence analysis, showed that the strains belonged to the genus Thioalkalivibrio. The optimal growth and thiosulfate removal of the selected strain were obtained at pH 10 and 50 g/l of salt (sodium chloride or sodium sulfate). At higher salt concentrations, thiosulfate removal was higher in the presence of sodium sulfate, rather than sodium chloride.
Discussion and conclusion: high sulfur removal activity of the isolated haloalkaliphilic Thioalkalivibrio strains in extreme conditions with these bacteria could be promising for the biotreatment of spent caustic.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Spent caustic
  • Optimization
  • Biological treatment
  • Chemolithoautotrophe
  • sulfur-oxidizing bacteria

مقدمه.

امروزه آلودگی محیط زیست یک معضل جهانی است و سازمان‌های محیط زیست، صنایع را ملزم به به‌کاربردن روش‌هایی برای کاهش مقدار آلایندۀ تولیدی، استفاده از روش‌هایی برای تصفیۀ پساب تولیدشده و پاکسازی محیط زیست کرده است (1 و 2). ازآنجا که بیش از 70درصد از میادین نفت و گاز کشور به‌صورت ترش است حذف ترکیبات گوگردی از نفت و گاز اهمیت زیادی دارد (3). یکی از آلاینده‌های صنعتی که به‌دلیل ویژگی‌های خاص آن بسیار به آن توجه شده است پسابی به‌نام سود مصرف‌شده[1] است که در پالایشگاه گاز و صنایع پتروشیمی به‌دنبال شیرین‌سازی گاز ترش تولید می‌شود. در پالایشگاه‌های مختلف انواع متنوعی از سود مصرف‌شده تولید می‌شود که در این میان می‌توان پساب‌های فنولی و سولفیدی را نام برد. pH بالای 12 سود مصرف‌شدۀ سولفیدی، شوری 5-12درصد وزنی و مقدار بالای ترکیبات سولفیدی که از 2-3درصد تجاوز می‌کند آن را در ردیف پساب‌های بسیار خطرناک قرار داده است. به‌دلیل ویژگی‌های ذکرشده، سود مصرف‌شده، پسابی سمی، بدبو و خورنده است و رهاسازی آن به محیط زیست خطرناک است و مخالف قوانین حفاظت از محیط زیست است و قبل از رهاکردن آن در محیط باید تحت تیمار قرار گیرد. امروزه روش‌های مختلف برای تیمار پساب‌های پالایشگاهی وجود دارد. یکی از روش‌های فیزیکوشیمیایی تصفیۀ پساب سود مصرف‌شده که در حال حاضر بسیار استفاده می‌شود، روش اکسیداسیون با هوای مرطوب[2] است. به‌دلیل هزینۀ مصرفی بالا برای ایجاد فشار و دمای بالای موردِنیاز برای انجام این فرایند و تولید آلاینده‌های ثانویه ناشی از کامل‌نبودن فرایند اکسیداسیون، روش‌های زیستی تیمار پساب مورد توجه قرار گرفته‌اند (4-12). در روش زیستی تصفیۀ سود مصرف‌شدۀ سولفیدی، تصفیه در راکتورهای هوازی و با کمک باکتری‌های اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی انجام می‌شود و درنهایت سولفیدهیدروژن به گوگرد عنصری و یا سولفات تبدیل می‌شود. انجام واکنش در دما و فشار محیط، کاهش هزینه‌های مصرفی و تولیدنکردن آلاینده‌های ثانویه را می‌توان از مزایای تیمار زیستی برشمرد(5، 9 و 12). برای تیمار سود مصرف‌شدۀ سولفیدی، بیشتر تجربیات مربوط به استفاده از گونۀ denitrificans Thiobacillus است. در این فرایند سود مصرف‌شدۀ سولفیدی نیاز دارد که با استفاده از آب رقیق شود و میزان یون سدیم و pH تعدیل شود. در روشی که اخیراً به آن توجه شده است برای اکسیداسیون ترکیبات گوگردی از باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست گوگردی استفاده می‌شود (13 و 14). در سال 2000 سوروکین[3] و همکاران باکتری‌های شیمیولیتوتروف اجباری نمک‌قلیادوست را کشف و بررسی کردند. این باکتری‌ها از دریاچه‌های سودای سیبری[4] و کنیا[5] جدا شده است که در آن کربنات/ بیکربنات سدیم به‌عنوان منبع کربن استفاده می‌کند و شرایط بافری را در pH قلیایی بین 9 تا 5/10 ایجاد و حفظ می‌کند. این گروه از باکتری‌ها دارای سه جنس Thioalkalimicrobium،  Thioalkalivibrio و Thioalaklispira هستند که ازلحاظ تحمل نمک متفاوت هستند. سویه‌های جداشده از دریاچه‌های سودای سیبری دارای درصد G+C کم هستند (48-51درصد مولی) درصورتی‌که سویه‌های Thioalkalivibrioدر گروه باکتری‌های با درصد G+C بالا قرار می‌گیرند. این گروه‌های باکتریایی متعلق به کلاس گاماپروتئوباکتریا هستند. گونه‌های Thioalkalivibrioبا گروه شیمیولیتوتروف‌ها ارتباط دارند که با فاصلۀ دور از باکتری‌های گوگردی بنفش جنس Ectothiorhodospiraقرار گرفته‌اند درصورتی‌که جنس Thioalkalimicrobium به باکتری‌های گوگردی شیمیولیتوتروفی نوتروفیل جنس Thiomicrospira نزدیک هستند و یک دودمان قلیادوست جدیدی را در این خوشه تشکیل می‌دهند (15-18). با وجود روش‌های مختلف فیزیکوشیمیایی، در پالایشگاه‌های کشور فقط به خنثی‌سازی سود مصرف‌شده بسنده می‌شود و اغلب پس از خنثی‌سازی نسبی و کاهش COD پساب به دریا تخلیه می‌شود. بسیار واضح است که رهاسازی ترکیبات بسیار خطرناک موجود در سود مصرف‌شده برای جانوران آبزی سمی است و چرخۀ حیات را به خطر می‌اندازد. در این مطالعه تلاش شد باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی از خاک تالاب میقان جدا شود. این باکتری‌ها که توانایی رشد و تحمل شرایط موجود در سود مصرف‌شده را دارند، می‌توانند به‌عنوان گزینه‌ای مناسب برای حذف ترکیبات گوگردی سود مصرف‌شده در نظر گرفته شوند.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‌برداری: تالاب میقان یک محیط شور است که در 15کیلومتری شمال شرقی شهر اراک در استان مرکزی واقع شده است (19). بعضی از نواحی آن دارای خاک گوگردی و سیاه‌رنگ است و برای هدف موردِنظر این مطالعه که جداسازی باکتری‌های گوگردی است مناسب بود. نمونه‌برداری از خاک تالاب میقان در آذرماه 91 در ظروف نمونه‌برداری استریل انجام شد و به آزمایشگاه منتقل شد. میزان pH و نمک کل خاک با استفاده از روش گل اشباع تعیین شد. در این روش یک گرم از خاک در هاون چینی کوبیده شد سپس با استفاده از پمپ خلأ از صافی رد شد و برای آنالیز استفاده شد (20-22). آنالیز خاک تالاب میقان از نظر عناصر و یون‌های موجود در آن با روش جذب اتمی[6] و با استفاده از دستگاه شعله‌سنجی[7] در آزمایشگاه آنالیز دستگاهی بخش زمین‌شناسی دانشگاه تهران انجام شد.

غنی‌سازی، جداسازی و خالص‌سازی: برای غنی‌سازی باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی، از محیط کشت مخصوص رشد باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست گوگردی با pH 8/9 و 6/3درصد نمک که در جدول 1 به آن اشاره شده است استفاده شد. در این محیط از سدیم‌تیوسولفات به‌عنوان منبع انرژی و الکترون و از سدیم‌کربنات/ بیکربنات به‌عنوان منبع کربن استفاده شد؛ علاوه بر این کربنات/ بیکربنات سدیم با خاصیت بافری بین 9 تا 5/10، شرایط قلیایی مناسب را برای رشد باکتری‌های نمک‌قلیادوست موردنظر فراهم می‌کنند. ارلن‌های حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت، در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با دور شیکر rpm150، به هم زده شد. بعد از یک ماه انکوبه‌شدن و سه بار کشت مجدد در محیط مایع اتوتروفی جدید، از محیط مایع به محیط جامد اتوتروفی کشت مجدد داده شد. برای تهیۀ محیط کشت جامد از همان محیط کشت ذکرشده در جدول 1 به‌همراه آگار (5/1درصد آگار) استفاده شد. برای تهیۀ این محیط کشت، محیط پایۀ معدنی و آگار به‌صورت جداگانه اتوکلاو شد و بعد از رسیدن به دمای 60 درجه سانتی‌گراد، در شرایط استریل به هم اضافه شد. این کار برای جلوگیری از کارامله‌شدن آگار در دمای بالا و pH قلیایی صورت گرفت (15-18). برای مشخص‌کردن سویه‌های اتوتروف اجباری از اختیاری، بعد از خالص‌سازی روی محیط جامد اتوتروفی، نمونه‌ها در نوترینت آگار (آگار خالص محصول شرکت مرک)[8] کشت داده شدند (17).

 

جدول 1- ترکیبات محیط کشت

20 گرم

سدیم‌کربنات

محیط پایه معدنی

(1 لیتر)

10 گرم

سدیم‌بیکربنات

5 گرم

سدیم‌کلرید

1گرم

دی پتاسیم هیدروژن فسفات

2 میلی‌لیتر/لیتر

عناصر کم‌مقدار

5/ میلی‌مولار

منیزیم‌کلرید

5 میلی‌مولار

پتاسیم‌نیترات

40 میلی‌مولار

سدیم‌تیوسولفات 5آبه

 

شناسایی- کلنی‌ها از نظر رنگ و شکل در محیط جامد بررسی شدند. برای شناسایی اولیۀ باکتری از رنگ‌آمیزی گرم و تست KOH استفاده شد )۲۳ و24). شناسایی تکمیلی جدایه‌های منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن  16S rRNA انجام گرفت. استخراج DNAژنومی به‌روش مارمور[9] انجام شد. PCR ژن   16S rRNAبا استفاده از پرایمرهای جهانی رفت و برگشت (پرایمر رفت 27 F با توالی AGAGTTTGATCMTGGCTCAG و دمای اتصال 3/56 و پرایمر برگشت 1492 R با توالی GGTTACCTTGTTACGACTT و دمای اتصال 54 درجه سانتی‌گراد) انجام شد (25). محصول PCR بر ژل آگارز 7/0درصد الکتروفورز شد و با استفاده از اتیدیوم برماید رنگ‌آمیزی شد و توسط دستگاه ترانس ایلومیناتور مشاهده شد. به‌منظور تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA محصول PCR از طریق شرکت تکاپوزیست به شرکت ماکروژن[10] در کره جنوبی ارسال شد. آنالیز فیلوژنتیک جدایه‌های منتخب و سویه‌های مشابه آنها با استفاده از نرم‌افزارClustal X،  Bioeditو Mega 6 انجام شد و رسم درخت فیلوژنتیک مربوط به این سویه‌ها با استفاده از روش‌های Neighbor Joining، Maximum Parsimony و Maximum Likelyhood انجام گرفت (26- 29).

تعیین pH بهینۀ رشد باکتری و حذف تیوسولفات: از میان سویه‌های توالی‌یابی‌شده، چون همۀ سویه‌ها متعلق به یک گروه باکتریایی بودند، به‌صورت تصادفی یک سویه انتخاب شد و pHبهینۀ رشد و حذف تیوسولفات تعیین شد. در سویه‌های Thioalkalivibrioبا مصرف تیوسولفات و اکسیداسیون آن به گوگرد عنصری، کدورت رشد باکتری بعد از رسیدن به فاز لگاریتمی زیاد می‌شود که ناشی از ترشح گوگرد عنصری در محیط کشت بوده است. بعد از مصرف کامل تیوسولفات و رسیدن باکتری به انتهای فاز لگاریتمی، باکتری شروع به مصرف گوگرد تولیدشده می‌کند و کدورت محیط کشت کاهش می‌یابد. با توجه به آنچه گفته شد استفاده از منحنی رشد باکتری به‌روش کدورت‌سنجی منطقی به نظر نمی‌رسد و برای سنجش رشد باکتری باید از روش پروتئین‌سنجی استفاده کرد (30). رشد باکتری در محدودۀ pH 8 تا 5/10 براساس روش پروتئین‌سنجی تعیین شد و برای سنجش حذف سدیم‌تیوسولفات از روش تیتراسیون استفاده شد. نمونه‌ها در دمای 35 درجه سانتی‌گراد با دور شیکر rpm 150 گرماگذاری شد. برای ایجاد محیط با 8 pH، تنها سدیم‌بیکربنات به‌عنوان منبع کربن در نظر گرفته شد. برای تهیۀ محیط‌های فوق از معادلۀ هندرسون-هاسلباخ و pHمتر استفاده شد. نمونه‌برداری در ابتدای فاز تأخیر، با فاصلۀ زمانی 6 تا 7 ساعت انجام شد و پس از آن در فاز لگاریتمی هر 2 تا 3 ساعت نمونه‌برداری شد و غلظت پروتئین و میزان حذف سدیم‌تیوسولفات آن سنجیده شد. (30 و 31).

- برای تعیین غلظت کمی پروتئین‌ها به‌روش برادفورد، یک میلی‌لیتر از محیط کشت به‌مدت 10 دقیقه با دور 11500g سانتریفیوژ شد. مایع رویی جدا شد و برای تخریب سلول و سنجش کل پروتئین سلول باکتری، 100 میکرولیتر سدیم‌هیدروکسید به پلیت سلولی اضافه شد و به‌مدت یک ساعت در حمام آب با دمای 100 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد. پس از آن به‌مدت 10 دقیقه با دور 11500g سانتریفیوژ شد. سپس 20 میکرولیتر از مایع رویی در یک کوت ریخته شد و 1000میکرولیتر معرف برادفورد به آن اضافه گردید. پس از هم‌زدن نمونه‌ها، جذب آنها در طول‌موج 595 نانومتر در برابر نمونۀ شاهد حاوی سدیم‌هیدروکسید و معرف برادفورد خوانده شد. براساس منحنی استاندارد به‌دست‌آمده از غلظت‌های مختلف BSA، غلظت پروتئینی نمونه‌ها تعیین شد (32- 35).

- برای سنجش حذف سدیم‌تیوسولفات از روش تیتراسیون با محلول یدین 10 میلی‌مولار و محلول نشاسته به‌عنوان معرف استفاده شد. براساس منحنی استاندارد به‌دست‌آمده از غلظت‌های مختلف سدیم‌تیوسولفات، غلظت سدیم‌تیوسولفات باقیمانده در نمونه‌ها تعیین شد (36 و 37).

تعیین بهینۀ رشد باکتری و حذف تیوسولفات در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید: بهینۀ رشد باکتری و حذف تیوسولفات توسط آن در غلظت‌های 5/0 تا 5درصد (وزنی/ حجمی) نمک سدیم‌کلرید بررسی شد. سنجش رشد براساس پروتئین‌سنجی و حذف سدیم‌تیوسولفات براساس روش تیتراسیون انجام شد (30).

تعیین بهینۀ رشد باکتری و حذف تیوسولفات در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات: بهینۀ رشد باکتری و حذف تیوسولفات توسط آن در غلظت‌های 5/0 تا 5درصد (وزنی/ حجمی) نمک سدیم‌سولفات بررسی شد. سنجش رشد و حذف تیوسولفات مطابق روش گفته‌شده در بالا انجام شد (30).

 

نتایج.

نمونه‌برداری: در این مطالعه، در نمونه‌برداری از تالاب میقان، مناطقی با خاک سیاه‌رنگ که با احتمال بیشتری بتوان باکتری‌های گوگردی را جدا کرد، مورد توجه قرار گرفت. پس از نمونه‌برداری و انتقال به آزمایشگاه، pH و شوری آن اندازه‌گیری شد. pH خاک 6/7 و شوری آن 3/0درصد گزارش شد. در جدول 2 آنالیز عناصر خاک تالاب میقان آورده شده است.

 

جدول 2- آنالیز نمونۀ خاک تالاب میقان

مقدار (میلی‌گرم بر کیلوگرم)

عناصر

42/1

Na2+

18/0

Mg2+

2

K+

410

Ca2+

7/0

Fe2+

1065

Cl-

61

HCO3-

 

جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی: پس از خالص‌سازی متوالی در کشت جامد، 10 سویه جدا شد. کلنی‌های جوان سویه‌های جداشده، در سطح پلیت دارای گوگرد سفیدرنگ در سلول است که با پیرترشدن سلول، زردرنگ دیده می‌شود. برای اطمینان از شیمیولیتوتروف‌بودن سویه‌های جداشده، مجدداً در کشت مایع کشت داده شدند. سویه‌ها بعد از یک هفته انکوباسیون، توانایی رشد در محیط مایع با همان ترکیبات بیان‌شده در جدول 1 را داشتند و همه، باکتری‌های شیمیولیتوترف اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی بودند. برای تعیین شیمیولیتوتروف اجباری یا اختیاری سویه‌ها، در پلیت نوترینت آگار کشت داده شدند که هیچ‌کدام توانایی رشد در نوترینت آگار را نداشته و شیمیولیتوتروف اجباری بودند.

کلنی‌های جوان سویه‌های Thioalkalivibrio بر محیط دارای تیوسولفات با pH 10 شفاف، سفید، صاف، منظم و برآمده هستند که رسوبات گوگردی سفیدرنگ دارند و ابتدا در مرکز و کناره‌های سلول دیده می‌شوند. کلنی‌های پیر کاملاً حاوی گوگرد هستند و زردرنگ دیده می‌شوند که شاید به‌دلیل یک تغییر در وضعیت فیزیکی گوگرد تولید شده باشد. کلنی باکتری در شکل1 نشان داده شده است. سلول‌های Thioalkalivibrio به‌صورت باسیل‌های کوتاه و گاهی خمیده بوده که با یک فلاژلۀ قطبی حرکت می‌کنند و گلبول‌های گوگردی در پری‌پلاسم خود دارند.

 از میان سویه‌های جداشده، به‌صورت تصادفی، 4 سویۀ EMA، HMA، DMA و KMA برای شناسایی مولکولی انتخاب شد. پس از استخراج ژنوم، انجام PCRو تعیین توالی ژن  16S rRNA، توالی‌های به‌دست‌آمده هم‌تراز[11] و با میکروارگانیسم‌های موجود در بانک ژنی Eztaxon مقایسه شد. نتایج حاصل از هم‌ترازی سویه‌ها مشخص کرد که باکتری‌های ذکرشده، متعلق به جنس Thioalkalivibrioهستند و توالی به‌دست‌آمده بیشترین شباهت را به سویۀ Thioalkalivibrio versutus نشان می‌دهند. سویۀ EMA، HMA، KMA و DMA به‌ترتیب به‌میزان 100، 99، 100 و 100درصد به Thioalkalivibrio versutusشباهت دارند.

از توالی ژنی 16S rRNAبه‌دست‌آمده از جدایه‌های بررسی‌شده، درخت فیلوژنتیک به‌روش Neighbor Joining و ضریب بوت استرپ[12] صد و با استفاده از نرم‌افزار Mega 6 رسم شد. درخت فیلوژنتیک سویه‌های به‌دست‌آمده، در شکل 2 نمایش داده شده است. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود فاصلۀ فیلوژنی سویه‌های موردنظر نسبت به برون گروه[13] آن که باکتری Thioalkalimicrobium aerophilum است مقایسه شده است. این باکتری یک جنس جدا را در باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی تشکیل می‌دهد.

 

 

شکل 1- کلنی باکتری سویۀ EMA

 

 

 

 

 EMA

 

 Thioalkalivibrio jannaschii strain ALM2 (NR 028807.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. ALMg (EU709869.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. ALR16(EU70987501)

 

 KMA

 

 DMA

 

 Thioalkalivibrio sp.ALJ6 (GU735092.1)

 

 HMA

 

 Thioalkalivibrio sp.ALBR6(EU709861.1)

 

 Thioalkalivibrio thiocyanoxidans strain ARh2(NR_025129.1

 

 Thioalkalivibrio sp.ALBR-X3(EU709864.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. ALJ 15 (GU735093.1)

 

 Thioalkalivibrio sp.AKL11 (EU709870.1)

 

 Thioalkalivibrio nitratis ALJ12 (NR 024991.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. K90mix strain K90mix (NR 07430.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. ASLr1(GU735087.1)

 

 Thioalkalivibrio sp. ALJ24 (EU709867.1)

 

 Thioalkalivibrio halophilus (NR 042855.1)

 

 Thioalkalivibrio sp.ALR14 (EU709874.1)

 

 Thioalkalivibrio sp.ALR20(EU709876.1)

 

 Thioalkalimicrobium aerophilum strain AL3 (NR_024992.1)

 

34

 

98

 

93

 

86

 

73

 

98

 

87

 

19

 

22

 

27

 

99

 

89

 

13

 

5

 

3

 

10

 

3

 

8

شکل 2- درخت فیلوژنی سویه‌های جداشده

 

 

تعیین pH بهینۀ رشد و حذف تیوسولفات: از میان سویه‌های توالی‌یابی‌شده، سویۀ EMAبرای ارزیابی فعالیت انتخاب شد و در محدودۀ pH 8 تا 5/10 رشد و حذف تیوسولفات از محیط بررسی شد. در شکل‌های 3 و 4 که رشد باکتری و حذف تیوسولفات از محیط را در pHهای مختلف نشان می‌دهد مشاهده می‌شود که بیشترین میزان پروتئین تولیدشده مربوط به pH ۱۰ و کمترین آن مربوط به pH ۵/۱۰ است. بعد از pH 10، سویۀ EMA به‌ترتیب در pH5/9، 9 و 8 بیشترین رشد را نشان داد. با حذف تیوسولفات به‌عنوان سوبسترا رشد باکتری زیاد می‌شود و بعد از اتمام تیوسولفات با مصرف گوگرد ترشح‌شده به محیط کشت، رشد ادامه می‌یابد و با مصرف کامل گوگرد رشد ثابت می‌شود. بازده رشد به‌صورت تولید پروتئین کل برحسب زمان تعریف شده است که در pH10 و 5/10 به‌ترتیب، 49/0 و 15/0 میلی‌گرم/میلی‌لیتر ساعت درصد است. ضریب رشد باکتری 093/0 بر ساعت اندازه‌گیری شد. باکتری در pH10 سریع‌تر از pHهای دیگر تیوسولفات سدیم را حذف کرده است و در ساعت 5/37 رشد میزان تیوسولفات به صفر رسیده است درحالی‌که در pH5/10 در ساعت 5/37 رشد تنها 2درصد از تیوسولفات محیط حذف شده است و درپایان ساعت 5/84 رشد، میزان حذف تیوسولفات 68درصد است. در pHهای 5/9، 9 و 8 به‌ترتیب در ساعت رشدی 41، 5/60 و 5/68 تیوسولفات به اتمام می‌رسد و میزان حذف تیوسولفات در ساعت 5/37 رشد به‌ترتیب 88، 67 و 32 است. مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در pHهای مختلف در شکل 5 نشان داده شده است.

 

 

شکل3- تعیین بهینۀ رشد در pHهای مختلف توسط سویۀ EMA

 

 

شکل 4- تعیین بهینۀ حذف تیوسولفات در pHهای مختلف توسط سویۀ EMA

 

 

شکل 5- مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در pHهای مختلف

 

تعیین بهینۀ رشد و حذف تیوسولفات در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید: بهینۀ رشد و حذف تیوسولفات از محیط توسط سویۀ EMA در غلظت‌های 5/0 تا 5درصد سدیم‌کلرید تعیین شد. شکل‌‌ 6 رشد باکتری و حذف تیوسولفات از محیط را در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید نشان می‌دهد. همان‌طور که مشاهده می‌شود باکتری در غلظت‌های 5/0 و 1درصد سدیم‌کلرید در بازۀ زمانی 80 ساعت رشد نداشته است. سریع‌ترین رشد مربوط به غلظت 5درصد سدیم‌کلرید بوده است و بازده رشد سویه در غلظت 5 و 5/2درصد به‌ترتیب 4/0 و 34/ میلی‌گرم/میلی‌لیتر ساعت درصد بوده است. ضریب رشد 0093/0 بر ساعت اندازه‌گیری شد. حذف تیوسولفات توسط باکتری در غلظت 5درصد سریع‌تر از 5/2درصد بوده است؛ به‌صورتی که در غلظت 5درصد، در ساعت 60 رشد، تمام تیوسولفات حذف شده است. درحالی‌که در غلظت 5/2درصد تمام تیوسولفات در ساعت 80 رشد حذف شده است و در ساعت 60 رشد میزان حذف، 28درصد است. در شکل 7 مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید آورده شده است.

 

 

الف

 

ب

شکل 6-تعیین بهینۀ رشد توسط سویۀ EMA (الف) تعیین بهینۀ حذف تیوسولفات توسط سویۀ EMA (ب) در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید

 

شکل 7- مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در غلظت‌های مختلف سدیم‌کلرید

الف

 


 

 

 

ب

شکل 8- تعیین بهینۀ رشد توسط سویۀ EMA (الف) تعیین بهینۀ حذف تیوسولفات توسط سویۀ EMA (ب) در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات

 

تعیین بهینۀ رشد و حذف تیوسولفات در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات: بهینۀ رشد و حذف تیوسولفات در غلظت‌های 5/0 تا 5درصد سدیم‌سولفات بررسی شد. درمورد نمک سدیم‌سولفات در غلظت 5/0 و 1درصد رشد مشاهده نشد و در غلظت‌های 5/2 و 5درصد نمک، هر دو تقریباً هم‌زمان شروع به رشد کردند. میزان پروتئین تولیدی نیز در هر دو غلظت 5/2 و 5درصد با هم یکسان بود و باکتری بعد از زمان 30 ساعت به فاز لگاریتمی رسید و بازده رشد سویه در غلظت‌های 5/2 و 5درصد، 5/0 میلی‌گرم/میلی‌لیتر ساعت درصد است. ضریب رشد باکتری 023/0 بر ساعت تعیین شد. حذف کامل تیوسولفات در غلظت 5 و 5/2درصد، به‌ترتیب در ساعت رشدی 47 و 52 انجام شد به‌طوری که میزان حذف تیوسولفات در غلظت 5/2درصد سدیم‌سولفات در ساعت رشدی 47 و 77درصد بوده است. شکل‌ 8  رشد باکتری و حذف تیوسولفات از محیط را در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات نشان می‌دهد. در شکل 9 مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 9- مقایسۀ ویژگی‌های رشدی سویۀ EMA در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

با توجه به تولید حجم قابلِ‌توجهی از سود مصرف‌شدۀ سولفیدی در کشور، به جداسازی باکتری‌های بومی برای تیمار این پساب، توجه شد. در سال 2000، باکتری‌های شیمیولیتوتروف اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی را سوروکین و همکارانش کشف کردند. این باکتری‌ها که در دو جنس Thioalkalivibrio و Thioalkalimicrobium قرار گرفتند از دریاچه‌های سودای سیبری و کنیا جدا شدند. در این مطالعه چندین محیط غنی‌سازی از دریاچه‌های سودای مختلف استفاده شد (17). در مطالعات بعدی که توسط سوروکین و همکارانش انجام گرفت ویژگی‌های این باکتری‌ها بیشتر بررسی شد و گونه‌های متنوعی از این گروه‌های باکتریایی جدا شد (17، 18، 19 و 38). برای اولین بار در کشور در این پژوهش، باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست اکسیدکنندۀ ترکیبات گوگردی جداسازی و شناسایی شدند. در مطالعۀ حاضر، جداسازی از تالاب میقان دارای خاک گوگردی با pH 6/7 انجام شد که منجر به جداسازی چهار سویه از جنس Thioalkalivibrio شد. به‌دلیل نبودِ دریاچه‌های سودا در ایران، جداسازی این باکتری‌ها از تالاب میقان می‌تواند نقطۀ قوتی برای این پژوهش باشد. با توجه به رویکرد این پژوهش که جداسازی باکتری‌های شیمیولیتوتروف گوگردی برای استفاده از آنها در تصفیۀ پساب سود مصرف‌شده است بهینه‌سازی رشد سویۀ EMA و حذف تیوسولفات از محیط کشت ازنظر pH 8 تا 5/10 و غلظت 5/0 تا 5درصد سدیم‌کلرید و سدیم‌سولفات انجام شد. به‌منظور استفاده از سویۀ جداشده در تصفیۀ پساب سود مصرف‌شده باpH قلیایی، بالاترین pH که در آن باکتری بیشترین رشد و حذف تیوسولفات را داشته باشد به‌عنوان pH مطلوب در نظر گرفته شد. سویۀ EMA، در pH 10، با سرعت بیشتری تیوسولفات را حذف کرده است. اگرچه میزان پروتئین تولیدشده در pHهای 5/9 و 9 تقریباً برابر با pH 10 است؛ به‌دلیل سرعت بیشتر حذف تیوسولفات توسط باکتری، pH 10 به‌عنوان بهینه در نظر گرفته شد. در پژوهش‌هایی که سوروکین و همکاران (17 و 39) انجام دادند pH 10 به‌عنوان بهینه در نظر گرفته شد. به‌دلیل بالابودن میزان نمک سود مصرف‌شدۀ بهینه‌سازی غلظت نمک سدیم‌کلرید و سدیم‌سولفات انجام شد. ازآنجاکه در مراحل خنثی‌سازی[xiv] سود مصرف‌شده در صنعت از سولفوریک‌اسید استفاده می‌شود و درنهایت نمک سدیم‌سولفات تولید می‌شود، بهینه‌سازی رشد باکتری و حذف تیوسولفات در غلظت‌های مختلف سدیم‌سولفات بررسی شد و مشخص شد که باکتری در غلظت های بالاتر نمک‌های سدیم‌سولفات و سدیم‌کلرید رشد سریع‌تری دارد به‌طوری که در غلظت 5/0 و 1درصد نمک توانایی رشد را نداشته است؛ از طرف دیگر، در غلظت‌های بالاتر باکتری با سرعت بیشتری تیوسولفات را حذف می‌کند. در مطالعه‌ای که سوروکین و همکارانش بر سویۀ Thioalkalivibrio versutus strain ALJ 15 انجام دادند (39) سینتیک رشد این سویه در کشت کموستات بررسی شد. در این مطالعه مشخص شد که این باکتری توانایی رشد در pH قلیایی را دارد و در غلظت بالایی از نمک رشد می‌کند. توانایی رشد باکتری‌های قلیانمک‌دوست در pH قلیایی و غلظت نمک بالا نشان می‌دهد که این گروه از باکتری‌ها مکانیسم‌های ویژه‌ای دارند که آنها را قادر می‌سازد که در محیط‌های پلی‌اکستریم[xv] موجود بهترین رشد را داشته باشند. اکثر سویه‌های Thioalkalivibrio در شرایط کمبود اکسیژن و در هنگام اکسیداسیون تیوسولفات، گوگرد عنصری را به‌عنوان ترکیب واسطه به‌صورت درون‌سلولی یا برون‌سلولی تولید می‌کنند و سپس به سولفات اکسید می‌شود. در این باکتری‌ها گوگرد عنصری می‌تواند در هنگام کشت مایع یا جامد تولید شود درحالی‌که در شرایط اکسیژن بالا، تیوسولفات مستقیماً به سولفات اکسید می‌شود. در مطالعۀ حاضر به‌دلیل استفاده از ارلن و تهیه‌نشدن اکسیژن کافی برای باکتری‌ها، تیوسولفات به گوگرد عنصری تبدیل می‌شود و پس از آن گوگرد به سولفات تبدیل می‌شود. افزایش ناگهانی پیک رشد به‌روش کدورت‌سنجی به‌دلیل تولید ناگهانی گوگرد و ترشح آن به محیط کشت بوده است. این باکتری بعد از مصرف گوگرد و کاهش پیک رشد و کاهش کدورت محیط کشت سولفات تولید می‌کند. اکثر مطالعات در تصفیه زیستی سود مصرف‌شده مربوط به استفاده از گونۀ Thiobacillus denitrificans بوده است. عدم رشد در pH بالا و نیاز به آب فراوان برای رقیق‌سازی سود مصرف‌شده، باعث توجه دانشمندان به استفاده از باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک‌قلیادوست برای تصفیۀ پساب سود مصرف‌شدۀ سولفیدی شده است و مطالعاتی در این زمینه انجام شده است (5 و 9). با توجه به مزیت‌های روش جدید زیستی امید است که بتوان باکتری‌های شیمیولیتوتروف نمک قلیادوست اکسیدکنندۀ ‌ترکیبات گوگردی بومی را برای تصفیۀ این پساب به کار برد.



[1]- Spent caustic

[2]- Wet air oxidation

[3]- Sorokin

[4]- Siberian

[5]- Kenyan

[6]- Atomic absorption

[7]- Flame photometry

[8]- Merck

[9]- Marmur

[10]- macrogen

[11]- alignment

[12]- Boot Strap

[13]- Out group

[xiv]- neutralization

[xv]- Poly extreme

 

(1)              Eugene L M. Environmental microbiology: from genomes to bio geochemistry.1rd ed. United State: Blackwell publishing; 2008.

(2)              Lloyd JR., Lovley DR. Microbial detoxification of metals and radionuclides. Current opinion in biotechnology 2001; 12(3): 248-253.

(3)              Moosavi Hejazi AS., Saadat Akefi A., Feizi Y., Naiini J., Editors. Understanding theprinciplesof gasprocessing. 1rd ed. Tehran: Internal publication of Iran Gas Company; 1388.

(4)              Gadekar S., Nemati M., Hill GA. Bach and continuous biooxidation of sulphide by Thiomicrospira sp. CVO: reaction kinetics and stoichiometry. Water research 2006; 40(12): 2436-2446

(5)              Graaff M., Klok j., Bijmans M., Muyzer G., Janssen A. Application of a 2-step process for the biological treatment of sulfidic spent caustics. Water research 2012; 4(6): 723-730.

(6)              Ravichandra P., Gopal M., Annapurna J. Biological treatment of toxic petroleum spent caustic in fluidized bed bioreactor using immobilized cells of Thiobacillus RAI01. Applied biochemistry and biotechnology 2008; 151(2-3): 532–546.

(7)              Jeung JP., So-Ra P., Dong-Jin J., Jeong-Keun A., Im-Gyu B., Tae-Joo P. Application of spent sulfidic caustics for autotrophic denitrification in a MLE process and their microbial characteristics by fluorescence in situhybridization. Korean Journal of Chemical Engineering 2008; 25(3): 542-547

(8)              Rebocas MV., Massa ACG., Vinicio M. Analysis of effluent from caustic treatment plants. Institute Colombia del Petroleo 2006; 3(2): 163-170

(9)               Graaff M., Bijmans FM., Abbas B., Euverink G., Muyzer G., Janssen A. Biological treatment of refinery spent caustics under halo-alkaline conditions. Bioresource Technology 2011; 102(15): 7257-64

(10)          Alnaizy R. Economic analysis for wet oxidation processes for the treatment of mixed refinery spent caustic. Environmental Progress 2008; 27(3): 295–301

(11)          Conner JA., Beitle RR., Duncan K., Kolhatkar R., Sublette K. Biotreatment of refinery spent sulfidic caustic using an enrichment culture immobilized in a novel support matrix. Applied Biochemistry and Biotechnology 2000; 84–86(1-9): 707–719.

(12)          Heidarinasab A., Hashemi SR. A Study of biological treatment of spent sulfidic caustic. International Conference on Chemical, Ecology and Environmental Sciences 2011; 418-421.

(13)          Buisman CJN., speert P., Hof A., Janssen ALJ., Hagen R., Lettinga G. Kinetic parameters of a mixed culture oxidizing sulfide and sulfur with oxygen. Biotechnology andBioengineering 1991; 38(8): 813-820.

(14)          Janssen AJ., Sleyster R., Vander C., Jochemsen A., Bontsema J., Lettinga G. Biological sulphide oxidation in a fed-batch reactor. Biotechnology and Bioengineering 1995; 47(3): 327-333.

(15)          Sorokin D., Lysenko A., Mityushina L., Tourova T., Jones B., Rainey A., et al.  Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov.and Thioalkalimicrobium sibericum sp. nov., and Thioalkalivibrio versutus gen. nov., sp. nov., Thioalkalivibrio nitratis sp. nov., novel and Thioalkalivibrio denitrificans sp. nov., novel obligately alkaliphilic and sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2001; 51(2): 565–580

(16)          Sorokin D., Tourova T., Schmid M. Isolation and properties of obligately chemolithoautotrophic and extremely alkali-tolerant ammonia-oxidizing bacteria from Mongolian soda lakes. Archives of microbiology 2001; 176(3): 170–177.

(17)          Sorokin D., Robertson L., kuenen JG. Isolation and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulphur-oxidizing bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 2000;77(3): 251–262.

(18)          Salamia N., Ebrahimipour Gh., Ghasemi SM. Isolation and characterization of a facultative chemolithotrophic sulphur and iron oxidizing bacterium from Ardabil acidic springs. Biological Journal of Microorganism 2012; 1(1): 1-10.

(19)          Sorokin DY., Tourova T., KolganivaT. Thioalkalispira microaerophila gen. nov., sp. Nov., a novel lithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium from a soda lake. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2002; 52(6): 2175-82.

(20)          Abdi L, Rahim Pour Bonab H., Yousefi Rad M. Quality and chemical changes saline Arak Meighan wetland associated with Incoming water surrounding area. The first national conference on combating desertification and sustainable development of desert wetlands. Arak, Iran; 1389.

(21)          Bordi M. Soil physics. 1st ed. Tehran: UniversityofTehran; 1379.

(22)          Bozorgmehr A. Fundamental soil physics. 1st ed. Ahvaz: UniversityofShahidChamran; 1380.

(23)          Murray R., Stackebrandt E. Taxonomic note: implementation of the Provisional status Candidates for incompletely described prokaryotes. International journal of systematic bacteriology 1995; 45(1): 186.

(24)          Baron F., Finegold S. Diagnostic Microbiology. 8rd ed. Houston, Texas: TheCVMosbyCompany; 1990.

(25)          Primrose SB., Twyman RM. Principles of gene manipulation and genomics. 7rd ed. USA: BlackwellPublishing; 2006.

(26)          Benson D., Karsch-Mizrachi IA. Gene Bank. Nucleic acids research 2008; 36(1): D25-D

(27)          Thompson J., Gibson T. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Research 1997; 25(24): 4876.

(28)          Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985; 39(4): 783-791

(29)          Felsenstein J. Phylogenies and the comparative method. American Naturalist 1985; 39(4): 1-15

(30)          Banciu HL., Sorokin DY., Tourova TP., Galinski EA., Muntyan MS., Kuenen JG., et al. Influence of salts and pH on growth and activity of a novel facultatively alkaliphilic, extremely salt-tolerant, obligately chemolithoautotrophic sufur-oxidizing Gammaproteobacterium Thioalkalibacter halophilus gen. nov., sp. nov. from South-Western Siberian soda lakes. Extremophiles 2008; 12(3): 391–404

(31)          Sorokin DY., Kuenen JG. Haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria in soda lakes. FEMS microbiology reviews 2005; 29(4): 685-702.

(32)          Reddy CA., Beveridge T., Breznak J., Marzluf G., Schmidt T., Snyder L. Methods for General and Molecular Bacteriology. Washington DC: AmericansocietyofMicrobiology; 1994.

(33)          Jansson J., Editor. Protein purification: principles, high resolution methods and applications. 3 rd ed. Canada: Johns Wiley and Sons, Inc.; 2011.

(34)          Sheehan D. Methods in molecular biology: in protein purification protocols. Totowa, NJ: human Press Inc.; 1996: 269-275.

(35)          Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry 1976; 72(1-2): 248-254.

(36)          Sorbo B. A colorimetric method for the determination of thiosulphate. Biochimica et Biophyicas Acta 1957;23: 412-416.

(37)          Kolthoff IM., Sandell EB., Meehan EJ., Bruckenstein S. Quantitative Chemical Analysis. Macmillan 1969; 857.

(38)          Sorokin DY., Gorlenko VM., Tourova TP., Tourova TP., Tsapin AI., Nealson KH., et al. Thioalkalimicrobium cyclicum sp. nov. and Thioalkalivibrio jannaschii sp. nov., novel species of halo alkaliphilic, obligatory chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from hyper saline alkaline Mono Lake (California). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2002; 52: 913-920

(39)          Banciu HL., Sorokin DY., Kleerebezem R., Muyzer G., Galinski EA., Kuenen JG. Growth kinetics of halo alkaliphilic, sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio versutus strain ALJ 15 in continuous culture. Extremophiles 2004; 8: 185–192