تجزیۀ زیستی آنتراسن توسط Bacillus sp. موجود در پساب آلوده به هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه‌ای

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد سلولی– مولکولی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 استـــادیــار میکــروبیــــولوژی، دانشگـــاه گیــــلان، رشت، ایران

3 استــــــــاد شیمـــــــــــی، دانشگــــــاه گیــــلان، رشـــت، ایــــران

چکیده

مقدمه: هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه‌ای (PAHs) یکی از مهم‌ترین آلاینده‌ها هستند که منشأ اصلی آن‌ها تولید صنعتی، حمل‌ونقل، سوزاندن زباله، تبدیل به گاز و سوزاندن پسماند پلاستیک است و ازاین‌رو باید تجزیه و یا حذف شوند. یکی از ایمن‌ترین و مقرون‌به‌صرفه‌ترین روش‌ها، استفاده از فرآیندهای زیستی نظیر زیست‌پالایی است. در این روش از میکروارگانیسم‌ها جهت حذف یا کاهش سمیّت آلاینده‌ها استفاده می‌شود. در این مطالعه زیست‌پالایی آنتراسن که یکی ازPAHهای سه‌حلقه‌ای است، به‌عنوان یک ترکیب اندیکاتور جهت نشان‌دادن آلودگی PAH، توسط باکتری بومی جداشده از پساب محل تجمع تانکرهای نفتی بررسی شد.
مواد و روش‌ها: جهت جداسازی و شناسایی باکتری، به‌ترتیب از محیط کشت پایه معدنی حاوی آنتراسن به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی و آزمون‌های افتراقی بیوشیمیایی و آنالیز ژن 16S rDNA استفاده شد. در آنالیز پساب، مقدار کلی هیدروکربن‌های نفتی، مقادیر هیدروکربن‌های آروماتیک و مقدار اکسیژن زیستی موردِنیاز اندازه‌گیری شد. به‌منظور تجزیۀ آنتراسن، از غلظت‌های مختلف آنتراسن و جهت تعیین میزان تجزیه آنتراسن و متابولیت‌های حاصل از تجزیه آن، به‌ترتیب از دستگاه‌های گاز کروماتوگرافی و گاز کروماتوگرافی- طیف‌سنجی جرمی استفاده شد.
نتایج: این مطالعه اولین گزارش از رشد، تحمل آلاینده‌های PAH با غلظت بالا در پساب و همچنین تجزیۀ آنتراسن توسط sp. Caspian1394 Bacillus  است که می‌تواند غلظت100 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن را با راندمان 5/99درصد و غلظت 350 میلی‌گرم بر لیتر را با راندمان 4/3درصد تجزیه کند. برخی از متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن، 1 و 4 متانوآزولن، 2 و 5 سیکلوهگزادین، ایکوزان، هگزادکان، هپتادکان و اکتادکان بودند.
بحث و نتیجه‌گیری: با توجه به رشد این باکتری در پساب با آلودگی هیدروکربنی بالا، تحمل غلظت زیاد PAHهای مختلف، اسپوردار بودن، مقاومت آن نسبت به شرایط های نامساعد محیطی و همچنین پراکنش در محیط‌های مختلف، این باکتری می‌تواند به‌عنوان یک کاندید در زیست‌پالایی محیط‌های آلوده به آنتراسن مطرح باشد. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biodegradation of anthracene by Bacillus sp. in wastewater contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons

نویسندگان [English]

  • Maryam Habibi 1
  • Mohammad Javad Mehdipour Moghaddam 2
  • Mohammad Ali Zanjanchi 3
1 M.Sc. student of cellular and molecular biology, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, University of Guilan, Rasht, Iran
3 Professor of Chemistry, University of Guilan, Rasht, Iran
چکیده [English]

Introduction:Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are one of the most important pollutants that majorly originate from industrial production, transportation, refuse burning, gasification and plastic waste incineration and therefore must be degraded or removed. One of the safest and cheapest methods is the utilization of biologic processes such as bioremediation. In this method, microorganisms are employed to remove or reduce the pollutants toxicity. Bioremediation of anthracene as one of the tricyclic PAHs by a local bacterium that was isolated from wastewater of oil tankers station was investigated in this study.
Materials and methods: Inorganic basal medium containing anthracene as the sole source of carbon and energy, biochemical tests and 16s rDNA gene analyses were applied respectively for bacterium isolation and identification. In wastewater analysis, the parameters such as total petroleum hydrocarbons (TPHs), aromatic hydrocarbons and biological oxygen demand (BOD) were measured.  For anthracene degradation, different concentrations of anthracene (100, 150, 200, 250, 300 and 350 mg/l) were used. Gas chromatography (GC) and Gas chromatography-mass spectrometry (GC-Mass) were applied to determine anthracene residue and metabolites from anthracene degradation, respectively.
Results: The current study showed the ability of Bacillus sp. Caspian1394to grow in wastewater and tolerate PAH pollutants with high concentration and also degrade anthracene. This bacterium degraded 100 and 350 mg/l concentrations of anthracene with 99.5% and 3.4% efficiency, respectively. Some of the metabolites derived from anthracene degradation were 1,4-methanoazulene, 2,5-cyclohexadiene, hexadecane, heptadecane, ocadecane and eicosane
Discussion and conclusion: The studied bacterial strain can grow in wastewater with high contamination to hydrocarbons and tolerate high concentrations of different PAHs. It is a spore forming bacterium leading to its resistance to unfavorable conditions and also dispersion in different environments. Then, it can be proposed as a candidate in bioremediation of environments contaminated with anthracene.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Polycyclic hydrocarbons
  • anthracene
  • Wastewater
  • Gas Chromatography

مقدمه.

هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه ای[1] (PAHs) گروه بزرگی از ترکیبات آلی با دو یا چند حلقه آروماتیک (حلقه بنزن) هستند که در آرایش خط، زاویه‌ای یا خوشه‌ای قرار گرفته‌اند (1). هیدروکربن‌های پلی آروماتیک از مهم‌ترین آلاینده‌های آب، هوا و رسوبات شناخته شده‌اند. این ترکیبات از راه‌های مختلفی وارد محیط زیست می‌شوند و از طریق فعالیت‌های طبیعی و انسانی در محیط انباشته می‌شوند و عمدتاً از احتراق ناقص مواد آلی، سوخت‌های فسیلی، نشت محصولات نفتی و فعالیت‌های مختلف صنعتی و بخشی از آن در اثر فعالیت‌های طبیعی مانند آتش‌سوزی جنگل‌ها و فوران‌های آتش‌فشانی تولید می‌شوند. براساس سمیّت آن‌ها، سازمان حفاظت از محیط زیست ایالت متحده[2]، 16 PAH را به‌عنوان آلاینده در اولویت پالایش مطرح کرده است (2-4). پایداری PAHها در محیط زیست، به عوامل مختلفی نظیر ساختار شیمیایی، غلظت، پراکندگی و دسترسی زیستی آلاینده بستگی دارد. علاوه بر این، عوامل محیطی مانند نوع و ساختار خاک، اسیدیته[3]، دما، سطوح کافی اکسیژن، مواد مغذی و آب جهت فعالیت میکروب‌های تجزیه‌کنندۀ آلاینده، زمان پایداری PAH در طبیعت را کنترل می‌کند. به‌طورکلی، هرچه وزن ملکولی ملکول PAH بیشتر باشد، آبگریزی و سمیّت و پایداری زیست‌محیطی آن ملکول بیشتر می‌شود (5 و 6). از جمله PAH، آنتراسن است که یک هیدروکربن آروماتیک سه‌حلقه‌ای مشتق از قطران ذغال‌سنگ با فرمول شیمیایی  H10C14است (7). آنتراسن از جمله سوبستراهای مدل یا شناساگر در مطالعات تجزیۀ محیطی PAHها است. هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک موجود در طبیعت به‌علت سمیّت، جهش‌زایی و سرطان‌زابودن، موجب نگرانی بزرگ محیط زیست شده‌اند. یکی از راهکارهای ارزان، مؤثر و ایمن جهت مقابله با این ترکیبات، زیست‌پالایی[4]یا همان استفاده از باکتری‌ها، قارچ‌ها و گیاهان به‌منظور تجزیه، شکستن، تغییر شکل و یا اساساً حذف آلاینده‌ها از محیط است. در این فرآیند، ارگانیسم آلایندۀ شیمیایی را به‌عنوان منبع انرژی و کربن استفاده و آن را به محصولات با سمیّت کمتر تبدیل می‌کند (8). هدف از این پژوهشْ جداسازی، شناسایی و بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن توسط باکتری بومی جداشده از پساب آلوده به آلاینده‌های نفتی از محل تجمع تانکرهای نفتی در شهرستان رشت است.

 

مواد و روش‌ها.

نمونۀ پساب و آنالیز آن: نمونۀ موردِآزمایش، پساب آلوده به هیدروکربن‌های نفتی بود که از یک حوضچه واقع در جایگاه تجمع تانکرهای نفتی جمع‌آوری شد (واقع در رشت با مختصات رشت – سنگر (N37.2668 E49.61171)). علت انتخاب این ناحیه، آلوده‌بودن طولانی‌مدت پساب با مواد نفتی است که دستیابی و جداسازی باکتری‌های بومی مقاوم و تجزیه‌کنندۀ این هیدروکربن‌ها را امکان‌پذیر می‌کند. نمونۀ پساب از عمق 30-20 سانتی‌متری جمع‌آوری شد. جهت نمونه‌برداری، از ظروف پلاستیکی و سرنگ استریل استفاده شد که بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شد و مقداری از آن نیز جهت اندازه‌گیری مقدار کل هیدروکربن‌های نفتی[5] توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی[6] (Agilent 7890A, USA)، شناسایی هیدروکربن‌های آروماتیک پساب توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی- طیف سنجی جرمی[7] (Agilent 5975C, USA) و همچنین اندازه‌گیری مقدار اکسیژن زیستی مورد نیاز[8] به آزمایشگاه ارسال شد. BOD خیلی بالا نشان‌دهندۀ بار آلی زیاد و همچنین حضور میکروارگانیسم‌های هوازی زیاد در پساب است.

جداسازی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: جهت جداسازی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن، از محیط کشت پایه معدنی که در آن آنتراسن به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود استفاده شد. بدین منظور به یک ارلن 250 میلی‌لیتری، مقدار 100 میلی‌لیتر محیط کشت پایه معدنی (بر حسب گرم بر لیتر) شامل 84/2 گرم NH4)2SO4)، 38/2 گرم KH2PO4، 65/5 گرم K2HPO4.3H2O، 1گرم MgSO4.7H2O و 1 میلی‌لیتر عناصر کمیاب (در لیتر) شامل 64/0 گرم CuSO4.5H2O، 11/0گرم FeSO4.5H2O، 79/0گرم MnCl2.4H2O، 15/0 گرم ZnSO4.7H2O و همچنین 01/0 گرم آنتراسن و 1 میلی‌لیتر نمونه پساب (اسیدیته محیط کشت برابر 2/7) اضافه شد (9). ارلن حاوی نمونه همراه با شاهد (محیط کشت تنها) در انکوباتور شیکردار با 130 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت دو هفته قرار داده شد. با مشاهده کدورت در محیط کشت مایع و به‌منظور حصول اطمینان از وجود باکتری، مقدار 1 میلی‌لیتر از محتویات محیط کشت موجود در ارلن به محیط پایه معدنی جامد تلقیح شد.

به‌منظور دستیابی به باکتری‌های خالص تجزیه‌کنندۀ آنتراسن، ارلن حاوی نمونۀ اصلی، 5 بار به‌صورت متوالی با فاصله زمانی یک هفته به محیط پایه معدنی مایع انتقال داده شد و پس از هر بار انتقال، رشد باکتری‌ها از طریق کشت در محیط کشت پایه معدنی جامد بررسی شد.

شناسایی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: بعد از رشد و تهیۀ کلنی خالص، جهت شناسایی جدایۀ موردِنظر از رنگ‌آمیزی گرم و کپسول، آزمون‌های افتراقی بیوشیمیایی و همچنین آنالیز مولکولی استفاده شد. در آنالیز مولکولی، از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[9] ژن 16S rDNA و سپس توالی‌یابی آن برای شناسایی استفاده شد. در این آنالیز، استخراج DNA با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت. در این روش، سوسپانسیونی از نمونه باکتری تهیه شد و به‌مدت 12 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد جوشانده شد. سپس PCR (با استفاده از پرایمرهای عمومی[10]27F و 1492R (جدول 1) انجام شد (جدول 2 و 3)(10). بعد از مشاهدۀ باند bp 1500، این باند از ژل استخراج شد تا توالی‌یابی شود (روش سنگر)(شرکت Seqlab، آلمان). توالی به‌دست‌آمده با توالی ژن‌های 16S rDNAموجود در پایگاه اطلاعاتی داده‌های ncbi تطبیق[11] تا مشخص شود به کدام باکتری تعلق دارد.

 

جدول 1- توالی پرایمرهای عمومی27F و 1492R.

ردیف

نام پرایمر

توالی پرایمر ( )

1

27F

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

2

1492R

GGTTACCTTGTTACGACTT

 

جدول 2- مواد مصرفی در واکنش PCR

مقدار(ماکرولیتر)

غلظت

ماده مصرفی

2

30 میلی‌گرم

DNA الگو

1

5/0 میلی‌مولار

پرایمر رفت

1

5/0 میلی‌مولار

پرایمر برگشت

10

-

Master mix

6

-

آب مقطر

 

 

 

 

جدول 3- چرخه حرارتی PCR ژن 16S rDNA.

زمان ( دقیقه )

دما ( 0C)

مراحل

4

95

واسرشت‌سازی اولیه

1

94

واسرشت‌سازی

1

55

اتصال آغازگر به رشته

1

72

بسط پلیمراز

10

72

بسط نهایی

 

بررسی میزان رشد جدایه در محیط حاوی آنتراسن: جهت بررسی میزان رشد باکتریایی در محیط کشت پایه معدنی مایع، از دستگاه اسپکتوفتومتر با طول موج 600 نانومتر استفاده شد. در این قسمت از آزمایش از 5 شاهد استفاده شد که عبارت‌اند از: محیط کشت تنها (شاهد 1)، محیط کشت + 1 میلی‌لیتر پساب غیراستریل (شاهد 2)، محیط کشت + 1 میلی‌لیتر پساب استریل (با استفاده از فیلتر 45/0 میکرون)(شاهد 3)، محیط کشت + آنتراسن (1/0 گرم آنتراسن را در 1 میلی‌لیتر دی کلرومتان حل شد)(شاهد 4) و محیط کشت + پساب استریل + آنتراسن (شاهد 5). جذب نوری محتویات 5 ارلن شامل نمونه اصلی و 4 شاهد (به‌جز شاهد 1)، به فاصله زمانی 4 روز به‌طور متوالی اندازه‌گیری شد. تغییرات اسیدیته نیز در طی تجزیه آنتراسن توسط باکتری، با استفاده از اسیدیته متر بررسی شد.

بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن و شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیه آن: به‌منظور تعیین غلظت قابل‌تحمل آنتراسن و حداکثر غلظتی که توسط باکتری تجزیه می‌شود، سری رقتی از آنتراسن (100، 150، 200، 250 و 300 میلی‌گرم بر لیتر) در محیط پایه معدنی تهیه شد. بعد از گذشت 20 روز و مشاهدۀ کدورت که نشان‌دهندۀ رشد باکتری در غلظت‌های مربوطه است، آنتراسن باقی‌مانده در محیط کشت با استفاده از روش مایع- مایع استخراج شد. برای استخراج، از دکانتور 250میلی‌لیتری استفاده شد. پنجاه میلی‌لیتر محیط کشت به دکانتور منتقل و 25 میلی‌لیتر دی کلرومتان به‌عنوان حلال به‌مرور و طی چند مرحله به آن اضافه شد. سپس محلول به‌خوبی تکان داده شد تا حلال به‌خوبی با محیط همگن شود و بعد از چند دقیقه، دو فاز آبی و آلی به‌راحتی از یکدیگر جدا شدند. سپس ناحیۀ شفاف که حاوی فاز آلی و سوبسترا است، به داخل یک بشر تخلیه و نمونه استخراج می‌شود. جهت آنالیز از روش  PY-ANT.M و از دستگاه GC (Agilent 7890A, USA) استفاده شد (10). به‌منظور شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن توسط باکتری، فاز آلی موجود در محیط کشت که شامل آنتراسن و متابولیت‌های آن است توسط روش مایع – مایع استخراج و جهت آنالیز از روش PAH-M و دستگاه GC-MS
(Agilent 5975C, USA) استفاده شد (10).

 

نتایج.

آنالیز پساب: مقدار TPH (شکل 1) و همچنین BOD نمونه پساب بالا و به‌ترتیب 73/16 و 3743 میلی‌گرم بر لیتر بود. نتایج حاصل از اندازه‌گیری هیدروکربن‌های آروماتیک موجود در پساب نیز در شکل 2 و جدول 4 آورده شده است.

 

 

 

 

شکل 1- کروماتوگرام TPH پساب

 

 

شکل 2- کروماتوگرام GC-MS پساب

 

 

 

جدول 4- هیدروکربن‌های آروماتیک موجود در پساب

نمونه (پساب)

ماکروگرم بر میلی‌لیتر

Naphthalene

14

Acenaphthalene

7/0<

Acenaphthylen

7/0<

Fluorene

7/0<

Phenanthrene

7/0<

Anthracene

7/0<

Fluoranthene

7/0<

pyrene

7/0<

Chrysene

7/0<

Benzo{a} anthracene

7/0<

Benzo{b} fluoranthene

7/0<

Benzo{k} fluoranthene

7/0<

Dibenzo{ah} anthracene

7/0<

Indeno{123-cd} pyrene

7/0<

Benzo{ghi} perylene

7/0<

 

جدول 5- نتایج آزمون افتراقی بیوشیمیایی

آزمون ها

نتیجه

تخمیر گلوکز

+

تخمیر لاکتوز

-

تخمیر گالاکتوز

-

مالونات

+

سیترات

-

MR

+

VP

-

H2S

-

CO2

-

حرکت

-

 

جداسازی و شناسایی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: نتیجۀ آزمون گرم نشان داد که این جدایه، باسیل گرم مثبت فاقد کپسول با کلنی‌های نسبتاً بزرگ نامنظم و غیرمسطح است. نتایج آزمون افتراقی بیوشیمیایی نیز در جدول 5 آورده شده است. توالی‌یابی محصول PCR نشان داد که سویۀ ذکرشده با 1406 نوکلئوتید به‌میزان 100درصد با توالی 16s rDNAبسیاری از سویه‌های Bacillus cereus، Bacillus  anthracisو Bacillus thuringiensis مشابهت دارد. توالی 16s rDNAاین باکتری در بانک ژنی[12]مربوط به NCBI با شماره دستیابی[13]KX216517 و به‌نام Bacillus sp. Caspian1394 ثبت شد.

میزان رشد جدایه در محیط حاوی آنتراسن: همان‌طور که انتظار می‌رفت با گذشت زمان، میزان رشد باکتری با افزایش جذب نوری تأیید شد و جذب نوری نمونه‌های شاهد اندکی دچار تغییرات شد که احتمالاً می‌تواند ناشی از خطای انسانی و دستگاهی باشد. کمترین میزان جذب نمونه اصلی مربوط به روز چهارم و مقدارش 20/0 و بیشترین آن مربوط به روز بیست و هشتم و مقدارش 85/0 بود. به عبارتی با گذشت زمان میزان رشد و تجزیۀ آنتراسن بیشتر می‌شود (شکل 3).

ازلحاظ تغییرات اسیدیته نیز، در روز اول اسیدیته برابر 2/7 و در روز بیستم به 5/6 رسید. درنتیجه به نظر می‌رسد کاهش اسیدیته به‌دلیل تولید ترکیبات اسیدی ناشی از تجزیۀ آنتراسن باشد.

بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن و شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آن: در ابتدا جهت تجزیۀ آنتراسن توسط جدایه موردنظر، از غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن استفاده شد و پس از تلقیح باکتری و با گذشت زمان 20 روز، با استفاده از دی کلرومتان میزان آنتراسن باقی‌مانده استخراج و توسط دستگاه GC اندازه گیری شد. نتیجۀ آنالیز نشان داد میزان آنتراسن از 100 میلی‌گرم بر لیتر به 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کاهش یافته است، به‌عبارتی راندمان تجزیه 5/99درصد  است (شکل 4).

 

نتایج حاصل از آنالیز GC نشان داد بیشترین و کمترین میزان تجزیه آنتراسن توسط جدایه به‌ترتیب مربوط به غلظت‌های150 میلی گرم بر لیتر و 350 میلی‌گرم بر لیتر با راندمان‌های تجزیه 3/63درصد و 6/3درصد است؛ بنابراین با افزایش غلظت آنتراسن، میزان رشد باکتری و درنتیجه میزان تجزیۀ آنتراسن توسط آن کاهش می‌یابد (شکل 5).

در ارتباط با شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن که با استفاده از دستگاه GC-MS انجام گرفت، بیشترین متابولیت‌های حاصل از تجزیه، شامل 1 و 4 متانوآزولن، 2 و 5 سیکلوهگزادین، ایکوزان، هگزادکان، هپتادکان و اکتادکان بودند (شکل 6).

 

 

 

شکل 3- تغییرات جذب نوری محیط حاوی آنتراسن در نمونه‌های اصلی و شاهد در طول موج 600 نانومتر.

 

 

شکل 4- کروماتوگرام GC نشان‌دهندۀ آنتراسن.

 

 

 

 

شکل 5- میزان تجزیۀ آنتراسن در غلظت‌های مختلف. نمونه‌ها، ارلن‌های حاوی غلظت‌های مختلف آنتراسن را نشان می‌دهند.

 

 

شکل 6- کروماتوگرام GC-MS مربوط به متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن.

 


بحث و نتیجه‌گیری.

وجود آلاینده‌ها به‌ویژه PAH ها در محیط یک مشکل زیست‌محیطی مهمی به شمار می‌رود. آنتراسن از جمله هیدروکربن‌های سه‌حلقه‌ای است که در غلظت‌های بالا در رسوبات آلوده به PAH، خاک‌های سطحی و مکان‌های دارای پسماند[xiv] یافت می‌شود و به‌عنوان یک شناساگر جهت شناسایی آلودگی محیط به PAH به کار می‌رود. برخلاف PAH با وزن مولکولی بالا (دارای چهار حلقه و بیشتر)، آنتراسن خطری برای سلامتی انسان و اثر سمّی برای ژنوم[xv] و همچنین خاصیت سرطان‌زایی ندارد اما برای ماهی‌ها و جلبک‌ها سمّی است (11). سرنوشت PAH ها در محیط شامل تبخیر، فتواکسیداسیون، اکسیداسیون شیمیایی، تجمع زیستی[xvi] و جذب به ذرات خاک است. باوجوداین، به نظر می‌رسد فرآیندهای اصلی برای برداشتن PAH ها از محیط، تغییر شکل[xvii] و تجزیۀ میکروبی یا همان زیست‌پالایی باشند (12). با توجه به اهمیت زیست‌پالایی آلاینده‌ها، در این پژوهش نیز هدف جداسازی و شناسایی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن و همچنین بررسی میزان تجزیۀ آن توسط این باکتری بود. در این مطالعه براساس آزمون‌های افتراقی بیوشیمیایی و توالی‌یابی ژن 16s rDNA یک باکتری گرم‌مثبت، اسپوردار و بومی به نام Bacillus sp. Caspian1394 از پساب محل تجمع تانکرهای نفتی جداسازی و شناسایی شد که قادر به تجزیۀ آنتراسن بود. این جدایه قادر بود غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن را با راندمان 5/99درصد طی مدت 28 روز تجزیه کند. برخی از متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن، 1 و 4 متانوآزولن، 2 و 5 سیکلوهگزادین، ایکوزان، هگزادکان، هپتادکان و اکتادکان بودند.

به‌طورکلی گونه‌های Bacillus گونه‌های میکروبی مستعد هستند که به‌طور گسترده به‌منظور تولید متابولیت‌های ثانویه و عوامل فعال سطحی نظیر سورفکتین[xviii]، فنژیسین[xix]، لیکنسین[xx] و غیره مطالعه شده‌اند. مطالعات نشان می‌دهد که هیدرولیز بیشتر PAHs در اسیدیته بالای خنثی اتفاق می‌افتد و با توجه به دو ویژگی مهم گونه‌های Bacillus یعنی تولید بیوسورفاکتانت و رشد در اسیدیته قلیایی سبب شده تا این باکتری‌ها به‌عنوان یک کاندید در تجزیۀ PAHs مدنظر قرار بگیرند (13).

به‌طورکلی تجزیۀ آنتراسن در حضور جدایۀ تجزیه‌کنندۀ آن و تحت شرایط انکوباسیون مناسب به‌طور چشمگیری افزایش می‌یابد. علاوه بر آنزیم‌ها، متابولیت‌های تولیدشده از باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ هیدروکربن‌های نفتی (سورفکتانت‌ها) نیز اغلب باعث ادامه و سهولت عملیات شکستن و تجزیه، می‌شود و همچنین با تولید این محصولات از سمیّت مواد اولیه کاسته می‌شود و حتی ممکن است نوع و ترکیب متابولیت‌ها از نظر کارایی شیمیایی خیلی مهم و مفید باشد (14).

در مطالعۀ احمد[xxi] و همکاران، باکتری قلیادوست Bacillus badius D1 جداشده از دریاچه‌ای در هند توانست آنتراسن با غلظت500 میلی‌گرم بر لیتر را در اسیدیته برابر 9 طی مدت 60 ساعت به‌طور کامل تجزیه کند. بیشرین میزان رشد این باکتری با میزان جذب نوری برابر 25/2 و بعد از مدت 48 ساعت به دست آمد. در مطالعۀ آن‌ها، متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن شامل 1،2 دی هیدروکسی آنتراسن، z3-4-J 3- هیدروکسی (2-نفتیل)-2-اکوبوت -3- انوئیک اسید، 6، 7 بنزوکومارین، 1- متوکسی -2 – هیدروکسی آنتراسن، (E)-3-(2-هیدروکسی نفتالن-3- ایل) آکریلیک اسید، فتالیک اسید، 9، 10 دی هیدروکسی آنتراسن، 9، 10- آنتراکوینون بودند (15).

در مطالعۀ مودی[xxii] و همکاران، Mycabacterium sp. starin PYR-1 بعد از مدت 14 روز توانست آنتراسن با غلظت 3/13 میلی‌گرم بر لیتررا با راندمان 92درصد تجزیه کند. متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن در مطالعۀ آن‌ها cis- 1، 2- دی هیدروکسی- 1، 2- دی هیدروکسی آنتراسن، 6، 7- بنزوکومارین، 1- متوکسی- 2- هیدروکسی آنتراسن و 9، 10- آنتراکوینون بودند (12).

در مطالعۀ لی لی[xxiii] و همکاران، باکتری گرم‌مثبت جداشده از خاک آلوده تعمیرگاه اتومبیل[xxiv] به‌نام paracouglomeratum Brachybacterium، توانست غلظت 500 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن را با راندمان 32/70درصد طی 10 روز تجزیه کند و بعد از 10 روز به‌دلیل عدم تغییر در شمارش تعداد باکتری، افزایش تجزیه حاصل نشد (16).

در مطالعۀ امینی و همکاران، از خاک آلوده به نفت در محدودۀ پالایشگاه اصفهان، باکتری Nocardia cyriacigeorgica ATAI20 را جداسازی کردند که قادر بود آنتراسن با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر را با راندمان 6/36درصد بعد از 9 روز تجزیه کند (17).

آرولاژگان[xxv] و همکاران، کونسرسیوم باکتریایی مقاوم به شوری[xxvi] را از محیط دریا جداسازی کردند. بیشترین میزان رشد کونسرسیوم (شمارش) در محیط حاوی آنتراسن در روز چهارم و بیشترین میزان تجزیه در روز پنجم بوده است. این کونسرسیوم توانست غلظت 3 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن را در حضور غلظت 30 گرم بر لیتر کلرید سدیم، طی مدت 2 روز 49درصد و طی مدت 4 روز 95درصد تجزیه کند. در غلظت 60 گرم بر لیتر کلرید سدیم، کونسرسیوم توانست آنتراسن را طی مدت 4 روز با راندمان 39درصد تجزیه نماید (12).

در مطالعۀ بیشت[xxvii] و همکاران، 16 باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن از ریزوسفر گیاه سپیدار لرزان[xxviii] که در حال رشد در خاک غیرآلوده بودند، جداسازی شدند. در بین جدایه‌ها، چهار جدایه یعنی Kurthia sp. SBA4، Micrococcus varians SBA8، Deinococcus radiodurans SBA6 و Bacillus circulans SBA12 توانستند علاوه بر آنتراسن و نفتالن از بنزن و تولوئن نیز استفاده کنند. Kurthia sp. و
B. circulans پاسخ کموتاکتیک مثبت به نفتالن و آنتراسن نشان دادند. در مطالعۀ آن‌ها با افزایش غلظت آنتراسن از 10 به 20 میلی‌گرم بر لیتر میزان رشد Kurthia sp. کاهش پیدا کرد. بیشترین میزان رشد این باکتری در هر سه غلظت 10، 16 و 20 میلی‌گرم بر لیتر طی مدت 39 ساعت و بیشترین میزان جذب نوری در این سه غلظت به‌ترتیب 48/0، 3/0 و 28/0 بود. B.circulans SBA12، Kurthia sp. SBA4، M. varians SBA8 و
 D. radiodurans SBA6 به‌ترتیب توانستند آنتراسن با غلظت 20 میلی‌گرم بر لیتر  را با راندمان 5/87درصد، 6/86درصد، 6/86درصد و  8/81درصد پس از مدت 6 روز تجزیه کند (18).

در مطالعۀ هرویجنن[xxix]و همکاران که تجزیه آنتراسن توسط Mycobacterium sp. LB501T در محدودۀ غلظتی 7/2-1/0 میلی‌گرم بر لیتر انجام گرفت، بیشترین میزان تجزیه در غلظت 4/2 میلی‌گرم بر لیتر با جذب نوری برابر 68/0 و در روز یازدهم بوده است (19).

در این مطالعه برخلاف سایر مطالعه‌ها، باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن از پساب با آلودگی PAH بالا جداسازی شد و این نشان‌دهندۀ آن است که این باکتری نسبت به سایر باکتری‌های مطالعه‌شده در ارتباط با تجزیۀ آنتراسن، تحمل و مقاومت بیشتری نسبت به بسیاری از آلاینده‌ها دارد. برخلاف مطالعه احمد و لی لی، در سایر موارد، جدایۀ ما نسبت به جدایه‌هایی که سایر پژوهشگران استفاده کرده‌اند، قدرت تحمل بالایی نسبت به آنتراسن داشته (300 میلی‌گرم بر لیتر با راندمان 4/3درصد تجزیه) ولی از طرفی میزان تجزیۀ آنتراسن توسط جدایۀ ما نسبت به سایر جدایه‌ها به زمان بیشتری نیاز داشته است. در این مورد احتمالاً Bacillus sp. Caspian 1394 توانسته آنتراسن را تجزیه کند ولی فرصت بیشتری به باکتری جهت تجزیۀ آنتراسن داده شده است. دلیل احتمالی در این زمینه می‌تواند بیان کم ژن‌های تولیدکنندۀ آنزیم‌های دخیل در تجزیۀ آنتراسن و یا فعالیت کم این آنزیم‌ها باشد. همچنین در این مطالعه، متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن متفاوت از متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن در مطالعات پژوهشگران دیگر بود ولی این قسمت نیاز به آنالیز بیشتر و دقیق‌تری دارد تا تأیید کند که مسیر تجزیۀ آنتراسن در این باکتری متفاوت یا مشابه مسیر تجزیۀ آنتراسن در سایر باکتری‌هایی که دیگر پژوهشگران مطالعه کرده‌اند، است.

با توجه به اینکه این باکتری توانست در پساب با آلودگی هیدروکربنی بالا رشد کند و غلظت بالای بسیاری از آلاینده‌های PAH را تحمل نماید و با توجه به اسپورداربودن این باکتری و درنتیجه مقاومت نسبت به شرایط نامساعد محیطی و همچنین پراکنش آن در محیط‌های مختلف، شاید بتوان از این باکتری در زیست‌پالایی محیط‌های آلوده به آنتراسن استفاده کرد. البته در این زمینه نیاز است تا تأثیر عوامل زیستی و غیرزیستی بر روی رشد این باکتری و روند تجزیۀ آنتراسن و حتی سایر آلاینده‌های PAH توسط این باکتری بررسی شود.

 



[1]- PAHs

[2]- US EPA

[3]- pH

[4]- Bioremediation

[5]- Total petroleum hydrocarbon (TPH)

[6]- Gas chromatography (GC)

[7]- Gas chromatography- Mass spectrometry (GC-Mass)

[8]- Biological oxygen demand (BOD)

[9]- Polymerase chain reaction (PCR)

[10]- Universal

[11]- Alignment

[12]- GeneBank

[13]- Accession number

[xiv]- wastes

[xv]- Genotoxic

[xvi]- Bioaccumulation

[xvii]- Transformation

[xviii]- Surfactin

[xix]- Fengycin

[xx]- lichenysin

[xxi]- Ahmed

[xxii]- Moody

[xxiii]- Lily

[xxiv]- Automobile workshop

[xxv]- Arulazhagan

[xxvi]- Halotolerant

[xxvii]- Bisht

[xxviii]- Populus deltoids

[xxix]- Herwijnen

 

(1)              Cerniglia, CE. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation 1992; 3 (2): 351–368.

(2)   Freeman DJ., Cattell FCR. Wood burning as a source of atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental Science and Technology 1990; 24(10): 1581–1585.

(3)   Coates JD., Anderson RT., Lovley DR. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons under sulfate-reducing conditions. Applied and Environmental Microbiology 1996; 62(3): 1099–1101.

(4)  Baek SO., Field RA., Goldstone ME., Kirk PW., Lester JN., Perry R. A review of atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbons: sources, fate and behavior. Water, Air, and Soil Pollution 1991; 60(3): 279-300.

(5)   Haritash AK., Kaushid CP. Biodegradation aspects of polyaromatic hydrocarbons (PAHs). Journal of Hazardous Materials 2009; 169(1-3): 1-15.

(6)   Hatzinger PB., Alexander M. Effect of aging on chemicals in soil on their biodegradability and extractability. Environmental Science and Technology 1995; 29(2): 537–545.

(7)   McNaught AD., Wilkinson A. IUPAC. Compendium of chemical terminology. 2nd ed. (the "Gold Book"). Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1997.

(8)              Alvarez PJJ., Illman  WA. Bioremediation and natural attenuation, process fundamentals and mathematerialmodels. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., Hoboken; 2006.

(9)  Ferradji FZ., Mnif S., Badis A., Rebbani S., Fodil D., Eddouaouda K., Sayadi S. Naphthalene and crude oil degradation by biosurfactant producing Streptomyces spp. isolated from Mitidja plain soil. (North of Algeria). International Bioderterioration and Biodegredation 2014; 86(C): 300-308.

(10)          A. Frank J., I. Reich C., Sharma S., S. Weisbaum J., A. Wilson B., J. Olsen G. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology 2008; 74(8): 2461-2470.

(11)          Balachandran C., Duraipandiyan V., Balakrishna K., Ignacimuthu S. Petroleum and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degradation and naphthalene metabolism in Streptomyces sp. (ERI-CPDA-1) isolated from oil contaminated soil. Bioresource Technology 2012; 112: 83–90.

(12)          Moody JD., Freeman JP., Doerge DR., Cerniglia CE. Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Mycobacterium sp. strain PYR-1. Applied and Environmental Microbiology 2001; 67(4): 1476-1483.

(13)          Arulazhagan P., Vasudevan N., Yeom LT. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon by a halotolerant bacterial consortium isolated from marine environment. International Journal of Environmental Science and Technology 2010; 7(4): 639-652.

(14)          Ahmed TA., Othman MA., Sarwade VD., Kachru GR. Degradation of anthracene by alkaliphilic bacteria Bacillus badius. Environment and Pollution 2012; 1(2): 97-104.

(15)          Lily MK., Bahuguna A., Bhatt KK., Dangwal K.  Degradation of Anthracene by a novel strain Brachybacterium paraconglomeratum BMIT637C (MTCC 9445). International Journal of Environmental Sciences 2013; 3(4): 1242-1252.

(16)          Amini I., Tahmourespour A., Abdollahi A., Doudi M. Isolation, molecular identification & anthracene biodegradation of Nocardia cyriacigeorgica isolated from oil refinery soil in Isfahan. Journal of Microbial World 2013; 6(3): 228- 236.

(17)          Bisht S., Pandey P., Sood A., Sharma S., Bisht NS. Biodegradation of naphthalene and anthracene by chemo-tactically active rhizobacteria of Populus deltoids. Brazilian Journal of Microbiology 2010; 41(4): 922-930.

(18) Herwijnen RV., Springael D., Slot P., Govers HAJ., Parsons JR. Degradation of anthracene by Mycobacterium sp. strain LB501T proceeds via a novel pathway, through o-phthalic acid. Applied and Environmental Microbiology 2003; 69(1): 186–190.

(19)          Ismail W., Gescher J. Epoxy coenzyme a thioester pathways for degradation of aromatic compounds. Applied and Environmental Microbiology 2012; 78(15): 5043-5051.